Krooninen sairaus

tiivistelmä

RGS10 on tärkeä säätelijä solujen eloonjäämistä ja chemoresistance munasarjasyöpää sairastavilla. Olemme äskettäin osoittaneet, että RGS10 transkriptin ilmentyminen tukahdutetaan aikana hankittu chemoresistance munasarjasyövän. Tukahduttaminen RGS10 johtuu DNA hypermetylaation ja histonien deasetylaatiolla, kaksi tärkeitä mekanismeja, jotka edistävät vaiennettu tuumorisuppressorigeeneille aikana syövän etenemisen. Täällä perinpohjaisesti molekyylimekanismeihin epigeneettiset vaiennettu RGS10 ilmentymisen solunsalpaajaresistentti A2780-AD munasarjasyöpäsoluja. Tunnistamme kaksi tärkeää epigeneettiset sääntelyviranomaisten HDAC1 ja DNMT1, joilla esiintyy poikkeava yhdessä RGS10 promoottorit solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja. Knockdovvn HDAC1 tai DNMT1 ilmaisun, ja farmakologinen esto DNMT tai HDAC-entsyymiaktiivisuutta, lisää merkittävästi RGS10 ilmaisun ja sisplatiini-välitteistä solukuolemaa. Lopuksi DNMT1 kaataa myös vähentää HDAC1 sitoutumalla RGS10 promoottori solunsalpaajaresistentti soluissa, mikä viittaa HDAC1 rekrytointi RGS10 promoottorit vaatii DNMT1 aktiivisuutta. Tuloksemme viittaavat siihen, että HDAC1 ja DNMT1 edistää tukahduttaminen RGS10 aikana hankittujen chemoresistance ja tukea eston HDAC1 ja DNMT1 adjuvanttina terapeuttinen lähestymistapa voittaa munasarjasyöpään chemoresistance.

Citation: Cacan E, Ali MW, Boyd NH , Koukut SB, Greer SF (2014) esto HDAC1 ja DNMT1 moduloida RGS10 Expression ja Vähennä munasarjasyöpä Chemoresistance. PLoS ONE 9 (1): e87455. doi: 10,1371 /journal.pone.0087455

Editor: Malú G. Tansey, Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 lokakuu 2013; Hyväksytty: 25 joulukuu 2013; Julkaistu: 27 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Cacan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Tutkimus oli tukee apurahan # RSG-09-067-01-LB American Cancer Society. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on yksi tappavimmista gynekologisten syöpien, jossa 60%: n kuolleisuus potilailla ja 5 vuoden eloonjäämisaste alle 30% pitkälle edennyt sairaus [1]. Korkea kuolleisuus johtuu suurelta osin resistenssin kehittymistä kemoterapeuttisia lääkkeitä [2], [3]. Siten ymmärtäminen molekyyli- ja geneettisiä mekanismeja, jotka ohjaavat kehitystä hankittujen chemoresistance pystymme parantamaan nykyisiä terapeuttisten aineiden munasarjasyövän hoitoon. G-proteiiniin kytkeytyneiden reseptorien (GPCR: t) aloittaa useita kasvaimia synnyttävän signalointireittien syöpäsoluissa aktivoimalla niihin liittyvien G-proteiinien [4], [5]. Aktivointi GPCR: kasvutekijät, kuten Lysofosfatidihappo (LPA) laukaisee selviytymisen signalointireittejä, jotka ajavat vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä, kuten sisplatiinin ja taksaania [6]. GPCR aktivointi G-proteiinien vastustavat toimintaa säädin G-proteiinin signalointi (RGS) proteiineja. RGS proteiinit estävät G-proteiiniin signalointireitteihin suoraan sitoutumalla aktivoitua Ga alayksikön G-proteiinien nopeuttaa hydrolyysiä GTP osaksi bruttokansantuotteesta, joka palauttaa G-proteiinien ei-aktiiviseen tilaan [7] – [10]. Osuvia tutkimuksia, tuoreet raportit osoittavat, että RGS-proteiinit estävät rinta-, keuhko-, eturauhas-, ja munasarjasyövän solujen kasvua estämällä GPCR: ien signalointireittien [2], [11] – [15].

RGS10 kuuluu pienin RGS-proteiinit ja ilmentyy erittäin laaja solutyyppejä [16] – [19]. RGS10 on tärkeä säätelijä solujen eloonjäämistä ja chemoresistance [2], ja RGS10 transkripti ilmentyminen on merkittävästi vaimentaa useita munasarjasyövän solulinjoissa [15]. Siten tukahduttaminen RGS10 proteiinit voivat edistää chemoresistance monistamalla GPCR-välitteistä solujen kasvua ja selviytymistä signalointireittejä. Olemme äskettäin osoittaneet, että tukahduttaminen RGS10 johtuu osittain DNA hypermetylaation ja histoni deasetylaatiolla, kaksi tärkeää geenien hiljentäminen mekanismeja, jotka edistävät etenemistä moniin syöpiin. DNA: n metylaatio on ylläpitää DNA metyyli transferaasit (DNMTs) [20], ja histoni-deasetylaatio ylläpitää histonideasetylaaseja (HDAC: t) [21]. Usein näillä kahdella entsyymillä koordinoidusti tukahduttaa transkriptionaalista aktiivisuutta geenien [22], [23]. Fuks

et al.

Ovat raportoineet, että DNMT1 liittyy histonideasetylaasiaktiivisuutta ja sillä on kyky sitoa HDAC1 [24]. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja, joilla DNA hypermetylaation ja histonien deasetylaatiolla tukahduttaa RGS10 ja edistää näiden entsyymien hankittu chemoresistance edelleen tuntematon.

Tutkimme tässä molekyylimekanismeihin epigeneettiset sääntelyn RGS10 ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja ja tarkennus on chemosensitive vanhempien A2780 soluissa ja niiden johdannainen solulinja, solunsalpaajaresistentti A2780-AD. Tunnistamme kaksi tärkeää epigeneettiset sääntelyviranomaisten HDAC1 ja DNMT1, jotka ovat erittäin liittyy RGS10 promoottorin solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja. HDAC1 ja DNMT1 kaataa lisää merkittävästi RGS10 ilmaisun ja sisplatiini stimuloimaa solukuolemaa. Tuloksemme viittaavat siihen, että HDAC1 ja DNMT1 edistää tukahduttaminen RGS10 aikana hankittujen chemoresistance ja tukea yhä enemmän näyttöä siitä esto HDAC1 /DNMT1 edustaa uusia hoitomenetelmiä voittamiseen munasarjasyöpään chemoresistance.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

chemosensitive A2780 emosolulinjassa ja niiden johdannainen solunsalpaajaresistentti A2780-AD soluja (saatu kuten on kuvattu [25]) on jalomielinen lahjoitus tohtori Bob Brown, Imperial College London. Nämä solut ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (Mediatech Inc.), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 5 mM L-glutamiinia. Solunsalpaajaresistentti soluja edelleen pidettiin 3 uM sisplatiinia. Kaikki solut kasvatettiin 5 mM penisilliiniä-streptomysiiniä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2. OV2008 ja C13-solut (saatu kuten on kuvattu [26], [27]) on jalomielinen lahjoitus tohtori Patricia Kruk, University of South Florida.

5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC ), trikostatiini A (TSA), ja sisplatiinin ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Vasta-aineet tunnustaa RGS10, HDAC1, vuohen-anti-rotta IgG-HRP (piparjuuren peroksidaasi) ja HRP konjugoidut kanin vasta-aineet on saatu Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Tunnistavien vasta-aineiden DNMT1 saatiin Abcam (Cambridge, MA). HRP konjugoidut hiiren vasta-aineet hankittiin Promegalta (Madison, WI). Vasta-aineita tunnustaa β-Actin saatiin Cell Signaling (Beverly, MA).

siRNA konstruktioita ja lyhytaikaista transfektiota

Short häiritsevä RNA (siRNA) valmiiksi suunniteltu HDAC1 (Qiagen), RGS10 ja DNMT1 (Santa Cruz) käytettiin kaataa ilmaus HDAC1, RGS10 tai DNMT1. Salatut All Star Control siRNA (Qiagen) käytettiin verrokkina. A2780-AD-solut transfektoitiin 10 nM HDAC1 tai DNMT1 erityisiä siRNA tai All Star sekoitetun ohjaus siRNA käyttäen HiPerfect transfektioreagenssia (Qiagen) mukaan valmistajan ohjeiden. Seuraavassa mainittu inkubaatioajan jälkeen solut otettiin talteen ja analysoitiin western blot, RNA ilmaisu tai kromatiinin immunosaostuskokeet.

RNA ilmaisun ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

mRNA eristettiin käyttämällä Qiazol RNA reagenssia (Qiagen), kuten on kuvattu valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut hajotettiin Qiazol ja sekoitettiin 3D-rotaattori 5 minuuttia. 200 ui kloroformia lisättiin ja inkuboitiin kolmen minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Näytteet sentrifugoitiin ja vesifaasi (400 ui) siirrettiin Eppendorf-putkeen. 500 ui isopropanolia lisättiin ja inkuboitiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sentrifugoinnin jälkeen pelletit pestiin 1 ml: lla kylmää 75% etanolia, sentrifugoidaan ja suspendoidaan uudelleen 50 ui RNAasi vapaata vettä. RNA kvantitoitiin ja cDNA tuotettiin 1 ug kokonais uutettu RNA käyttäen Omniscript Reverse Transcription Kit (Qiagen). CDNA-synteesin jälkeen, kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio suoritettiin käyttäen TaqMan Universal PCR Master Mix (Roche) ja spesifisiä alukkeita ja koettimia kohdistaminen RGS10 tai GAPDH koodaavat alueet. Transkriptioekspressiokuvio arvioitiin käyttäen ABI prism 7900HT Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaktiot normalisoitui vastaan ​​GAPDH ilmaisun ja laskelmat tehtiin tavallisilla käyriä tuotetaan. Käytetyt alukkeet olivat: RGS10 Forward: 5′-GAC CCA AGA AGG CGT GAA AAG A-3 ’, RGS10 Reverse: 5′-GCT GGA CAG AAA GGT CAT GTA GA-3′, RGS10 koetin: 5’-AGA TAA GAC GCA GAT GCA GGA AAA GGC-3 ’, GAPDH Forward: 5′-GGA AGC TCA CTG GCA TGG C-3′, GAPDH Reverse: 5’-TAG ACG GCA GGT CAG GTC CA-3 ’ja GAPDH koetin: 5’- CCC CAC TGC CAA CGT GTC AGT G-3 ’.

vaikutuksen määrittämiseksi 5-atsa-dC ja TSA altistumisen RGS10 transkriptio ilme, 1 x 10

6 A2780-AD solua maljattiin kohti 10 cm

2 kudosviljelymaljalla ja inkuboitiin yön yli. Soluja käsiteltiin 20 uM 5-atsa-dC tai 500 ng TSA liuotettiin DMSO: hon. TSA käsiteltyjä soluja inkuboitiin 48 tuntia ja 5-atsa-käsitellyt DC-soluja inkuboitiin kolme, viisi tai seitsemän päivää, median aspiroitiin ja korvattiin päivittäin. RNA: n eristys ja DNA-synteesin suoritettiin kuten edellä on kuvattu.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritys

ChIP-kokeet suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, solut maljattiin tiheydellä 2 x 10

6 10 cm:

2 levyä. Kolme miljoonaa solua silloitettu 1% formaldehydiä kahdeksan minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Silloittamalla reaktiot pysäytettiin lisäämällä 0,125 M glysiiniä. Soluytimet eristettiin ja konsentroitiin lyysi SDS-lyysipuskuria (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8,0) plus proteaasinestäjät 30 minuuttia jäillä, minkä jälkeen flash jäädyttäminen nestetypessä. Tumat sonikoitiin käyttäen Bioruptor vettä haudesonikaattorissa (Diagenode) tuottaa keskimäärin 500 bp pilkottua DNA: ta, joka on vahvistettu agaroosigeelielektroforeesilla. Sonikoitiin lysaatit esikirkastettiin lohen sperman /agaroosi-helmiä (Millipore), 5% koko lysaattia tallennetaan tulo normalisointia. Puolet jäljellä lysaattia immunosaostettiin 5 ug osoitetun vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa ja toinen puoli lysaattia immunosaostettiin kontrollivasta-ainetta. Seuraavat vielä kahden tunnin immunosaostus lohen sperma päällystettyjä agaroosihelmiä, kaikki näytteet pestiin kutakin seuraavista puskureista: alhainen puskuria (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl), korkean suolapitoisuuden puskuria (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl), LiCI: n (0,25 M LiCI: a, 1% NP40, 1% DOC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,0), ja 1 x TE (Tris-EDTA); Sitten DNA eluoitiin SDS eluutiopuskurilla (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3). Eluoinnin jälkeen, ristisidosten purettu yön yli 5 M NaCl: a 65 ° C: ssa ja immunosaostettiin DNA eristettiin käyttäen fenoli: kloroformi: isopropanoli-seosta (Invitrogen) kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eristetty DNA kvantifioitiin reaaliaikaista PCR ABI prism 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen spesifisiä alukkeita ja koettimia kohdistaminen RGS10 ja GAPDH promoottorit alue. Arvot syntyvät reaaliaikaista PCR-reaktiot laskeminen perustuu standardin käyrät syntyvät, ajettiin kolmena kappaleena reaktioita, ja analysoitiin käyttäen SDS 2.0 -ohjelman (Applied Biosystems).

Kromatiini immuunisaostustesti siRNA käsitellyissä soluissa

solunsalpaajaresistentti A2780-AD-solut maljattiin tiheydellä 1,2 x 10

6 solua per 10 cm

2 kudosviljelylevyillä. Soluja käsiteltiin siRNA konstruktioita, kuten edellä on kuvattu ja inkuboitiin 72 tunnin ajan. Solut kerättiin ja 1/10 solun tilavuudesta oli poistettu analyysiä varten pudotus tehokkuuden Western blot -analyysillä. ChIP määritykset suoritettiin edellä kuvatulla tavalla jäljellä kerättyjen solujen.

RNA ilmentymisen siRNA käsitellyissä soluissa

Solut maljattiin tiheydellä 1 x 10

6 solua per 10 cm

2 kudosviljelymaljalla ja inkuboitiin yön yli. Sitten solut transfektoitiin ilmoitetuilla siRNA rakentaa, kuten edellä on kuvattu ja inkuboitiin 72 tunnin ajan, ja RNA-uutto suoritettiin, kuten on kuvattu edellä.

apoptoosimäärityksessä

apoptoosi A2780-AD-soluissa oli arvioitiin käyttämällä anneksiini V: PE Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen). 1 x 10

6 A2780-AD-solut maljattiin 10 cm:

2 kudosviljelymaljalla ja inkuboitiin 24 tuntia 37 ° C: ssa. Soluja käsiteltiin HDAC1 siRNA tai ohjaus siRNA käyttäen HiPerfect transfektioreagenssia. Seuraavat 48 tunnin inkuboinnin 50 uM sisplatiinin lisättiin sekä HDAC1 siRNA ja hallita siRNA käsiteltyjä soluja ja soluja inkuboitiin vielä 48 tuntia. A2780-AD solut lyhyesti trypsiinillä ja ne on korjattu. Pieni osa solun tilavuudesta oli poistettu ja western blot-analyysiä ja jäljellä oleva osuus solujen pestiin kylmällä PBS: llä kaksi kertaa ja suspendoitiin uudelleen anneksiini V: n sitoutumisen konsentraatiossa 1 x 10

6 solua /ml. Sitten solut siirrettiin 5 ml: n viljelmä putkiin, jotka sisältävät 5 ui anneksiini V-PE ja /tai 5 ui 7-Aminoactinomycin D (7-AAD). Näytteet sekoitettiin varovasti ja inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lisäyksen jälkeen 400 ui anneksiini V: n sitoutumisen puskuria jokaiseen putkeen, näytteet analysoitiin ja kvantitoitiin virtaussytometrillä ja tuloksena saadut tiedot analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa.

Tulokset

histoni asetylaatio vaimenee RGS10 promoottorit munasarjasyöpäsoluja

Olemme äskettäin osoittaneet, että tasot asetyloitua histoni H3 histoni merkittävästi vähentynyt klo RGS10-1 promoottorin A2780-AD solu malli munasarjasyövän chemoresistance [15]. Vahvista nämä havainnot ylimääräisiä solulinjoissa, kromatiinin immunosaostus (chip) määritykset toteutettiin chemosensitive munasarjasyövän solulinja OV2008 ja solunsalpaajaresistentti C13 tytär soluja. Vaikka yhteensä tasot histoni H3 ovat samanlaisia ​​sekä RGS10 ja GAPDH promoottorien chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti soluja (Fig. 1A), tasot asetyloitua histoni H3 ovat huomattavasti alhaisempi RGS10 promoottorit solunsalpaajaresistentti C13 munasarjasyöpäsoluja verrattuna chemosensitive OV2008 soluihin ( kuva 1B).

ChIP määritykset suoritettiin OV2008 emosoluista ja lääkkeille vastustuskykyiset C13-soluissa. Lysaatit immunosaostettiin ohjaus, anti-histoni H3, anti-asetyyli histoni H3, tai anti-asetyyli H3K18 vasta-aineita. Associated DNA eristettiin ja analysoitiin reaaliaikainen PCR: llä käyttäen alukkeita ulottuu RGS10 ja GAPDH promoottorit. Reaaliaikainen PCR-arvot normalisoitiin kokonaismäärä promoottori-DNA lisättiin (input). Input arvot edustavat 5% kokosolulysaattia. ** P 0,005. A) Global histoni H3 tasot liittyvät RGS10 ja GAPDH promoottorit. B) Maailmanlaajuinen tasot histoni H3 asetylointi liittyy RGS10 ja GAPDH promoottorit. C) tasot histoni H3 asetyloitu lysiiniä 18 liittyy RGS10 ja GAPDH promoottorit.

vähennykset H3 lysiiniä 18 asetylointi (H3K18Ac) on yhdistetty aggressiiviseen syöpään fenotyyppejä ja huono potilaan ennusteeseen [28] , [29]. Me seuraavaksi suoritetaan ChIP määrityksiä sen määrittämiseksi, onko menetys H3K18 edistää menetys maailmanlaajuisen histoni asetylointi RGS10 promoottorit solunsalpaajaresistentti C13-soluissa. Merkittävä väheneminen H3K18 asetylointi RGS10 promoottorit havaittiin solunsalpaajaresistentti C13 soluissa, kun taas H3K18 asetylointi GAPDH promoottorit OV2008 ja C13-solut pysyivät ennallaan (kuvio. 1 C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, menetys asetylointi RGS10 promoottorit edistää menetys RGS10 ilmentymisen kaksi riippumatonta solujen mallia solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä.

HDAC1 ja DNMT1 tukahduttaa RGS10 ilmentymistä solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja

Olemme aiemmin osoittaneet, että HDAC1 proteiinit sitoutuvat merkittävästi useammin kuin RGS10 promoottori solunsalpaajaresistentti A2780-AD solujen verrattuna vanhempien chemosensitive A2780 soluissa [15]. Tutkia molekyylitason rooleja HDAC1 säätelyssä RGS10 ilmaisun, siRNA duplex käytettiin nimenomaan kaataa endogeenisen HDAC1 ilmentymistä A2780-AD soluissa. siRNA-välitteisen knockdovvn HDAC1 johti yli 3-kertainen endogeenisen RGS10 transkriptioekspressiokuvio verrattuna ohjata siRNA (Fig. 2A), mikä viittaa siihen, että HDAC1 on kriittinen rooli säätelyssä RGS10 transkriptio. Western blot analyysi vahvisti HDAC1 kaataa lisääntynyt RGS10 proteiinin ilmentymisen (kuvio 2B). Samanlaisessa kokeessa, A2780-AD-solut transfektoitiin HDAC1 vaikutusten määrittämiseksi ectopic ilmentymisen HDAC1. Yliekspressio HDAC1 vähentänyt dramaattisesti RGS10 ilmentymistä solunsalpaajaresistentti A2780-AD-soluissa (kuvio. 2C-E). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että HDAC1 kerääntyminen RGS10 promoottorit todennäköisesti edistää poistaminen RGS10 in solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja.

A) knockdovvn HDAC1 lisää RGS10 mRNA transkriptio. A2780-AD-solut transfektoitiin HDAC1 siRNA tai valvoa siRNA ja inkuboitiin 72 tuntia. RNA uutettiin ja cDNA luotiin käyttäen alukkeena taaksepäin kohdistuksen RGS10 tai GAPDH koodaavan alueen. Tiedot kvantifioitiin käyttäen qPCR alukkeilla ja koettimilla spesifisiä RGS10 ja GAPDH koodaavat alueet. Graafisesti tiedot osoittavat keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta, jossa virhe baareja ilmaiseva standardi keskivirhe (SEM). Merkittävyys laskettiin Studentin t-testiä ** p 0,005. B) Western blot-analyysi osoittaa, tehokkuutta HDAC1 Knockdown ja RGS10 proteiinin ilmentyminen seuraavien HDAC1 kaataa Beta-Actin valvontaa. C-D) HDAC1 yliekspressio pienenee RGS10 ilmentymistä solunsalpaajaresistentti soluissa. A2780 /AD-soluja maljattiin 24-kuoppaiselle levylle ja annettiin kiinnittyä yön yli. Solut transfektoitiin 500 ng HDAC1 tai tyhjän vektorin käyttämällä FuGene 6-reagenssia (Promega) mukaan valmistajan protokollaa. Seuraavat 48 tunnin inkuboinnin jälkeen solut otettiin talteen Trizol (Invitrogen) ja ilmentymistä RGS10 ja HDAC1 geenien arvioitiin käyttäen RT-PCR: llä, kuten on kuvattu, ja normalisoitiin aktiinin geenin ilmentymistä. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM neljän itsenäisen kokeen *** p 0,0005. E) Western blot-analyysi osoittaa, RGS10 proteiinin ilmentymisen jälkeen, HDAC1 yli-ilmentymisen kanssa Beta-Actin valvontaa.

RGS10-1 promoottori sisältää runsaasti CpG-dinukleotidien joten se potentiaalinen kohde DNMT huoltoa metylaation aikana munasarjojen syövän etenemisessä. Ensin määritettiin Western blot -analyysillä, että DNMT1 ekspressiotasot ovat samanlaisia ​​A2780 ja A2780-AD solulinjoissa (Fig. 3B). Tutkimaan edelleen merkitystä DNMT1 erityisessä tukahduttaminen RGS10 ilmaisun, siru määritykset suoritettiin A2780 vanhempien ja niiden johdannainen kestävä A2780-AD soluissa. Lysaatit immunosaostettiin ohjaus- tai anti-DNMT1-vasta-aine ja siihen liittyvät DNA analysoitiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) käyttämällä spesifisiä alukkeita ja koettimia ulottuu RGS10 ja GAPDH-promoottorit. Toisin kuin kokonaisproteiinin runsautta, siru määritykset osoittavat, että sitoutuminen DNMT1 on huomattavasti klo RGS10 promoottori solunsalpaajaresistentti soluissa verrattuna chemosensitive munasarjasyöpäsoluja (Fig. 3A). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että kertymisen DNMT1 on RGS10 promoottorin todennäköisesti edistää poistaminen RGS10 aikana munasarjasyövän chemoresistance.

A) tasot DNMT1 liittyy RGS10 promoottorit A2780 ja A2780-AD munasarjasyöpä soluja. ChIP määritykset suoritettiin A2780 vanhempien ja niiden johdannainen kestävä A2780-AD soluissa. Lysaatit immunosaostettiin ohjaus tai anti-DNMT1 vasta-aine. Associated DNA eristettiin ja analysoitiin reaaliaikainen PCR käyttäen spesifisiä alukkeita ja koettimia kattavat RGS10 ja GAPDH promoottorit. Reaaliaikainen PCR-arvot normalisoitiin kokonaismäärä promoottori-DNA lisättiin (input). Arvot normalisoitiin GAPDH ja edustavat keskiarvoa ± SEM kolmen erillisen kokeen ** p 0,005. B) Western blot-analyysi globaalin DNMT1 tasoilla A2780 ja A2780-AD soluissa. Solut kerättiin ja lysaatit käytettiin immunosaostukseen. Vasta-aine-konjugoitua agaroosijyväsiä (IP) varten DNMT1 inkuboitiin kierto yön yli. Helmet pestiin, eluoitiin ja alistettiin western blot vastaavien vasta-aineita. C) A2780-AD-solut transfektoitiin DNMT1 siRNA tai ohjaus siRNA ja inkuboitiin 72 tuntia. RNA uutettiin ja cDNA luotiin käyttäen alukkeita taaksepäin suunnattu RGS10 ja GAPDH koodaavat alueet. Tuotetut tiedot kvantifioitiin käyttäen qRT-PCR alukkeita ja koettimia, jotka ovat spesifisiä RGS10 koodaavan alueen. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM neljän itsenäisen kokeen ** p 0,005. D) Western blot analyysi tehokkuuden kaatamalla DNMT1 ja RGS10 proteiinin ilmentyminen seuraavien DNMT1 kaataa.

kertyminen DNMT1 klo RGS10 promoottori sai meidät määrittämiseksi, kertyminen vaikuttaa RGS10 transkriptio ekspressiotaso solunsalpaajaresistentti soluja. Tätä tarkoitusta varten, A2780-AD-solut transfektoitiin DNMT1 siRNA tai ohjaus siRNA. RNA eristettiin ja se tuotti cDNA kvantitoitiin käyttäen qRT-PCR alukkeita ja koettimia, jotka ovat spesifisiä RGS10 koodaavan alueen ja normalisoidaan taloudenhoito geeni GAPDH ilme. Tiedot paljastaa, että kaatamalla DNMT1 lisää merkittävästi endogeenistä RGS10 transkriptioekspressiokuvio (Fig. 3C) ja proteiinin ilmentymisen (Fig. 3d) A2780-AD soluissa. Tämä kasvu viittaa siihen, että DNMT1 toimintoja HDAC1 säännellä tukahduttaminen RGS10 transkription solunsalpaajaresistentti A2780-AD soluissa.

esto HDAC ja DNMT toimintaa tehostaa RGS10 ilmaisua ja vähentää munasarjasyövän solujen elinkelpoisuuden

seuraava pyrittiin määrittämään jos farmakologisen estäjiä histoni deasetyloinnin ja DNA: n metylaatio voi muuttaa ilmaus RGS10 vuonna solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja. HDAC-inhibiittori TSA ja DNMT inhibiittorin 5-atsa-dC käytettiin estämään HDAC: ien ja DNMTs, vastaavasti. A2780-AD-soluja käsiteltiin 500 nM TSA ja inkuboitiin 2 päivää tai käsiteltiin 20 uM 5-atsa-dC ja inkuboitiin 3, 5 ja 7 päivää. Kokonais-RNA eristettiin käsittelemätön kontrolli solut, TSA, ja 5-atsa-käsitellyt DC-solut. Suhteellinen ilmentyminen RGS10 transkriptin ilmentyminen kvantifioitiin qRT-PCR ja normalisoitiin GAPDH transkriptio ilme. Yhdenmukainen havaintojen HDAC1 ja DNMT1 kaataa kokeita, TSA ja 5-atsa-dC hoitoja sekä tehostaa merkittävästi RGS10 transkriptin ilmentymistä solunsalpaajaresistentti A2780-AD-soluissa (kuvio. 4A ja 4B). Tutkitaan mahdolliset synergistiset roolit HDAC1 ja DNMT1 säätelyssä RGS10 ilmaisun, yhdistelmä suoritettiin käyttäen TSA ja 5-atsa-dC solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja. Jälleen, TSA tai 5-atsa-dC yksin parannettu RGS10 ilmentymisen A2780-AD-soluja, ja näiden kahden lääkkeiden johtaa kertaisen kasvun RGS10 ilmentyminen on suurempi kuin summa yksittäisten vaikutuksen, mikä viittaa siihen, mahdollinen yhteistoiminnallinen vaikutus (kuvio . 4C). Tutkimaan yhteistoiminnallinen roolit HDAC1 ja DNMT1 solujen kasvun ja chemoresistance, A2780-AD-soluja käsiteltiin TSA ja /tai 5-atsa-dC: n läsnä ollessa sisplatiinin ja solujen elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin. 5-atsa-dC yksinään vähensi solujen kasvua noin 40%, kun taas TSA yksin oli vaatimaton, mutta merkittävä vaikutus solujen elinkelpoisuuteen; kuitenkin, yhdistelmä TSA ja 5-atsa-dC inhiboi solun elinkelpoisuutta 90%. Kuten odotettua, A2780-AD solut olivat resistenttejä sisplatiinin myrkyllisyyttä, mutta joko TSA tai 5-atsa-dC osittain uudelleen herkistyneet solut sisplatiinin sytotoksisuus (Fig. 4D). Sen määrittämiseksi, RGS10 säätelyä TSA /5-atsa-dC yhdistelmähoito voisi täysin selittää menetys solujen elinkelpoisuuden, yritimme pelastaa solujen elinkelpoisuuden läsnäollessa 5-atsa-dC ja TSA kanssa RGS10 siRNA. Ei ole yllättävää, knock-alas RGS10 yksinään ei pelasta solujen elävyyden, laajojen valikoima HDAC ja DNMT kohdegeenien syöpäsoluissa (Fig. 4E). Näin ollen, RGS10 yhteistoiminnallisesti säätelee solujen elinkelpoisuus ja kemosensitiivisyys ylimääräisiä HDAC ja DNMT kohdegeenien.

Kokonais-RNA eristettiin käsittelemätön kontrolli solut ja TSA tai 5-atsa-käsitellyt DC-solut. Suhteellinen ilmentyminen RGS10 mRNA kvantifioitiin qRT-PCR ja normalisoitiin GAPDH transkriptioekspressiokuvio * p 0,05; ** P 0,005. A) HDAC esto lisää RGS10 ilmentymistä solunsalpaajaresistentti A2780-AD soluissa. Solut maljattiin 10 cm:

2 levyä ja inkuboitiin 24 tuntia. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin 500 nM TSA ja inkuboitiin vielä 48 tunnin ajan. B) DNMT estäjä 5-atsa-dC tehostaa RGS10 ilmentymistä solunsalpaajaresistentti soluissa. Kaksi miljoonaa A2780-AD-soluja ympättiin 10 cm:

2 levyille ja inkuboitiin 24 tuntia. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin 20 uM 5-atsa-dC. Media ja huumeiden oli päivittyy 24 tunnin välein. Sen jälkeen kun ilmoitettu inkubaatioajan (3, 5, ja 7 päivää), solut kerättiin talteen, mRNA eristettiin, ja cDNA luotiin ja kvantifioitiin käyttäen qRT-PCR: ää, jossa spesifisiä alukkeita ja koetinta. C) A2780-AD-soluja maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin 5 uM 5-atsa-DC 5 päivää, 500 nM TSA 36 tuntia, yhdistelmä 5 uM 5-atsa-DC 5 päivää ja 500 nM TSA Lopullisessa 36 tuntia tai DMSO. Geenien ilmentyminen arvioitiin käyttämällä qRT-PCR: ää, kuten on kuvattu, ja normalisoitiin RPL13A geenin ilmentymistä. Nuoli osoittaa, että ilmentymisen taso ennustaa additiivinen vaikutus TSA ja 5-atsa-dC. D) Rinnakkaisessa kokeessa, A2780-AD-soluja käsiteltiin samoissa olosuhteissa kuin 4C tai ilman 30 uM sisplatiinin lopullinen 12 tuntia. Solujen eloonjäänti arvioitiin käyttämällä CellTiter-Blue fluorimetrisella luelinkykymäärityksillä. ***: P 0,001 verrataan epigeneettisellä lääkeainetta DMSO-kontrollin puuttuessa sisplatiinia. ###: P 0,001 vertaamalla ajoneuvon versus sisplatiinihoitoon sisällä epigeneettisellä lääkehoitoa ryhmiä. Katkoviivalaatikossa ilmaisee solujen elävyyden ennustaa lisäävä vaikutus TSA ja 5-atsa-dC. E) A2780 /AD-solut (5000 solua /kuoppa) maljattiin 96-kuoppalevylle ja transfektoidaan negatiivinen kontrolli tai RGS10 siRNA-dupleksit (Ambion Grand Island, NY) kohti valmistajan protokollaa käyttäen Dharmafect1 transfektioreagenssia (Dharmacon). Soluja annosteltiin yhdistelmä 5 uM 5-atsa-DC 3 päivää ja 500 nM TSA viimeisen 36 h tai DMSO. 30pM sisplatiini tai ajoneuvon lisättiin viimeisten 12 h. Solujen eloonjäänti arvioitiin käyttämällä CellTiter-Blue fluorimetrisella luelinkykymäärityksillä.

kaatamalla HDAC1 lisää sisplatiinin stimuloimaa apoptoosin solunsalpaajaresistentti soluissa

edellinen työ osoittaa, että suppressio RGS10 ilmaisun myötävaikuttaa kehittäminen chemoresistance aikana munasarjasyövän etenemisen läpi monistamisen endogeenisen selviytymisen signalointireittien [2], [15], ja tulokset esitetään tässä viittaavat siihen, että HDAC1 edistää menetys RGS10 ilmentymisen solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja. Määrittää HDAC1-välitteisen muutoksia solujen selviytymisen solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja, sisplatiini kestävä A2780-AD-solut transfektoitiin HDAC1 siRNA. Transfektion jälkeen soluja inkuboitiin 50 uM sisplatiinin ja apoptoosi analysoitiin käyttämällä anneksiini V: PE apoptoosin detektioreagenssipakkaus (BD Pharmingen). Anneksiini V: sitoo fosfatidyyliseriini, joka altistuu vain apoptoottiset solut, kun taas kalvo läpäisemätön DNA etiketti 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) sitoutuu selektiivisesti GC alueille DNA vasta myöhään apoptoottiset tai kuolleita soluja, joilla on heikentynyt kalvot [30] – [32]. Siten varhainen apoptoottiset solut värjätään vain anneksiini V-PE, vaikka myöhäinen apoptoottiset ja kuolleet solut värjätään sekä anneksiini V-PE ja 7-AAD. Virtaussytometria-analyysiä käytetään erottamaan populaatioiden leimaamatonta ja singly- tai kaksinkertaisesti leimattuja soluja. HDAC1 kaataa huomattavasti väestön sisplatiinin stimuloiduista 12,9%: sta 32,1%, jotka ovat positiivisia sekä anneksiini V-PE ja 7-AAD (myöhäinen apoptoottiset tai kuolleet solut) (Fig. 5A). Tulokset vahvistavat kolmen erillisen kokeen (kuvio. 5B). Knock alas tehokkuutta HDAC1 ja RGS10 proteiinin ilmentymisen jälkeen HDAC1 kaataa vahvistettiin A2780-AD-solujen Western blot analyysi (kuvio. 5C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että HDAC1 välitteinen väheneminen RGS10 ilmentymisen pilaa kyky sisplatiinin indusoimaan solukuolemaan A2780 /AD munasarjasyöpäsoluja.

A2780-AD-soluja käsiteltiin HDAC1 siRNA tai valvoa siRNA ja inkuboitiin 48 tuntia. Inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin 50 uM sisplatiinin ja inkuboitiin lisäksi 48 tunnin ajan RPMI 1640 media. Anneksiini V: PE Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen) käytettiin värjäystä; tulokset kvantifioitiin virtaussytometrialla analysointia ja analysoitiin käyttämällä FlowJo ohjelmistoa. Elävät solut olivat negatiivisia molempien anneksiini V-PE ja 7-AAD; varhainen apoptoottiset solut olivat positiivisia anneksiini V-PE ja negatiivinen 7-AAD, kun taas myöhäinen apoptoottiset kuolleet solut olivat positiivisia sekä anneksiini V-PE ja 7-AAD merkintöjä. A) suhteellinen kasvu apoptoottisten solujen HDAC1- siRNA transfektoiduissa A2780-AD soluja, jotka sisällytetty anneksiini V-PE ja 7-AAD tahroja. B) Kaavio edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen, jossa virhe baareja ilmaiseva SEM * p 0,05. C) Western blot-analyysi edustaa tehokkuutta HDAC1 Knockdown ja RGS10 proteiinin ilmentyminen seuraavien HDAC1 kaataa.

DNMT1 kaataa vähenee HDAC1 sitoutumalla RGS10 promoottori solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja

HDAC1 ja DNMT1 edistää geenin hiljentäminen palvelukseen transkriptiorepresso- promoottori alueille [33] – [35] ja yhdessä tukahduttaa geenin ilmentymisen [24], [36]. Tuloksemme viittaavat siihen, että HDAC ja DNMT toiminta yhteistoiminnallisesti hiljentää RGS10 (Fig. 4C). Tutkimaan ylikuuluminen näiden kahden epigeneettisiä säätölaitteet, A2780-AD-solut transfektoitiin DNMT1 siRNA tai ohjaus siRNA ja inkuboitiin 72 tuntia. HDAC1 sitoutuminen RGS10 promoottori tutkittiin ChIP määrityksissä DNMT1 siRNA tai ohjata siRNA käsitelty A2780-AD soluissa. DNMT1 kaataa merkittävästi vähentynyt sitoutuminen HDAC1 että RGS10 promoottori (Fig. 6A) ja western blot-analyysi (Fig. 6B) osoittivat onnistunut ja erityisiä knockdovvn DNMT1. Päinvastaista koe suoritettiin myös missä A2780-AD-solut transfektoitiin HDAC1 siRNA. Western blot-analyysi osoitti, knockdovvn HDAC1 johti suppressio DNMT1 proteiinin ilmentymisen (tuloksia ei ole esitetty); havainto nähdä muut samoin [37]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että HDAC1 rekrytoimista RGS10 promoottori kautta DNMT1 ja metyyli-CpG sitovan proteiinin 2 (MeCP2) riippuvainen mekanismeja (Fig. 6C).