Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useimmat miehet diagnosoitu eturauhasen syöpä tulee olemaan veltto ja parannettavissa tauti, kun taas noin 15% näistä potilaista nopeasti edetä on kastraatiotason kestäviä ja etäpesäkkeitä korkea sairastuvuus ja kuolleisuus. Siksi tunnistaminen molekyylimerkkiaineet (t), jotka tunnistavat miehet vaarassa etenee tauti on edelleen puristus- ja silti tyydyttämätön tarve näille potilaille. Tässä käytimme integroitu löytö alusta yhdistämällä eturauhassyövän solulinjoissa, Siirtogeenisen Adenokarsinooma Hiiren eturauhasen (TRAMP) malli ja kliinisesti-selityksin ihmisen kudosnäytteiden tunnistaa menetys ilmentymisen mikroRNA-34b johdonmukaisesti liittyy eturauhassyöpään uusiutumisen. Mekanistisesti, tämä liittyi epigenetiikka hiljentäminen MIR34B /C-lokuksen ja kohonnut DNA kopioluvun menetys, selektiivisesti androgeeniriippuvaisissa eturauhassyöpä. Puolestaan ​​menetys miR-34b johti loppupään sääntelyn ja yli-ilmentyminen ”stemness” merkki, Sox2. Nämä havainnot tunnistaa menetys miR-34b kestäväksi biomarkkeri eturauhassyövän etenemisen androgeeni herkkien kasvainten, ja ennakoida mahdollista asemaa esisolujen /kantasolujen signalointia tässä vaiheessa taudin.

Citation: Forno I, Ferrero S, Russo MV, Gazzano G, Giangiobbe S, Montanari E, et al. (2015) Puretaan MiR-34b /Sox2 ennustaa eturauhassyövän eteneminen. PLoS ONE 10 (6): e0130060. doi: 10,1371 /journal.pone.0130060

Academic Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 16 helmikuu 2015; Hyväksytty: 15 toukokuu 2015; Julkaistu: 24 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Fornon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot on sisällä paperin ja tukeminen Information tiedostoja. Lisäksi TLDA array raakadata on sisällytetty tietoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Fondazione Cariplo kanssa palkinto n. 2010-0846 (SB) (https://www.fondazionecariplo.it/it/index.html) ja National Institutes of Health myöntää CA140043 (jotta LRL ja DCA) ja CA190027 (DCA) (http: //apurahat .nih.gov /apurahat /oer.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin diagnosoitu sisäelinten maligniteetti miesten keskuudessa kaikkialla maailmassa. Yhdysvalloissa PCA osuus 26% kaikista uusista syöpätapauksista ja 9% koko syöpään liittyvien kuolemien, sijoitus toinen keuhkosyöpään. Todennäköisyys sairastua eturauhassyöpään syntymästä kuolemaan on 1 7, korkein esiintyvyys miehillä yli 70-vuotiaille [1]. Vaikka useimmat miehet diagnosoitu eturauhasen syöpä tulee olemaan veltto ja parannettavissa taudinkulku, noin 15% näistä potilaista näyttää nopeasti etenevät, hoitoresistenteillä ja etäpesäkkeitä luihin ja sisäelimissä korkea sairastuvuus ja kuolleisuus [2]. Koska ei ole luotettavia keinoja tunnistaa potilaiden riski metastaattisen levittämisen hetkellä saatavilla [3], haku molekyyli allekirjoitus (t) sairauden etenemisen, erityisesti siirtyminen castrate-vastus [4] on kiireellinen ja yhä pitkälti lääketieteellinen tarve vuonna hallinnassa eturauhassyövän diagnoosia.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaus, endogeeninen RNA: iden pleiotrooppinen toiminnot geenin ilmentymisen [5,6]. Tämä polku on dramaattisesti hyödynnetään syövän, ja erilaisia ​​miRNA on liitetty vapautuneilla onkogeeniset tai tuumorisuppressoriproteiinia väyliä [7,8]. Vastavuoroisesti kuljettajat maligniteetin, mukaan lukien DNA aberraatioita, transkription sääntelyn purkaminen ja epigenetiikka hiljentäminen myötävaikuttaa poikkeava miRNA ilmaisun [9,10]. Heidän vakautta biologisissa nesteissä [11], ja suhteellisen helppo havaita kliinisissä näytteissä [12], miRNA on harjoitettu kasvainten biomarkkereita [8], niiden mahdollisen ennalta ehkäisevän tai ennusteen arvioinnissa potilailla, joilla rintojen [13], maksa [ ,,,0],14,15], tai keuhkojen [16] syöpä. Vapautettiin miRNA ilme on myös havaittu eturauhassyöpä, verrattuna normaaliin epiteelin [17-19], ja joissakin tapauksissa liittyy metastasoituneen levittämiseen [20-22], mutta lopullinen allekirjoitus (t) sairauden etenemisen, erityisesti kastroida-vastus, ei ole tunnistettu.

tässä tutkimuksessa käytimme integroitu löytö alusta yhdistämällä vakiintuneet solulinjat, geneettinen hiirimallissa taudin etenemistä, ja ensisijainen potilaan näytteitä profiloida ero miRNA ilmentymistä eturauhassyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

kliiniset näytteet

kliiniset ja patologiset parametrit PCa potilaiden tai eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) tutkittu näissä tutkimuksissa on kuvattu taulukossa 1. maailmanlaajuisesti me haetaan arkistointiin kudosten ja kliiniset tiedot 192 potilasta, joille tehtiin leikkaus 2004-2006 San Paolo sairaala tai Fondazione IRCCS Ca ’Granda sairaalat Milano (Italia), alle protokolla hyväksymä Institutional Review Boards (IRB) San Paolo sairaala (koodi 10664 ) ja Fondazione IRCCS Ca ’Granda-Ospedale Maggiore Policlinico (koodi 1381/11). Koska taannehtivuus Tutkimuksen ja tietojen käyttöä nimettömäksi käytäntöjen tarve kirjallinen suostumus luovuttiin. Seuranta koostui aktiivista seurantaa potilaista peräkkäisen mittaamalla seerumin eturauhasen antigeenin (PSA) tasot. PCA potilaille, biokemiallisten toistuminen määriteltiin kahtena peräkkäisenä PSA-arvot yli 0,2 ng /ml.

molekyylitason analyysit tapauksissa on ollut tyydyttävä RNA sisältö (260/280 absorbanssisuhde 1,2 ja 2.1 ja 500 ng kokonais-RNA) on ainakin vastaaviin normaaleihin ja kasvaimen eturauhanen näyte potilasta kohden. Kuusikymmentäkuusi potilasta 192 arvioi tyytyväisiä nämä kriteerit ja viisikymmentä niistä myös eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN) leesion oli saatavilla. Siksi lajiteltu potilaiden ensimmäinen alijoukko täydellinen tavanomaiset, PIN ja PCa kudoksissa (n = 50, sarja A; taulukko 1), ja toisessa osajoukko koostuu jäljelle jäävistä potilaista vain vastaaviin normaaleihin ja kasvaimen näytettä (n = 16, sarja B, taulukko 1). Epiteelikudoksissa normaalin eturauhasen, PIN ja PCa olivat erikseen hakea iskemällä arkistomateriaalia lohkojen 1 mm neula kuvatulla [23]. Kukin näyte jatkuvasti ylittänyt 80% puhtaus vuonna epiteelisolujen sisältöä. Normaali kudos näytteenotto suoritettiin etäisyydellä vähintään 2 cm: n päässä kasvainkudoksessa. Täysi sarja osallistuvilla potilailla tässä tutkimuksessa (n = 192, sarja C, taulukko 1) oli tarkoitus rakentaa kuusitoista kudoksen mikro paneelit (TMA) lohkot [24] immunohistokemiallista arviointia.

BPH näytteitä (n = 10) olivat potilailla, joille tehtiin höyläysleikkaus eturauhasen (TURP) at Fondazione IRCSS Ca ’Granda Hospital (Milan), joille eturauhasen kartoitus oli negatiivinen PCA ja seurattiin vähintään 3 vuotta (sarja BPH, taulukko 1). Tämä sarja ei sisälly TMA alustan ja koko kudoksen leikkeitä käytettiin joko molekyyli- tai immunohistokemiallista analyysejä.

Solulinjat

Ihmisen eturauhasen solulinjojen RWPE-1, BPH-1, LNCaP, DU145 ja PC3-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Normaali solulinja RWPE-1 viljeltiin Keratinosyyttien Serum-Free Medium, jota oli täydennetty 5 ng /ml EGF: ää, 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta, ja 1% Pen-Strep: antibiootteja cocktail. Kaikki muut solulinjat viljeltiin RPMI, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% Pen-Strep. Soluviljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Sillä miRNA transfektion jälkeen solut siirrostettiin 5×10

5 kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyillä, ja transfektoitiin 150 pmol miR-34b estäjä (a-miR-34b, HSTUD0511), tai miR-34b esiaste (p- miR34b, HMI0511), tai vastaava ei-kohdesekvenssien (a-Ctrl tai p-Ctrl, vastaavasti HMC0002 ja NCSTUD001) läsnä ollessa Lipofectamine 2000 (Life Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA), kuten on kuvattu [25]. Kaikki miRNA-molekyylit olivat Sigma Aldrich, Milan, Italia.

Laser-avusteinen mikrodissektion eturauhasen vaurioiden siirtogeenisestä Adenokarsinooma Hiiren eturauhasen (TRAMP) hiiret

Arkistointi kudosblokeista sekä virtsa, kuten virtsarakon, rakkularauhaset ja eturauhasen viidestä TRAMP hiiriä käytettiin [26,27]. Kaikki hiiret olivat kehittäneet eturauhasen kasvaimia ja lopetettiin 24 viikon iässä. Kaikki eläinkokeet on tarkistanut ja hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komitean Thomas Jefferson University. Epämukavuutta ja vahinkoa eläimille on rajoitettu siihen, mikä on väistämätöntä kulusta tieteellisesti arvokasta tutkimusta. Kaikki koetoimenpiteet toteutetaan osana tätä tutkimusta noudattavat hyväksyttyjen käytäntöjen varmistaa korkeimpia inhimillinen hoito eläimille. Kipulääkkeet, anesteetit ja rauhoittava lääkkeitä on käytetty määritettynä eläinlääkintähenkilöstön. Eutanasia on suoritettu hoitaa CO

2 anestesian. Tämä menetelmä on yhdenmukainen suositusten 1316 paneelin eutanasia of American Veterinary Medical Association.

Eturauhasen näytteitä TRAMP hiiriä rikastuneet PIN tai eturauhasen kasvaimia (S1 kuvio) laser-avusteinen mikrodissektion (LMD; Leica Microsystems, Milano, Italia) epiteelin vaurioiden, kuten on kuvattu [28]. Sillä miRNA profilointi, PCa tai PIN kudosten eri eläinten (n = 5 ryhmää kohti), yhdistettiin.

RNA puhdistus, retrotransskription ja microRNA profilointi

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen MasterPure RNA Purification Kit (Epicentre Biotekniikka, Madison, WI, USA), kuten on kuvattu [28], ja retro- transskriboidun käyttämällä Megaplex RT alukkeita ihmisen tai Jyrsijöiden altaat A ja B v3.0 ja Taqman MicroRNA Käänteinen transkriptio kit. Hiiren näytteitä esi-monistettiin käyttämällä Megaplex PreaAmp aluketta Jyrsijöiden altaat A ja B. Ihmisen tai jyrsijän TaqMan low-density paneelit (TLDA), sitten suoritettiin miRNA profiloinnin eturauhassyövän solulinjoissa tai TRAMP eturauhaskudoksista, vastaavasti. Ihmisen TLDA sisältää 754 miRNA ja 4 endogeenisen nucleolar RNA: t (RNU44, RNU48 ja U6snRNA), kun taas jyrsijä TLDA sisältää 750 miRNA, ja 6 valvonta RNA: t, joista 675 miRNA ja kolme endogeenisen valvonta (snoRNA135, snoRNA202 ja U6snRNA) ovat spesifisiä hiiren. Sekä ihmisen ja jyrsijä alusta sisältää yhden negatiivisen kontrollikoettimen (ATH-miR-159) korttia kohden. Sillä validointi, kahdeksantoista valittu miRNA plus viite selostukset (U6snRNA, RNU48, RNU44, ja RNU24) ja kaksi negatiiviset kontrollit (ATH-miR-159a ja hyvin ilman detektiokoetinta) analysoitiin ihmisen näytteistä (sarja A, B ja BPH; taulukko 1) käyttämällä mukautettua RT ja Esivahvistustaso alukkeita altaat yhdessä mukautetun TLDA alustaa ennalta täplikäs alukkeita ja Taqman. Kaikki reagenssit, sarjat ja instrumentoinnin käytettävien miRNA profilointiin olivat Life Technologies Inc. (nyt osa Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA).

metyloituvuutta MIR34B /C CpG-saarekkeen

genominen DNA puhdistettiin 4 eturauhasen solulinjojen (RWPE-1, BPH-1, LNCaP, DU145), 16 PCA ja 12 normaalin eturauhasen kudoksia (sarjasta B), ja 10 BPH (sarja BPH) näytteitä käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Waltham, MA, USA). Natriumbisulfiittia muuntaminen DNA: ta (400 ng) suoritettiin käyttäen EZ DNA Metylointi-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). Metylaatiospesifinen polymeraasiketjureaktio (MSP) on CpG-saarekkeen ylävirtaan MIR34B /C-lokus suoritettiin, kuten on kuvattu [29], käyttäen seuraavia alukkeita havaitsemista varten metyloitumattoman (UM) tai denaturoitua (M) alue: UM-eteenpäin 5 ’ – TGTTTTTTGGTGAAATGGGGTTTGAGGT-3 ’UM-käänteinen 5′- CCTACAAACCAAACACCAAACACCCACA3’; M-eteenpäin 5’CGGTGAAATGGGGTTCGAGGC-3 ’M-reverse 5′- CCGAACACCGAACACCCGCG-3’. Terminen profiili oli 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 95 ° C 1 min, 65 ° C 1 min, ja 72 ° C 1 min 45 sykliä ja tämän jälkeen 72 ° C: ssa 7 min.

Kopioi numero vaihtelu (CNV) analyysi

Perimän muunnelmia 11q23.1b klusterin ja viereisen loci analysoitiin TaqMan kopioluvun määritys suhteessa vertailutasoon geeni RNaasi P kuvatulla [30]. Määrityksessä tunnistenumerot olivat seuraavat: Hs00608392_cn (CNV # 1; tarkka sijainti 111383042), Hs03049129_cn (CNV # 2; tarkka sijainti 111368721) ja Hs06336326_cn (CNV # 3; tarkka sijainti 81902545). Vaihtelut DNA kopiomäärä kvantitoitiin käyttämällä Copy soittajan ohjelmistoja. Kaikki määritykset, reagenssit ja ohjelmistot olivat Life Technologies Inc.

miR-34b tavoitteet ilmentymisen analyysi

Hyperplastista (BPH-1) tai kasvain (LNCaP ja DU145) eturauhasen solulinjat transfektoitiin miR -34b matkivat /estäjän tai säätimet 72 tunnin ajan, ja kokonais-RNA puhdistettiin, kuten edellä on kuvattu. Sitten DNA-vapaa kokonais-RNA käänteistranskriptio sattumanvaraisia ​​heksameerejä ja Sox2, CDKN1A, MET, c-MYC, HES1 geenien ilmentyminen (TaqMan Gene Expression Analyysit) oli verrattain määrä määritetään viite transkripti (beeta-2-mikroglobuliini) by Real- Time PCR (qPCR). Kaikki reagenssit ja välineet olivat Life Technologies Inc. Target ilmentyminen laskettiin sitten käyttäen 2 ^

-ΔCt kaava, mediaani normalisoitu ja log2 muuttaneet lämmön kartta tuottamalla dChip softare (DNA-Chip Analyzer, www.dchip.org) kuten on kuvattu [9].

immunoblottauksella

Solut kerättiin talteen 72 h transfektion jälkeen miRNA jäljittelee /estäjän ja liuotetaan 100 ul: ssa hajotuspuskuria, jota oli täydennetty proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Basel, Sveitsi) , kuten on kuvattu [25]. Alikvootit (50 ug) kutakin solulysaattia koetettiin 1 ug /ml seuraavia primaaristen vasta-aineiden c-Myc (klooni D84C12; Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, USA), Sox2 (klooni D6D9; Cell Signaling Technologies), tai Notch1 (klooni A-8; Santa Cruz Biotekniikka, Santa Cruz, CA, USA). β-tubuliinia (Sigma Aldrich) käytettiin latauskontrollina. Reaktiiviset bändit visualisoitiin ECL Plus (GE Healthcare, Milano, Italia).

eturauhaskudoksiin mikrosirut (TMA) rakentaminen ja immunohistokemia (IHC) B

Kustakin 192 PCa potilaat (sarja C ; taulukko 1), neljä ydintä eturauhasen kasvain, yksi ydin PIN ja yksi ydin normaalia parenchyma jos saatavilla käytettiin rakentamiseen 22 TMA lohkoja, kuten on kuvattu [24], jossa muutokset [23]. FFPE kudoksia potilailta BPH (sarja BPH, taulukko 1) käytettiin täyden kohdissa eikä niitä ole sisällytetty TMA. Neljä um: n paksuisia leikkeitä kustakin lohkosta värjättiin vasta-aineella Sox2 (1: 100, Cell Signaling), diaminobentsidiinillä (DAB) kromogeenina. Immunohistokemia suoritettiin käyttämällä Benchmark Ultra Roche Ventana immunostainer (Roche Group, Tucson, AZ, USA). Kaikki objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä. Kaksi patologit (GG ja SF) sokeita kliinisiä tietoja arvioidaan ja teki kaikki dioja. Kun poikkeamia tapahtui, asia tarkistetaan uudelleen päästä sopimukseen pisteet. Vain reaktiivisuus ydinvoiman Sox2 epiteelisoluissa eikä pohjapinta myoepithelial osastossa nauhoitettiin ja prosenttiosuus immunoreaktiivisten solujen PCa näytteiden keskiarvo joukossa neljä ydintä samasta potilaasta. Aiempien raportissa [31], Sox2 immunoreaktiivisuus sitten luokiteltu neljään ryhmään ja tulokset siirrettiin siis seuraavasti: pisteet 0 (negatiivinen tumavärjäystä), 1 (1-10% ydinvoiman Sox2), 2 (11-50% ydinaseiden Sox2), 3 (yli 50% ydinvoiman Sox2).

tilastollinen analyysi

miRNA suhteelliset määrät (RQ) saatiin tuovat raaka TLDA datatiedostoja DataAssist ohjelmisto (Life Technologies Inc .) käyttäen arvoa 35 kuin kynnysarvo suurimman sallitun Ct ja globaali normalisointi kohde kvantifiointiin. RQ-arvot sitten log2 muuntuvat ja tuodaan BRB ArrayTools (https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) kun Anova tai differentiaalikaavojen analyysit tehtiin kuvatulla [15]. Korrelaatioparametrit välillä miRNA ilmaisun ja kliinis muuttujat johdettiin käyttämällä U-testi, Friedman testin tai chi-neliö testi jatkuvat tai erilliset muuttujan vastaavasti käyttäen GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) tai MedCalc ( Mariakerke, Belgia) tilastollinen paketti. Vastaanotin toimii ominaisuudet (ROC) käyriä menetelmää käytettiin testaamaan tarkkuutta miRNA oikein syrjiä hyvänlaatuinen sairaus, PIN tai eturauhassyöpä, ja tunnistaa potilaat, joilla oli PSA vika (PSA 0,2 ng /ml vähintään kaksi peräkkäistä kertaa) seuranta-aikana, kuten on kuvattu [15]. dChip ohjelmistoa käytettiin ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi.

In vitro

kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa, ja tulokset on ilmoitettu keskiarvona ± SD, ellei toisin mainita. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

miRNA allekirjoitukset Eturauhassyöpä mallien

aloitti tämän tutkimuksen profilointi ilmentymistä miRNA paneeliin eturauhassyövän solutyyppejä eri Tuumorigeenisuustutkimuksissa (S1 File) ja TRAMP hiiriä (S2 File). Näissä kokeissa miRNA ilmentymisen helposti eriytetty androgen-epäherkkä (DU145 ja PC3) peräisin herkkä eturauhassyövän solutyypeissä (kuvio 1A). Niinpä ei-tuumorigeeniset RWPE-1 ja BPH-1 solulinjoissa (kuvio 1A) ryhmittyneet erillään aggressiivisempi, LNCaP. Me seuraavaksi valitaan miRNA kahden kriteerin perusteella: 20-kertainen ero androgen-herkkien tai erottelua solutyyppejä ja ei-tuumorigeeniset RWPE-1 tai tuumorigeenisiä LNCaP (kuvio 1 B) (i), ja huomattavia eroja (p 0,05 ANOVA) ilmentymisessä normaalin, hyperplastinen, androgen-herkkien ja erottelua soluja (kuvio 1 C) (ii). Nämä analyysit tunnistettu 18 miRNA, ja 16 näistä selostukset oli hiiren ortologeihin (kuvio 1 D).

A) Heat-kartta globaalin miRNA profiilien (≈750 miRNA) ei-tuumorigeenisiä (RWPE-1, normaali) , hyperplastinen (BPH-1), androgeeniriippuvainen (LNCaP, AR

sens-PCA) tai riippumaton (DU145 ja PC3, AR

ins-PCA) syöpäsolujen. Punainen, yli-ilmentyminen; sininen, alle-ilme, vastaavasti. B) scatterplots kaaviot tehtiin välillä androgeeniriippuvaisen ja riippumaton PCa solujen ja normaalien eturauhasen solujen ja AR

sens PCa solujen valita miRNA kanssa differentiaalikaavojen jompaankumpaan suuntaan (fold-muutos) vähintään 20 taittuu. Luettelo 41 miRNA samanaikaisesti muuteta molemmissa vertailuissa syntyi. C) Kaaviokuva valintakriteerit hyväksyttiin tunnistaa miRNA mahdollisesti liittyviä PCa. D) Kahdeksantoista miRNA allekirjoitukset tunnistetaan C varmistettiin qPCR annettuina eturauhasen soluja. Kaikki miRNA paitsi kaksi (miR-577 ja miR-886-3p) oli hiiren ortologeihin. Punainen, valkoinen ja sininen lämpöä-kartan kannalta parempi, yhtä suuri tai pienempi miRNA ilmaisun näytteissä suhteen mediaani miRNA arvoon.

Seuraava suoritetaan globaali miRNA profilointi LMD PIN tai tuumorileesioissa maasta TRAMP hiirillä (kuvio 2A), käyttäen 20-kertainen cutoff ero miRNA ilmaisu kahden näytteen (kuvio 2B). Yksi satoja kaksikymmentäyksi miRNA täytti nämä kriteerit (kuvio 2B ja 2C), ja 61 miRNA oli ihmisen ortologeihin (S1 taulukko). Tässä analyysissä, vain neljä miRNA oli ekspressoituu differentiaalisesti sekä ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja kasvaimen näytteitä TRAMP-hiirissä, kuten miR-34b-3p, miR-34c-5p, miR-138, ja miR-224 (kuvio 2C ja 2D ). Näin ollen ilmaisu profiili näiden neljän MikroRNA osoittaneet, että androgeeni-riippumaton DU145 tai PC3-solut liittyvät läheisemmin TRAMP kasvaimia, kuin muut ihmisen solulinjoja (kuvio 2D).

A) Global miRNA profilointi eturauhassyövän (PCA) tai eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN) leesioita eristetty TRAMP hiirillä. B) scatterplot kaavio miRNA kanssa differentiaalikaavojen vähintään 20 taittuu välillä PIN ja PCa kudosten TRAMP hiirillä. Tunnistetuista 121 vapautettu miRNA (S1 taulukko) 61 oli ihmisen ortologeihin. C, D) vertailu merkittäviä miRNA allekirjoituksia eturauhasen solulinjojen ja TRAMP vaurioita. Vain neljä miRNA olivat yhteisiä kahden kokeellisissa järjestelmissä. Expression analyysillä, jota seuraa ilman valvontaa hierarkkinen ryhmittely D) miR-224, -34b-3p, -138 ja miR-34c-5p paljastaa, että androgeenista riippumaton eturauhassyöpä solut ovat samanlaisia ​​kuin TRAMP kudoksiin kuin androgeeniriippuvaisen tai ei-tuumorigeenisiä eturauhasen ihmisen soluja.

LNCaP PCa malli kuvastaa miRNA sääntelyn ihmisen eturauhasen sairauksien

vieressä tutki miRNA tunnistettu edellä (n = 18) sarjassa 50 potilasta (A-sarjan ; taulukko 1), joiden kirjo vaurioita kuten PCA PIN ja normaali epiteelin. MiR-31, miR-34b-3p, miR-205, miR-224 ja miR-452 osoitti ero ekspressiotasot normaalin, PIN ja PCa Hyväksytty näytettä (p 0,01 Friedman testi; kuvio 3). Kaikki miRNA olivat alassäädetty PCA verrattuna normaaliin epiteelin, yhteensovitus saadut tulokset LNCaP, RWPE-1 tai BPH-1 solutyyppejä (kuvio 1 D).

Hyväksytty normaalia eturauhasen rauhaset, eturauhasen intraepiteelisen neoplasia (PIN ) ja eturauhassyöpä (PCa) leesiot saatavilla 50 potilasta testattiin ekspressiotasot kahdeksantoista valitun miRNA. MiR-31, 34b-3p, 205, 224 ja miR-452 näytetä merkittävästi muuttunut tasojen kolmen kudoksen luokkaa (p 0,01 Friedman testi). Bars, keskiarvo ± SEM. RQ, suhteellinen miRNA määrä.

Seuraava keskittynyt näihin viiteen miRNA, ja tutkitaan niiden mahdollisia yhteyksiä kliinisiin parametreihin Eturauhassyövän eteneminen, kuten biokemialliset toistuminen (kahden perättäisen PSA-arvot 0,2 ng /ml aikana seuranta), Gleason (GS ≤7

vs

GS 7), kasvaimen koko (T2

vs

T3-T4 PCA) ja imusolmukkeiden etäpesäkkeitä. Lisätietoja validointi, käytimme ylimääräinen, riippumaton joukko kuudentoista potilaista (sarja B taulukossa 1) varten kokonaismäärä 66 analysoitu PCa. Tässä analyysissä vähennetään miRNA tasot korreloivat kliinis-patologinen etenemistä PCa (taulukko 2), ja ero ilmentyminen mir-31, miR-34b-3p ja miR-452 voisi merkittävästi syrjiä potilaat mukaan biokemiallisia uusiutumisen (kuvio 4A). Seuraavaksi kysyimme, onko sama, viiden miRNA voisi syrjiä PIN ja PCa vaurioita, mikä samanlainen suhde BPH-1 ja LNCaP-soluissa. Näitä kokeita, arvioimme kymmenen potilasta, joille tehtiin TURP BPH (sarja BPH taulukossa 1), ja seurattiin vähintään 3 vuotta Fondazione IRCCS Ca ’Granda Hospital. Sekä miR-31 ja miR-34b-3p oli ilmennetty eri välillä PIN tai PCa näytteitä ja BPH (p 0,001 Mann Whitneyn testi; kuvio 4B). Toisin kuin profiilin havaittiin solulinjoissa, miR-34b-3p nousivat yli kymmenen taittuu BPH näytteissä verrattuna PIN tai PCa. Lopuksi ilmentyminen miR-34b-3p tarkasti syrjinyt PIN tai PCA näytteitä BPH, mukaan ROC-analyysi (p 0,0001; S2 Kuva). MiR-205 ilmentymisen taso oli pienempi BPH verrattuna PIN (p = 0,0027; kuvio 4B). Toisaalta miR-452 ja miR-224 ei ilmennetty eri välillä PCa ja BPH tai välillä PIN ja BPH, vastaavasti (kuvio 4B).

A) Receiver operating (ROC) käyriä käytettiin testaamaan tarkkuutta of miRNA tunnistaa potilaat, joilla oli PSA vika seuranta-aikana. AUC; Käyrän alapuolinen alue; CI, luottamusväli. B) MiR-31, 34b-3p, 205, 224 ja miR-452 ilmentyminen arvioitiin qPCR in parittomia syöpää edeltävän rauhaset (PIN, n = 50), neoplastisia eturauhasen vaurioita (PCA, n = 66), tai hyvänlaatuinen hyperplastisessa kudosten (BPH, n = 10). **, P = 0,0027; ***, P 0,001, kaikki Mann-Whitneyn testi. Bars, keskiarvo ± SEM. RQ, suhteellinen miRNA määrä.

MiR-34b tukahduttaminen on biomarkkereiden Eturauhassyövän

MiR-34b ja miR-34c transkriboidaan samasta lokukseen kromosomissa 11 ( sytogeneettinen bändi 11q23.1; kuvio 5A), ja niiden ilmentyminen säätelee epigenetiikka, kuten CpG-saarekkeen metylaation [29], ja p53-toiminto [32]. Siksi tutkimme BPH potilaille, osajoukko PCa näytteistä (satunnaisesti valittu sarja B, taulukko 1), normaali eturauhasnäytteissä, ja ei-tuumorigeeniset tai invasiivisia eturauhasen solulinjojen mahdollisten alleelinen kopioluvun vaihtelua, ja metylaatiostatuksen CpG saari MIR34B /C-lokuksessa (kuvio 5B-5G).

A) kaaviokuva ihmisen MIR34B /C lokuksen kromosomissa 11q. B, C) miR-34b-3p ja miR-34c-5p ilmentymisen ilmoitettu näytteiden normaalin eturauhasen (pooli 10 näytettä), hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH), eturauhasen syöpä (PCa) tai ei-neoplastisten (RWPE-1) , hyperplastinen (BPH-1) tai kasvain (LNCaP, DU145) eturauhasen solulinjoissa. D, E) Kopio määrä genomista DNA-alueet proksimaalinen MIR34B /C-lokus (CNV # 1, Hs00608392), tai BTG4 geenin (CNV # 2, Hs03049129) arvioitiin qPCR samoissa näytteissä kuvattu paneelit B, C . Cutoff arvot merkittävä lasku tai nousu tavoitteiden DNA suhteessa viittaus määritys (RNaasi P) määriteltiin kopioita 0,5 tai 4, vastaavasti (ei muutosta: CNV = 2). F, G) analyysi MIR34B /C CpG-saarekkeen epigeneettisellä tila suoritettiin metylaatiospesifisen PCR vastaaviin normaaleihin tai neoplastisten (PCA) eturauhasen parenchyma, hyvänlaatuinen hyperplastic näytteitä ja eturauhasen solulinjoissa. Näyte pidettiin osittain metyloitu (M /UM), jos monistetaan molemmat alukeparia. M, Metyloidut; UM metyloimattomat. Tyhjä, ei mallia valvonta; NA, näytettä ei ole saatavilla.

Näissä kokeissa miR-34b-3p aleni PCa, verrattuna normaaliin tai hyperplastinen eturauhasessa, BPH-1 tai LNCaP-soluissa (kuvio 5B). Sen sijaan, miR-34c-5p oli erilainen ilmentymiskuvio ihmisen kudoksissa, mikä viittaa siihen, että nämä kaksi transkriptit voi olla riippumattomasti säädellä (kuvio 5C). Genominen analyysi paljasti, että vain alue proksimaalinen MIR34B /C-lokuksessa (määritys CNV # 1, kuvio 5D) osoitti menetys DNA kopioluvun, koska kauempana antureista (CNV # 2 ja CNV # 3) eivät osoittaneet muutoksia genomista sisältöön (kuvio 5E ja S2 taulukko). Menetys DNA kopioluvun oli huomattavasti selvempi PCa kudoksissa verrattuna hyvänlaatuinen hyperplastic rauhaset (p = 0,01 Fisherin tarkka testi), ja oli havaita altaassa terveillä (kuvio 5D). Molemmat CNV # 1 ja # 2 menetettiin BPH-1 ja LNCaP solulinjoja, mahdollisesti kuvastaa samanaikaisesti alas-säätely miR-34b /c. Sitä vastoin DU145 solut eivät osoittaneet modulaatio miR-34b /c lauseke tai alleelinen kopioluvun menetys (kuvio 5D ja 5E).

Kun analysoitiin epigeneettisellä tilan metylaatiospesifistä PCR: n CpG-saarekkeen ylävirtaan n MIR34B /C-lokuksessa (kuvio 5F) oli huomattavasti metyloitu eturauhassyövissä kuin normaali tai hyperplastista eturauhasessa (50% vs. 30% tai 0%: lla, p = 0,026 by chi-neliö testi; kuvio 5G). Osittainen verran metylaation voitiin havaita kaikissa solulinjoissa, mutta BPH-1, jossa MIR34B /C-lokus epigeneettiseltä vaiennettu (kuvio 5F ja 5G). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että vähentynyt ilmentyminen miR-34b PCA voi liittyä yhdistelmä epigenetic hiljentämisen ja DNA kopioluvun tappio (S2 taulukko).

mierossa-34b-3p-Sox2 akseli selektiivisesti vapautettiin androgeeniriippuvaisissa PCa

MiR-34b-3p säätelee ilmentymistä kantasolujen liittyvät tekijät, mukaan lukien c-Myc, Sox2, Met ja Notch1 [33,34], joka on myös liitetty eturauhasen syöpä [ ,,,0],35-37]. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, pakko ilmentyminen miR-34b prekursorisekvenssejä eri eturauhasen solulinjoissa mutta ei antagonisti (paneeli A S3 kuvassa), voimakkaasti tukahdutettu endogeeniset Sox2 tasoilla BPH-1-soluissa (kuvio 6A) taas ei moduloida ekspressiotasot c-Myc, Notch1 ja Met (paneelit B, C S3 kuvassa). Toisaalta, androgeenistä riippumaton DU145-solut eivät osoittaneet miR34b-modulaatio Sox2 ilmentymisen (kuvio 6A), ja LNCaP-soluja ei ollut havaittavissa olevia Sox2 (S4 kuvassa). Lopuksi soluproliferaatiota ei vaikuta huomattavasti alle eri olosuhteissa testattu (paneeli D S3 kuvassa).

A) Sox2 ilmentyminen analysoitiin immunoblottauksella BPH-1 tai DU145 solujen transfektion jälkeen miR-34b jäljittelee tai Kontrollisekvenssi 72 tuntia. Untr., Käsittelemätön näyte. p-miR-34b tai a-miR-34b, esiaste tai antagonistin miR-34b; p-Ctrl tai a-Ctrl, ei-kohdistuksen säädöt esiastetta tai antagonisti molekyylejä. B) Sox2 immunoreaktiivisuus analysoitiin eturauhasen TMA, joka sisälsi normaaleissa kudoksissa, pre-neoplastisia (PIN) ja kasvaimen (PCA) leesioita 192 potilasta, ja hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvun (BPH) näytteet. Sox2 ilmentyy erittäin tyvisolukerroksessa ei-neoplastisten kudosten ja epiteelisoluissa syöpäkudoksessa. C, D) Sox2 kohonnut ilmentyminen luonnehtii PCa kudoksia PIN tai BPH vaurioita ja erottelee PCa potilaalla on biokemiallisia uusiutumisen. Määrä PIN PCA tai BPH tapauksissa (C) tai Eturauhassyövän potilasta joille tehtiin tai biokemiallisia uusiutumisen aikana kliinistä seurantaa (serologinen PSA 0,2; D) mukaan ydinvoiman Sox2 värjäys tulokset on esitetty. p = 0,02 tai p = 0,0006, vastaavasti Chi-square test.

Kun analysoidaan ihmisen kudoksissa (kuvio 6B), Sox2 näkyy hyvin heterogeeninen ekspressiotasot erityisesti PCA kudoksissa vaihtelevat välillä 0% 70% positiivisia ytimet (kuvio 1 C). Kääntäen, PIN-koodi tai BPH vaurioita näytteille korkea Sox2 immunoreaktiivisuus basaali myoepithelial soluissa (ei lasketa), kun taas niiden epiteelin osastoja näkyvissä matalan Sox2 taso (≤10%; Sox2 pisteet = 1; kuvio 1C). Kuten aiemmin dokumentoitu [31,36,38], immunoreaktiivisuus Sox2 oli anatomisesti rajoittui myoepithelial /tyvisoluihin epäneoplas- rauhaset. Käänteisesti tämä malli oli vähitellen hävisi PIN ja PCa näytteitä. Itse Sox2 ilme yli 10% ytimet (Sox2 pisteet 2 ja 3) oli ominaista PCa verrattuna PIN tai BPH näytteistä (p = 0,02 Chi-square test). Tämän mukaisesti tulos, korkeammat Sox2 pistemäärät useammin löytyy PCA kudoksissa kokeneiden potilaiden biokemiallinen uusiutumisen (p = 0,0006 Chi-square testi; kuvio 6D). Todellakin suurin osa Sox2-negatiivinen (PCA 59 ulos 68, 87%) ei kokenut biokemiallisia uusiutumisen vastapäätä PCA Sox2 yli 10% soluista (1 ulos 6, 0,17%; Kuva 6D).

Ei muita kliinisiä muuttuja tutkitut korreloi merkitsevästi Sox2 ilme.

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että menetys miR-34b liittyy etenemisen eturauhassyöpä, ja voi tarkasti syrjiä hyvänlaatuinen liikakasvu ja PIN vaurioita tai soluttautuminen eturauhasadenokarsinoomaa ihmisillä. Mekanistisesti tämän reitin heijastaa epigeneettisellä hiljentämisen ja DNA kopioluvun menetys MIR34B /C lokukseen kromosomissa 11, mikä johtaa vapautetuilla ilmaus loppupään stemness tavoite, Sox2 PCA. Tärkeää on, vapautettiin miR-34b signalointi näyttää valikoivasti eritellä androgeeniriippuvaisissa eturauhasen soluissa, mikä viittaa mahdolliseen rooliin tämän reitin taudin uusiutumisen ja mahdollisesti siirryttäessä castrate kestäviä vaiheessa.

miR-34 perheen ja miRNA on aiemmin raportoitu tukahduttaa kasvaimen kehittymisen eri mekanismeilla, mukaan lukien modulaatio solusyklin siirtymiä, EMT, etäpesäke, tai syöpä stemness [33].