Krooninen sairaus

tiivistelmä

Androgeenireseptorin (AR) on mukana kehittämässä ja etenemisen eturauhasen syöpiä. Kuitenkin mekanismeja, joilla tämä tapahtuu jäävät puutteellisesti. Aiemmissa raporteissa kanan ovalbumiini ylävirtaan promoottori-transkriptiotekijä II (COUP-TF II) on ehdotettu rooli syövän kehittyminen. Tässä tutkimuksessa selvitimme otaksuttu rooli COUP-TF II eturauhassyövissä tutkimalla sen vaikutus soluproliferaatioon ja rajat talk välillä COUP-TF II ja AR. Yliekspressio COUP-TF II johtaa inhibitioon androgeeniriippuvaisen leviämisen eturauhasen syöpäsoluja. Lisätutkimukset osoittavat, että COUP-TF II toimii corepressor AR. Se tukahduttaa AR-transaktivaatiota tavoite promoottorit sisältävät androgeenireseptorin vaste-elementin (ARE) annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi, COUP-TF II on vuorovaikutuksessa fyysisesti AR

in vitro

ja

in vivo.

Se sitoutuu sekä DNA: ta sitovan domeenin (DBD) ja ligandia sitovan domeenin (LBD) ja AR ja häiritsee N /C terminaalista vuorovaikutus AR. Lisäksi COUP-TF II kilpailee koaktivaattoreiden kuten ARA70, SRC-1, ja GRIP1 moduloida AR transaktivaatiota sekä estämällä rekrytointia AR sen ARE sisältäviä kohdepromoottorin. Yhdessä meidän tulokset viittaavat siihen COUP-TF II on uusi corepressor AR, ja antavat kuvan rooliin COUP-TF II eturauhasen syöpiä.

Citation: Song CH, Lee HJ, Park E , Lee K (2012) Kana ovalbumiini alkupään promoottori-transkriptiotekijä II säätelee negatiivisesti transaktivaatiota androgeenireseptorin eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (11): e49026. doi: 10,1371 /journal.pone.0049026

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 03 lokakuu 2012; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Song et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, tiede ja teknologia (2012-0085). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

normaaliin kasvuun, erilaistumiseen, ja toiminta on eturauhanen pitkälti säätelee androgeenien, jotka toimivat läpi androgeenireseptorin (AR) [1], [2]. Esto AR aktiivisuuden millään tavalla, kuten kastraatio ja antiandrogeeni hoito voi estää tai poistaa kaikki vaiheet eturauhassyövän kehitystä [3]. AR-funktio voidaan moduloida solunsisäisten signalointireittien, transkriptiotekijät, solusyklin proteiineja, ja muut tekijät, jotka muuttavat AR transkriptionaalista aktiivisuutta tai järjestää välineet cross-talk välillä androgeenireseptorin ja muiden signaalien [4]. Androgeenit ja AR myös olla olennainen rooli kasvun eturauhasen kasvaimia [5], [6]. Etenemisen eturauhassyöpä kautta tapahtuvaa vuorottelu normaalin androgeenin akselia, jonka dysregulaatio AR toiminnan kautta signaalitransduktion cascades, muutokset AR säätelijäproteiinien ilmaisun, ja mutaatiot AR [7].

AR, joka on ligandeille riippuvaista transkriptiota tekijä, säätelee ilmentymistä kohdegeenien, kun on aktivoitu androgeenien [1]. AR koostuu kolmesta erillisestä funktionaalisia domeeneja: n N-terminaalisen aktivoivan domeenin, keskellä DNA: ta sitovan domeenin ja C-pään ligandia sitova domeeni [8]. N-terminaalissa on osoitettu olevan suorassa vuorovaikutuksessa C-terminaalisen pään ligandista riippuvalla tavalla, mikä on tarpeen koko transkription potentiaalia AR [9]. Ennen androgen altistumista, AR sitoutuu usean proteiinin kaperoni- kompleksi-aktiivisessa tilassa. Androgeenien sitova indusoi konformaatiomuutoksen AR joka johtaa irtaantuu kaperoni- monimutkainen, dimerointi, ja translokaation tumaan, jolloin sitoutuminen ARE sääntelyn alueilla kohdegeenien [9] – [11]. AR transkriptionaalinen aktiivisuus moduloidaan säätelijäproteiinien proteiineja. ARE-sidottu AR homodimeeri rekrytoi koaktivaattoreiden, kuten P160 ja P300 /CBP, jossa silta vuorovaikutus yleisen transkription koneiden ja muokata histonit siten vaikutukset geeniekspression aktivaation [12] – [16]. Sen sijaan, korepressoreiden voi rekrytoida histonideasetylaasi (HDAC) AR monimutkainen, siten ylläpitäen kromatiinin rakennetta [17], [18]. Ne voivat myös estää toiminnallista vuorovaikutusta yleisen transkriptiotekijöiden kanssa promoottori [16].

kanan ovalbumiinin ylävirtaan promoottori-transkriptiotekijöiden (COUP-TF: t) ovat orpo jäseniä tumareseptorisuperperheen jotka aktivoivat tai tukahduttaa geenin transkriptio suoraan sitova DNA-sekvenssi [19]. On olemassa kolme jäsentä ihmisen COUP-TF perhe: COUP-TF I (NR2F1), COUP-TF II (NR2F2), ja Erba liittyvä proteiini 2 (NR2F6) [20]. COUP-TF I ja COUP-TF II-proteiinit ovat 95% homologisia ja evolutiivisesti konservoituneita DNA: ta sitovan domeenin sekä ligandia sitovan domeenin, pääasiassa erilaiset N-terminaalissa (katsaus [19]). COUP-TF I on enemmän erittäin ilmaistaan ​​hermosolukudoksista keskus- ja ääreishermoston, kun taas COUP-TF II pidemmälle ilmaistaan ​​kehittämisessä elinten, kuten keuhko-, munuais-, haima- ja eturauhassyöpä [20], [21]. Erba liittyvä proteiini 2 on vähemmän konservoitunut ja vähän tietoa sen ilmentymistä ja toimintaa [22].

COUP-TF vuorovaikutuksessa muiden ydin- reseptoreihin, kuten estrogeenireseptori (ER), retinoidi-X-reseptori (RXR) , peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorien (PPAR), ja D-vitamiinin reseptorin (VDR) [23] – [27]. Yleensä COUP-TF estää transkriptionaalista aktiivisuutta muiden tumareseptorien kilpailemalla niiden DNA sitoutumiskohdista tai heterodimerisaatio, jossa luokan II tumareseptorin heterodimeerin kumppani retinoidi-X-reseptorin, mikä estää geenin ilmentymistä [28]. Lisäksi, kuten kilpirauhashormonin reseptori ja retinolihapporeseptori, unliganded DNA: han sitoutuneen COUP-TF I repressoi geenin ilmentymisen aktiivisella hiljentäminen domeenin ligandia sitovan domeenin, joka rekrytoi korepressoreiden (eli NCOR ja SMRT), prosessissa, jota kutsutaan aktiivinen tukahduttaminen [29]. Lopuksi, COUP-TF voi myös tukahduttaa transkriptio suoraan sitovia ligandia sitovan domeenin nukleaarihormonireseptorit (transrepression; [30], [31]). Aiemmissa raporteissa COUP-TF liittyi kanssa kehittää erilaisia ​​syövän kuten rintasyövän [24], [32] – [34], keuhkosyöpä, ja lisämunuaisen syövän etenemisessä [35] – [37].

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että COUP-TF II tukahduttaa transaktivaatiota AR eturauhassyöpäsoluissa, jolloin eston androgeeniriippuvaisen solujen kasvua. COUP-TF II suoraan sitoutuu AR, estää N /C terminaalista vuorovaikutus AR. Lisäksi COUP-TF II estää ligandin indusoiman rekrytointi AR PSA promoottori ja kilpailee AR koaktivaattoreiden moduloida AR transaktivaatiota. Kaikki yhdessä, meidän tulokset viittaavat COUP-TF II voimakas AR corepressor ja antavat kuvan rooliin COUP-TF II eturauhasen syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Vasta AR (sc-815), PSA (sc-7638), HA (sc-7392), GFP (sc-9996), ja α-tubuliinin (sc-5286) saatiin Santa Cruz Biotechnology, Inc . ja vasta-aine AR (PG-21, 06-680) saatiin EMD Millipore Corporation. Vasta-aine COUP-TF II (PP-H7147-00), joka ei tunnusta COUP-TF I [19], ostettiin Perseus Proteomiikka Inc. Radiolabeled tymidiiniä ([metyyli

3H] -tymidiinin, spesifinen aktiivisuus 80 Ci /mmol) saatiin Perkin Elmer Life Science. Trichostation A Sigma-Aldrich Co., ja Natrium butylaattia ja Nicotinamide (NIC) hankittiin Calbiochem.

Plasmidit ja Hakemisto Rakentaminen

nisäkkään plasmideja hiiren AR (pcDNA3-AR ), pcDNA3-ARA70, pcDNA3-p300, pSG5HA GRIP1, ja pCR3.1 SRC-1, ja MMTV-Luc ja PSA-Luc toimittaja plasmidit on kuvattu aikaisemmin [38]. PPBARE x 7-tk-Luc rakennettiin insertoimalla kahdeksan kappaletta androgeenireseptorin vaste-elementin (ARE) hiiren Probasiinin (PB) geenin. HA-merkittyjä hiiren COUP-TF II rakennettiin insertoimalla

MSL

I /

Xho

I pilkottua fragmenttia pCR3.1-hiiren COUP-TF II:

Eco

RV /

Xho

I pilkottuun HA epitooppimerkittyjen pcDNA3 vektori (pcDNA3HA). GFP-COUP-TF II ja GST-COUP-TF II täyspitkä subkloonattiin liittämällä

Eco

RI /

Xho

I pilkottua fragmenttia pcDNA3HA-COUP-TF II:

Xmal

I-pilkottu pEGFP-C1 vektori ja

Eco

RI /

Xho

I-pilkottu pGEX4T-1 vektorin, vastaavasti. GST-COUP-TF II täyspitkä ja deleetiomutanttien, AF1, DBD + sarana (DBDH), ja ΔAF1 alueita, rakennettiin ligatoimalla se itsensä on

Sma

I /

Xho

I-

Sph

I /

XhoI

I- ja

Eco

RI /

Smal

I pilkottua fragmenttia GST-COUP-TF II täyspitkä vastaavasti. Nisäkkäiden ekspressioplasmidit VP-AR1-660 ja GAL-AR624-919 ja reportteri rakentaa 5XGAL4-Luc3 (alunperin Dr. Donald McDonnell) oli ystävällisesti lahjaksi tri Elizabeth M. Wilson (University of North Carolina) [39 ].

valmistaminen rekombinanttiadenovirus-

ektooppinen ilmentyminen hiiren COUP-TF II, adenoviruksen jakelujärjestelmä käytettiin [40]. Lyhyesti, COUP-TF II cDNA kloonattiin pAdTrack-CMV sukkulavektoriin. Homologinen rekombinaatio suoritettiin transformaatio adEasy-BJ5138 toimivaltaiselle solujen pAdTrack-CMV-COUP-TF II yhdessä adenovirusgeeninsiirtovälineiden operaattorin vektori. Yhdistelmä-DNA-virukset valittiin, monistettiin HEK 293-soluissa ja puhdistettiin cesiumkloridi tiheyssentrifugoinnilla. Virustiittereitä mitattiin käyttäen Adeno-X nopea tiitteri (BD Biosciences) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Soluviljelmä ja Ohimenevä transfektio Pitoisuus

COS-7 ja PPC-1-soluja ylläpidettiin Dulbeccon minimum essential (DMEM) (Life Technologies, Inc.), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä. LNCaP-soluja (American Type Culture Collection) ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (Life Technologies Inc.), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä ja 2 mM L-glutamiinia.

Kaksikymmentä neljä tuntia ennen transfektiota solut maljattiin 24-kuoppalevyille ja transfektoitiin ilmoitettu määrä ekspressioplasmideja, reportteri-konstrukti ja ohjaus lacZ-ekspressioplasmidin pCMVß käyttäen SuperFect (Qiagen) tai Lipo2000 (Invitrogen) transfektioreagenssia. Kokonaismäärät ekspressiovektoreita pidettiin vakiona lisäämällä sopivia määriä köyhdytettyä vektorin. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen elatusaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 10% hiilellä erotettua seerumia ja joko DHT tai ajoneuvon. Solut kerättiin 24 tunnin kuluttua hormonin lisäyksestä, ja lusiferaasi ja ß-galaktosidaasin aktiivisuudet määritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [41]. Tasot lusiferaasiaktiivisuuden normalisoitiin lacZ ilmentyminen.

RT-PCR: llä ja qRT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin eturauhasen Tri reagenssin liuosta (Molecular Research Center, Inc.) . RT-PCR: llä, 1 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin ja PCR-monistettiin COUP-TF II-spesifisiä alukkeita, jotka monistavat 650 bp: n fragmentti, joka kattaa ORF. Kvantitatiivinen analyysi PSA-geenin ilmentymisen LNCaP tartunnan AdGFP tai AdCOUP-TF II arvioitiin qRT-PCR: llä PSA-spesifisiä alukkeita, joka monistaa 517 emäsparin alueella, joka kattaa ORF, käyttämällä SYBR Green PCR kit ja Roottorin Gene RG3000 Real-Time PCR-järjestelmä (Corbett Research). Sisäisenä kontrollina, PCR-reaktiot suoritettiin myös käyttäen β-aktiini-spesifisiä alukkeita, jotka monistavat 362 bp: n alueella, joka kattaa eksonin 4. Oligonukleotidisekvenssit olivat seuraavat: eteenpäin 5′-AAGCTGTACAGAGAGGCAGGA-3 ’ja reverse 5’-AGAGCTTTCCGAACCGTGTT- 3 ’varten COUP-TF II; eteenpäin 5’-GGCCAGGTATTTCAGGTCAG-3 ’ja reverse 5′- CCACGATGGTGTCCTTGATC-3’ PSA; ja eteenpäin 5’GAGACCTTCAACACCCCAGCC -3 ”ja kääntää 5’CCGTCAGGCAGCTCATAGCTC -3 ’varten β-aktiini.

GST Alasvetoköysi Pitoisuus

GST, GST-AR domain mutantteja, ja GST -COUP-TF II deleetiomutantteja ilmaistaan ​​

E. coli

BL21 soluja ja eristetään glutationi-Sepharose-4B-helmiä (Pharmacia, Biotech AB). Immobilisoituun GST-fuusioproteiineja inkuboitiin sitten [

35S] metioniini-leimatun COUP-TF II tai AR tuottamien proteiinien

in vitro

käännös käyttäen TNT-kytketyt transkriptio-translaatio-järjestelmä (Promega). Sitova reaktiot suoritettiin 250 ul: ssa GST-sitomispuskuria (20 mM Tris-HCl: ää, pH 7,9, 250 mM NaCl, 10% glyserolia, 0,05% NP-40, 5 mM MgCl

2, 0,5 mM EDTA: ta, 1 mM DTT: tä, ja 1,5% BSA) yön yli 4 ° C: ssa. Helmet pestiin viisi kertaa 1 ml: lla GST-sitomispuskuria. Sitoutuneet proteiinit eluoitiin lisäämällä 20 ui SDS-PAGE-näytepuskuria, ja analysoitiin SDS-PAGE: lla ja autoradiografialla [41].

Sen määrittämiseksi interferoimalla välillä esiintyvät DBD ja LBD ja AR by COUP-TF II, teimme GST avattavan kilpailun määritys. Immobilisoituun GST-AR LBD proteiinit inkuboitiin [

35S] metioniinilla merkitty AR AF1DBDh tuottamia proteiineja

in vitro

käännös. Kilpailevan analyysi, 2, 5, ja 10-kertainen ylimäärä

in vitro

käännetty COUP-TF II proteiineja lisättiin yhdessä radioleimattujen AR AF1DBDh proteiineja.

Coimmunoprecipitation ja Western Blot analyysi

In vivo

coimmunoprecipitation määritys suoritettiin PPC-1-solut transfektoitiin 5 ug: AR ja 5 ug GFP-COUP-TF II ekspressioplasmidien. Transfektoidut solut käsiteltiin 10 nM DHT tai ajoneuvon 4 h transfektion jälkeen ja kerättiin RIPA soluhajotuspuskurin (50 mM Tris-HCl: ää, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 ug /ml aprotiniinia, 0,1 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiinia, 0,1 mM PMSF). Kokosolulysaatti (800 ug) inkuboitiin 20 ui proteiini A /G plus agaroosia helmilietettä (Santacruz) jättää epäspesifisen sitoutumisen ja sentrifugoitiin sitten. Supernatantti jaettiin kahteen yhtä suureen osaan. Yksi annos inkuboitiin 2 ug: n anti-AR-vasta-ainetta (sc-815) ja toinen inkuboitiin 2 ug: lla anti-GFP-vasta-ainetta (sc-9996), yön yli 4 ° C: ssa. Jokainen osa inkuboitiin vielä toiset 4 h kuluttua lisäämällä 20 ui proteiini A /G plus agaroosia helmilietettä (Santacruz). Agaroosihelmet pestiin neljä kertaa kulloinkin RIPA-puskurissa 4 ° C: ssa, ja sitoutuneet proteiinit eroteltiin SDS-PAGE: lla. Proteiinit geelit siirrettiin Protran nitroselluloosalle siirron kalvo (Schleicher ja Schuell Bioscience), ja sille suoritettiin Western blot -analyysi anti-AR (sc-815) ja anti-GFP (sc-9996) vasta-aineet. Signaalit sitten havaittu ECL (Amersham Pharmacia).

Kromatiini immunosaostus (ChIP) Pitoisuus

LNCaP-soluja kasvatettiin RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 10% hiilellä erotettua seerumia infektoitiin joko AdCOUP -TF II tai AdGFP, ja soluja käsiteltiin 10 nM DHT tai ajoneuvon 6 tuntia. Soluja kuin silloitettu 1% formaldehydiä, ja käsitellään ChIP määritystä kuten aiemmin on kuvattu [42]. Anti-AR-vasta-aine (PG-21) käytettiin immunosaostukseen. Immunosaostettiin DNA: n ja input-pilkottua DNA: ta tehtiin PCR käyttämällä erityistä alukeparia (eteenpäin: 5′-CATGTTCACATTAGTACACCTTGCC-3 ’ja reverse: 5′-TCTCAGATCCAGGC TTGCTTACTGTC-3′), joka monistaa 315 bp: n alueella, joka kattaa AR sitoutumiskohta PSA tehostaja-alue [43]. Negatiivisena kontrollina, PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen aktiini alukeparia (eteenpäin: 5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3 ’ja reverse: 5′-CCGTCAGGCA GCTCATAGCTC-3’), joka monistaa 362 bp: n alueella, joka kattaa eksonin 4 β- aktiini-geeni.

Immunofluoresenssi

päivä ennen transfektiota, PPC-1 maljattiin gelatiinilla päällystetyille peitinlasit. RFP-leimatun AR ja GFP-merkityn COUP-TF II transfektoitiin käyttäen SuperFect-reagenssia (Qiagen). 4 tunnin kuluttua tuoretta alustaa lisättiin soluihin. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut syötettiin tuoretta kasvualustaa 10 nM DHT tai ajoneuvon ja inkuboitiin vielä 4 tuntia. Sitten solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä 10 min ajan. Kiinnitetyt solut asetettiin lasilevyille ja tarkkailtiin laser skannaus konfokaalimikroskoopilla (LSM 5 PASCAL Laser Scanning Microscope, Zeiss).

tymidiinin

LNCaP-soluja viljeltiin 24-kuoppalevyille tiheys on 2 × 10

4 solua kuoppaa kohti ja infektoitiin joko AdCOUP-TF II tai AdGFP 10% hiilellä erotettua seerumia toimittama väliaineessa. Istuttuaan yön yli, solut käsiteltiin 10 nM DHT: ssa 24 tuntia ja sitten pulssi leimattiin [

3H] -tymidiinin (10 uCi /ml, spesifinen aktiivisuus 80 Ci /mmol, PerkinElmer Life Sciences, Norwalk, CT) varten 4 h. Solut kerättiin päälle lasimikrokuitusuodatinpaperin suodattimen (Whatman, Inc., Florham Park, NJ) ja intensiivisesti pestiin tislatulla vedellä. Tymidiinin DNA: mitataan laskemalla suodattimet tuikelaskimella.

Soft Agar Colony Formation

LNCaP-solut infektoitiin joko AdCOUP-TF II tai AdGFP 10% hiilellä erotettua seerumin toimittama väliaineessa. 24 tunnin kuluttua infektion jälkeen solut trypsinoitiin ja ympättiin 5 x 10

3 solujen 0,35% agaria yli 0,7% agar-kerroksen kuuden kuoppaisille viljelylevyille. Tuoretta täydellistä kasvualustaa tai hiilellä erotettua seerumia alustassa, joka sisälsi ei ole tai läsnä on 1 nM DHT vaihdettiin joka 2 päivä 2 viikkoa. Pesäkkeet suurempi kuin halkaisija 300 mm pisteytettiin.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä Studentin t-testi PRISM ohjelmisto Windows. Kaikissa tapauksissa todennäköisyys (P) arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

COUP-TF II Yliekspressio tukahduttaa leviämisen eturauhassyöpäsolujen

COUP-TF II on ilmentyy voimakkaasti mesenkymaaliset osastoissa kehittyville elimille, mukaan lukien eturauhasen [20], [21]. Lisäksi COUP-TF II on ehdotettu rooli syövän kehittymiseen [24], [32], [33], [35] – [37]. Siksi olemme alun perin tutkittu ekspressiota COUP-TF: iä eturauhassyövän solulinjoissa ja myös rooli leviämisen eturauhasen syöpäsoluja. COUP-TF II ilmentyy voimakkaasti normaalissa eturauhasessa solulinja, RWPE1, mutta sen ilmentyminen oli tuskin havaittavissa tai hyvin alhainen eturauhassyövän solulinjoissa, sekä androgeeniriippuvaisten ja androgeeni-riippumattomia (kuvio 1A).

(A) COUP-TF II ilmentymistä ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa. Proteiinin ekspressiotasot COUP-TF II määritettiin Western blot-analyysi kokonaisproteiineista käyttäen anti-COUP-TF II, anti-AR (sc-815), ja anti-α-tubuliinin vasta-aineita. mRNA: n ekspression tasojen COUP-TF II määritettiin RT-PCR: llä kokonais-RNA: t. Ilmaus tubuliinia ja β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (B) COUP-TF II estää niiden kasvun eturauhasen syöpäsoluja. Pehmeä agar pesäkemuodostusta suoritettiin täydellinen kasvualusta (vasen paneeli) tai alustalla, joka sisälsi hiilellä erotettua seerumia ja täydennetty tai ilman 1 nM DHT (oikea paneeli). LNCaP-solut infektoitiin AdGFP tai AdCOUP-TF II: ssa 24 tuntia, ja prosessoitiin pesäkemuodostusta kuten on osoitettu ”Materiaalit ja menetelmät”. Pesäkkeet suurempi kuin halkaisija 300 mm pisteytettiin. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) COUP-TF II hidastaa DNA-synteesin eturauhasen syöpäsoluja. LNCaP-solut infektoitiin AdGFP tai AdCOUP-TF II elatusaineessa, joka sisälsi hiilellä erotettua seerumia ja johon on lisätty tai ilman 1 nM DHT. Niiden DNA-synteesi korko analysoitiin sitten [

3H] -tymidiinin määrityksessä. Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta yhdistettiin ja arvot edustavat keskiarvoja ± SEM. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001.

Koska COUP-TF II ilmentyi hyvin alhaisena eturauhassyövän solulinjoissa, me arveltu, että COUP-TF II saattaisi estää leviämisen eturauhasen syöpäsoluja. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me tartunnan androgeeniriippuvainen LNCaP-solujen AdGFP tai AdCOUP-TF II, ja tarkastetaan soluproliferaatiota korkoaan pehmeä agar pesäkemuodostusta. Yli-ilmentymisen COUP-TF II vähensi merkittävästi yhdyskunnan numero sekä siirtomaa koko LNCaP täydellisessä kasvualustassa (kuvio 1 B, vasen paneeli). Sitten tutkittiin, COUP-TF II vaikuttaa androgeeniriippuvaisen leviämisen LNCaP. Yli-ilmentymisen COUP-TF II estivät täysin DHT-riippuvaista pesäkkeiden muodostumista LNCaP-solujen alustassa, joka sisälsi hiilellä erotettua seerumia (kuvio 1 B, oikea paneeli). Esto androgeeniriippuvaisen kasvua COUP-TF II vahvistettiin edelleen vuonna [

3H] -tymidiinin määrityksessä. COUP-TF II ilmentymisen täysin tukossa androgeenin indusoiman DNA-synteesiin LNCaP (kuvio 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että COUP-TF II estää androgeeniriippuvaisen kasvua eturauhasen syöpäsoluja.

COUP-TF II tukahduttaa AR transaktivointi

Koska COUP-TF II yli-ilmentyminen estää androgeeniriippuvaisen kasvua LNCaP eturauhas- syöpäsolujen, tutkimme mahdollista cross-talk välillä COUP-TF II ja AR, mikä on tärkeää kehitystä eturauhasen syöpiä. Testata rajat talk, me ekspressoidaan COUP-TF II AR PPC-1 solulinja, PC-3 johdannainen ja AR-negatiivinen [44], ja pääsee vaikutus transaktivaatiota potentiaalia AR. Kuten kuviossa 2A on esitetty, COUP-TF II esti androgeeniriippuvaisissa AR transaktivaatiota annoksesta riippuvalla tavalla. COUP-TF Olen myös vahvasti inhiboi AR-transaktivaatiota, mutta se on ilmaistu ei hiiren eturauhasen (dataa ei esitetty) eikä eturauhassyövän solulinjoissa [20], [21].

(A) annos-riippuvainen inhibitio AR transaktivaatiota COUP-TF: iä. PPC-1-soluja kotransfektoitiin 350 ng pPBARE x 7-tk-Luc reportteri ja 50 ng AR-ekspressioplasmidin kanssa konsentraation kasvaessa (100, 250, ja 500 ng) COUP-TF I tai COUP-TF II. Soluja käsiteltiin tai ei 3 nM DHT: ssa 24 tuntia. (B) COUP-TF II välittämää tukahduttaminen AR transaktivaation luonnon AR-kohde promoottorit. PPC-1-solut transfektoitiin kuten ”A”, jossa PSA-luc tai MMTV-luc-reportterin. (C) COUP-TF II välittämää tukahduttaminen endogeenisen AR transaktivaation. LNCaP-solut transfektoitiin kuten ”A”, ilman AR ekspressioplasmidin. (D) tukahduttaminen androgeenin indusoiman PSA mRNA ilmentymisen COUP-TF II. LNCaP-solut infektoitiin AdGFP tai AdCOUP-TF II. 24 tunnin kuluttua elpymisen, soluja käsiteltiin 10 nM DHT, ja viljeltiin vielä 24 tunnin ajan ennen sadonkorjuuta. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suoritettiin käyttäen alukkeina PSA ja β-aktiini. Suhteellinen PSA-mRNA normalisoitui β-aktiinin ilmentymistä. Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta yhdistettiin ja arvot edustavat keskiarvoa ± SEM (A-D). **, P 0,01; ***, P 0,001. (E) tukahduttaminen androgeenin indusoiman PSA-proteiinin ilmentymistä COUP-TF II. LNCaP-solut infektoitiin ja käsitellään kuten ”D”, ja viljeltiin vielä 48 tuntia ennen sadonkorjuuta. Western blot-analyysi proteiinien kokonaismäärän suoritettiin käyttäen anti-PSA, anti-AR (sc-815), anti-HA, ja anti-α-tubuliinin. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen (vasemmalla). Suhteellinen PSA-proteiinin ilmentyminen kvantifioitiin normalisoimalla kanssa tubuliinin ilme (rignt).

Jotta voidaan vahvistaa, että on tärkeää COUP-TF II välittämän AR tukahduttaminen, tutkimme COUP-TF II vaikutus luonnon AR-kohde promoottoreita kuten MMTV ja PSA. PPC-1-soluissa, -parin COUP-TF II AR tukahdutettu AR transaktivointimäärityksen molemmilla MMTV ja PSA promoottorit (kuvio 2B). Lisäksi COUP-TF II myös tukahduttaa endogeenisen AR transaktivaatiota on minimaalinen ARE promoottorin AREx7 ja PSA-promoottorin LNCaP-solut, jotka ilmentävät mutatoidun, mutta toimiva, AR (kuvio 2C).

PSA on paras tunnettu siitä, androgeeni- reagoiva geenin sekä prostataspesifisen tuumorimarkkeri. Näin ollen meidän arvioida vaikutusta COUP-TF II endogeenistä PSA AR-positiivisia LNCaP-soluja, jotka oli infektoitu COUP-TF II ilmennä adenoviruksen (AdCOUP-TF II). Ilmentynyt COUP-TF II merkittävästi vaimentua androgeenin indusoima endogeeninen PSA-mRNA: n (kuvio 2D) ja proteiini (kuvio 2E), kun se ei ollut vaikutusta AR-proteiinin ilmentymisen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että COUP-TF II tukahduttaa Jälleenkytkentätoiminto eturauhasen syöpäsolujen estämällä endogeenisen AR: kohdegeenin PSA.

COUP-TF II Fyysisesti Vuorovaikutus on AR

in vitro

ja

in vivo

GST pull-down-määritys suoritettiin, jotta voitaisiin tutkia, AR tukahduttamisen COUP-TF II välittyy suoraan proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen. Vuorovaikutukset AR COUP-TF II, sekä AR domeenit vastuussa vuorovaikutuksesta, tutkittiin käyttämällä erilaisia ​​AR deleetiomutantit fuusioitu GST-proteiinin (kuvio 3A, vasen paneeli).

in vitro

käännetty COUP-TF II vuorovaikutuksessa GST-AR AF1DBDh, GST-AR DBDH, ja GST-AR LBD, mutta ei GST-AR TAU, mikä viittaa osallistuminen DBDH ja LBD domeenien AR sen vuorovaikutuksessa COUP-TF II. COUP-TF II verkkotunnuksia vastaa sen vuorovaikutus AR Sitten tutkittiin käyttämällä GST fuusioproteiinin COUP-TF II häviämämutantit (kuvio 3A, oikea paneeli).

in vitro

käännetty AR vuorovaikutuksessa täyspitkän COUP-TF II ja deleetiomutanteissa (COUP-TF II AF1, COUP-TF II DBDH ja COUP-TF II ΔAF1), mikä viittaa siihen, AR vuorovaikutusta useiden domeeneja COUP-TF II.

(A) Suora vuorovaikutus COUP-TF II ja AR. Vasen ylempi paneeli, Kaavamainen esitys täyspitkän AR ja sen eri domain häviämämutantteja käytetään GST pull-down määrityksessä. Vasen alempi paneeli, COUP-TF II suoraan vuorovaikutuksessa AR kautta DBDH, ja LBD alue AR. [

35S] metioniini-leimatun COUP-TF II annettiin sitoutua bakteerissa ilmaistuna GST yksin tai eri verkko-deleetiomutanttien AR (GST-AR AF1DBDh, GST-AR-TAU, GST-AR DBDH, GST-AR-LBD ). Reaktiot suoritettiin vastaavalla määrällä kunkin proteiinin määritettiin Coomassie blue -värjäyksellä (tuloksia ei ole esitetty). Viisi prosenttia leimatun proteiinin käytetty sitova reaktio ladattiin syötteenä. Oikea ylempi paneeli, Kaavioesitys täyspitkän COUP-TF II ja poistamisen mutantteja. Oikea alempi paneeli, AR suoraan vuorovaikutuksessa COUP-TF II. [

35S] metioniinilla merkitty AR annettiin sitoutua pelkän GST täyspitkän (GST-COUP-TF II F) tai erilaisia ​​deleetiomutanttien COUP-TF II (GST-COUP-TF II AF1, GST COUP-TF II DBDH, ja GST-COUP-TF II ΔAF1). Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. F: kokonaispituus COUP-TF II; AF1DBDh: AF1 + DBD + sarana; TAU: transactivation yksikkö; DBDH: DBD + sarana-alue. (B) COUP-TF II coimmunoprecipitated kanssa AR. PPC-1-solut transfektoitiin AR ja GFP-fuusioitunut COUP-TF II ekspressioplasmideja ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman 10 nM DHT: ssa 24 tuntia transfektion jälkeen. Coimmunoprecipitations tehtiin anti-AR (sc-815) tai anti-GFP-vasta. Western blot -analyysit Immunopresipitoidun materiaalien suoritettiin käyttäen anti-AR (sc-815) tai anti-GFP-vasta-aineita. Input blots on esitetty ilmentymisen taso kunkin proteiinin. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

tutkimiseksi

in vivo

vuorovaikutusta COUP-TF II ja AR, suoritimme coimmunoprecipitation määrityksessä PPC-1-soluja, jotka kotransfektoitiin AR ja GFP-fuusioitunut COUP-TF II ekspressioplasmidien. Immunosaostukset käyttämällä anti-AR tai anti-GFP-vasta-ainetta, jota seurasi Western blot -analyysi immunosaostetun komplekseja AR ja COUP-TF II, paljasti, että AR ja COUP-TF II: ta tehokkaasti yhteissaostetusta (kuvio 3B).

COUP-TF II häiritsee N /C-terminaalista vuorovaikutus AR

ligandin sitoutuessa, AR dissosioituu lämpöshokkiproteiineiksi ja translokoituu tumaan, jolloin sitoutuminen kohteeseensa geenipromoottorit homodimeerinä joka muodostuu jonka molekyylien N /C terminaalista vuorovaikutus kahden AR molekyylejä. Koska jotkut AR korepressoreiden häiritä vaiheista androgeeniriippuvaisissa AR aktivointi siten tukahduttaa AR-transaktivaatiota potentiaalia [45], kyky COUP-TF II estämään minkä tahansa AR aktivoinnin vaiheita, kuten N /C-terminaalinen vuorovaikutus ja tumaansiirtymiseen AR, tutkittiin. PPC-1-solut transfektoitiin VP-AR1-660 (sisältää AR tähteet 1-660), GAL-AR624-919 (sisältää AR tähteet 624-919), ja yhä suurempia määriä COUP-TF II-ekspressioplasmidin, yhdessä lusiferaasin reportterigeeni säätelee tandem Gal4 reagoiva elementit (5XGAL4-Luc3) [39]. Kuten on esitetty kuviossa 4A, COUP-TF II inhiboi Gal4-AR624-919 VP-AR1-660 nisäkkään kaksi-hybridi-järjestelmässä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että COUP-TF II estää dimerointi AR kautta N /C sitova. Sen määrittämiseksi, onko COUP-TF II häiritsee fyysisesti vuorovaikutusta esiintyy välillä N-pään ja C-pään AR, teimme GST avattavan kilpailun määritys käyttäen GST-AR LBD,

in vitro

käännetty [ ,,,0],

35S] metioniinilla merkitty AR AF1DBDh, ja

in vitro

käännetty COUP-TF II proteiineja. AR AF1DBDh on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa GST-AR-LBD, ja vuorovaikutus oli häiritsevät COUP-TF II annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4B).

(A) Mammalian kahden hybridin määrityksessä. PPC-1-solut transfektoitiin 5XGAL4-Luc3 yhdessä tai ilman VP-AR1-660, GAL-AR624-919, ja COUP-TF II ekspressioplasmidien. Soluja käsiteltiin tai ei ollut 10 nM DHT: ssa 24 tuntia. Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta yhdistettiin ja arvot edustavat keskiarvoja ± SEM. ***, P 0,001. (B) GST avattavan kilpailun määritys. Immobilisoituun GST-AR LBD proteiinit inkuboitiin [

35S] metioniinilla merkitty AR AF1DBDh tuottamia proteiineja

in vitro

käännös. Kilpailevan analyysi, 5 ja 10-kertainen ylimäärä

in vitro

käännetty COUP-TF II proteiineja lisättiin yhdessä radioleimattujen AR AF1DBDh proteiineja. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. AF1DBDh: AF1 + DBD + sarana-alue.

COUP-TF II aiheuttama AR tukahduttaminen ei Related kanssa tumaansiirtymiseen AR ja HDAC rekrytointi

The effect of COUP-TF II on AR tumaansiirtymiseen arvioitiin ilmensi RFP-merkittyjä AR ja GFP-tagged COUP-TF II COS-7-soluissa. Kun RFP-AR ja GFP-COUP-TF II yhdessä ilmenivät, AR proteiini pääasiassa sijaitsee sytoplasmassa ilman ligandia, mutta, AR-proteiinin translokaatio tumaan, kun läsnä oli 10 nM DHT (kuvio 5A). Riippumatta DHT, COUP-TF II ennustettavasti tumassa.