Krooninen sairaus

tiivistelmä

Paras tapa lisätä potilaiden eloonjäämisaste on tunnistaa potilaat, jotka ovat todennäköisesti edetä lihas- invasiivisia tai etäpesäkkeitä etukäteen ja hoitamiseksi aggressiivisemmin. Ihmisen solulinjoja HCV29 (normaali virtsarakon epiteelissä), KK47 (huono laatu nonmuscle invasiivinen virtsarakon syövän, NMIBC), ja YTS1 (metastaattinen virtsarakon syöpä), on laajalti käytetty tutkimuksissa molekyylitason mekanismeja ja solun signaloinnin aikana virtsarakon syöpä (BC) etenemistä. Kuitenkin vähän huomiota on kiinnitettävä maailmanlaajuiseen kvantitatiivinen proteomianalyysi näistä kolmesta solulinjoista. Me merkitty HCV29, KK47, ja YTS1 soluihin SILAC menetelmällä käyttäen kolmea stabiilit isotoopit sekä arginiinia ja lysiiniä. Leimatut proteiinit analysoitiin 2D ultra-korkea resoluutio nestekromatografia LTQ Orbitrap massaspektrometrialla. Niistä 3721 ainutlaatuinen tunnistetut ja selityksin proteiinien KK47 ja YTS1 soluja, 36 oli merkittävästi voimistunut ja 74 olivat merkittävästi vaimentua kanssa 95%: n luottamusväli. Ero näiden proteiinien ilmentymisen vahvistettiin western blottauksella, kvantitatiivinen RT-PCR: llä, ja solujen värjäys spesifisten vasta-aineiden. Gene ontologia (GO) termi ja polku analyysi osoitti, että säädellään eri tavalla proteiinit olivat mukana DNA: n replikaatioon ja molekyylien kuljetus, solujen kasvua ja lisääntymistä, solujen liike, immuunisolujen kaupan, ja solukuoleman ja selviytymistä. Nämä proteiinit ja kehittynyt proteomiin kuvattuja tekniikoita täällä on hyötyä edelleen selvittämiseen molekyylitason mekanismeja BC ja muiden syöpien.

Citation: Yang G, Xu Z, Lu W, Li X, Sun C, Guo J, et al. (2015) kvantitatiivinen analyysi Differential Proteome ilmentäminen virtsarakon syövän vs. Normaali Virtsarakon Cells käyttäminen SILAC Method. PLoS ONE 10 (7): e0134727. doi: 10,1371 /journal.pone.0134727

Toimittaja: Jon M. Jacobs, Pacific Northwest National Laboratory, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 20 tammikuu 2015; Hyväksytty: 13 heinäkuu 2015; Julkaistu: 31 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin tiedostot ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Science Foundation nuorten tutkijoiden of China (nro 81402115, 81201572), Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa Kiinassa (nro BK20140172) ja 111 Project Kiina (No.111-2-06). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä (BC) on viidenneksi yleisin ihmisen syövän. Oli arviolta 74690 äskettäin diagnosoitu tapauksissa ja 15580 kuolemantapausta tämä sairaus Yhdysvalloissa vuonna 2013 [1]. Niistä yhteensä BC potilasta, 70% on nonmuscle-invasiivista sairautta ja ~ 25% läsnä aluksi lihas hyökkäystä. Potilaat, joilla on lihas-invasiivisen muodossa on 50% riski kaukaisia ​​etäpesäkkeitä ja huono ennuste [2]. Toistumisen pinnallisen virtsarakon kasvainten on merkittävä syy maailmanlaajuisesti esiintyvyys BC [3]. Suurin osa (90%) tasapainotusliivit luokitellaan histologisesti urothelial karsinoomat (UCS), joka on johdettu virtsarakon uroteelin [4]. Virtsarakon epiteelikudoksissa on selkeä hierarkkinen organisaatio koostuu kolmesta morfologisesti erillistä solutyyppien: pohjapinta, väli-, ja sateenvarjo soluja, jotka vastaavat alku-, keski- ja myöhäinen erilaistuminen valtiot [5]. Pahanlaatuisiin voi esiintyä kaikissa näissä solutyypeissä, mikä johtaa monimuotoisuuden kasvaimen fenotyyppien [6]. Uusimpien raportin American Cancer Society, suhteellinen 5 vuoden pysyvyys BC varhainen havaitseminen (vaihe I, (T1, N0, M0)) on ~ 88% [7]. Siksi tunnistaminen uusien alkuvaiheen molekyylimarkkereita on toivottavaa riskien parempaa kerrostumista.

Asiaan biomarkkereita BC havaitsemiseen arvioitu tähän mennessä sisällyttää telomeraasia, virtsarakon kasvaimen antigeeni (BTA), ydin- matriisin proteiini 22 (NMP-22) , ja fibriinin hajoamistuote (FDP). Luotettavuus perustuvat testit aivovaurion on huono koska alhainen herkkyys ja korkea vääriä positiivisia hinnat [8-11]. Proteiinit voidaan mahdollisesti tunnistaa spesifisiä aggressiivisia tai aggressiiviset syöpien riskiä. Proteomianalyysi on haastavaa, koska rajallinen määrä käytettävissä kliinisestä näytteestä [12]. Seuranta proteomiin BC solut voitaisiin antaa lisätietoa kliinisiin diagnostisiin tarkoituksiin.

Viimeaikaiset edistysaskeleet massaspektrometriaa (MS) proteiinien tunnistamiseen ja kvantifiointiin helpottaa perusteellisen analyysin suuria määriä proteiineja, ja niitä on käytetty tutkimista varten koko proteomiin useissa järjestelmissä. Tällaisia ​​menetelmiä ovat 2D-ero geelielektroforeesi (2D DIGE), samanlainen iTRAQ (isobaaristen tag suhteellinen ja absoluuttinen kvantitointi), isotooppi-koodattu affiniteetti koodaus (ICCAT), ja vakaa isotooppi merkintöjä aminohappojen soluviljelmissä (SILAC) [13- 15]. Verrattuna peptideihin perustuva absoluuttinen kvantitointi menetelmiä, SILAC on edut sekoittamalla näytteitä aivan alussa, ja vähensi näytteen ja näytteen vaihtelu. Metabolinen leimaus stabiilit isotoopit on kuvattu ”kultaisena standardina” proteiinia määrällisesti [16]. Arginiini (Arg) ja lysiini (Lys), ovat stabiileja isotooppi-leimattuja aminohappoja käytetään useimmin SILAC perustuvat tutkimukset, koska myöhemmin trypsiinillä eristetyt proteiinit (joka katkaisee emäksisiä tähteitä) MS-analyysi tuottaa peptidejä, joilla on yhden kerran leimattu amino happo, yksinkertaistaa analyysi ja kvantifiointi [17]. Esillä olevassa tutkimuksessa, kolme stabiilit isotoopit kunkin Arg (R0, R6, R10) ja Lys (K0, K4, K8) kolmessa erillisessä kulttuureissa ( ”kevyt” (L), ”medium” (M), ja ”raskas” (H)) käytettiin analysoimaan proteomiin eroja eri vaiheissa BC. Erottuva L, M, ja H muodot kullekin peptidille havaittiin MS näkyy suhteelliset määrät vastaavan proteiinin kolmen isotooppisesti koodattu BC solujen vaiheissa.

kolme ihmisen solulinjoissa tutkittiin: normaali virtsarakon epiteelin HCV29, huono laatu nonmuscle invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC) KK47, ja metastaattinen lihasten invasiivisia virtsarakon syöpä YTS1. Kukin kolmesta solulinjoja viljeltiin mediassa lisätty kolme yhdistelmiä leimaamattoman Lys ja Arg ( ”kevyt”), D

4-Lys ja

13C

6-Arg ( ”medium”), ja

13C

6

15N

2-Lys ja

13C

6

15N

4-Arg ( ”heavy”). Proteiinit kanssa 98% etiketin liittäminen analysoitiin ja kvantifioidaan 2D-HPLC-LTQ Orbitrap MS (kuvio 1). Differential ilmaus tunnistettu proteiineja, jotka oletettavasti liittyvät BC kehittämiseen, vahvistettiin western blottauksella, kvantitatiivinen RT-PCR, ja solujen värjäys spesifisten vasta-aineiden.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

HCV29, KK47, ja YTS1 solut perustettiin aiemmin kuvatulla [18-20] ja ystävällisesti lahjoitti Dr. Sen-itiroh Hakomori (Sen Biomembrane instituutin Seattle, WA, USA). Soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiinillä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä. Sillä SILAC merkintöjä, soluja viljeltiin SILAC-leimattu RPMI 1640, jossa oli 10% dialysoitua FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä, joka sisältää ”kevyt” (K0R0), ”medium” (K4R6), tai ”raskas” (K8R10) Lys ja Arg. Estää Arg-to-Pro muuntaminen, L-Pro (200 mg /L) lisättiin väliaineeseen kuten aiemmin on kuvattu [21]. Soluja viljeltiin vähintään 5 kohtien poistamiseksi leimattuja Lys ja Arg.

Solulyysis ja proteiini uuttamalla

Yhteensä proteiineja kolme solulinjojen lyysattiin ja uutettiin käyttäen T-PER Reagent (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, soluja (~ 1 x 10

7) irrotettiin trypsiinillä, pestiin kaksi kertaa jääkylmällä 1 x PBS: ää (0,01 M fosfaattipuskuria, joka sisälsi 0,15 M NaCl, pH 7,4), hajotettiin 1 ml: aan T-PER-reagenssia joka sisältää proteaasi-inhibiittoreita (1 mM PMSF ja 0,1% aprotiniini), inkuboitiin 30 minuuttia jäillä, homogenoitiin ja sentrifugoitiin 12000 rpm 15 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityksellä (Beyotime; Haimen, Kiina).

SDS-PAGE: lla ja

geelissä

ruoansulatusta

Proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE , näkyviksi Coomassie-värjäys 2 h, ja väri poistettiin yli yön. Irrotettiin geelisuikaleista pestiin 25 mM ammoniumbikarbonaattia /50% asetonitriiliä (ACN). Kuivatut palat inkuboitiin 20 ui 10 mM ditiotreitolia (DTT) 56 ° C: ssa 1 tunti ja sen jälkeen yhtä suuren tilavuuden kanssa 20 mM jodiasetamidia (IAM) huoneenlämpötilassa pimeässä. Geelipalat pestiin ja trypsinoitiin 20 ui (10 ng /ul) trypsiinillä (Promega, Madison, WI, USA) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Ylimääräinen trypsiini-liuos poistettiin, 20 ui 25 mM NH

4HCO

3 lisättiin, ja seosta inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Uutetaan tuotteet kuivattiin SpeedVac keskitin (CentriVap Cold Trap, Labconco, Kansas, MO, USA) [22].

MALDI-TOF /TOF-MS

Kuivatut näytteet liuotettiin 0,1 % trifluorietikkahappoa (TFA), täplittäin MTP AnchorChip näyte kohde, ja kuivataan ilmassa. Peptidit kiteytettiin uudelleen matriisin α-cyanohydroxycinnamic happo (CHCA, 1 ui 10 mg /ml), ja tunnettu siitä, että MALDI-TOF /TOF-MS (UltrafleXtreme, Bruker Daltonics, Bremen, Saksa). Ionisaatio saatiin aikaan säteilyttämällä typen laser (λ = 337 nm), joka toimii 20 Hz. Massaspektrit hankittiin käyttäen FlexControl ja FlexAnalysis ohjelmia.

In-liuosta ruoansulatusta

Proteiinit kolme stabiililla isotoopilla-leimatut solut sekoitetaan 1: 1: 1, pienennetään, ja alkyloidaan inkuboimalla yhtä suuret määrät 10 mM DTT ja 20 mM IAM. Alkyloidut proteiinit pilkottiin trypsiinillä lisätään suhteessa 01:50 (w /w), ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa [23]. Yhteensä peptidit konsentroitiin ja suolat käyttäen 10 kD kokoeksluusio- spin ultrasuodatusyksikköä ja kuivataan käyttäen SpeedVac rikastamon.

LC-MS /MS-analyysi

2D-LC-MS suoritettiin käyttäen LTQ Orbitrap MS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) kuten aiemmin on kuvattu [24]. Hajotettua peptidejä (100 ug) injektoitiin kaksivaiheinen kapillaarikolonnia (id 200 um) oli pakattu C

18-hartsia (Reprosil-Pur, 5 um, Dr. Maisch GmbH) ja vahva kationinvaihtohartsilla (Luna 5 pm SCX 100A, Phenomenex). Peptidi sivuvirtojen kaksivaiheisesti pylvään jokaisessa vaiheessa suunnattiin 15 cm: C

18 analyyttisen pylvään (sisähalk 75 pm, Reprosil-Pur, 3 um) virtausnopeudella 500 nl /min. Nano-ESI suoritettiin spray jännite 2,0 kV ja kuumennetun kapillaarin lämpötila 200 ° C. Yksi täysi MS scan (300-1800) on Orbitrap seurasi viisi MS /MS skannaa viiden kiihkeimmän valittujen ionien MS-spektri LTQ. Varaustila seulonta käytössä +2, +3, +4, ja yli [25].

Tietojen analysointi

Raaka MS tiedot analysoitiin käyttämällä MaxQuant ohjelma (V. 1.2. 2.5) [26,27]. Väärä löytö korko (FDR) 0,01 proteiineille ja peptideille ja vähintään peptidin pituus on 6 aminohapon edellytettiin. MS /MS-spektrit etsittiin Andromeda [28] vastaan ​​IPI ihmisen tietokanta (V. 3,85). MaxQuant ohjelma määritti SILAC tila peptidien massan eroista SILAC peptidin paria, ja tätä tietoa käytettiin hakujen kiinteillä Arg6 ja Lys4 tai Arg10 ja Lys8 muutoksia tarvittaessa. Kvantifiointiin MaxQuant suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [26].

Differential sääntely kunkin kokeellisen M /L ( ”medium /kevyt”) suhde ja H /L ( ”heavy /kevyt”) suhde tunnistetuista proteiineista normalisoitiin käyttäen z-pisteet analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [29,30]. Lyhyesti, M /L ja H /L suhde muunnettiin log2 tilaa, ja keskimääräinen suhteet ja SD (keskihajonnat) laskettiin jokaiselle tietokokonaisuus. Log2 M /L ja H /L-suhde kunkin proteiinin on muunnettu z-pisteet, seuraavalla kaavalla: missä b katsottiin yhtenä proteiinin datajoukon väestö (a … .N). Z-pistemäärä oli mitata, kuinka monta SD yksikköä (σ) on log2 M /L tai H /L-suhde proteiini oli poissa populaation keskiarvo. Z-arvoksi ≥1.960σ edustaa että ero proteiinin ekspressiota valehteli ulkopuolella 95%: n luottamusväli, pisteet ≥2.576σ edustaa ilmaisun ulkopuolella 99%: n luottamusväli, ja pisteet ≥3.291σ edusti 99,9%: n luottamusväli. Z-score ≥1.960σ katsottiin olevan merkittäviä [29].

Toiminnalliset huomautusta ja kekseliäisyyttä Väylät Analysis

Tunnistetut proteiinit analysoitiin edelleen käyttämällä SWISS-PROT-tietokantaan luokittelemaan biologisen prosessin, solukomponenttiin, ja molekyylien toiminta [31]. Merkittävät yliedustettuina geeni ontologian (GO) ehdot tunnistettiin käyttäen Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID) geeni bioinformatiikan resurssit [32, 33]. Proteiinit, joihin todennäköisesti säädellään eri tavalla, kuten on kuvattu edellisessä jaksossa esitettiin taulukkomuodossa Excel ja niiden kansainvälinen Protein Index (IPI) numerot ladattiin DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) toiminnallisten huomautusta analyysia . Data sarjoista, jotka geenin tunnisteet ja vastaavia ilmaisun arvot sen jälkeen ladata osaksi Ingenuity Systems sovellus. Kukin IPI numero kartoitettiin sen vastaava geeni esineen Ingenuity Pathways Knowledge Base. Verkostot proteiinit luodaan algoritmien perustuu niiden yhteydet. Fisherin testiä käytettiin laskemiseen p-arvo, joka osoittaa todennäköisyyttä, että tietty biologinen funktio ja /tai sairaus osoitettu, että verkon johtui mahdollisuus yksin.

Western blotting

Western blotting oli suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [34]. Lyhyesti, proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE-geelissä, siirrettiin PVDF-kalvolle ja kalvo blokattiin käyttämällä 5% rasvaton maito TBST ja tutkittiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita. Ensisijainen vasta-aineet olivat kanin anti-insuliinin kaltainen kasvutekijä 2: n mRNA-sitova proteiini 1 (IGF2BP1) (# AP10466b, Abgent, San Diego, CA, USA), kanin anti-melanooma-liittyvä antigeeni 4 (MAGEA4) (# AP6166a, Abgent), kanin anti-Thy-1 membraaniglykoproteiinin (THY1) (# AP2050a, Abgent), 14-3-3 proteiinia sigma (SFN) (# sc-365539, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), jäniksen anti -fibronectin (FN1) (# F3648, Sigma-Aldrich), hiiren anti-vimentiinista (VIM) (# V5255, Sigma-Aldrich), CD70-antigeeni (CD70) (# sc-7681, Santa Cruz Biotechnology), ja hiiren anti- p-kateniinin (CTNNB1) (# 610153, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Toissijainen vasta-aineet olivat asianmukaiset piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua kanin anti-hiiri- tai vuohen anti-kani (# A0216 ja # A0208, Beyotime). Bändit visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla Kit (Westaria Nova, Cyanagen, Bologna, Italia).

Quantitative real-time PCR

Solut (1 x 10

5 kuoppaa kohti 6-kuoppalevyllä), viljeltiin ja käsiteltiin, kuten edellä on kuvattu. Totaali-RNA eristettiin käyttämällä RNApure Tissue Kit (CWBiotech, Peking, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Alukkeet suunniteltiin käyttäen DNAMAN ohjelmaa (V 6.0.3, Lynnon Biosoft, Kanada). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: sta käyttäen ReverTra Ace-α (Toyobo, Osaka, Japani). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin LightCycler-pohjainen SYBR Green I värjätä tunnistus UltraSYBR Seos (CWBiotech). Geenien ilmentyminen kvantifioitiin 2

-ΔΔCT menetelmä [35].

Soluvärjäys

Soluja viljeltiin steriloitiin peitelaseilla 24-kuoppalevyillä, kunnes 70-80% konfluenssiin, pestiin , immobilisoitu, läpäiseviksi 0,2% Triton X-100: ssa 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja estettiin 5% rasvatonta maitoa yön yli 4 ° C: ssa. Kiinnitettyjä soluja inkuboitiin laimennetulla primaarisilla vasta-aineilla 12 tunnin ajan, inkuboitiin FITC-leimatun sekundaarisen vasta-aineita, 4 ° C: ssa 6 tunnin ajan pimeässä, pestiin, värjättiin 4 ug /ml DAPI huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan, pestiin 1 x PBS, ja valokuvattiin fluoresenssimikroskoopilla (Eclipse E600, Nikon, Tokio, Japani).

tulokset

määritys isotoopin liittymistehokkuutta

analysoimiseksi dynaamisia muutoksia BC oncogenesis at proteomiin tasolla SILAC menetelmää on sovellettu kolmeen virtsarakon solulinjojen saamiseksi leimatun solupopulaatioiden. Riittävä merkinnät on edellytys luotettavien kvantifiointiin tällä menetelmällä. Kun kyseessä on keskeneräinen merkinnät proteiinien, erityisesti merkintöjä tehokkuuteen 95%, kvantitointiin matalan runsaus proteiinit olisi peittää saastuneen ”kevyt” peptidejä. Määrittämään liittymistehokkuutta leimatun Lys ja Arg, ”kevyt” (HCV29), ”medium” (KK47), ja ”raskas” (YTS1) proteiinit erotettiin, ja korkean runsaus proteiini oli

in-geeli

pilkottu. MALDI-TOF /TOF-MS-tulokset peptidin GVVDSEDLPLNISR vuonna lämpöshokkiproteiini 90 (P08238) osoitti, että täydellinen sisällyttäminen isotooppileimattujen Arg ja Lys saavutettiin KK47 ja YTS1, eikä Arg-to-Pro muuntaminen tapahtui (kuvio 2A). LC-ESI-MS /MS-analyysi kaksinkertaisesti peritään peptidi VNQIGSVTESLQACK alfa-enolaasi (P06733) ja GGPEVQQVPAGER rasvahapon nopaliinisyntaasin (P49327) osoitti, että nämä dupleteiksi todellisten huippu klusterit olivat HCV29, KK47, ja YTS1 soluja, tässä järjestyksessä ( Kuva 2B).

(A) määritys liittymistehokkuutta MALDI-TOF /TOF-MS. Peaks annotoitu R0 (vasemmalla), R6 (keskellä), ja R10 (oikealla) ovat peptidi GVVDSEDLPLNISR lämmön shock proteiini 90 alkaen HCV29, KK47, ja YTS1 soluja. (B) tunnistaminen ja määrittäminen proteomista BC soluissa 2D-HPLC LTQ Orbitrap MS. Peaks selityksin kuten K0, K4, ja K8 (vasemmalla) ja R0, R6 ja R10 (oikealla) ovat kaksinkertaisesti veloitetaan peptidi VNQIGSVTESLQACK alfa enolaasi- ja GGPEVQQVPAGER rasvahapon nopaliinisyntaasin.

SILAC solu malli kvantifiointi proteomi BC etenemisen

proteiinit eristettiin kolme solulinjojen sekoitettiin (1: 1: 1) ja hajotettiin käyttäen 10 KD suodattimen (Millipore, Bedford, MA, USA). Peptidit analysoitiin ultrahigh erotuskyvyn nestekromatografia-tandem MS (NLC-ESI-MS /MS) on hybridi lineaarinen ioniloukku LTQ Orbitrap väline. Kaikkiaan 3721 proteiineja tunnistettiin kaksi itsenäistä koetta uudestaan ​​(kuvio 3A ja S1 taulukko). Näistä 1766 proteiinit (47,5% kokonaismäärästä), jotka havaittiin sekä kokeiluja ja täytti perustettu proteiinin kvantitoimiseksi tehtiin edelleen bioinformatiikan analyysi. Jakauma histogrammit log suhdeluvut sekä M /L ja H /L sopivat Gaussin. Useimmat tunnistetuista proteiineista olivat sisällä ± 1 valikoima log suhdetta (kuvio 3C ja 3D). Käyttäen 1 kynnyksenä log suhde, ilmaus 255 proteiineihin oli korkeampi sekä KK47 ja HCV29, ja ilmentäminen 434 proteiineihin oli alhaisempi sekä KK47 ja HCV29 (kuvio 3B). Väestön jakautuminen perustuva z-arvoja mahdollisti suoran vertailun proteiinien eri kokeita. Erilaiset luotettavuustasolla cutoffs levitettiin tietoja z-analyysi, mitkä proteiinit merkittävästi säädellään eri tavalla. Cutoffs sovellettu olivat 95%, 99% ja 99,9%, mikä vastaa z-tulokset ± 1.960, ± 2,576, ja ± 3,291, tässä järjestyksessä. Käyttäen 95% sulku, merkittävä ero sääntely havaittiin 110 proteiinien KK47 vs. HCV29 (36 voimistunut, 74 vaimentua) ja 87 proteiinien YTS1 vs. HCV29 (17 ylös, 70 alas). Differential asetus havaittiin 35 proteiinien kaksi BC riviä vs. HCV29 käyttäen 99% sulku (2 ylös, 33 alas), mutta vain viisi näistä proteiineista käyttäen 99,9% sulku (2 ylös, 3 alas) (taulukko 1 ). Taulukot 2 ja 3 luetellaan voimistunut ja vaimentua proteiinit määritettiin kahdessa kokeessa, joissa keskimääräisten SILAC suhteet ja z-arvoja. Kaikki proteiinit differentiaalisesti säädellä 95%: n luottamusväli oli 5-kertainen muuttaminen SILAC suhteet, ja useimmat proteiinit differentiaalisesti säädellä 99%: n luottamusväli oli 10-kertainen muuttaminen SILAC suhteissa.

(A) Venn kaavioita tunnistettujen proteiinien yksittäisistä kokeista. (B) Suhteita KK47 /HCV29 (M /L) ja YTS1 /HCV29 (H /L) varten joukon 1766 proteiineja. log2 SILAC suhde kutakin proteiinia (n = 2) heijastaa eroja suhteellinen ekspressio keskuudessa KK47, YTS1, ja HCV29 soluja. (C) jakautuminen SILAC M /L suhde. (D) jakautuminen SILAC H /L suhde. (E) Cluster kuvaaja ( ”lämpö kartta”) tuottama hierarkkinen klusterointi merkittävien säänneltyjen proteiinien jälkeen keskimäärin z-arvoja käyttäen 95%: sulku.

Hierarkkinen klusterointi näytteiden analysointi suoritettiin tutkimaan korrelaatiot proteomiin kuvioita joukossa kolme solulinjat. Cluster kuvaaja ( ”lämpö kartta”) osoittaa, että näytettä samasta solulinjasta klusterin yhdessä (kuvio 3E). Jotkut proteomeja olivat erottuva joukossa kolme solulinjojen perustuu merkittäviä muutoksia metastaattisessa vs. huono laatu nonmuscle invasiivisia, kun taas muut proteomeja maltillisesti ja yhdenmukaisia. Proteiinit entisessä ryhmässä voi olla mukana BC kehittämiseen.

Toiminnallinen luokittelu ja koulutusjakson analyysi tunnistettu proteiinien

Toiminnallinen tulkinta on ratkaiseva askel data-analyysi, kun laajoja funktionaalisen merkinnästä paikkatietoaineistojen on ei saatavilla. Kun otetaan huomioon niiden ei-yksinomaisen lokalisointi GO, tunnistettujen proteiinien liittyy ainakin yksi merkintä aikavälillä kunkin sisällä GO molekyyli toiminto, biologisen prosessin, ja molekyylitason komponentti luokkia. Yleisin molekyyli- toiminnot sitovia (47,2%), ja katalyyttinen aktiivisuus (30,9%) (kuvio 4A). Tärkeimmät biologinen prosessi luokat olivat solujen (16,3%), single-organismi (14,2%), ja aineenvaihdunnan (13,8%) (kuvio 4B). Tärkeimmät solukomponenttiin luokat olivat solu (17,6%), solun osa (17,6%), ja organelle (15,8%) (kuvio 4C).

Proteiinit osoitettu liittyi ainakin yksi merkintä aikavälin sisällä GO molekyyli toiminto (A), biologisen prosessin (B), ja solujen komponentti (C) luokat.

tunnistaa rikastamiseen ehdot liittyvät voimistunut ja vaimentua ryhmien proteiinien jälkeen keskimäärin z-pisteiden avulla 95 % sulku luettelot proteiinit ladattu DAVID sivuston avulla täydellisen ihmisen proteomiin tausta. Auttaa selventämään joka molekyyli toiminnot ja biologiset prosessit vaikuttavat eniten aikana BC kypsymisen, yliedustettuja GO termejä tunnistettiin perustuen kynnyksen count ≥ 2 ja Expression Analysis Systemaattinen Explorer (EASE) 0.1. Yli-edusti molekyyli toimintoja, biologisia prosesseja ja solukomponenttien merkittävät rikastetun GO kannalta ilmen- tymisen lisääntymisen proteiinit analysoitiin. Kaikkein korkealle rankattu molekyyli- toiminta oli neutraalia aminohappoa transmembraanisen kuljettaja aktiivisuus (2 proteiinit). Kaikkein korkealle rankattu biologiset prosessit olivat solujen Aminohappojohdannaisen aineenvaihduntaa (4 proteiinit), ribonukleoproteiini- kompleksi biogeneesin (4 proteiinit), vaste solunulkoiseen ärsyke (4 proteiineja), ja typpiyhdiste biosynteettinen prosessin (4 proteiineja). Kaikkein korkealle rankattu solukomponenttien olivat solunsisäiset ei-kalvoon, jota rajoittaa organelle (14 proteiinit) ja ei-kalvoon, jota rajoittaa organelle (14 proteiinit).

Seuraavaksi yliedustettuina molekyyli toimintoja, biologisia prosesseja ja solukomponenttien että merkittävä rikastetun GO kannalta vaimentua proteiinit analysoitiin. Kaikkein korkealle rankattu molekyyli- toiminnot olivat kalsiumionin sitovia (16 proteiinit), rakenteelliset molekyyli aktiivisuus (11-proteiinien), ja sama proteiineihin (10 proteiinit). Kaikkein korkealle rankattu biologiset prosessit olivat soluadheesiota (14 proteiinit), biologinen tartunta (14 proteiinit), vaste haavan tekemistä (13 proteiinit), ja immuunivastetta (13 proteiineja). Pisimmälle sijoittunut solun komponentit olivat solukalvon (40-proteiinien), solukalvon osan (30-proteiineja), ja ei-kalvoon, jota rajoittaa organelliin (24-proteiinit) (S2 taulukko).

Proteiinit analysoitiin edelleen, ja aineenvaihdunnan ja kanoninen reitit ja toisiinsa proteiinit tuotetaan käyttäen Ingenuity Pathways Analysis (IngenuityH Systems, www.ingenuity.com). Top verkkotoimintojen tunnistettu yliaktiivista proteiinien BC solut mukana DNA: n replikaatioon, aminohappo aineenvaihduntaa, molekyyli- liikenne (52 proteiinit; kuvio 5A), geenien ilmentyminen ja perinnölliset sairaudet (33 proteiinit), solujen kasvun ja lisääntymisen (20 proteiinit; Fig 5B), ja translaation jälkeisen modifikaation ja syöpä (4 proteiineja). Top verkkotoimintojen tunnistettu vaimentua proteiineja BC solut solun liikkumista ja immuunisolujen kaupan (97 proteiinit; kuvio 5C), rasva-aineenvaihdunnan (31 proteiinit; kuvio 5D), solujen kehitystä, kasvua ja lisääntymistä, ja solukuolema ja eloonjäämisen (6 proteiinit). Nämä havainnot osoittavat, että BC solu proteomeja oli jatkuvasti siirtymässä vaiheesta riippuen solun etäpesäke.

(A ja B) Ylös verkkotoimintojen DNA-replikaation, molekyylinkuljetuksessa, solujen kasvuun ja solujen lisääntymistä varten ilmen- tymisen lisääntymisen proteiineja. (C ja D) Top verkkotoimintojen solun liikkumista, immuunisolujen kaupan, ja rasva-aineenvaihduntaan. Yhtenäiset viivat: suora tunnettuja yhteisvaikutuksia. Katkoviivat: epäiltyjen tai epäsuorat vuorovaikutukset. Valkoinen: proteiineja tiedetään olevan verkossa, mutta ei tunnistettu tutkimuksessamme.

Vahvistus MS tulosten western blottauksella

variaatiot ero proteiinien edellä kuvatut varmistettiin western blottauksella . THY1, MAGEA4, IGF2BP1 ja SFN havaittiin korkeammalla tasolla BC KK47 ja YTS1 soluissa kuin normaalissa virtsarakossa epiteelin HCV29 soluja, kun taas VIM, CTNNB1, FN1 ja CD70 havaittiin alemmilla tasoilla KK47 ja YTS1 kuin HCV29 (kuvio 6B ja 6C). Yleensä Western blotting tulokset olivat yhdenmukaisia ​​muuttujat MS-analyysi (kuvio 6A; S1 Taulukko ja S1 kuviossa).

(A) SILAC L: M: H keskimääräinen tunnusluvut kuuden valitun proteiineja. (B) Western-blottaus-analyysi valituista proteiineista. Proteiinit siirrettiin PVDF-kalvolle, tutkittiin niiden ensisijainen vasta-aineita, ja niitä inkuboitiin HRP-konjugoitua kanin anti-hiiri- tai vuohen anti-kaniini-vasta-aineita. (C) densitometrinen määrittämällä proteiini tasoilla. Proteiini, joka on normalisoitu tublin, ja verrataan sitten HCV29, jotka mielivaltaisesti 1,0. (D) Geenien ilmentyminen proteiineja analysoitiin qRT-PCR. Suhteellinen ilmentyminen verrattuna hallita näytteitä analysoitiin 2

-ΔΔCt menetelmä ja edustettuina Log

2. Geenien ilmentymistä edellä Log

2 (2) tai alle Log

2 (1/2) oli merkittävästi voimistunut tai vaimentua, vastaavasti.

Vahvistus SILAC tuloksia qRT-PCR

ilmentymistä kuusi vastaamisen geenien transkription tasolla arvioitiin qRT-PCR. BC KK47 ja YTS1 soluja, ilmaus

MAGEA4

,

THY1

, ja

IGF2BP1

lisääntyi merkittävästi, kun taas on

VIM

,

CTNNB1

, ja

FN1

pieneni huomattavasti (kuvio 6D). Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​SILAC tuloksia.

Vahvistus SILAC ja western blotting tulokset solujen värjäytymisen kanssa vasta

Vasta tunnustaa MAGEA4, THY1, IGF2BP1, VIM, CTNNB1, ja FN1 proteiineja, joiden ilmentymistä erosivat merkittävästi BC soluissa vs. HCV29 soluja, käytettiin tulosten varmistamiseksi aikaisempien analyysien ja arvioida proteiinin jakaumat. Fluoresenssisignaali intensiteetit kahdessa BC solulinjat olivat merkittävästi korkeammat MAGEA4, THY1 ja IGF2BP1 ja merkittävästi alemmat VIM, CTNNB1, ja FN1 suostumuksella SILAC, Western blotting ja RT-PCR-tuloksiin. Hakeutuvan havaittiin MAGEA4 Keski sytoplasmassa (mukaan lukien mitokondrioita ja sentrosomimäärän) ja ydinvoiman alueella, sillä THY1 ja VIM vuonna solukalvon ja solulimassa, sillä IGF2BP1 ydinvoiman alueella ja solulimassa sekä CTNNB1 ja FN1 in solukalvon (kuvio 7 ).

HCV29, KK47, ja YTS1 soluja viljeltiin ja värjättiin kuusi suunnattujen vasta tunnistettuja proteiineja (MAGEA4, THY1, IGF2BP1, VIM, CTNNB1, FN1) leimattu Cy3 kuvatun M M. Kuvat näkyvät sekä yhdistämisen kuvia Cy3-konjugoitu vasta-aineita ja DAPI värjäys ytimet (tavoite suurennus 60 x). Mittaviivat: 70 pm.

Keskustelu

urothelial rakkokarsinooman on ainutlaatuinen epiteelin karsinoomien sen erilaiset polkuja kasvaimen. Tuolloin diagnoosin siirtymäkauden solun BC, ~ 80% potilaista ovat huonolaatuista (grade 1-2) ei-lihas- invasiivisia (CTA tai CT1) vaihe. Potilailla, joilla on huono laatu Ta sairaus, 15 vuoden ilman taudin etenemistä on 95% ilman syöpäkuolleisuuden [36]. Siksi biomarkkerit tarvitaan ennustavat riski vaiheen etenemisen ei-invasiivisia invasiivisia tai ei-metastasoitunut metastaattinen ja ennustamisessa vastata systeemisiä hoitoja. Ihmisen solulinjat HCV29 (normaali virtsarakon epiteelissä), KK47 (huono laatu nonmuscle invasiivisia virtsarakon syöpä), ja YTS1 (metastaattinen virtsarakon syöpä) on käytetty laajalti tutkimuksissa molekyylimekanismeja ja solusignalointia etenemisen aikana virtsarakon syövän lihaksen tai metastaattisen valtiot [37]. Kuitenkin vähän huomiota on kiinnitettävä maailmanlaajuiseen kvantitatiivinen proteomianalyysi näistä kolmesta solulinjoista.

kvantitatiivinen analyysi proteiineja eri vaiheissa BC eteneminen on haastava mutta tärkeä tehtävä ymmärtämisen tautimekanismien. SILAC, differentiaalinen isotooppi merkintöjä strategia, johon liittyy metabolinen leimaus proteiinien

in vivo

, on laajalti käytetty solubiologian ja tutkimukset malliorganismien kuten hiiva, bakteerit, sukkulamadot, kasveja, ja hiiret [38, 39 ]. Vuonna SILAC, luonnollinen ”kevyt” isotoopit hiilen, typen ja vedyn aminohappoja lisätyt proteiini käännös on korvattu ”heavy” isotoopit kuten

13C,

15N, ja

2 H. Ei tutkimus on tähän mennessä määrälliset erot proteiinia runsaasti eri vaiheissa BC. Aiemmat tutkimukset ovat keskittyneet vertailevaa proteiinin tasot BC potilaista ja verrokkien, mutta ei muutoksia proteiinin tasojen aikana BC etenemisen [8,9].

tunnistaminen ja luonnehdinta proteiinin tasot eri vaiheissa eriyttäminen ovat olennaista ymmärrystämme normaalin kudoksen kehitykseen ja pahanlaatuisiksi. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme soveltaneet SILAC menetelmää analyysi HCV29, KK47, ja YTS1. Tämä strategia säädetty proteiini tiedot kaikista kolmesta solulinjoissa jonakin MS kokeen. Sen jälkeen normalisointi jonka z-menetelmällä, ero sääntely havaittiin 110 proteiinien KK47 vs. HCV29 ja 87 proteiinien YTS1 vs. HCV29. Nämä säädellään eri tavalla proteiineja, jotka voi olla tärkeitä rooleja BC kehittämiseen, ovat SFN (14-3-3-proteiinia sigma), SELENBP1 (seleeni-sitova proteiini 1), COL6A3 (kollageeni α3 (VI)-ketju), ja CD70.