Krooninen sairaus

tiivistelmä

Wnt /β-kateniinin signalointireitin pelaa tärkeä rooli etenemistä paksusuolensyöpä.

DACT1

on tunnistettu modulaattori Wnt signalointia sen vuorovaikutusta Dishevelled (DVL), keskeinen välittäjäaine sekä kanoninen ja noncanonical Wnt polkuja. Kuitenkin toiminnot

DACT1

että WNT /β-kateniinin signalointireitin jää epäselväksi. Tässä esitämme näyttöä siitä, että

DACT1

on merkittävä positiivinen säätelijä paksusuolensyöpä kautta säännellään vakautta ja sublocation of β-kateniinin. Olemme osoittaneet, että

DACT1

edistää syöpäsolujen lisääntymistä

in vitro

ja kasvaimen kasvu

in vivo

ja parantaa muuttavien ja invasiivisia potentiaalia koolonkarsinoomasoluissa. Lisäksi korkeampi ilmentyminen

DACT1

ei vain lisää ydin- ja sytoplasmisen jakeet β-kateniinin, mutta lisää myös sen kalvoon liittyvä osa. Yli-ilmentyminen

DACT1

johtaa lisääntyneeseen kertyminen fosforyloimattomia β-kateniinin sytoplasmassa ja erityisesti ytimet. Olemme osoittaneet, että

DACT1

vuorovaikutuksessa GSK-3β ja β-kateniinin.

DACT1

stabiloi p-kateniinin kautta

DACT1

indusoimaan vaikutuksia GSK-3β ja suoraan vuorovaikutuksessa β-kateniinin proteiineja. Fosforyloidun GSK-3β at Ser9 on kasvanut huomattavasti sen jälkeen, kun kohonnut ilmentyminen

DACT1

.

DACT1

välittää solunosasijaintia β-kateniinin kautta tason nostaminen fosforyloidun GSK-3β on Ser9 inhiboimaan GSK-3β. Yhdessä Tutkimuksemme tunnistaa

DACT1

tärkeänä positiivisena säätelijänä paksusuolen syövän ja ehdottaa mahdollisia strategia terapeuttisen valvonnasta β-kateniinin-riippuvaisen reitin.

Citation: Yuan G, Wang C, Ma C, Chen N, Tian Q, Zhang T, et ai. (2012) onkogeeninen toiminta

DACT1

Colon Cancer kautta asetukseen β-kateniinin. PLoS ONE 7 (3): e34004. doi: 10,1371 /journal.pone.0034004

Editor: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 21 helmikuu 2012; Julkaistu: 21 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Yuan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Science Foundation of China, nro 30770440. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mutaatiot ja säädeltyyn ilmaus komponenttien muinaisten Wnt-signalointireitin liittyy kasvaimen synnyssä useissa järjestelmissä, ja on erityisesti osallisena aloittamisen paksusuolen syöpä [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Yli 90% paksusuolen ja peräsuolen syöpiä peräisin aktiivisten mutaatioiden Wnt-reitin [1]. Mutaatioita on kuvattu adenomatoottisen polypoosin coli (

APC

) geenin tapauksissa familiaalinen adenomatoottisen polypoosin (FAP), ja tämä mutaatio esiintyy myös suuri osa satunnaista paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [9], [10].

APC

mutaatiot ovat varhainen tapahtuma paksusuolen ja peräsuolen kasvainten synnyssä [11].

β-kateniinin (virallinen symboli CTNB1) katsotaan olevan keskeinen toimija Wnt signalointireitin. Vaikka Wnt aktivointi voi tapahtua mutaatioita, jotka vaikuttavat fosforylaatiopaikat eksonissa 3 β-kateniinin muutamissa Kolorektaalituumorien [12], [13], monet muut komponentit Wnt-signalointireitin edistää peräsuolen syövän kautta dysregulating aktiivisuutta tai lokalisointia ja β-kateniinin [14], [15].

DACT1

(Dapper1 /Dpr1) geeni, joka sijaitsee kromosomissa 14q22.3, koodaa 836 aminohapon proteiinia, jossa on oletetun leusiinin vetoketju (LZ) domeenin amino-terminaaliseen päähän ja konsensus PDZ sitova (PDZ-B) motiivi karboksiterminaalinen pää, joka mahdollistaa sen, että

DACT1

proteiini vuorovaikutuksessa Dishevelled (DVL) PDZ domain [ ,,,0],16]. Bioinformatiikka analyysit ovat osoittaneet, että

DACT1

mRNA ilmentyy amnion, sikiön aivot, silmä, sydän, aikuisen aivot ydin, mahasyövän (sinettisormus solun ominaisuuksia), RER + paksusuolen kasvain, akuutti lymfaattinen leukemia, itusolutuumoritapauksia , kondrosarkooma, ja lisäkilpirauhasen kasvaimet [17]. Lisäksi perustuu evoluution ja toiminnallinen säilyttäminen Wnt signalointimolekyylien, samoin kuin ihmisen kromosomaalinen sijainti DACT1,

DACT1

geeni on myös ennustettu olevan voimakas syöpään liittyvän geenin [17].

DACT1

on raportoitu vaimentua maksasolukarsinoomassa [18]. Tuoreessa raportissa havaittu korrelaatiota

DACT1

ilmentymistä keuhkosyövässä ja huono histologinen luokka, suuri kasvaimen koko, laajuus kasvain hyökkäyksen, ja imusolmuke etäpesäke [19].

Vaikka joissakin tutkimuksissa on osoittaneet yhdistysten välillä

DACT1

ilmaisun ja syöpä, toiminta

DACT1

että WNT /β-kateniinin signalointireitin jää epäselväksi. Yksi mahdollinen mekanismi on, että Dpr stabiloi GSK-3β ja ak- siini APC monimutkainen, kuten on esitetty samanaikainen immunosaostus tutkimuksissa [16]. Toinen mahdollisuus on, että Dpr kilpailee Fz sitoutumisesta PDZ verkkotunnuksen DVL, mikä estää signaalin välittymistä DVL, ja siten estää DVL-välitteisen vakauttaminen β-kateniinin [20]. Yau et ai. raportoitu, että ihmisen Dpr1 säädeltiin vähentävästi maksasolukarsinoomassa, ja downregulation korreloi sytoplasmisen kerääntymisen β-kateniinin [18]. Kuitenkin tässä raportissa, olemme havainneet, että

DACT1

yliekspressoituu paksusuolensyöpä, ja se toimii parantaa solujen jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja hyökkäyksen koolonsyöpäsolulinjaa. Olemme osoittaneet, että

DACT1

vuorovaikutuksessa GSK-3β ja β-kateniinin. Olemme lisäksi osoittaneet, että

DACT1

stabiloi p-kateniinin kautta

DACT1

indusoimaan vaikutuksia GSK-3β ja suoraan vuorovaikutuksessa β-kateniinin. Olemme myös osoittaneet,

DACT1

inhiboi GSK-3β kautta tason nostaminen fosforyloidun GSK-3β on Ser9, joka muuttaa solunsisäisen sijainnin β-kateniinin. Se edistää erityisesti β-kateniinin tasoilla solukalvon ja tumassa.

Tulokset

DACT1

yli-ilmennetään ihmisen paksusuolen syöpä

Tunnistaa mahdolliset roolit

DACT1

kehittämisessä ja etenemisen paksusuolen syöpä, käytimme kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) arvioimaan geeni-ilmentymisen. Vertasimme ilmaisu kuudessa syövän kudoksissa kuin kuudessa pariksi näytteitä normaalista kontrolli paksusuolen limakalvoa. Tulokset osoittivat, että taso

DACT1

mRNA oli merkittävästi kohonnut kaikissa kuudella paksusuolensyöpä (kuvio 1A). Geenin ilmentyminen tietoja varmistettiin lisäksi Western-blottauksella, mikä suoritettiin käyttäen liukoisen solulysaateista valmistaa kirurgisten kolektomian yksilöitä. Tulokset vahvistivat, että korkeat

DACT1

proteiinia ovat läsnä paksusuolen syöpä (kuvio 1 B).

(A)

DACT1

mRNA-tasot määritettiin käyttämällä kvantitatiivista tosiaikaista RT-PCR-analyysi. Näytteitä paksusuolen adenokarsinooma (T, valkoiset pylväät) ja normaali-näkymästä ohjaus limakalvon (N, mustat palkit) analysoitiin kuudessa tapauksessa paksusuolen syöpä. (B) ilmentäminen

DACT1

proteiini ihmisen paksusuolen adenokarsinooma (T) ja normaali-näkymästä ohjaus limakalvon (N) kuudessa tapauksessa, määritettynä Western immuuniblottausanalyysi. Ilmaisu GAPDH käytettiin latauskontrollina.

DACT1

parantaa solujen lisääntymistä

in vitro

ja paksusuolen kasvaimen kehittymisen

in vivo

Ymmärtääksemme toiminnon

DACT1

paksusuolen syöpä, selvitimme vaikutus kohdunulkoisen

DACT1

ilme solujen kasvuun in vitro solulinjoissa erilaisilla tasoilla endogeenisten

DACT1

ilme. Transfektion jälkeen, jossa on

DACT1

cDNA ekspressiokonstrukti, SW480 paksusuolen syöpäsoluja, jotka ilmentävät hyvin alhainen endogeenisten tasojen

DACT1

, osoitti merkittävää kasvua solujen proliferaation (kuvio 2A). Kääntäen, soluproliferaation vähentynyt kun omien

DACT1

ilmentymistä hiljennettiin vakaa transfektoimalla siRNA vektoreilla että kohdennettu

DACT1

että HCT116, LoVo ja HT29 koolonsyöpäsolulinjaa, joka on paljon suurempi endogeenisia tasoja ja

DACT1

(kuvio 2B-D). Näiden tulosten vahvistamiseksi, endogeeninen

DACT1

ilmentymistä hiljennettiin vakaa transfektion toisen siRNA vektorit (

DACT1

siRNA1) että kohdennetut erilliset alueet

DACT1

että HCT116-soluissa ja samat tulokset havaittiin (kuvio S1A-B).

(A) Vasen: n yliekspressio

DACT1

stabiilisti transfektoiduissa SW480-soluissa. Oikea: kasvukäyrä runsaudenmäärityksessä in

DACT1

-transfected SW480-solut (keskiarvo ± SEM, n = 3, * p 0,05 versus tyhjän vektorin-transfektoitujen solujen). (B, C, D) Vasen:

DACT1

ilmentymistä villityypin, ohjaus siRNA-transfektoiduissa, ja

DACT1

siRNA-transfektoiduissa HCT116, LoVo ja HT29. Oikea: kasvukäyrä määritykset

DACT1

siRNA-transfektoiduissa HCT116, LoVo ja HT29 (keskiarvo ± SEM, n = 3, * p 0,05 verrattuna villityypin soluja). (E) Keskimääräinen kasvaimen tilavuus arvioitiin viikoittain injektion jälkeen eläimet ohjaus siRNA-tai

DACT1

siRNA-transfektoiduissa HCT116-solut (keskiarvo ± SEM, n = 3, * p 0,05). (F) edustaja kuvia kahdeksan viikon kuluessa injektion hiiren koolonkarsinoomasoluissa kanssa ohjaus siRNA tai

DACT1

siRNA-transfektoiduissa HCT116-soluissa.

vaikutusten tutkimiseksi vaiennettaisi

DACT1

paksusuolen kasvaimen kasvua in vivo, HCT116-solut, jotka pysyvästi ilmensivät ohjaus siRNA tai

DACT1

siRNA käytettiin. -Soluja (5 x 10

6) injektoitiin ihonalaiskudoksen nude-hiiren (n = 8 eläintä ryhmää kohti). Kasvaimet mitattiin viikoittain mikrometrillä, ja niiden tilavuudet laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: π /6 x pituus x leveys

2 [21]. Kaikki eläimet injektoitiin HCT116-soluja, jotka ilmensivät ohjaus siRNA kehittänyt tuumoreita 14 päivää injektion jälkeen, kun taas vain 75% (6/8) ja

DACT1

siRNA eläimille kehittyi kasvaimia. Viisikymmentä kuusi päivää injektion jälkeen, kasvainten valvonnassa siRNA eläimet olivat merkittävästi suurempi (kuvio 2F). Kasvaimen keskimääräinen tilavuus oli 2,068.78 ± 561,57 mm

3 hiirissä injektoitiin HCT116-soluja, jotka ilmensivät ohjaus siRNA, verrattuna kasvaimen keskimääräinen tilavuus hiiriä, joihin injektoitiin HCT116-soluja, jotka ilmensivät

DACT1

siRNA (503,46 ± 178,90 mm

3) (kuvio 2E). Nämä tiedot osoittavat tärkeän roolin

DACT1

edistämisessä kasvun koolonkarsinoomasoluissa.

DACT1

parantaa muuttoliikettä ja puute ankkurointia koolonkarsinoomasoluissa

Anchorage riippumaton leviämisen on tunnusmerkki syövän syntyyn ja katsotaan olevan omiaan leviämisen syöpäsolujen pois alkuperäisestä sivustosta. Tämän tiedon, tutkimme kapasiteettia

DACT1

ajaa kiinnittymisestä riippumattoman kasvun koolonkarsinoomasoluissa pehmeä agar pesäkemuodostusta määrityksiä. Yli-ilmentyminen

DACT1

parannettu kiinnittymisestä riippumaton leviämisen SW480-soluja (kuvio 3A). Downregulation

DACT1

vähensi kiinnittymisestä riippumatonta potentiaalia HCT116, LoVo ja HT29 (Kuva 3B-D ja S1C). Lisäksi havaitsimme, että

DACT1

yli-ilmentyminen tehosti muuttavia mahdollisuuksia SW480 solujen transwell määritykset (kuvio 3E ja I). Käänteisesti muuttavien potentiaalia solujen vähentynyt kun omien

DACT1

ilmentymistä hiljennettiin vakaa transfektoimalla siRNA vektoreilla että kohdennettu

DACT1

vuonna HCT116, LoVo ja HT29 (kuvio 3F-I). Näiden tulosten, voimme päätellä, että

DACT1

vahvistaa ankkurointiriippumattomuudeksi paksusuolen syöpäsoluissa ja niiden muuttavien potentiaalia.

(A) Pehmeä agar määrityksessä

DACT1

-transfected SW480-soluissa sen jälkeen, kun 14 päivää inkuboinnin jälkeen. (B, C, D) Pehmeä agar määritys siRNA-transfektoiduissa HCT116, LoVo ja HT29 jälkeen 14 päivää inkuboinnin jälkeen. (E) Kuvat ovat on esitetty yli-ilmentyminen

DACT1

stabiilisti transfektoiduissa SW480-soluissa. Solut siirrostettiin transwell kammiossa ja annettiin siirtyä kammion poikki kohti soluspesifinen kasvualusta 24 tuntia. Mikrovalokuvia värjättyä vaeltavien solujen otettiin nojalla brightfield valaistus (20 x). (F, G, H) edustaja kuvat näkyvät

DACT1

siRNA-transfektoiduissa HCT116, LoVo ja HT29. Solut siirrostettiin transwell kammiossa ja annettiin siirtyä kammion poikki kohti soluspesifinen kasvualusta 24 tuntia. Mikrovalokuvia värjättyä vaeltavien solujen otettiin nojalla brightfield valaistus (20 x). (I) kvantifiointi migraatiokokeessa. Tulokset on saatu kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Migration määritettiin laskemalla solut kuusi sattumanvaraisesti mikroskooppikentäs- kuoppaa kohti (keskiarvo ± SEM; * p 0,05 versus kontrolliryhmän soluja).

DACT1

parantaa invaasion koolonkarsinoomasoluissa

in vitro

tai

in vivo

vaarallisin piirre maligniteetti on invasiivinen ja metastaattinen potentiaali syöpäsoluja. Sen testaamiseksi soluinvaasiota vaikuttivat

DACT1

, vaikutukset

DACT1

soluinvaasiota kautta Matrigeliä tutkittiin. Yliekspressio

DACT1

tehostettu hyökkäys SW480-solujen (kuvio 4A ja E). Downregulation

DACT1

vähensi invasiivisia potentiaalia HCT116, LoVo ja HT29 kautta matrigeelin (kuva 4B-E). Tutkia vaikutuksia

DACT1

hiljentäminen on hyökkäyksen koolonkarsinoomasoluissa in vivo, meidän tartunnan HCT116-solut, jotka ilmensivät ohjaus siRNA tai

DACT1

siRNA. Sitten, 5 x 10

6 solua injektoitiin subkutaaniseen kudokseen kunkin paljaan hiiren (n = 8 eläintä ryhmää kohti). Viisikymmentäkuusi päivää myöhemmin kasvain kuusi kahdeksasta ohjaus siRNA-transfektoiduissa nude-hiiriin oli tunkeutunut osaksi lihaksistoon, kun taas vain kaksi kasvainten

DACT1

siRNA-transfektoiduissa eläimet olivat tunkeutuneet osaksi lihaksisto. Nämä tiedot osoittavat lisäksi, että

DACT1

teki vaikuttaa invasiivisen potentiaalia koolonkarsinoomasoluissa in vitro ja in vivo.

(A) Kuvat ovat on esitetty yli-ilmentyminen

DACT1

-transfected SW480-soluissa. Solut ympättiin invasiivisessa kammioon ja sen annettiin tunkeutua kammioon päin soluspesifinen kasvualusta 24 tuntia. Mikrovalokuvia värjättyä tunkeutumaan solujen otettiin nojalla brightfield valaistus (20 x). (B, C, D) Kuvat ovat näkyvät

DACT1

siRNA-transfektoiduissa HCT116, LoVo ja HT29. Solut ympättiin hyökkäys kammiossa ja annettiin hyökätä kammion kohti soluspesifisestä kasvualusta 24 tuntia. Mikrovalokuvia värjättyä hyökkääviä solut otettiin nojalla brightfield valaistus (20 x). (E) kvantifiointi migraatiokokeessa. Tulokset on saatu kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Invasion määritettiin laskemalla solut kuusi sattumanvaraisesti mikroskooppikentäs- kuoppaa kohti (keskiarvo ± SEM; * p 0,05 versus kontrolliryhmän soluja).

DACT1

säätelee solusyklin vaikka yhä β-kateniinin tasoilla

selvittämiseksi mekanismi, joka aiheutti edellä olevista tuloksista edelleen, testasimme proteiinin tasot β-kateniinin ja Wnt /β-kateniinin kohdegeenien, sykliini D1 [8] ja c-Myc [22]. Meidän koe osoitti, että yli-ilmentyminen

DACT1

johti merkittävään kasvuun kokonaismäärän tasoja β-kateniinin, sykliini D1 ja c-Myc in SW480-soluissa (kuvio 5A). Toisaalta,

DACT1

siRNA, joka välitti hiljentäminen endogeenisen

DACT1

ilmaisu, väheni yhteensä tasot β-kateniinin, sykliini D1 ja c-Myc tasot HCT116, LoVo ja HT29-soluja ( Kuva 5B).

(A) edustaja Western blotit tyhjiä vektorin transfektoiduissa ja

DACT1

-transfected SW480-soluissa. Yliekspressio

DACT1

tuloksia ylösajon β-kateniinin ja T-solujen tekijä (TCF) kohdegeenien, sykliini D1 ja c-Myc. GAPDH: ta käytettiin lastaus ohjaus. (B) edustaja Länsi-täplien HCT116 ja LoVo ja HT29 ilmentävät ohjaus siRNA tai

DACT1

siRNA. Hiljentäminen

DACT1

ilmaisun HCT116 ja LoVo ja HT29 laski veren kokonaiskolesterolia β-kateniinin, sykliini D1 ja c-Myc. GAPDH: ta käytettiin lastaus ohjaus. (C) vaikutus

DACT1

ilmentymisen vaikutus solusyklin profiilia SW480-solujen. Kolmen vuorokauden kuluttua seerumistarvaatio soluja analysoitiin niiden solusyklin profiili FACS. Prosenttiosuus soluja G1, G2 ja S vaiheet on esitetty. (D, E, F) vaikutus

DACT1

siRNA transfektion solun sykliprofiilia HCT116, LoVo ja HT29. Kolmen vuorokauden kuluttua seerumistarvaatio soluja analysoitiin niiden solusyklin profiili FACS. Prosenttiosuus solujen G1, G2 ja S vaiheet näkyvät.

Kun otetaan huomioon, että sykliini D1 ja c-Myc liittyvät solukierron säätelyssä, tutkimme vaikutus

DACT1

yli-ilmentymisen ja hiljentäminen solusyklin sääntelyn koolonkarsinoomasoluissa. Näissä kokeissa kaikki solut synkronoidaan G0 /G1 vaiheissa seerumin nälkään. Solusyklin profilointi FACS osoitti, että yli-ilmentyminen

DACT1

vuonna SW480-soluissa liittyy osuuden kasvu solujen G0 /G1 vaiheissa (kuvio 5C). Tasaisen, hiljentäminen on

DACT1

ilmaisutapoja siRNA johti lisääntyneeseen solujen määrä S + G2 /M vaihetta HCT116, LoVo ja HT29 solulinjoissa (kuvio 5D-F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että S + G2 /M kerääntyminen solujen jälkeen

DACT1

hiljentäminen on nimenomaan liittyy menetys

DACT1

proteiinia. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että

DACT1

edistää leviämisen koolonkarsinoomasoluissa helpottamalla siirtymistä G1 S vaiheeseen solusyklin.

Lisäksi sykliini D1, CDK4 on toinen keskeinen tekijä, joka helpottaa G1 /S siirtyminen. Totesimme, että yli-ilmentyminen

DACT1

vuonna SW480-solujen määrä nousi ilmaisun CDK4, kun taas CDK4 tasot vähensi merkittävästi HCT116, LoVo ja HT29, jotka ilmaisivat

DACT1

siRNA (kuva S2). Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että

DACT1

stimuloi solujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvua edistämällä solunjakautumisen solusyklin läpi lisääntyvää β-kateniinin.

dACT 1

parantaa muuttavien ja invasiivisia potentiaalia koolonkarsinoomasoluissa muuttamalla solunsisäisen sijainnin β-kateniinin

paljastaa keinoja, joilla

DACT1

lisää β-kateniinin /TCF-säännelty geenin ilmentymisen, tarkka sijainti β-kateniinin havaittiin alle laserskannaus -konfokaalimikroskoopilla (LSCM) immunofluoresenssilla. Tulokset osoittivat, että mitä korkeampi ilmentyminen

DACT1

ei ainoastaan ​​lisännyt ydin- ja sytoplasmisen jakeet β-kateniinin, vaan myös kasvatti kalvoon liittyvä osa. Muutos tason β-kateniinin kalvoon liittyvä osa oli merkittävin havainto (kuva 6A-D ja S1D).

(A) mikrovalokuvia tyhjän vektorin ja

DACT1

– yli-ilmentävät SW480-soluja immunovärjättiin anti-β-kateniinin vasta-ainetta (punainen). (B, C, D) mikrovalokuvia ohjaus siRNA ja

DACT1

siRNA HCT116, LoVo ja HT29 immunovärjättiin anti-β-kateniinin vasta-aineella (punainen). (E) edustaja blotit β-kateniinin tasoilla kalvo (Mem), ydin- (Nuc), ja sytoplasman (Cyto) murtolukuja ja koko lysaatit (Lys) in SW480-soluissa. Laminiini B (ydin- lauseke) ja GAPDH (sytoplasman lauseke) käytettiin lastaus valvontaa. ”+” Edustaa yli-ilmentymisen

DACT1

. ”-” On tyhjä vektori. (F) edustaja blotit β-kateniinin tasoilla kalvo (Mem), ydin- (Nuc), ja sytoplasman (Cyto) murtolukuja ja koko lysaatit (Lys) in HCT116-soluissa. Laminiini B (ydin- lauseke) ja GAPDH (sytoplasman lauseke) käytettiin lastaus valvontaa. ”+” Edustaa hallita siRNA. ”-” On

DACT1

siRNA.

Vahvista näitä mielenkiintoisia tuloksia, otteita ohjaus /

DACT1

-overexpressing SW480 solua ja ohjaus /

DACT1

-silenced HCT116-solut erotettiin kalvo, soluliman ja ydinvoiman jakeet. Sitten suhteellinen runsaus β-kateniinin näissä fraktioissa analysoitiin Western blottauksella (kuvio 6E ja F). Aiemmat raportit ovat osoittaneet tärkeä rooli β-kateniinin solun tarttumiseen osana proteiinin monimutkainen, joka sisältää E-kadheriinin [23]. E-kadheriinin ilmentämiskuviota koolonkarsinoomasoluissa oli muuttumattomana

DACT1

hiljentäminen tai yli-ilmentyminen (kuva S3). Nämä tiedot viittaavat siihen, että kohonneet

DACT1

vaikuttaa β-kateniinin tasoilla ja β-kateniinin /TCF-riippuvaista transkriptiota aktivoimalla Wnt-signalointireitin. Ne viittaavat myös siihen mahdollisuuteen, että

DACT1

parantaa muuttavien ja invasiivisia potentiaalia koolonkarsinoomasoluissa kautta β-kateniinin välittämää vakauttamisen vyöliitos.

korrelaatio

DACT1

ja kalvoon liittyvä β-kateniinin ilmaisun

in vitro

ja

in vivo

tulosten edellä kokeita, huomasimme, että

DACT1

was ilmentyy voimakkaasti ihmisen paksusuolen syöpää ja että se edistää solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio potentiaalia koolonkarsinoomasoluissa kautta sen vaikutukset β-kateniinin signalointi. Näiden tulosten perusteella, me arveltu, että

DACT1

ja ekspressiotasot kalvoon liittyvä β-kateniinin olisi korreloi positiivisesti vuonna koolonsyöpäsolulinjaa ja ensisijainen paksusuolen syöpiin. Kuten kuviossa 7A ja B, tasot

DACT1

ja β-kateniinin koolonsyöpäsolulinjoissa korreloivat. Korkeimman β-kateniinin at solukalvon havaittiin HCT116-soluissa, joilla on korkea endogeenisten

DACT1

. Väliportaan β-kateniinin on solukalvon ja

DACT1

proteiineja löydettiin HT29. Sekä kalvoon liittyvä β-kateniinin ja

DACT1

oli minimaalisesti ilmaistu SW480-soluissa.

(A) semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

DACT1

ilmaisun HCT116, HT29 ja SW480-soluja. GAPDH: ta käytettiin kontrollina. (B) Immunofluoresenssianalyysi on

DACT1

ja β-kateniinin ilmentymistä HCT116, HT29 ja SW480-soluissa. Alkuperäinen suurennus, 40 ×. (C, D) HE-värjäys näytteiden normaalin ihmisen paksusuolen limakalvo (N) ja adenokarsinooman (T) kudosten anti-β-kateniinin vasta-aine. Alkuperäinen suurennus, 40 ×. (E, F) immunofluoresenssilla (IF) värjäys näytteitä normaalista ihmisen paksusuolen limakalvo (N) ja adenokarsinooman (T) kudosten anti-β-kateniinin vasta-aine. Alkuperäinen suurennus, 40 ×. (G, H) immunohistokemiallinen (IHC) värjäys näytteitä normaalista ihmisen paksusuolen limakalvo (N) ja adenokarsinooman (T) kudosten anti-β-kateniinin vasta-aine. Alkuperäinen suurennos, 40 x.

tutkittiin suhdetta

DACT1

ja kalvoon liittyvä β-kateniinin ilmentymistä paksusuolensyöpä edelleen immunohistokemiallinen ja immunofluoresenssilla analyysit tehtiin sekä β-kateniinin ihmisen paksusuolen normaali ja adenokarsinooma kudoksissa (kuusi yllä mainituissa tapauksissa). Havaitsimme polttoväli värjäytymisen kalvoon liittyvä β-kateniinin kaikki kuusi kasvaimia (100%, kuvio 7C-H). Nämä tulokset korreloivat hyvin aiempia tuloksia suhteen p-kateniinin ilmentymistä koolonsyöpäsolulinjoissa. Nämä tulokset vahvistavat, että kohonneet kalvoon liittyvä β-kateniinin voi olla riippuvainen kohonnut ilmentyminen

DACT1

.

DACT1

vuorovaikutuksessa β-kateniinin ja komponentit n β-kateniinin tuhoa monimutkainen vakauttaa β-kateniinin

Olimme kiinnostuneita selventää mekanismia, jolla kohonneet

DACT1

lisännyt β-kateniinin ilme. Puuttuessa Wnt-ligandien, pitoisuudet sytoplasmassa β-kateniinin säädellään tuhoa kompleksi, joka sisältää ak- siini, APC, ja glykogeenisyntaasikinaasi-3β (GSK-3β), jossa β-kateniinin fosforyloituu GSK-3β useilla seriini ja treoniinitähteiden sen N-päässä. Fosforyloitua β-kateniinin sitten ubikitinoitu, mikä johtaa sen nopea proteasomaalisten hajoaminen [4], [24], [25], [26], [27], [28]. Sen määrittämiseksi, onko

DACT1

lisää β-kateniinin tasoilla vaikuttamalla β-kateniinin vakautta, HCT116-solut (tai ilman

DACT1

hiljentäminen) inkuboitiin 10 ug /ml sykloheksimidiä (CHX) estää uusi β-kateniinin synteesi. Sitten, β-kateniinin tasoja mitattiin Western-blottauksella vastaamaan määrä β-kateniinin proteiinien hajoaminen. Hiljentäminen

DACT1

ilmentyminen kasvoi merkittävästi β-kateniinin hajoamisnopeus, mikä johtaa selvästi vähennettyä jäljellä β-kateniinin (kuvio 8A). Tämä vaikutus on

DACT1

β-kateniinin vakaus vahvistettiin immunofluoresenssianalyysia. Huomasimme, että β-kateniinin oli hajonnut nopeammin HCT116-soluissa, jotka ilmensivät

DACT1

siRNA kuin HCT116 soluissa, jotka ilmentävät ohjaus

DACT1

siRNA (kuvio 8B).

(A ) Western blot analyysit HCT116-soluissa suoritettiin määrittämään β-kateniinin vakautta. (B) Immunofluoresenssimääritykset in HCT116-soluissa suoritettiin määrittämään β-kateniinin vakautta. (C) Solulysaatit SW480-soluja, jotka on transfektoitu GFP-

DACT1

tehtiin immunosaostus (IP) anti-ak- siini, anti-GSK-3β, tai anti-β-kateniinin vasta-aineita. Immunokompleksit erotettiin SDS-PAGE: lla ja alistettiin Western blot -analyysit, joissa anti-GFP-vasta-ainetta. Blotting anti-GAPDH-vasta osoitti yhtä suuri kuormitus. (D) Subsellulaariset kolokalisaation endogeenisen

DACT1

ja β-kateniinin,

DACT1

ja GSK-3β in HT29. (E) Solulysaatit HT29-soluja altistettiin immunosaostus (IP), jossa on anti-

DACT1

vasta-ainetta. Immunokompleksit erotettiin SDS-PAGE: lla ja alistettiin Western blot-analyysit anti-GSK-3β, tai anti-β-kateniinin vasta-aineita. Blotting anti-GAPDH-vasta osoitti yhtä suuri kuormitus.

selville mekanismi, jonka

DACT1

vaikutteita β-kateniinin vakautta, tutkimme onko

DACT1

vuorovaikutuksessa komponenttien moniproteiinikompleksin joka säätelee β-kateniinin vakautta. Meidän samanaikainen immunosaostus analyysi paljasti rinnakkaispaikantumisen on

DACT1

ja GSK-3β,

DACT1

ja ak- siini in SW480 pysyvästi transfektoitujen solujen GFP-merkitty

DACT1

rakentaa (kuvio 8C ). Lisäksi

DACT1

ei vuorovaikutuksessa β-kateniinin SW480-soluissa, jotka yli-ilmentynyt

DACT1

(kuvio 8C). Sitten tutki rinnakkaispaikantumisen on

DACT1

kanssa GSK-3β, ja

DACT1

kanssa β-kateniinin villityypin HT29 (ilman APC tai β-kateniinin mutaatioita) (kuva 8D-E) . Nämä yhdenmukaiset tulokset osoittivat, että

DACT1

häiritsee GSK-3β-riippuvainen fosforylaatio β-kateniinin tuhoutuminen monimutkainen, ja

DACT1

vaikuttaa β-kateniinin vakaus vuorovaikutuksessa β-kateniinin.

DACT1

vaikuttaa solunsisäisen paikallinen β-kateniinin kautta GSK-3β aktiivisuus

β-kateniinin tiedetään kertyvän tumaan [29], ja sen taso on spekuloitu kasvavan kalvon lamellipodioihin, kalvo vyöliitos ja kalvo röyhelöt [30], [31] vastauksena Wnt signalointia tai lääke estoa GSK-3β aktiivisuutta. Lisäksi perustuu meidän havaintojen me arveltu, että

DACT1

estää GSK-3β. Jotkut tekijät, jotka estävät GSK-3β kautta fosforylaation Ser9 on raportoitu [32], [33]. Havaitsimme proteiinin ekspressiotasot GSK-3β fosforyloituine Ser9 in HCT116-soluissa (tai ilman

DACT1

hiljentäminen). Tulokset osoittivat, että tasot fosforyloitua GSK-3β on Ser9 lisättiin merkittävästi HCT116-soluissa, jotka ekspressoivat ohjaus siRNA (kuvio 9A ja B). Sen vahvistamiseksi, että

DACT1

säännelty lokalisoinnin mallia β-kateniinin avulla GSK-3β, testasimme vaikutus GSK-3β estoa HCT116-solut, jotka ilmensivät joko ohjaus siRNA tai

DACT1

siRNA. Havaitsimme selkeää ja paranevat merkittävästi soluissa, jotka näytetään kalvoon liittyvä β-kateniinin värjäyksen jälkeen niitä käsiteltiin 40 mM LIC1 1 h (kuvio 9C ja D). Testasimme lisäksi ekspressiota aktivoitu β-kateniinin SW480-soluissa. Tuloksista ilmeni lisääntynyt kertyminen fosforyloimattomia β-kateniinin sytoplasmassa ja erityisesti ytimet SW480-soluja, jotka yli-ilmentynyt

DACT1

(kuvio 9E ja F). Kaikki nämä tulokset tukevat päätelmää, että

DACT1

vaikuttaa solunosasijaintia β-kateniinin kautta GSK-3β aktiivisuutta.

(A) mikrovalokuvia ohjaus siRNA ja

DACT1

siRNA ilmentävät HCT116-solut immunovärjättiin anti-fosfo-GSK-3β (Ser9) vasta-aineen (punainen). Hiljentäminen

DACT1

vuonna HCT116-soluissa vähenee tasot fosfo-GSK-3β (Ser9). (B) edustaja Western blotit HCT116 soluja, jotka ilmentävät ohjaus siRNA ja

DACT1

siRNA. Hiljentäminen

DACT1

vuonna HCT116-soluissa vähenee tasot fosfo-GSK-3β (Ser9). GAPDH: ta käytettiin lastaus ohjaus. (C) HCT116-solut ilmentävät ohjaus siRNA ja

DACT1

siRNA käsiteltiin 1 tunnin ajan GSK-3β inhiboivia lääkeaineita (40 mM LiCl: a). Solut värjättiin ja analysoitiin mikroskopialla sen ekspression havaitsemiseksi β-kateniinin. LiCI: n hoitoon HCT116-solujen lisää tasoja β-kateniinin solukalvolle. (D) edustaja Western blotit LiCl-käsiteltyjen HCT116-solut, jotka ilmentävät joko ohjaus siRNA tai

DACT1

siRNA. LiCI: n hoitoon HCT116-solujen kohottavat β-kateniinin solukalvolle. KDEL käytettiin latauskontrollina. 1: HCT116-solut ilmentävät ohjaus siRNA, joka oli käsitelty 40 mM LiCl: a 1 tunnin ajan. 2: HCT116-solut ilmentävät ohjaus siRNA, joita ei ollut käsitelty LiCl. 3: HCT116-solut ilmentävät

DACT1

siRNA jotka hoidettiin 40 mM LiCl 1 h; 4: HCT116-solut ilmentävät

DACT1

siRNA, joita ei ollut käsitelty LiCl. (E) mikrovalokuvia ohjaus siRNA ja

DACT1

siRNA ilmentävien HCT116-solut immunovärjättiin anti-fosfo-GSK-3β (Ser9) vasta-aine (punainen). Hiljentäminen

DACT1

vuonna HCT116-soluissa vähenee tasot fosfo-GSK-3β (Ser9). (F) edustaja Western blotit HCT116 soluja, jotka ilmentävät ohjaus siRNA ja

DACT1

siRNA. Hiljentäminen

DACT1

vuonna HCT116-soluissa vähenee tasot fosfo-GSK-3β (Ser9). GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.

Keskustelu

lisääntynyt ilmentyminen

DACT1

on onkogeeninen toimintoja paksusuolensyöpä

tutkimukset ovat osoittaneet, että

DACT1

yli-ilmennetään ihmisen paksusuolen adenokarsinooman. Tämä tulos on yhdenmukainen aiempien havainto, että

DACT1

oli yläreguloituja invasiivisen rintasyövän kasvaimia [34].