Krooninen sairaus

tiivistelmä

Maksasyövän riveissä esiintymis- ja kuolleisuus viiden syöpiä maailmanlaajuisesti. Kertyvät intressit ovat keskittyneet kehittämään uusia strategioita maksasyövän hoitoon. Olemme aiemmin osoittaneet, että dihydroartemisiniini (DHA) osoitti antituumorivaikutus kohti maksasyövän. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että histonideasetylaasi estäjät (HDACi) merkittävästi täydennetty antineoplastisen vaikutuksen DHA kautta kasvaa apoptoosin

in vitro

ja

in vivo

. Esto ERK-fosforylaation osaltaan DHA: n indusoiman apoptoosin, mikä johtuu siitä, että inhibiittori ERK-fosforylaation (PD98059) kasvoi DHA: n indusoiman apoptoosin. Verrattuna DHA yksin, yhdistetty hoito DHA ja HDACi vähennetään mitokondriot kalvo potentiaali, julkaistiin sytokromi

c

solulimaan lisääntynyt p53 ja Bak, laski Mcl-1 ja p-ERK, aktivoitu kaspaasi 3 ja PARP, ja indusoi apoptoottisia soluja. Lisäksi olemme osoittaneet, että HDACi esikäsittely helpottaa DHA: n indusoiman apoptoosin. Hep G2-ksenograftissa kuljettaa nude hiirien vatsaonteloon DHA ja SAHA aiheutti merkittäviä eston ksenograftikasvaimissa. Tulokset TUNEL ja H Hyväksytty: 28 toukokuu 2012; Julkaistu: 28 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 81172345 ja nro 30973506). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Maksasyövän on viidenneksi yleisin syöpä maailmassa ja kolmanneksi yleisin kuolinsyy syöpään [1]. Yli 75% uusista tapauksista diagnosoidaan kehitysmaissa; kuitenkin, esiintyvyys lisääntyy taloudellisesti kehittyneillä alueilla, kuten Japanissa, Länsi-Euroopassa, ja Yhdysvalloissa [2], [3]. Vaikka kirurginen resektio ja maksansiirron ovat kaksi hoitovaihtoehtojen kanssa parantava potentiaali, leikkaus on ainoa toteuttamiskelpoinen noin 20% maksasyövän tapauksissa, koska potilaat ovat useimmiten diagnosoitu pitkälle edenneessä [4], [5]. Tähän mennessä kemoterapiaa maksasyövän ei ole tyydyttävä ja pitkällä aikavälillä säilyttämään maksasyövän potilaiden on edelleen heikko [4], [6]. Siksi kehittämään uusia ja tehokkaita hoitostrategioita maksasyövän on suuri tarve ja merkitys.

histonideasetylaasi estäjät (HDACi) ovat tällä hetkellä merkittävä painopiste edun syöpälääkkeet [7], [8]. HDACi on luokan aineita, jotka toimivat kautta estää histoni deasetylaatiolla siten muuttamalla kromatiinirakenteeseen ja geenin transkriptio [9]. Erityisesti, HDACi estävät asetylaatio lysiinitähteiden histoni N-terminaalisen hännän, joka johtaa irtoaminen yhdistyksen histonien kanssa DNA: ta, jolloin geenien ekspressiota, jotka liittyvät kasvaimen suppression [10]. Ymmärtäminen yhteydestä HDAC toimintojen ja erilaiset syövät saanut monet tutkijat pitävät HDAC-inhibiittorit kuten voimakkaita aineita, jotka voivat häiritä syöpäsolujen lisääntymistä ja /tai selviytyminen modulaation kautta solusyklin etenemisen, erilaistuminen tai edistämällä solukuolema. Esimerkiksi Kim et ai. kertoi, että CG0006 altistuminen rintasyöpäsolulinjoissa johti solukuoleman kautta alassäätöä HDAC6 [11]. Bommi et ai. osoittivat, että natriumbutyraattia indusoi apoptoosin syöpäsoluissa transkription downregulation BMI1 [12].

Vaikka HDACi yksin voivat olla kliinisesti käyttökelpoisia, ne ovat todennäköisesti arvokkaita yhdessä muiden kasvaimia estävinä aineina. SAHA on hyväksynyt Yhdysvaltojen Food and Drug Administration (FDA) hoitoon ihon T-solulymfooma ja muut HDACi nyt käynnissä faasi I /II kliinisessä tutkimuksessa yksittäisenä aineena tai yhdessä muiden aineiden kanssa [13], [14 ]. Kertyvät raportit on ilmoittanut synergiavaikutusta kuolleisuutta yhdistelmästä HDACi ja muiden kemoterapia-aineiden. Kretzner et ai. osoittivat, että yhdistelmä HDACi ja Aki parannettu lymfooma solukuoleman kautta tukahduttaminen c-Myc, hTERT, ja microRNA tasolla [15]. Nguyen et ai. kertoi, että anto HDACi synergistisesti lisääntynyt KW-2449 kuolleisuutta johtuvat inaktivaatio Bcr /Abl [16]. Viime aikoina vaiheen II tutkimuksessa ilmeni, että hoito vorinostat yhdistetty tamoksifeenin merkittävästi lisäsi elinaikaa potilailla, joilla on rintasyöpä [17]. Tällainen synergistinen vaikutus on harvoin osoitettu maksasyöpä.

Olemme hiljattain raportoitu, että dihydroartemisiniini (DHA), tärkein aktiivinen metaboliitti artemisiinipohjaisten johdannaisia, osoitti syövän vastaista aktiivisuutta maksasyövän [18]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että (a) DHA: n indusoiman apoptoosin kautta vähen- tämisessä ERK-fosforylaation, joka edelleen tiedot vahvistivat, että estäjä ERK-fosforylaation (PD98059) kasvoi DHA: n indusoiman apoptoosin, (b) HDACi

in vitro

huomattavasti parannettu DHA-solukuolema, mukana ja alentaa niiden mitokondrioita kalvon potentiaalin vapauttaminen sytokromi

c

solulimaan lisääntyminen p53 ja Bak, ja vähennysten Mcl-1 ja p-ERK, ( c) yhdistelmä HDACi ja DHA

in vivo

merkittävästi pysäyttää kasvun maksasyövän -tuumoriksenografti. Meidän data voi ehdottaa yhdistelmä HDACi ja DHA on lupaava strategia maksan syövän kemoterapiassa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen maksan syöpäsolulinjoissa (Hep G2 ja PLC /PRF /5) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 mg /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2 ja 95% ilmaa 37 ° C: ssa.

Vasta-aineet ja reagenssit

Vasta-aineet Mcl- 1, PARP, Bak, ja Actin ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineita kaspaasi 3, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, ja p-JNK toimitti Cell Signaling (Danvers, MA). Dihydroartemisiniini (DHA, liuotettu DMSO: hon), natriumbutyraatilla (NaB, liuotettiin H

2O), suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA, liuotettu DMSO: hon) ja p-ERK-inhibiittoria (PD98059, liuotettuna DMSO) hankittiin Sigmalta ( St. Louis, MO).

MTT

Solujen elinkelpoisuus määritettiin 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-diphenyltetrazo-Lium bromidia (MTT) määritys. Lyhyesti, 8 x 10

3-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille 24 tuntia, jonka jälkeen inkuboitiin erilaisten annosten DHA: ta, määritettynä ajankohtana. Kun oli lisätty 100 ul /kuoppa MTT-liuosta, soluja inkuboitiin vielä 2 h. Sitten supernatantit poistettiin ja formatsaanikiteet liuotettiin 100 ul /kuoppa DMSO. Absorbanssi 570/630 nm: ssä kunkin näytteen mitattiin käyttämällä Multilabel levynlukijaa (PerkinElmer). Kolme itsenäistä koetta suoritettiin.

Pesäkkeenmuodostusta

Sata soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyille, ja niitä viljeltiin 7 d. Ja sitten elatusaine korvattiin tuoreella, joka sisältää DHA: ta. Sen jälkeen, kun on inkuboitu vielä 7 vrk, pesäkkeitä muodostettu maksasyövän solut värjättiin 0,05% kristalliviolettia (Sigma, St. Louis, MO), 8 minuutin ajan. Pesäkkeitä kvantitoitiin sitten.

Western blot

Solulysaatteja keitettiin 6x natriumdodekyylisulfaattia (SDS) latauspuskurilla ja sitten fraktioitiin SDS-PAGE: lla. Proteiinit siirrettiin PVDF-membraanille, jota sitten inkuboitiin primäärinen vasta-aine 5% rasvatonta maitoa, jonka jälkeen piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua anti-hiiri tai anti-kani toisen vasta-aineita. ECL Detektioreagenssi (Amersham Life Science, Piscataway, NJ) käytettiin osoittamaan tuloksia.

anneksiini V /PI määritys

Apoptoosi arvioitiin käyttäen anneksiini V-PI kaksinkertainen värjäys. Käsittelyjen jälkeen solut käsiteltiin trypsiinillä ja värjättiin 0,5 mg /ml anneksiini V sitomispuskuriin (10 mM HEPES vapaa happo, 0,14 M NaCl: a, ja 2,5 mM CaCl

2) 30 minuutin ajan. Sen jälkeen, PI (5 ug /ml lopullinen konsentraatio) lisättiin ja inkuboitiin vielä 15 min. Solut levitettiin virtaussytometrillä tiedonkeruuseen.

TUNEL määritys

Apoptoosi analyysi suoritettiin käyttäen Apo-Direct TUNEL Assay Kit (Millipore). Solut kerättiin ja kiinnitettiin 4% PFA: ssa 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa, jota seurasi toinen kiinnitys 70% (v /v) etanolia yön yli -20 ° C: ssa. Sitten soluja käsiteltiin erilaisilla reagensseilla varten suunniteltu ajan mukaan valmistajan ohjeen. Lopuksi solut analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä FACS Vantage kone (Becton Dickinson). The Cell Quest ohjelmisto (Verity Software House) käytettiin analysointiin.

In situ

solukuoleman havaitseminen

leimaus hajanainen DNA arvioida apoptoosin suoritettiin TUNEL värjäys (vihreä fluoresenssi), käyttäen

in situ

Cell Death Detection Kit (Roche, LA), kuten kuvattu edellisessä tutkimuksessa [19].

mittaus kaspaasi 3 aktiviteetti

kaspaasi 3 indusoima DHA hoidon määritettiin kaspaasi-3 Activity Assay Kit (Merck, Darmstadt).

mittaus mitokondrion kalvon potentiaali (Δψ

m) virtaussytometrialla

Neljäkymmentä nM DioC6 (Sigma-Aldrich, MO) inkuboitiin käsiteltiin solujen ilmoitettuina ajankohtina 15 minuuttia 37 ° C: ssa. Kerätyt solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen Becton Dickinson FACS Vantage kone (Becton Dickinson, NJ). Solut, joilla on alhainen Δψ

m esitettiin prosentteina koko solupopulaation. CellQuest ohjelmisto (Verity Software House) käytettiin analysointiin.

Eläinkokeet

Kaikki eläinkokeet suoritettiin noudattaen niitä kansallisia ja kansainvälisiä ohjeita ja on hyväksynyt instituutin Research Medical eettisen komitean Sun Yat-Senin yliopistossa Cancer Center. 1 x 10

7 Hep G2 solut suspendoitiin steriiliin PBS: ään ja injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen hiirten. Hiiret tarkastettiin päivittäin ksenografti /kasvainten kehittymiseen. Hiiret satunnaistettiin kolmeen ryhmään 6 hiirtä /ryhmä. DHA (5 mg /kg hiiren ruumiinpainoa) annettiin ”DHA” ryhmä, SAHA (1,5 mg /kg hiiri ruumiinpainoa) annettiin ”SAHA” ryhmä, yhdistelmä SAHA ja DHA annettiin ”DHA + SAHA ”ryhmä, kerran päivässä viitenä peräkkäisenä päivänä viikossa 24 d. DMSO ryhmä sai yhtä suuren tilavuuden liuotinta valvontaa. Käsittelyn jälkeen eri aikavälein, hiiren ruumiinpainon ja kasvaimen koko mitattiin. Lopuksi, kasvaimet irrotettiin, punnittiin ja kiinnitettiin 4% PFA. Parafinoidut Sitten kudokset leikattiin 4 nm ja valmis H 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset laskelmat suoritettiin SPSS-ohjelmisto (SPSS, Inc., Chicago, IL). Aineisto esitetään keskiarvona ± SD vähintään kolmen erillisen kokeen.

Tulokset

Aktivoinnit MAP-kinaasien osallistui DHA: n indusoiman apoptoosin

DHA on osoitettu indusoivat solukuoleman ihmisen syövissä [20], [21]. Ensin arvioitiin DHA: n indusoiman apoptoosin maksan syöpäsolulinjoissa käyttämällä anneksiini V-määrityksellä. Tulokset osoittivat, että prosenttiosuus anneksiini V-positiiviset solut kasvanut dramaattisesti, kun DHA hoitoon (Fig. 1A), mikä viittaa siihen, DHA ollessa voimakas apoptoosin indusoija maksan syöpäsoluja. Kontrolliin verrattuna, altistuksen jälkeen 10 uM DHA: ta, 24 h, prosenttiosuus apoptoottisten solujen merkittävästi kasvoi 5,3% ja 4,9%: sta 16,6% ja 13,5%, vastaavasti Hep G2 ja PLC /PRF /5-soluissa (kuvio. 1B).

. DHA aiheuttama apoptoosin maksan syöpäsoluja. Soluja käsiteltiin joko DMSO: ssa tai 10 uM DHA 24 ja 48 h värjättiin sekä anneksiini V ja propidiumjodidia (PI) 45 min. Indusoiman apoptoosin DHA arvioitiin sitten virtaussytometrillä analyysi. B. prosenttiosuus apoptoottisten solujen esitetty, sen jälkeen, kun kvantitatiivinen analyysi PI /anneksiini V-määrityksellä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

P

0,05, verrattuna DMSO ryhmä. C. MAP-kinaasien aktivoitiin DHA. Soluja käsiteltiin 10 uM DHA: ta, määritettynä ajankohtana. Fosforylaatio p38, ERK ja JNK määritettiin. D. määrälliset tiedot kolmesta itsenäisestä kokeet osoittaneet, osoittaa suhteellista ilmentymistä p-p38, p-JNK, ja p-ERK.

apoptoosin tavallisesti assosioituu aktivointi MAP kinaasien. Aika-tietenkin analyysi suoritettiin fosforylaation tasoja kolme MAP-kinaasin jäsentä, mukaan lukien ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK), c-Jun-NH2-terminaalisen kinaasin (JNK) ja p38 (Fig. 1 C). Proteiini tasojen kaikkien 3 MAP-kinaasien pysyi ennallaan. Kuitenkin p38 fosforylaatio nostettiin jälkeen DHA kohtelu sekä testattu soluissa. Taso JNK fosforylaation pysyi valvonnan Hep G2-soluissa, mutta oli merkittävästi lisääntynyt PLC /PRF /5-soluissa (kuvio. 1 D). Tasot p-ERK ilmestyi laskeva molemmissa maksasyövän solut käsitelty DHA. Nämä tiedot voi ehdottaa, että inaktivointi ERK osallistuu DHA: n indusoiman apoptoosin.

esto ERK-fosforylaation johtui DHA aiheuttaman apoptoosin maksan syöpäsoluissa

testata oletusta, että inaktivointi ERK oli mukana DHA: n indusoiman apoptoosin, esikäsittelimme solujen PD98059, estäjä ERK-fosforylaation. Ensinnäkin, sytotoksisuuden PD98059 testattiin. Tulokset osoittivat, että PD98059 yksinään ei aiheuttanut merkittävää apoptoosia sekä soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Me seuraavaksi määritetään vaikutus PD98059 on DHA-indusoidun solujen kasvun vaimennusta. Kuten MTT seurauksena PD98059 vähensi maksan syöpäsolun elinkykyisyyksiä verrattuna DHA ryhmien (Fig. 2A).

PD98059, estäjä ERK-fosforylaation, parannettu DHA aiheuttama lasku solujen elinkelpoisuuden. Soluja esikäsiteltiin 10 uM PD98059 2 h, ja sitten inkuboitiin 10 uM DHA: ta, vielä 24 tuntia. Jäljelle jäänyt solujen elinkykyisyys määritettiin MTT-määrityksellä. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta *

P

0,05. B. PD98059 käsittely lisäsi tuotantoa apoptoottisten elin. Soluja esikäsiteltiin 10 uM PD98059 2 h, ja sitten inkuboitiin 10 uM DHA vielä 24 h värjättiin Hoechst 33342 väriainetta. DNA: n fragmentoituminen (merkitty tähdellä) ja ydin- tiivistyminen (merkitty nuolilla) havaittiin fluoresenssimikroskoopilla. C. PD98059 hoito parantaa DHA: n indusoiman apoptoosin. TUNEL-määritys suoritettiin sen määrittämiseksi apoptoosin. Määrä apoptoottisten solujen määritettiin ja prosentuaalinen on merkitty histogrammin. *

P

0,05. D. PD98059 ja DHA hoito johti pilkkoutuminen PARP ja kaspaasi 3. Proteiinit kerättiin solut, joita käsiteltiin PD98059 ja DHA: ta, 24 h alistettiin western blot havaita pilkkoutuminen PARP ja kaspaasi 3 Actin käytettiin latauskontrollina.

Seuraavaksi tutkittiin, PD98059 hoito tehostetun DHA aiheuttaman solukasvuneston kautta aiheuttamaan apoptoosin. Arvioimme DHA aiheuttaman apoptoosin maksasyövän soluissa esikäsitellyt 10pM PD98059 2 h Hoechst 33342 värjäystä. Tulokset paljastivat enemmän soluja, joiden ominaisuuksia, kuten kromatiinin tiivistyminen ja apoptoottisten kehon esitetty PD98059-esikäsitellyt solut (Fig. 2B). Tämä vahvistettiin myöhemmin TUNEL jotka osoittavat, että prosenttiosuudet Tunel-positiiviset solut lisääntyivät maksasyövän käsitellyissä soluissa sekä PD98059 ja DHA (Fig. 2C). Lisäksi tasot pilkotun PARP ja halkaistut kaspaasi 3 oli huomattavasti kasvanut ERK estäjän 2 maksasyövän solulinjoja (Fig. 2D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että DHA: n indusoiman apoptoosin voi liittyä ERK-fosforylaation.

HDACi helpottaa DHA: n indusoiman apoptoosin maksan syöpäsoluissa

Koska että HDACi pystyy parantamaan tappava vaikutus kemoterapeuttiset aineet [22], [23], halusimme tutkia DHA yhdistettynä HDACi aiheutti lisää solukuolemaa maksasyövän. NaB ja SAHA käytettiin MTT analyysissä. Tulosten mukaan, yhdistelmä DHA ja HDACi vähensi elinvoimaisten solujen maksan syöpäsoluja, verrattuna hoitoon monoterapiana (Fig. 3A). Lisääntynyt sytotoksisuus yhdistelmä DHA: n ja HDACi määritettiin myös pesäkemuodostusta. Solut DMSO ryhmiä, jotka muodostuvat useista näkyvä pesäkkeiden 15 d. Pesäkkeitä muodostuu soluja viljeltiin sekä DHA: ta ja HDACi oli merkittävästi pienempi kuin DHA yksinään (Fig. 3B).

Yhdistelmähoito, jossa HDACi ja DHA lisääntynyt solukuolema. Soluja käsiteltiin 4 mM NaB, 1,25 uM SAHA, 10 uM DHA tai yhdistelmä NaB /SAHA ja DHA: ta, 24 h. Elinvoimaisten solujen mitattiin MTT-määrityksellä. B. inhiboiva vaikutus HDACi ja DHA yhdessä maksan syöpäsolun kasvua vahvistettiin edelleen pesäkemuodostusta. Sata soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyille 7 d, ja sitten viljeltiin joko HDACi tai DHA vielä 7 d. Pesäkkeet värjättiin 0,05% kristalliviolettia. Pesäkkeitä kussakin kuopassa laskettiin ja tilastollinen analyysi suoritettiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. C. Vaikutus HDACi DHA: n indusoiman apoptoosin mitattiin TUNEL määrityksellä, käyttäen

in situ

solukuoleman havaitseminen kit. Hep G2-soluja käsiteltiin, kuten on kuvattu kohdassa A tehtiin TUNEL-määritystä. Apoptoottisia soluja havaittiin alle fluoresenssimikroskoopilla. D. vaikutus HDACi ja DHA: n yhdistelmän vahvistettiin lisäksi TUNEL-määrityksessä käyttämällä virtaussytometria. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen laskettiin. E. Kaspaasi 3 aktivaatio oli mukana HDACi-välitteistä apoptoosia soluissa käsiteltiin DHA. Aktiivisuus kaspaasi 3 käsitellyissä soluissa, kuten on kuvattu kohdassa A määritettiin ja asiaan muutos on esitetty. For A, B, D ja E, *

P

0,05, **

P

0,01, verrattuna DHA ryhmä.

Seuraavaksi määritetään pro-apoptoottista aktiivisuutta yhdistetyn hoidon DHA ja HDACi. DHA hoito voimakkaasti indusoi apoptoosin maksasyövän soluissa, mutta apoptoosia indusoitiin yhdistelmähoito sekä aineita, kuten on esitetty TUNEL määritykset osoittavat huomattava kasvu TUNEL-positiivisia soluja (kuvio. 3C). Tilastollisesti DHA yhdessä NaB tai SAHA kasvanut apoptoottisten solujen 1,9 tai 2,8 kertaiseksi Hep G2-soluissa, ja 3,0 tai 3,5 kertaiseksi PLC /PRF /5-soluissa (kuvio. 3D). Mukaisesti lisääntyneen apoptoosin, kaspaasi 3 aktiivisuus oli suurempi käsitellyissä soluissa sekä DHA ja HDACi (Fig. 3E).

Release sytokromi

c

solulimaan ja downregulation Mcl-1 ja p-ERK osaltaan aiheuttamaa apoptoosia yhdistetyn hoidon HDACi ja DHA

Olemme aiemmin osoittaneet, että DHA: n indusoiman apoptoosin liittyvät Mcl-1 hajoamista ja Bak aktivointi [18]. Me seuraavaksi tutkittava, onko Mcl-1 ja Bak olivat mukana HDACi välittämää rikastamista apoptoosin DHA-käsitellyissä soluissa. Kuten tuloksista western blot, Mcl-1 oli dramaattisesti vähentynyt, kun taas Bak oli merkittävästi lisääntynyt Hep G2 käsitellyissä soluissa sekä DHA ja NaB /SAHA. Korjauskierrosta Mcl-1 ja Bak PLC /PRF /5 solua jaettu samansuuntaisesti kanssa Hep G2-soluissa (kuvio. 4A). Lisäksi villityypin p53: Hep G2-soluja voimistunut, kun mutantti p53 PLC /PRF /5-soluja tuskin vaikuttaa, hoidon jälkeen (Fig. 4A).

Yhdistelmähoito, jossa HDACi ja DHA johtanut in downregulation MCL-1 ja säätelyä Bak. maksasyövän solut altistettiin 4 mM NaB, 1,25 uM SAHA, 10 uM DHA tai yhdistelmä NaB /SAHA ja DHA: ta, 24 h. Expression of Mcl-1, Bak ja halkaistut PARP tutkittiin western blot. Ylempi paneeli: edustava tulos näytetään. Pohjalevy: suhteellinen ilmentyminen Mcl-1 ja Bak normalisoidaan Actin oli merkitty histogrammin. B. ilmentyminen p-ERK väheni käsitellyissä soluissa HDACi ja DHA: ta. Proteiinit kerätään maksasyövän käsiteltyjen solujen SAHA, DHA tai yhdessä lääkkeiden alistettiin western blot tutkia p-ERK ilme. Ylempi paneeli: edustava tulos esiteltiin. Pohjalevy: suhteellinen ilmentyminen p-ERK /ERK näytettiin. C. vähentäminen mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) aiheutettiin HDACi /DHA-käsitellyt solut. Hep G2 ja PLC /PRF /5-solut käsiteltiin kuten on kuvattu A. MMP romahdus (Δψ

ml) mitattiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen solut DioC6 ja määrällisen analyysin Δψ

m näytettiin. Edustamat tiedot keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. D. Sytokromi

c

julkaistiin sytosoliin käsitellyissä soluissa. Solut käsiteltiin, kuten on kuvattu julkaisussa A. Fraktiot sytosolia eristettiin tutkia jakelua sytokromi

c

. p-Actin käytettiin merkkiaineena sytosoliin. E. HDACi esikäsittely herkistyneet solut DHA: n indusoiman apoptoosin. maksasyövän solut esikäsiteltiin 4 mM NaB tai 1,25 uM SAHA 2 h käsiteltiin edelleen 10 uM DHA vielä 24 tuntia. TUNEL-kokeet suoritettiin sen määrittämiseksi apoptoosin. Prosenttiosuus TUNEL-positiivisten solujen osoitettiin. B, C ja E, *

P

0,05, verrattuna DHA ryhmä.

Kun otetaan huomioon uusien tietojen ERK fosforylaatio estyi DHA-käsiteltyjen ja HDACi- käsitellyt solut. Olemme ensi tutkinut taso fosforyloidun ERK. Tulokset osoittivat nopeaa laskua p-ERK maksan syöpäsoluja käsitellään sekä DHA: ta ja SAHA, erityisesti PLC /PRF /5-soluissa (kuvio. 4B).

Koska DHA: n indusoiman apoptoosin johtuvan Depolarisaatio mitokondrion ulkokalvon [18], tutkimme seuraavaksi vähentäminen mitokondrion kalvon potentiaali (MMP). Tulokset osoittivat, että yhdistetty hoito merkittävästi alensi mitokondrion transmembraanisen potentiaalin (Fig. 4C), jota seuraa ilmeinen vapautuminen sytokromi

c

mitokondrioista sytoplasmaan (Fig. 4D).

Kuten on esitetty edellisessä tutkimuksessa, HDACi esikäsittely herkistyneet maksan syöpäsoluja etoposidiksi [22]. Me esikäsitelty solujen NaB tai SAHA, ja sitten arvioidaan tuloksena apoptoosin TUNEL määrityksiä. Verrattu unpretreated solujen prosenttiosuudet TUNEL-positiivisten solujen HDACi-esikäsitellyt solut huomattavasti (Fig. 4E).

SAHA parannettu antituumorivaikutus DHA Hep G2 ksenograftin kasvaimen hiirillä

on osoittanut kykyä SAHA parantaa DHA välittämä solukuolema

in vitro

, me edelleen määrittää synerginen vaikutus SAHA ja DHA

in vivo

. Hep G2-soluja ihon alle ruiskutetaan nude-hiiriin perustaa -tuumoriksenografti. Nudehiiriin tuumoriksenografteja annosteltiin DHA (5 mg /kg /Bid) ja /tai SAHA (1,5 mg /kg /Bid) päivittäin 24 päivän ajan. Hoito ei näytä olevan merkittävää vaikutusta kehon painoon hiirillä. Keskimäärin yhdistelmähoito esti maksasyövän kasvaimen kasvua yli 44,7%, kun taas yksittäisenä aineena käsittelemällä joko DHA tai SAHA vain esti tuumorin kasvua 17,6% ja 4,6%, vastaavasti (Fig. 5A). Päivänä 24 hiiret lopetettiin ja tuumorit punnittiin. Kuten odotettua, yhdistelmä HDACi ja DHA vähensi painot ksenografti kasvain, verrattuna vain DHA ryhmien (Fig. 5B). Nämä tiedot osoittivat, että yhdistelmähoito tuotti suuremman antiproliferatiivinen vaikutus ja sytotoksisuus kuin kumpikaan yksittäinen aine yksin maksasyövän ksenografteissa

in vivo

.

yhdistelmä SAHA ja DHA huomattavasti pysäytti kasvua Hep G2 ksenograftin kasvain. Nude hiiret inokuloitiin 1 x 10

7 Hep G2-soluja. Sen jälkeen, kun muodostunut kasvain oli palpoitavissa, hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään. DHA (5 mg /kg hiiren ruumiinpainoa) annettiin ”DHA” ryhmä, SAHA (1 mg /kg hiiren ruumiinpainoa) annettiin ”SAHA” ryhmä, yhdistelmä SAHA ja DHA annettiin ”DHA + SAHA ”ryhmä, kerran päivässä viitenä peräkkäisenä päivänä viikossa 24 d. Kasvainten tilavuuden laskettiin kahden päivän välein. Kuusi -ksenografteja suoritetaan kussakin ryhmässä. Tiedot ovat keskiarvo ± SD, *

P

0,05, verrattuna DMSO ryhmä. B. Yhdistelmä SAHA ja DHA hoitoja johti dramaattiseen laskuun kasvaimen painoa. Päivänä 24 hiiret lopetettiin ja tuumorit punnittiin. C. Apoptoosi indusoitiin

in vivo

. Kasvaimet leikattiin ja apoptoosi määritettiin käyttäen

in situ

solukuoleman havaitseminen pakki. Apoptoottisia soluja havaittiin alle fluoresenssimikroskoopilla. D. SAHA huomattavasti apoptoosin DHA-käsitellyissä hiirissä. Prosenttiosuudet apoptoottisia soluja mitattiin laskemalla vihreiden solujen viiteen satunnainen kentät.

Sen testaamiseksi, onko HDACi parannettu tappava vaikutus DHA kautta kasvaa apoptoosin, kasvaimen kudokset leikattiin ja alistettiin

in situ

solukuoleman tunnistus (Fig. 5C). Tulokset osoittivat, että osuutta apoptoottisten solujen kasvoi merkittävästi 8,6 ± 2,4% DHA ryhmässä 17,7 ± 3,3% yhdistetyn hoitoryhmässä (kuvio. 5D). Lisäksi tutkimme histologia kasvainten käsittelyn jälkeen käyttämällä H & E-värjäystä. Kasvaimet alkaen kontrolliryhmään osoitti tyypillistä histologinen ulkonäkö maksasyövän (Fig. 6). Osien DHA-käsitellyt tuumorit osoittivat, että syöpäsolut laskivat tuntuvasti, joilla on merkkejä apoptoosin, tulehdussolujen ja fibroosia. Yhdistetyssä hoidetussa ryhmässä, apoptoottiset alueet ja laaja nekroosia soluttautuminen fagosyyttisoluihin voitiin havaita varsin usein.

SAHA suurennetaan apoptoottinen alueella aiheuttamat DHA käsittely Hep G2 ksenograftin kasvain. Kasvaimet leikattiin irti ja alistettiin H & E-värjäystä määrittämiseksi patologisen arvioinnin. Toisaalta, kudokset -ksenografteja altistettiin immunokemian havaita ilmentymisen Ki-67, p53, Mcl-1, p-ERK, ja aktiivinen PARP. Alkuperäinen suurennos x 400.

Lisäksi, teimme immunohistokemia havaita proteiinit, jotka osallistuvat HDACi /DHA: n indusoiman apoptoosin (Fig. 6). Vähentynyt ilmentyminen Ki-67 osoitti vähentäminen soluproliferaation ja todennäköisesti parantaa solukuolemaa. Havaittavissa ero p53 ilmentymistä havaittiin. Silmiinpistävää kasvua aktiivisen PARP, sekä hallitseva lasku Mcl-1 ja p-ERK, oli läsnä HDACi /DHA-käsitelty ksenografti. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että HDACi pystyivät merkittävästi lisätä DHA kasvaimen vastaisen vaikutuksia.

Keskustelu

Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että HDACi lukien NaB ja SAHA vuorovaikutuksessa synergisesti sytostaattien, kuten fludarabiini ja etoposidi, lisäämään tuntuvasti mitokondrioiden vammoja ja apoptoosin leukemia- ja epiteelisyöpäsolujen [24], [25]. Antitumorigenic ominaisuudet HDACi ovat erityisen merkittäviä johtuen todennäköisesti siitä, että niiden sytotoksisia vaikutuksia ovat yleensä spesifisiä syöpäsoluja, mutta ei normaaleihin soluihin. Kuitenkin, kun käytetään ainoana lääkkeenä, HDACi saattaa esiintyä rajoitettu tappava aktiivisuus maksasyövän, mikä näkyy tässä tutkimuksessa osoittavat, että molemmat NaB ja SAHA pieninä annoksina voi aiheuttaa merkittävää kasvun estäminen

in vitro

ja

in vivo

. Kuitenkin, kun HDACi käytetään yhdessä DHA, johdannainen artemisiniinin, joka on kliinisesti käytetty malarian hoitoon hyvän toksisuusprofiili [26], ne voivat aiheuttaa paljon enemmän apoptoosia, jolloin merkittävä pysähtyminen -tuumoriksenografti nude-hiirissä. On hyvin vähän tietoa HDACi yhdessä muiden syöpälääkkeitä vastaan ​​maksasyöpä. Meidän tiedot ensimmäisen kerran ovat osoittaneet synergistisen vaikutuksen DHA: n ja HDACi estoon maksasyövän.

Monet raportit ovat osoittaneet, että kynnys apoptoosin syöpäsoluissa voidaan ohjata toimintaa useiden signaalitransduktioreaktioteiden , joista yksi on Raf-MEK1 /2-ERK1 /2-reitin [27], [28]. Tämä polku on usein väärin säädellystä neoplastisissa muutos yhdessä c-Jun-NH2-pään kinaasin (JNK1 /2) ja p38 MAPK reittejä [29]. Se on myös liitetty että aktivoituminen ERK1 /2-reitin liittyy yleensä selviytymisen mutta JNK1 /2 ja p38 MAPK-reitin kanssa apoptoosin [30]. Tutkimuksessamme ERK1 /2 fosforylaatio oli hieman inhiboitui DHA hoitoa, mutta voimakkaasti inhiboi yhdistelmähoito DHA ja HDACi. Lisäksi, käyttämällä ERK-spesifisen inhibiittorin PD98059, olemme osoittaneet, että aktivointi ERK on antiapoptoottisten koska ERK-inhibiittoria parannettu DHA: n indusoiman apoptoosin maksan syöpäsoluja.

Useat antiapoptoottisten efektoriproteiinien on tunnistettu alavirtaan ERK1 /2 signaloinnin, mukaan lukien Bcl-xL: n ja Mcl-1 [31], [32]. Muutokset sekä fosforyloidun ERK ja Mcl-1 esiintyy usein samaan suuntaan. Yuen et ai. ilmoitti, että hiljentäminen Ran voi johtaa deaktivoinnin ERK ja downregulation Mcl-1 syöpäsoluissa [33]. Reeves et ai. osoitti, että aktivointi ERK ja induktio Mcl-1 havaittiin myeloidisoluissa tartunnan ihmisen sytomegaloviruksen [34]. Calvino et al. raportoitu treatement kanssa lonidamiini plus arseenitrioksidiannostus aiheutti vähennyksiä Mcl-1 ja p-ERK [35].