Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haimasyöpä on erittäin pahanlaatuinen sairaus äärimmäisen huonoon ennusteeseen. Histonideasetylaasi- inhibiittorit (HDACIs) ovat osoittaneet lupaavia antituumoriaktiivisuuksia vastaan ​​prekliinisissä, haimasyöpä, joko yksin tai yhdessä kemoterapeuttisten aineiden kanssa. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet tunnistamaan kliinisesti merkittäviä histonideasetylaaseja (HDAC: t), jotka ohjaavat valintaa HDAC-estäjien (HDACIs) räätälöity hoitoon haimasyövän.

Menetelmät

HDAC ilmaisun seitsemässä haimasyövän solulinjoissa ja normaaleihin ihmisen haimatiehyen epiteelisolujen määritettiin Western-blottauksella. Kasvaintenvastainen vuorovaikutukset luokka I- ja luokka II-selektiiviset HDACIs määritettiin MTT määrityksiä ja tavallinen isobologram- /CompuSyn ohjelmisto analysoi. Vaikutukset HDACIs solukuolemaan, apoptoosin ja solusyklin etenemisen, ja histoni H4, alfa-tubuliinin, p21, ja γH2AX tasot määritettiin pesäkemuodostusta määrityksissä, virtaussytometria-analyysi, ja Western-blottaus, vastaavasti.

tulokset

suurin osa luokkien I ja II HDAC: t havaittiin haimasyövän solulinjoissa, vaikkakin vaihtelevia määriä. Hoidot kanssa MGCD0103 (luokan I-selektiivinen HDACI) aiheutti annoksesta riippuvaa kasvun pysähtymisen, solukuolema /apoptoosin, ja solusyklin pysähtymisen G2 /M vaiheessa mukana induktio p21 ja DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t). Sen sijaan MC1568 (luokka II-selektiivinen HDACI) tai Tubastatin A (a HDAC6-estäjä) oli minimaaliset vaikutukset. Kun yhdistetään samanaikaisesti, MC1568 merkittävästi parannettu MGCD0103 aiheuttama kasvun pysähtymisen, solukuolema /apoptoosin, ja G2 /M solusyklin pysähtymiseen, kun taas Tubastatin ainoastaan ​​A synergistisesti MGCD0103 aiheuttama kasvun pysähtymistä. Vaikka MC1568 tai Tubastatin yksinään ei ollut selvää vaikutusta DNA DSB: t ja p21 ilmaus, niiden yhdistäminen MGCD0103 johti osuuskunta induktio p21 soluissa.

Johtopäätös

Tuloksemme viittaavat siihen, että I- ja II HDAC: t ovat potentiaalisia terapeuttisten kohteiden hoitoon haimasyöpä. Niinpä hoitoon haimasyövän kanssa yleiseurooppalaisen HDACIs voi olla enemmän hyötyä kuin luokkahuo- tai isoformi-selektiivisiä.

Citation: Wang G, hän J, Zhao J, Yun W, Xie C, Taub JW, et al . (2012) luokan I ja luokan II Histonideasetylaasit ovat mahdollisia terapeuttisia kohteita hoitoon Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (12): e52095. doi: 10,1371 /journal.pone.0052095

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 09 marraskuu 2012; Julkaistu: 14 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Jilin University, Changchun, Kiina, National Natural Science Foundation of China (nro 31071105), ja osittain käynnistysvaiheessa Fund päässä Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit , MI. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on erittäin pahanlaatuinen sairaus, jossa on tasaisesti lisääntyvä. Huolimatta neljänneksi yleisin kuolinsyy syöpään Yhdysvalloissa, pieni parannus ennusteen on tehty viimeisen 20 vuoden aikana [1] – [3]. Viivästymisen vuoksi kliininen diagnoosi, haimasyöpä on usein havaitaan pitkälle ja ennuste on erittäin huono, joiden selviytyminen 4-6 kuukautta [2]. Gemsitabiini (2 ’, 2’-difluorodeoxycytidine, dFdC) on standardi ensilinjan lääke hoitoon potilaille, joilla on edennyt haimasyöpä [4]. Kuitenkin mediaanielossaolosta 5,7 kuukautta ja 1-vuoden pysyvyys 18%, sen tehokkuus on edelleen alhainen [5], [6]. Siksi haimasyövän edelleen erittäin solunsalpaajaresistentti maligniteetti ja tarvitsee kiireellisesti uusia hoitomenetelmiä.

histonideasetylaaseja (HDAC: t) kriittisiä rooleja epigeneettisenä geenin ilmentymisen säätelyyn kataly- poistamalla asetyyliryhmiä, stimuloiva kromatiinin tiivistyminen ja edistämällä transkription tukahduttaminen [7], [8]. HDAC: t käsittävät suuren ryhmän proteiinien jaettu neljään luokkaan perustuen niiden homologiaa hiivan HDAC: t, niiden solunosasijainti ja entsyymiaktiivisuuksien [8] – [10]. Luokka I käsittää HDAC1, 2, 3 ja 8, jotka kaikki ovat homologeja hiivan rpd3 proteiinia. Ne ekspressoituvat ja sijaitsee pääasiallisesti tumassa [8] – [10]. Luokan II entsyymejä ovat HDAC4, 5, 6, 7, 9 ja 10, jotka ovat homologeja hiivan hda1 proteiinia. Nämä entsyymit yleensä näytteille kudosspesifisiä ilmaisun ja shuttle välillä sytoplasmassa ja tumassa vastauksena solujen signaalien [8], [11]. Koska HDAC 6 ja 10 sisältävät kaksi katalyyttinen sivustoja, nämä entsyymit ovat joskus lisäksi nimetty erillinen alaluokka (luokka II b) peräisin HDAC 4, 5, 7 ja 9 (luokka II) [8], [12]. Luokka III käsittää seitsemän sirtuins, SIRT1-7, homologeja hiivan SIR2 proteiini [8], [13]. HDAC11 sisältää konservoituneita tähteitä, jotka ovat yhteisiä sekä luokan I ja luokan II entsyymien ja joka edustaa erillistä luokkaa HDAC (luokka IV) [8], [10], [14].

Aberrant epigeneettisellä muutokset ovat tunnusmerkki ihmisen syövissä [15]. Korkea HDAC1 ilmaisun on todettu korreloivan pitkälle keuhko- ja haimasyövän [16] – [18]. Siten HDAC voi edustaa lupaavaa kohteita farmakologisen väliintulon syövän. Lukuisat pienimolekyylisiä HDACIs on kehitetty viime vuosikymmenen aikana [19], [20], jotka ovat osoittaneet lupaavia antituumoriaktiivisuuksia vastaan ​​prekliinisissä, haimasyöpä, joko yksin tai yhdessä kemoterapeuttisten tai kohdennettuja aineet [16], [21] – [24]. Kuitenkin kliinisesti merkittäviä HDAC isomuotojen haimasyövän ei ole täysin määritetty. Knockout ja siRNA knockdown kokeet ovat osoittaneet, että luokan I HDAC ovat välttämättömiä syövän solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen toisin kuin luokan II HDAC: t 4 ja 7 [25], [26]. Kuitenkin esto luokan IIb HDAC6 johtaa asetylaatio ja häiriöitä saattaja toiminta lämpöisku- 90 (Hsp90) leukemiasoluissa [27]. Vaikka jotkut HDACIs pidetään yleiseurooppalainen HDACIs (esim LBH-589, PXD-101, ja SAHA), tuore tutkimus osoitti, että luokan II a entsyymejä ei kohdistettu kaikkein HDACIs (esim FK-228, LBH-589 , MGCD0103, MS-275, PXD-101, ja SAHA) farmakologisesti merkittävinä pitoisuuksina [28]. Siten vaikka on yhä selvempää, että luokan I HDAC-entsyymejä ovat kliinisesti merkityksellisiä syöpään [25], [26], tämä on vähemmän määritettyihin luokan II entsyymien erityisesti ajatellen luokan I HDAC: ien.

tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus luokkien I ja II HDAC: t seitsemässä haimasyövän solulinjoissa ja ihmisen haimatiehyen epiteelisolujen ja määritettiin niiden terapeuttista roolit haimasyöpäsoluissa käyttämällä luokka-, subclass- ja isoentsyymiselektiivisiä HDACIs. Tuloksemme osoittavat ensimmäistä kertaa,

in vitro

synergistisiä antituumorivaikutuksen vuorovaikutukset luokka I ja luokka II HDACIs haiman syöpäsoluissa, mutta ei normaaleissa ihmisen haimatiehyen epiteelisolujen. Vaikka tarvitaan seurantatutkimuksia in

in vivo

malleja, tulokset viittaavat siihen, että sekä luokan I ja luokan II HDAC: t ovat potentiaalisia terapeuttisten kohteiden hoitoon haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

HDACIs

uuden luokan I-selektiivinen HDACI MGCD0103 (Mocetinostat) [29], ja luokan II a-selektiivinen HDACI MC1568 [30] – [32] hankittiin Selleck Chemicals LLC ( Houston, TX). Romaani HDAC6-estäjä Tubastatin [33] ostettiin BioVision Inc. (Mountain View, CA). Kaikki HDACIs liuotettiin DMSO: hon ja säilytettiin -80 ° C: ssa, suosittelema toimittajilta.

Cell Culture

LVI, MiaPaca-2, BxPC-3, PANC-1 ( johdetut kasvaimen [34]), AsPC-1, CFPAC-1, ja Capan-1 (johdettu etäpesäke [34]) ihmisen haimasyövän solulinjoissa ostettiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Normaali ihmisen haiman ductal epiteelin (HDPE) solut saatiin M. D. Anderson Cancer Center. Solulinjoja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) tai RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), jossa oli 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone Labs, Logan, UT) ja 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug: /ml streptomysiiniä 37 ° C kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2/95,% ilmaa.

in vitro

sytotoksisuusmääritykset

in vitro

HDACI cytotoxicities haimasyövän solulinjoissa ja HDPE solut mitattiin käyttäen MTT (3- [4,5-dimetyyli-tiatsol-2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi-bromidi, Sigma Aldrich, St Louis , MO) reagenssin, kuten aiemmin on kuvattu [35], [36]. Lyhyesti, AsPC-1, BxPC-3, PANC-1 (yleisesti käytetty solulinja malleja haimasyövän tutkimus), tai HDPE-soluja viljeltiin 100 ul: ssa DMEM /10% FBS: ää 96-kuoppaisilla levyillä. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5 eri pitoisuuksina ja MGCD0103 (0-4 uM), MC1568 (0-10 uM), tai Tubastatin A (0-8 uM). Jälkeen 96 h, MTT lisättiin lopulliseen konsentraatioon 1 mM. 4,5 tunnin kuluttua, formatsaanikiteet liuotettiin lisäämällä 100 ui 10% SDS: ää 10 mM HCl: a. Optiset tiheydet mitattiin näkyvän mikrolevylukijalla 590 nm: ssä. IC

50-arvot laskettiin lääkkeen pitoisuudet, joka tarvitaan estämään 50%: n kasvu verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin. Tiedot solulinjoja esitetään keskiarvoina ± keskivirhe vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Laajuus ja suunta MGCD0103 ja MC1568 tai Tubastatin antituumorivaikutuksen vuorovaikutukset arvioitiin standardin isobologram- analyysi aikaisemmin kuvatulla [35], [37], [38], ja käyttämällä CompuSyn ohjelmistoa (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ) . Lyhyesti, lääkeyhteisvaikutukset kvantitoitiin määrittämällä yhdistelmä indeksi (CI), jossa CI 1, CI = 1, ja CI 1 osoittavat synergistisiä, lisäaine, ja antagonistisia vaikutuksia, vastaavasti. Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskivirhe vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen.

Colony Formation määritykset

Yksi päivä ennen HDACI hoitoja, 300 PANC-1 tai 500 BxPC-3-solut ympättiin osaksi 100 mm ruokia täydellinen DMEM tai RPMI160. Solut käsiteltiin sitten eri pitoisuuksina ja MGCD0103 (0-1,0 uM), MC1568 (0-10 uM), Tubastatin A (0-4 uM), MGCD0103 plus MC1568 (0,5 uM +5 uM), tai MGCD0103 plus Tubastatin (0,5pM +2 uM) 96 tuntia. Sitten solut pestiin kahdesti huumeettomia DMEM tai RPMI1640 ja viljellään täydellisessä DMEM tai RPMI1640 jopa 3 viikkoa. Pesäkkeet tehtiin näkyviksi Coomassie-sinivärjäyksellä ja laskettiin. Tulokset esitetään keskiarvona prosenttiosuudet ± keskivirhe verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Laajuus ja suunta antitumor vuorovaikutukset MGCD0103 ja MC1568 tai Tubastatin ia oli määritetty käyttämällä CompuSyn ohjelmistoa (ComboSyn, Inc.).

shRNA knockdovvn HDAC: ien in PANC-1-soluissa

HDAC4 ja HDAC6 shRNA lentivirus kloonia hankittiin RNAi Consortium (Sigma-Aldrich) ja käytettiin infektoimaan PANC-1-soluja. Kun valinta on puromysiini, uima-allas infektoitujen solujen laajennettiin ja testattiin HDAC4 tai HDAC6 ilmentymisen Western-blottauksella (nimetty HDAC4- tai HDAC6-shRNA solut). Pooli solujen negatiivisena kontrollina transduktio käytettiin negatiivisena kontrollina (nimetty NTC-shRNA solut).

Western blot -analyysi

Liukoiset proteiinit uutettiin HPAC, MiaPaca-2, BxPC -3, PANC-1, AsPC-1, CFPAC-1, Capan-1, tai HDPE-solut, käsittelemätön tai käsitelty HDACIs 96 tuntia, ja sille suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi. Erotetut proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Thermo Fisher Inc., Rockford, IL) ja immunoblotattiin anti-HDAC1 (# 2062), -HDAC2 (# 2540), -HDAC3 (# 2632), -HDAC4 ( # 2072), -HDAC5 (# 2082), -HDAC7 (# 2882), -p21 (# 2947S), -γH2AX (# 2577S), (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), -HDAC6 (sc-11420, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), -HDAC8 (H6412), -HDAC10 (H3412), asetyyli (ac) tubuliinin (T7451) (Sigma, Saint Louis, MO), -HDAC9 (SH030228P, ABGENT, San Diego, CA), -ac-histoni H4, -histone H4, tai beeta-aktiini-vasta-ainetta (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), kuten aiemmin on kuvattu [39], [40]. Immunoreaktiivisia proteiineja ei havaittu Lumi-Light Western blotting substraattia (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), kuten valmistaja on kuvannut.

arviointi perus- ja HDACI indusoiman apoptoosin

BxPC-3 tai PANC-1-soluja käsiteltiin MGCD0103 (0,5 uM), MC1568 (5 uM), Tubastatin A (2 uM), MGCD0103 plus MC1568 (0,5 uM +5 uM), tai MGCD0103 plus Tubastatin A (0,5 uM +2 uM) ja 96 h. Sitten solut kerättiin ja voimakkaasti pipetoitiin, ja näytteitä otettiin määrittämiseksi lähtötilanteessa ja HDACI indusoiman apoptoosin avulla Apoptosis anneksiini V-FITC /propidiumjodidia (PI) kit (Beckman Coulter, Brea, CA) ja FACS Calibur virtaussytometrillä ( Becton Dickinson, San Jose, CA), kuten aiemmin on kuvattu [35], [36], [41]. Apoptoottiset tapahtumaa tallennettiin yhdistelmänä anneksiini V

+ /PI

– (varhainen apoptoottinen) ja anneksiini V

+ /PI

+ (myöhäinen apoptoottiset /kuolleet) tapahtumia. Koe toistettiin kolme kertaa, ja tulokset esitetään keskiarvona prosentit ± keskivirheet anneksiini V

+ soluja kolmen rinnakkaisen kokeen yhdestä edustavasta kokeesta.

Effects of HDACIs solusyklin etenemistä in haimasyöpäsoluissa

BxPC-3 tai PANC-1-soluja käsiteltiin MGCD0103 (0,5 uM), MC1568 (5 uM), Tubastatin A (2 uM), MGCD0103 plus MC1568 (0,5 uM +5 uM), tai MGCD0103 plus Tubastatin (0,5 uM +2 uM) 96 tuntia kerättiin ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% (v /v) etanolia 24 tunnin ajan. Kun oli sentrifugoitu 200 x g 5 minuuttia, solupelletit pestiin PBS: llä (pH 7,4) ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi PI: (50 ug /ml), Triton X-100 (0,1%, v /v), ja DNase- RNaasia (1 ug /ml). DNA sisältö määritettiin virtaussytometrialla (FACS Calibur). Solusyklianalyysiä suoritettiin ModFit

LT

TM3.0 DNA-analyysi ohjelmisto (Becton Dickinson).

Tilastollinen analyysi

erot MGCD0103 IC

50s välillä MC1568 tai Tubastatin käsitelty ja käsittelemättömän BxPC-3 tai PANC-1-soluja ja erot solukuolemaan /apoptoosi MGCD0103 ja MC1568 tai Tubastatin käsitelty (yksittäin tai yhdistetty) ja käsittelemättömien solujen verrattiin käyttäen parillista t-testiä. Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism 4.0.

Tulokset

HDAC Expression ja HDACI herkkyyttä in Haimasyöpä Solulinjat ja HDPE Solut

luokka III HDAC (Sirts 1- 7) ei ole kohdistettu perinteisiä HDACIs [20] ja eivät olleet mukana tässä tutkimuksessa. Expression Luokkien I ja II HDAC: t määritettiin Western blotting in LVI, MiaPaca-2, BxPC-3, PANC-1, AsPC-1, CFPAC-1, Capan-1, ja normaali HDPE solulinjassa. Luokan I HDAC: t (1, 2, 3, ja 8) havaittiin kaikissa solulinjoissa, vaikka tasot olivat vaihtelevia. Yleensä tasoja luokan I HDAC-entsyymien, että HDPE-solut suhteellisen alhainen verrattuna suurin osa haimasyövän solulinjoissa. Mielenkiintoista on, että suurin osa luokan II HDAC: ien (paitsi HDAC5) havaittiin lähes kaikissa haimasyövän solulinjoissa, mutta ei HDPE-soluissa. Sen sijaan, HDAC 6 ja 10 havaittiin kaikissa solulinjoissa ja niiden tasot HDPE solut olivat vertailukelpoisia (jos ei ole suurempi), jotka on syöpäsolulinjoissa (kuvio 1). Voit selvittää niiden roolia HDAC: t haiman syöpäsolujen kasvua ja selviytymistä, käytimme kolmea eri HDACIs, MGCD0103 (Mocetinostat, luokka I-selektiivinen HDACI) [29], MC1568 (luokka II-selektiivinen HDACI) [30] – [ ,,,0],32], ja Tubastatin A (uusi HDAC6-spesifinen estäjä) [33]. Hoidot PANC-1-solujen kanssa eri pitoisuuksina ja MGCD0103 (0-1,0 uM) aiheutti annoksesta riippuvan hyperasetylaation histoni H4, mutta sillä ei ole vaikutusta alfa-tubuliinin (a HDAC6 substraatti) asetylaatio tai kokonaan H4 tasot (kuvio 2A) . Hoitoja MC1568 johti myös asetylaatio histoni H4 (ilmeinen 5 ja 10 uM), mutta paljon vähäisemmässä määrin kuin MGCD0103, ja tasot asetyloitua histoni H4 tasaantui 5 ja 10 uM. Edelleen, nämä hoidot ollut vaikutusta alfa-tubuliinin asetylointi (kuvio 2B). Toisin kuin kaksi muuta HDACIs, Tubastatin hoitoja (0-4 uM) aiheutti annoksesta riippuvaa hyperasetylaation alfa-tubuliinin, joka tasaantui 2 ja 4 uM. Kuitenkin, nämä hoidot ei ollut vaikutusta asetylointi histoni H4 (kuvio 2C). Nämä tulokset vahvisti HDACI ominaisuuksia näiden tekijöiden ja osittain tukivat substraattispesifisyydet.

Proteiiniekstraktit log-vaiheen AsPC-1, BxPC-3, PANC-1, LVI, MiaPaca-2, CFPAC-1, Capan -1, ja HDPE solut altistettiin Western-blotit tutkittiin anti-HDAC tai -β-aktiini-vasta-aine, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Luokan I HDAC: t (1, 2, 3, ja 8) havaittiin kaikissa solulinjoissa, vaikka tasot olivat vaihtelevia. Yleensä tasoja luokan I HDAC-entsyymien, että HDPE-solut suhteellisen alhainen verrattuna suurin osa haimasyövän solulinjoissa. Mielenkiintoista on, että suurin osa luokan II HDAC: ien (paitsi HDAC5) havaittiin lähes kaikissa haimasyövän solulinjoissa, mutta ei HDPE-soluissa. Sen sijaan, HDAC 6 ja 10 havaittiin kaikissa solulinjoissa ja niiden tasot HDPE solut olivat vertailukelpoisia (jos ei ole suurempi), jotka on syöpäsolulinjoissa.

Paneelit A-C: PANC-1-solut kerättiin ja lyysattiin inkuboinnin jälkeen eri konsentraatioiden MGCD0103 (0-1,0 uM), MC1568 (0-10 uM), tai Tubastatin A (0-4 uM) 96 tuntia. Liukoiset proteiinit analysoitiin Western blot koetettiin anti-asetyloitu (ac) -H4, -H4, -ac-tubuliinia tai -β-aktiini vasta-aine. Paneeli D: AsPC-1, BxPC-3, PANC-1, tai HDPE-soluja viljeltiin 37 ° C: ssa 96 h täydellisessä väliaineessa 96-kuoppalevyillä, joilla on erilaisia ​​pitoisuuksia MGCD0103, MC1568, tai Tubastatin , ja elinvoimaisten solujen määritettiin käyttämällä MTT-reagenssilla, ja näkyvän valon mikrolevylukijalla. IC

50-arvot laskettiin pitoisuudet lääkkeen, joka tarvitaan estämään 50%: n kasvu verrattuna kontrollisoluihin viljeltiin ilman lääkkeen. Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskivirhe vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. MG, MGCD0103; MC, MC1568; TA, Tubastatin A. Sama lyhenteitä käytetään läpi koko tutkimuksen, ellei toisin mainita.

Hoidot PANC-1-solujen kanssa eri pitoisuuksina ja MGCD0103 (0-4 uM) aiheutti annoksesta riippuvaa kasvun pysähtymistä määritettynä MTT määrityksissä (tuloksia ei ole esitetty), jossa on IC

50 2,0 uM (kuvio 2D). Sen sijaan, hoidot solut MC1568 (0-10 uM) tai Tubastatin A (0-8 uM) johti rajoitettu solujen kasvun esto (erityisesti pienemmillä annoksilla, tuloksia ei ole esitetty), jossa on

arvioitiin

IC

50 29,7 uM ja 11,5 uM (kuvio 2D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin AsPC-1 ja BxPC-3-soluja (kuvio 2D). Yllättäen HDPE solut vastasivat MGCD0103 sekä haimasyövän solulinjoissa (kuvio 2D). Vaikka hoidot Tubastatin A (0-4 uM) aiheutti myös rajoitettu, solun kasvu estyy, että HDPE-solujen (joiden arvioitu IC

50 11,5 uM), hoitoja MC1568 (0-10 uM) ei osoittanut vaikutuksia kaikki (tuloksia ei ole esitetty ja kuvio 2D).

Nämä havainnot viittaavat siihen, että luokan I HDAC kriittisiä rooleja haiman syöpäsolujen kasvua, kun taas luokan II HDAC: t itse pelata vähän rooleja tätä näkökohtaa. On kuitenkin mahdollista, että samanaikainen kohdentaminen luokan I ja luokan II HDAC: t voivat aiheuttaa synergistisiä kasvun pysähtymisen haiman syöpäsoluja.

Tehostemateriaalit Kasvaintenvastainen vuorovaikutukset luokan I ja luokan II-Selective HDACIs in haimasyöpäsoluissa

tämän mahdollisuuden testaamiseksi, PANC-1-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksina ja MGCD0103, MC1568, tai Tubastatin A, joko yksinään tai yhdessä 96 tuntia. Solun kasvu estyy näiden hoitojen mitattiin MTT-määrityksissä. Kun annettiin samanaikaisesti, MC1568 tai Tubastatin Merkittävästi parannettu MGCD0103 aiheuttama kasvun pysähtymisen (kuten heijastuu laski IC

50s) solujen (kuviot 3A B). Yhdistetyt vaikutukset MGCD0103 kanssa MC1568 tai Tubastatin A solujen kasvun pysähtymisen olivat selvästi synergistinen, määritettynä standardin isobologram- analyysit (kuviot 3C 1, osoittaa synergismiä, laskettiin kunkin lääkkeen yhdistelmien (tuloksia ei ole esitetty). Lähes identtiset tulokset saatiin BxPC-3-solut (kuviot 3A, B, E, ja F). Antamaan suoraa näyttöä siitä, että kohdistuksen luokan II HDAC: t voivat parantaa antituumorivaikutuksen MGCD0103 haiman syöpäsoluissa, shRNA pudotus stabiileja klooneja HDAC4 (nimetty HDAC4-shRNA solut), HDAC6 (nimetty HDAC6-shRNA solut), ja negatiivinen kontrolli (nimetty NTC-shRNA solut) kertyi PANC-1-soluissa (kuvio 3G). Mielenkiintoista, HDAC4-shRNA ja HDAC6-shRNA solut osoittivat merkitsevästi herkemmäksi MGCD0103 verrattuna NTC-shRNA soluja (MGCD0103 IC

50s olivat 2,60, 1,06 ja 0,83 uM NTC-, HDAC4- ja HDAC6-shRNA solut, vastaavasti; p 0,005) (kuvio 3H). Suuressa ristiriidassa, yhdistetty käsittely HDPE solujen MC1568 ja MGCD0103 johti hieman vähentynyt MGCD0103 herkkyys (kuvio 4A). Standard isobologram- ja CompuSyn analyysiä ei voitu suorittaa, koska puute vastaus on HDPE solujen MC1568. Vaikka yhteiskäsittely ja HDPE solujen Tubastatin A ja MGCD0103 aiheutti myös hieman lisääntynyt herkkyys MGCD0103 (kuvio 4B), vuorovaikutusta kahden aineen oli paras lisäaineen määritettynä standardin isobologrammia analyysin (kuvio 4C).

paneelit A ja B: MGCD0103 IC

50s BxPC-3 tai PANC-1-solut määritettiin puuttuessa tai läsnä MC1568 (paneeli A) tai Tubastatin A (paneeli B), joita hoidettiin samanaikaisesti. * Osoittaa p 0,05, kun taas ** osoittaa p 0,005. Paneelit C-F: Standard isobologrammia analyysi inhibition PANC-1 (paneelit C F) solujen kasvua MGCD0103 ja MC1568 (paneelit C F ). IC

50-arvot kunkin lääkkeen piirretään akselit; kiinteä viiva edustaa additiivinen vaikutus, kun taas kohdat edustavat pitoisuuksia kunkin lääkkeen tuloksena 50% kasvun estoa. Pisteet alittaa linjan osoittavat synergian lääkeyhdistelmää taas viivan yläpuolella osoittavat antagonismia. Paneelit G ja H: shRNA vakaa klooneja negatiivinen kontrolli (NTC), HDAC4, ja HDAC6 syntyi PANC-1-soluissa. Ekspressiotasot HDAC4, HDAC6, ac-H4 ja ac-alfa-tubuliinin määritettiin western blotit (paneeli G). Herkkyys MGCD0103 näiden shRNA stabiilien kloonien määritettiin MTT-määrityksissä. ** Osoittaa p 0,005.

paneelit A ja B: MGCD0103 IC

50s HDPE soluja määritettiin puuttuessa tai läsnä MC1568 (paneeli A) tai Tubastatin A (paneeli B) käsitellään samanaikaisesti. Paneeli C: Standard isobologrammia analyysi inhibition HDPE solukasvun MGCD0103 ja Tubastatin A. IC

50-arvot kunkin lääkkeen piirretään akselit; kiinteä viiva edustaa additiivinen vaikutus, kun taas kohdat edustavat pitoisuuksia kunkin lääkkeen tuloksena 50% kasvun estoa. Pisteet alittaa linjan osoittavat synergian lääkeyhdistelmää taas viivan yläpuolella osoittavat antagonismia.

Toimia Sitten sitoutuneet onko luokka I- ja luokka II-selektiiviset HDACIs synergize aiheuttamisessa haimasyövän solukuoleman by pesäkemuodostusta määrityksiä. Hoidot PANC-1 tai BxPC-3-solujen kanssa eri pitoisuuksina ja MGCD0103 96 tuntia aiheutti annoksesta riippuvaa solukuoleman induktioon, kuten heijastuu laski pesäkkeiden lukumäärät käsittelemättömään kontrolliin verrattuna soluihin (kuviot 5A B). Tämä oli suuressa ristiriidassa käsittelyt MC1568 tai Tubastatin A, joka tuotti hyvin vähän vaikutusta solun kuolemaan, etenkin pienemmillä pitoisuuksilla (kuviot 5A B). Mielenkiintoista on, että kun sitä annetaan samanaikaisesti, MC1568 tai Tubastatin merkitsevästi parantaa MGCD0103 solukuolema, mikä heijastuu edelleen vähentynyt pesäkkeiden lukumäärät verrattuna peräisin MGCD0103 hoito yksinään (kuviot 5C 0,05, kun taas ** osoittaa p 0,005.

Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että luokan I HDAC pelata keskeisiä rooleja haiman syöpäsolujen kasvua ja selviytymistä. Vaikka luokan II HDAC: t itse pelata hyvin vähän tehtävissä, ne tekevät yhteistyötä luokan I HDAC parantaa luokan I HDAC välittämä haimasyövän solujen kasvua ja selviytymistä.

Effects of Class I- ja II-Selective HDACIs on Apoptosis ja solusyklin etenemisen in haimasyöpäsoluissa

Ennen määrittämään mekanismeja, joilla MGCD0103 ja MC1568 tai Tubastatin synergize aiheuttamisessa haimasyövän solujen kasvun pysähtymisen ja kuoleman, me seuraavaksi tutkinut, mitä vaikutuksia kolmen HDACIs apoptoosiin ja solusyklin jakautumisen PANC-1 ja BxPC-3-soluissa. Hoidot of PANC-1 tai BxPC-3-solujen MGCD0103 (0,5 uM) aiheutti apoptoosin ja solukierron pysähtymisen G2 /M vaiheessa. Sen sijaan, hoitoja MC1568 (5 uM) tai Tubastatin A (2 uM) ei ollut mitään selvää vaikutusta joko apoptoosia tai solusykliä näissä soluissa (kuviot 6A-D). Kun yhdistetään samanaikaisesti, MC1568 mutta ei Tubastatin A, merkittävästi parannettu MGCD0103-indusoitua apoptoosia ja G2 /M-pysähtymisen PANC-1 tai BxPC-3-solut (kuviot 6A-D).

PANC-1 (paneelit A ja B) tai BxPC-3 (paneelit C ja D) soluja käsiteltiin MGCD0103, MC1568, tai Tubastatin A, joko yksinään tai yhdessä 96 tuntia. Solut kerättiin ja alistettiin virtaussytometria-analyysi mitata sekä perustason ja HDACI-indusoitua apoptoosia (paneelit A ja C), ja solusyklin jakautuminen (paneelit B ja D). Kokeet toistettiin kolme kertaa, ja tulokset on esitetty keskiarvoina ± keskivirheet kolmen rinnakkaisen kokeen yhdestä edustavasta kokeesta. ** Osoittaa p 0,005. Paneelit E ja F: Effects of luokka I- ja luokka II-selektiiviset HDACIs on p21 ilmaisun ja DNA DSB: t in BxPC-3 ja PANC-1-soluissa. PANC-1 (paneeli E) tai BxPC-3 (paneeli F) soluja käsiteltiin MGCD0103, MC1568, tai Tubastatin A, joko yksinään tai yhdessä 96 tuntia. Solut kerättiin ja liukoiset proteiinit uutetaan ja altistetaan Western blotting mitata p21 ja γH2AX tasolla. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus.

Nämä tulokset viittaavat siihen, että apoptoosin indusoimiseksi ja solusyklin pysähtymisen G2 /M-vaiheessa voi edustaa päämekanismia vastuussa solukuoleman ja kasvun pysähtymisen aiheuttamaa MGCD0103, tai MGCD0103 plus MC1568. Tuloksemme osoittavat myös, että luokan I HDAC kriittisiä rooleja haimasyövän apoptoosia ja G2 M vaiheeseen etenemistä ja vaikutuksia voidaan parantaa luokan IIa HDAC, mutta ei HDAC6.

Effects of Class I- ja luokka II-Selective HDACIs DNA Double-Strand tauot ja p21 ilmentäminen haimasyöpäsoluissa

Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että esto HDAC-entsyymeistä syöpäsoluissa aiheuttaa DNA-vaurioita, kuten DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t), jotka voi johtaa aktivoitumiseen solusyklin tarkastuspisteitä ja myöhemmät apoptoosin jos vahingoittunut DNA ei voida korjata [42] – [45]. Edelleen, HDACI aiheuttama proliferaatio pidätys on tiukasti sidoksissa induktion p21 [45]. Siten HDAC voi edistää haiman syöpäsolujen kasvua ja selviytymistä kautta säätelevät p21 ilmaisun ja DNA: n DSB korjaus. Mielenkiintoista, hoidot PANC-1 tai BxPC-3-solujen kanssa MGCD0103 tuottanut huomattavaa induktio p21 ja DNA DSB: iden, heijastuu induktion γH2AX, biomarkkeri DSB [46]. Sen sijaan hoitoja MC1568 tai Tubastatin ei havaittu vaikutusta DNA DSB: t tai induktion p21. Kun yhdistetään samanaikaisesti, sekä MC1568 ja Tubastatin yhteistoiminnallisesti (jos ei synergisesti) parannettu MGCD0103 indusoima p21 (kuviot 6E F). Nämä yhdistelmät eivät osoittaneet edelleen vaikutuksia tasoilla γH2AX verrattuna MGCD0103 hoito yksinään (kuviot 6 E F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että luokan II HDAC vaaditaan maksimaalista suppressio p21 ilmaisun välittyy pääasiassa luokittain I HDAC, ne ovat kuitenkin tarpeeton luokan I HDAC-välitteinen korjaus DNA DSB.

Keskustelu

HDACIs tarjoavat lupaavan uuden luokan syöpälääkkeiden [19], [20], [45], [47]. Paitsi Vorinostat ja Romidepsin jotka on hyväksynyt Yhdysvaltain Food and Drug Administration hoitoon ihon T-solu lymfooma, ainakin 11 muuta HDACIs parhaillaan kliininen arviointi hoitoon sekä kiinteitä kasvaimia ja hematologisia syöpiä [19]. Vaikka HDACIs ovat osoittaneet lupaavia antituumoriaktiivisuuksia kokeellisissa malleissa haimasyövän [16], [21] – [24], jää epäselväksi, mikä HDAC ovat asiaan terapeuttisia kohteita. Vastaus Tämän tärkeän kysymyksen olisi edellytyksenä valittaessa optimaalista HDACI hoitoon tämän erittäin aggressiivinen tauti.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli käsitellä edellä mainittuun kysymykseen. Ensin määritellään ilmaisun profiilit luokkien I ja II HDAC: t seitsemässä haimasyövän solulinjoissa ja normaalit HPDE soluissa. Sirts 1-7 (luokka III HDAC) on suljettava pois, koska perinteinen HDACIs eivät estä tätä luokkaa HDAC-entsyymeistä.