Krooninen sairaus

tiivistelmä

Stressi on ehdotettu olevan kasvaimen edistäjänä kautta eritystä erityisten neuromediators, kuten Urocortin2 ja 3 (Ucn2 /3), mutta sen rooli peräsuolen syöpä (CRC) on edelleen heikko. Havaitsimme, että Ucn2 /3 ja niiden reseptori kortikotropiinia vapauttava tekijä reseptori 2 (CRF2) oli säädellään ylöspäin korkealuokkaisesta ja huonosti eriytetty CRC. Tämä viittaa rooli CRF2 menetys solujen organisaation ja syövän etenemiseen. Käyttämällä HT-29 ja SW620-soluissa, kaksi CRC solulinjat eroavat kykynsä suorittaa solu-kontakteja, huomasimme, että CRF2 signaaleja Src /ERK-reitin aikaansaamiseksi muuttumiseen solu-solu risteyksissä ja shuttle p120ctn ja Kaiso vuonna ydin. HT-29-soluja, tämä signalointireitin johtaa myös remodeling soluadheesion i) fosforylaation Focal Adhesion Kinase ja ii) muuttamista aktiinitukirangan ja fokaalisen adheesion komplekseja. Nämä tapahtumat stimuloivat solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Lopuksi todettakoon, että tulokset osoittavat, että CRF2 signalointi valvonta solujen organisaatiota ja saattavat edistää metastaattisen potentiaalin ihmisen CRC solujen kautta epiteelin-mesenkymaalitransitioon kaltainen prosessi. Tämä myötävaikuttaa ymmärtämistä kasvain edistäviä vaikutuksia stressiä molekyylejä ja nimeää Ucn2 /3-CRF2 tandem tavoitteeksi estää CRC etenemistä ja aggressiivisuus.

Citation: Ducarouge B, Pelissier-Rota M, Lainé M Cristina N, Vachez Y, Scoazec JY, et ai. (2013) CRF2 signalointi Novel Regulator Cellular Adhesion ja maahanmuutto peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 8 (11): e79335. doi: 10,1371 /journal.pone.0079335

Editor: Alice Y. W. Chang, Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan

vastaanotettu: 01 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 30 syyskuu 2013; Julkaistu: 18 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Ducarouge et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Association pour la Recherche sur le Cancer (www.arc-cancer.net), Ligue Nationale contre le Cancer (www.ligue-cancer.net), Association François AUPETIT (www.afa.asso.fr), GEFLUC (www.gefluc.org) ja ESPOIR Isère Cancer (www.espoir-isere-cancer.com). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat länsimaissa. Histologinen arvosana on tärkeä prognostinen merkkiainetta korkealaatuista, huonosti eriytetty kasvaimet ovat yleensä aggressiivisempia ja invasiiviset kuin matala-asteista, hyvin erilaistunut kollegansa. Tunnusmerkki CRC on menetys solujen organisaation. Liima vuorovaikutukset solujen ja soluväliaineen (ECM) ovat keskeisiä tekijöitä kudoksen organisaation ja niiden modulaatiot osallistuvat solujen vaeltamiseen ja kasvainmetastaasit.

epiteelisolujen, solu-soluadheesion ylläpidetään useiden proteiini kompleksit kuten adherens liittymissä (AJ). Kadheriineja ovat transmembraaniproteiineja että nukleoitumaan AJ muodostamalla homotyyppisessä kalsiumista riippuvaa vuorovaikutusta kadheriineja viereisistä soluista. Manipulointi E-kadheriinin toiminto suoliston epiteelissä on paljastanut tärkeä rooli solujen erilaistumiseen tai solujen /matriisin tarttuvuus [1]. E-kadheriinin on vähentynyt invasiivisia CRC yhdessä hankkimalla mesenkymaalisten fenotyypin [2]. Solunsisäisen domeenin E-kadheriinin vaikuttaa suoraan β- ja p120 catenins (CTN). Ne säätelevät AJ ohjaamalla kadheriinin klustereiden, endosytoosin tai vakautta ja aktiinisytoskeletonin ankkurointi (tarkistetaan [3]). E-kadheriinin vajaiden solujen p120ctn sukkulat sytoplasmaan ja /tai tumaan, jossa se kohdistaa eri toimintoja riippuen sen kumppanit [4], [5]. Tumassa, p120ctn voivat olla vuorovaikutuksessa transkriptiotekijän Kaiso ja lievittää sen geeni repressioaktiivisuuteen [6], [7]. Epänormaali ydinvoiman lokalisointi p120ctn ja Kaiso on prognostisten varten aggressiivisuutta CRC [8].

Micro-ympäristö ohjaa syövän etenemisen kautta solukontaktien tai välittäjänä signaalit [9]. Kortikotropiinia vapauttavan tekijän (CRF) ja analogit, kuten urocortins (Ucns) [10] erittää peptidejä, jotka liittyvät stressiin. Ne toimivat kahdella G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien, CRF1 ja CRF2, eri kantoja [11]. CRF ja Ucn1 sitovat sekä reseptoreihin, kun taas Ucn2 /3 ovat selektiivisiä CRF2. CRF-reseptorit ovat pääasiassa kytketty Gαs ja käynnistää cAMP: n muodostumisen kautta adenylyylisyklaasin aktivointia [12]. Jos CRF järjestelmä on hyvin dokumentoitu ruuansulatuskanavassa sen ilmaisun ja sääntelyn stressi ja tulehdus, sen implisiittisesti CRC on huonosti tutkittu [13], [14]. Ligandeja ja ilmentyvät ja erittävät useat normaalit ja syöpäsolut. Siksi CRF järjestelmä voisi moduloida kasvain mikro-ympäristön autokriininen /parakriininen aktivointien syövästä tai stroomasoluissa [9], [15], [16]. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää ilmaus CRF2 ja sen ligandien CRC ja miten niiden signalointi voisi osallistua syövän etenemiseen. Tuloksemme kuvattu poikkeava ilmentymä CRF2 ja ligandien sekä CRC kasvaimia ja solulinjat, niiden laatu ja /tai erilaistumista tila. Käyttämällä HT-29 ja SW620 solulinjoissa, huomasimme, että CRF2 signalointi muuttaa soluadheesiota ja perustettu mekanismi, jonka korostavat molekyylit voivat osallistua syövän etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen paksusuolen adenokarsinooman solulinjoja HT-29 ja SW620 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO2-atmosfäärissä DMEM: ssä, joka sisälsi 25 mM glukoosia (Invitrogen , Cergy Pontoise, Ranska) ja jota oli täydennetty 10% FCS, 5% penisilliiniä ja streptomysiiniä. Ihmisen CRF2-GFP-konstrukti kloonattiin pBabe ekspressiovektoriin. Retrovirusinfektioiden HT-29-solut tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [17], ja sitten viljeltiin elatusaineessa, joka sisälsi 2 ug /ml puromysiiniä (BD Biosciences), seuraavat FACS valinnan virus-infektoitujen solujen.

Vasta-aineet ja reagenssin

Polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja CRF2 olivat Abcam (12964, Pariisi, Ranska). Immunisoiva peptidi käytetään tuottamaan CRF2-vasta-aine oli suunniteltu konservoitunut sekvenssi α, β ja γ-isoformit. Tämä vasta-aine sitten tunnistaa kaikki isomuodot reseptorin. Anti-ihminen E-kadheriinin (HECD1) monoklonaalinen vasta-aine saatiin Takara Biochemicals (Cambrex Bio Science, Pariisi, Ranska). Monoklonaalinen vasta-aine p120ctn (klooni 98) hankittiin BD Transduction Laboratories (Pont de Claix, Ranska). Anti-aktiini, anti-MMP3 polyklonaalisia vasta-aineita, ja anti-Kaiso, anti-vinkuliinin monoklonaalisia vasta-aineita saatiin Sigma Aldrich (L’Isle d’Abeau, Ranska). Polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja Src-P

Tyr418 hankittiin MBL Calbiochem (Fontenay-sous-Bois, Ranska), monoklonaalinen anti-Src ja anti-MMP7 vasta-aineet olivat Milliporelta (Molsheim, Ranska). Monoklonaalisia vasta-aineita ERK ja ERK-P

Tyr204 olivat BD transduktion laboratorioista ja Santa Cruz välillä Tebu (Le Perray-en-Yvelines, Ranska) vastaavasti. Polyklonaalisia anti-FAK-P

Ser910 antobodies saatiin Invitrogen (Cergy Pontoise, Ranska). Alexa-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-aine saatiin yhtiöltä Molecular Probes (Eugene, OR). Piparjuuren peroksidaasi-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-aine saatiin Bio-Rad (Marnes-la-Coquette, Ranska), aasin anti-kani-vasta-aineita saatiin Jackson Immunoresearch (Immunotech, Marseille, Ranska). Topro3 ostettiin Invitrogen. Urocortins, CRF ja Astressin 2b ostettiin Sigma Aldrich.

Patient kohortin Tissue Micro Taulukot ja immunohistokemia

Tutkimus tehtiin cDNA kohortin 30 CRC potilaista. Näytteitä jäädytetystä kasvain ja peritumoraalista kudokset saatiin Tuumorikudoksen Pankin Hospices Civils de Lyon, tukee National Institute of Cancer (INCA) ja ranskalainen Ministeriöltä of Health. Kudospankin vastaa Ranskan lainsäädännön. Kaikki potilaat ovat antaneet kirjallisen tietoisen suostumuksen käyttöön kudosnäytteiden tutkimustarkoituksiin; puuttuessa tietoisen suostumuksen, kudosnäytteitä potilaiden tiedetään kuolleen voitaisiin käyttää myös tutkimustarkoituksiin mukaisesti Ranskan määräyksiä. Keräys-, varastointiin ja vapauttamaan kudosnäytteiden ovat mukaisesti kansallisten ja kansainvälisten suositusten ja laadunhallintaohjelma on kehitetty. Kaikkien esitettyjen hankkeiden kudospankki arvioi ja hyväksyy sen tieteellinen komitea, joka myös vahvistaa niiden vaatimustenmukaisuuden eettisiä säännöksiä. Jos haluat säilyttää anonymiteetti, erityinen tunnus oli kullekin potilaalle. Kunkin näytteen cDNA kasvainkudokseen on yhdistetty cDNA viereisen normaalin kudoksen. Kasvain vaiheet määriteltiin mukaan TNM tilan kasvaimet (American sekakomitean Cancer Staging järjestelmä). Tissue Micro Array (TMA) CDA3 hankittiin SUPER BIO CHIPS (Korea). Dia blokattiin TBS /BSA 3% /Tween-20 0,1% ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-CRF2 klo 1:100. Mitä pidemmälle IHC suoritettiin Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories, Courtaboeuf, Ranska), vastavärjättiin 1 min inkuboinnin hematoksyliinillä, kuivattu ja asennettu DPX. Jokainen mikroskooppi hankinnat olivat alas ”Tribun” ja määrällisesti Image J. IHC kvantitatiivinen suoritettiin ImageJ WCIF kanssa CIE Lab toiminta väri perustuu kynnystykseen segmentointi erottaa CRF2 värjäys alkaen hematoksyliini vasta-värjäystä. Kuusi eri alojen jokaisen näytettä segmentoitu ja keskimääräinen harmaa laskettiin varten CRF2 ja Hematoksyliini. CRF2 voimakkuus jokaisesta näytteestä on keskiarvo CRF2 /Hematoksiliini suhde lasketaan kuudesta eri aloilla.

solufraktioinnin

ydin- fraktiointiin, solu hajotettiin HEPES 10 mM /MgCl2 1,5 mM /KCI 10 mM /DTT 0,5 mM /NP40 0,05% /pH 7,9. Sen jälkeen kun 10 minuutin sentrifugaatiolla 3000 rpm ja 4 ° C: ssa, suspendoitiin uudestaan ​​HEPES 5 mM /MgCI 2: ta 1,5 mM /EDTA 0,2 mM /DTT 0,5 mM /glyseroli 26% (v /v) /pH 7,9, ja homogenoitiin 20 täydellä aivohalvauksia Dounce. 30 min jäissä inkuboinnin, lysaatit sentrifugoitiin 20 minuutin ajan 24000 g ja 4 ° C: ssa. Sisältäviä supernatantteja tumauutteita analysoitiin immunoblottauksella.

Immunoblot ja immunosaostus

Yhteensä lysaattien tai subsellulaarisia fraktiot käsitellä immunoblot kuten aiemmin on kuvattu [18].

immunofluoresenssivärjäyksellä

Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille ja sitten käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [18]. Kiinnityksen jälkeen PFA 4% sakkaroosia, ei-spesifisiä tukittiin 1 h ajan 37 ° C: ssa 3% BSA: ta 0,5% Tween 20: tä. Sitten soluja inkuboitiin 1 tunti 37 ° C: ssa, joilla on erityisiä vasta-aineita, jotka oli laimennettu esto liuoksessa 1:100 perus- ja 1:500 varten sekundäärisiä vasta-aineita. Fluoresenssi mikrovalokuvia jotka on otettu -konfokaalimikroskoopilla klo x 100 tavoite (Leica TCS SPE) tai epifluoresenssimikroskoopilla klo x 100 tavoite (ZEISS, AvioVert 200M).

RT ja qPCR

Yhteensä RNA otot suoritettiin käyttäen Trizol

TM reagenssia ja 1 ug kokonais-RNA: ta denaturized ja myöhemmin käsitellä käänteistranskriptioon käyttämällä M-MLV (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. qRT-PCR tehtiin kevyellä cycler 480 ja universaali koetin kirjasto (Roche). Alukesekvenssit ja koettimet on esitetty taulukossa 1.

ECM valmistelu ja soluadheesion

kudosviljelymaljoihin päällystettiin LM-332 käyttämällä seuraavia menetelmiä: A431 epidermaalisiin soluja viljeltiin yhtymäkohta erilaisille pinnoille 37 ° C, jotta tallettamista LM-332, sitten solut poistettiin aikaisemmin kuvatulla [19], [20]. Lyhyesti, konfluentit yksisolukerrokset peräkkäin uutettiin 1% (v /v) Triton X-100 PBS: ssä, jota seurasi 2 M ureaa 1 M NaCl. Levyt pestiin PBS: ssä, inkuboitiin 1% BSA: ta, ja varastoitiin -20 ° C: ssa. Ihmisen kollageenin tyyppi IV istukasta saatiin Sigma Aldrich. Muovipäällyste petrimaljoille (Mikrotiitterilevyt 96-, Nunclone; Nunc, Roskilde, Tanska) suoritettiin yön yli inkuboimalla ECM-proteiineja (10 ug /ml) 4 ° C: ssa. Levyt kyllästettiin 3% (w /v) BSA: lla PBS: ssa 2 tuntia 37 ° C: ssa. HT-29 CRF2-GFP-soluja esikäsiteltiin on tai ei ole 100 nM Ucn3 30 minuuttia, ennen kuin on päällystetty (5 x 10

4 solua /kuoppa) kolmena kappaleena päällystettyjen 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille ja inkuboitiin 0-60 min 37 ° C: ssa. Tarttumattomat solut poistettiin pesemällä kolme kertaa PBS: llä, ja solujen adheesio arvioitiin solunlisään- (CellTiter 96 AQ

ueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Promega).

Cell transmigraatio ja invaasio

HT-29 CRF2-GFP-solut ympättiin 24-kuoppaisille siirtoaltaat (8 uM huokoskoko) (Becton Dickinson). Sen jälkeen solu yhtymäkohta, viljelyalusta seerumin korjattu yli yön ylös ja alas kammioihin. Transmigration käynnistettiin sitten perustamalla seerumin kaltevuus 10% FCS alemmassa kammiossa, tai ilman 100 nM Ucn3 kussakin kammiossa. 72 tuntia aloittamisen jälkeen sielunvaelluksesta, vanupuikkoja käytettiin poistamaan solut yläpinnalla siirtoaltaat. Kiinnityksen jälkeen PFA 4%, muuttavien solut värjättiin hematoksyliinillä ja käsin laskettiin mikroskoopilla. Keskiarvot +/- SEM laskettiin ja analysoitiin käyttäen Studentin testiä.

HT-29 CRF2-GFP-soluja (2,5 10

-5 /ml) pantiin alkuun osaston 24-monikuoppaiselle aseta insert levy (BD Falcon), jotka erotettiin pohjaosastossa BD-matrigeeliä Matrix kalvo, jossa on 0,4-um huokoskoko. Seerumitonta RPMI kanssa tai ilman Ucn3 (1 uM) lisättiin ylempään osastoon ja 10% FCS pohjaan osastoon. 48 tunnin kuluttua 37 ° C: ssa 5% CO2-atmosfäärissä, solut, jotka olivat tunkeutuneet läpi Matrigel, analysoitiin kuten edellä on kuvattu, että transmigraationa määrityksessä.

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin CellTiter 96 Kit (Promega) mukaan valmistajan ohjeiden.

liivate hajoaminen määrityksen

Noin 40 ui (20-30 ug solu-proteiini) korjataan viljelyväliaineessa elektroforeesi ei-pelkistävissä olosuhteissa 10% akryyliamidia geeliä sisältää 1 mg /ml gelatiini (Sigma-Aldrich), menetelmän mukaisesti kuvanneet Werb ja al., [21]. Elektroforeesin jälkeen geelit pestiin huoneen lämpötilassa 3 x 30 min 2% Triton X-100 ja yön yli 37 ° C: ssa puskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCl (pH 7,7) ja 5 mM CaCl

2.Thereafter , geelit värjättiin 0,1% (paino /tilavuus) Coomassie Brillant Blue R-250 50% (tilavuus /tilavuus) isopropyylialkoholi /10% (tilavuus /tilavuus) jääetikassa 60 min ja väri poistettiin 20% (vol /tilavuus) isopropyylialkoholi /5% (tilavuus /tilavuus) jääetikkaa.

Densitometri analyysi ja tilastot

Immunoblotit Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. Kaikki graafit ovat keskiarvo ± SD proteiinin ekspressiotasoja mitattiin densitometrisellä analyysi ”Image J” ohjelmistot (NIH). Suhteellinen ekspressiotasot mRNA: n tai proteiinien määritetään seuraavasti: ilmaus kunkin tason transkriptin tai proteiinin normalisoitiin i) niiden siivous geenin qPCR tai RT-PCR: llä; ii) aktiini kokonaan lysaatissa westernblots tai histonien ydin- ote westernblots. Joissakin kokeissa ja jotta näyttää kertaiseksi kasvua ohjaus suhteellinen ilmentyminen transkriptien tai proteiinien tarkastusolosuhteet asetettiin 1. Tilastot ovat parittomia t-testi ja tilastollinen merkitsevyys on annettu useissa tähdellä (* P 0,05 ; ** P 0,01; *** P 0,001).

tulokset

ilmentäminen CRF2 ja sen ligandien kasvaa lavastus CRC kudoksissa ja solulinjoissa

on ensin tehty qPCR varten CRF2α (suuret CRF2 isoformin paksusuolen epiteelin), [22] ja Ucn2 /3 normaaleissa ja CRC kudoksia 30 potilasta, ymmärtää paremmin niiden sääntelyn aikana kasvaimen etenemistä (kuvio 1A). Kliinis havainnot kasvainten käytettiin tutkimuksessa on esitetty taulukossa 2. Kasvaimet ryhmittyneet pieni (n = 19, mikä vastaa vaiheita 1-2) ja korkea (n = 11, mikä vastaa vaiheita 3-4) laadut ja standardoitu niiden normaaleissa kudoksissa. Tilastollinen analyysi paljasti merkittävää lisäystä CRF2α ja Ucn3 mRNA: n ekspression kasvaimissa verrattuna normaaleihin kudoksiin mukaan kasvaimen. Ei ollut merkittäviä eroja Ucn2 selostukset näissä olosuhteissa. Kuitenkin, kun analyysi tehtiin kasvainten kudokset vain, kuvio paljastui koskevat Ucn2 mRNA: n ilmentymisen: Ucn2 transkriptin kohoamiseen mukaan PNM asema, imusolmuke hyökkäyksen ja mikrosatelliitti epävakaus (MSI). Lopuksi CRF2α, Ucn2 ja Ucn3 transkriptipitoisuuksissa eivät korreloi mutaatiot

K-ras tai B-raf

. Samanlainen tulos havaittiin CRC solulinjojen (täydentävä kuva S1). Immunohistokemiallista analyysiä käytettiin havaitsemiseksi CRF2 reseptoriproteiinin ilmentyminen peräsuolen kohdissa vastaavat normaaleja kudoksia (n = 9), huono laatu (n = 24) ja korkea-asteen (n = 18) kasvaimia (kuvio 1 B). Osuus näytteiden suurempi kuin keskiarvo normaaleissa kudoksissa kasvoi 22% normaalista 33% ja 72% matalan ja korkean asteen kasvaimet vastaavasti (kuvio 1 C, vasen paneeli). Lisäksi CRF2 proteiinin ilmentyminen kasvoi mukaan kasvaimen (ANOVA p = 0,047) (oikea paneeli). Nämä tulokset viittaavat suhde CRF2 proteiinin ilmentymisen ja korkeampi kasvaimen laadut. Laajensimme analyysi qPCR 17 ihmisen CRC solulinjoissa (täydentävä kuva S1). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että ilmaus CRF2 ligandien korreloi käänteisesti epiteeli- Differentiaatiomarkkerien kuten E-kadheriinin (

Cdh1

), mutta korreloi mesenkymaalisten päättäjien kuten vimentiinista (

Vim

), mikä viittaa rooli of CRF2 solu epäjärjestyksestä havaittu syövän etenemiseen. Kaksi CRC solulinjat valittiin: i) HT-29-solut, jotka ilmentävät korkea E-kadheriinin mutta alhainen Ucn2 eikä vimentiinista; ii) SW620-soluissa, huonosti eriytetty mesenkymaalisten soluja, jotka ilmentävät korkeita Ucn2 ja vimentiinista verrattuna tasolle heikko E-kadheriinin (kuvio 2A). Ilmaus CRF2 ja E-kadheriinin proteiinitasolla vahvistettiin immunoblottauksella (kuvio 2B). Käyttämällä HT-29-soluja, jotka stabiilisti yli-ilmentävät CRF2 kytketty GFP-proteiinia (HT -29 CRF2-GFP solut) havaitsimme, että CRF2-GFP pääasiassa paikallistaa kalvo, solujen väliseen yhteystiedot (kuvio 2C). Tämä havainto tuki lisäksi mikroskoopilla konfokaali analyysi osoittaa kolokalisaation CRF2-GFP-proteiinia, jossa E-kadheriinin HT-29-solut (kuvio 2D). Kanssa Ucn3 (tehokkain CRF2 agonistia HT-29-solut, katso täydentävien kuva S2), solut kontakteja muutettiin ja CRF2-GFP siirtynyt sytoplasman rakkulat (kuvio 2C).

(A) histogrammit edustavat CRF2α, Ucn2 ja Ucn3 transkriptioekspressiokuvio normalisoitu taloudenhoito geeni PGK (fosfoglyseraattikinaasi) ihmisen normaaleissa kudoksissa tai CRC (matala ja korkea laatu). (B) edustaja CRF2 immunohistokemia suoritettiin CRC kudoksia matalasta korkeaan grade. Mittakaava, 50 pm. (C) histogrammit edustavat CRF2 proteiinin ilmentyminen kvantitoidaan immunohistokemiallisesti. Kukin näyte edustettuina tumma baareja +/- SD (vasemmalla) ja keskiarvon kunkin ryhmän +/- SD (oikealla). Korkea arvosana on tilastollisesti erilainen kuin normaali *, p 0,05.

(A) karakterisointi HT-29 ja SW620 solulinjoissa mRNA ilmaus Ucn2, vimentiinistä (Vim) ja E-kadheriinin ( Cdh1) normalisoida taloudenhoito geeni HPRT (ihmisen fosforibosyylitransferaasigeeniä). (B) E-kadheriinin /aktiini ja CRF2 /aktiinin proteiinin ilmentyminen kvantifioitiin immunoblottauksella vuonna SW620 ja HT-29 solulinjoissa. (C) Konfokaalimikroskopia analyysi CRF2-GFP jakelun Ucn3 saaneilla HT-29-soluja. Mittakaava, 15 pm. (D) Konfokaalimikroskopia analyysi CRF2-GFP ja E-kadheriinin jakelun HT-29-soluja. Mitta-asteikko, 20 um.

Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että CRF2, ja sen ligandien ilmaistaan ​​ihmisen CRC ja solulinjat mukaan kasvaimen ja /tai erilaistumisen tilasta. CRC-solut voivat aktivoida CRF2 kautta autokriini tuotantoa ligandien, erityisesti erilaistumaton solulinjoissa.

asetus solu-solu-kontakteja CRF2 signalointi

CRF2 signalization on hiljattain laajennettu koskemaan muita kuin kanoninen G PROTEIN reseptorin polkuja, mukaan lukien Src, joka suoraan vuorovaikutuksessa endosytoidut CRF-reseptoreihin ja osallistuu aktivointi ERK [23], [24]. Src-P

Tyr418 ekspressio lisätään asteittain 5-30 min, kun koko src pysyi muuttumattomana (kuvio 3A). Fosforyloitu muoto Src on yhteistyössä immunosaostettiin CRF2 aikana alkuvaiheessa kineettisen (täydentävä kuva S3). CRC, Src aktivointi korreloi E-kadheriinin häiriö, histologisia luokittelua ja huonon ennusteen [25]. Meillä on siis tutkittu osallistumista Src-vaikutuksen Ucn3 välittämiä solun dissosiaatiota. HT-29-solujen, konfokaalimikroskopialla analyysi osoitti, että E-kadheriinin värjäys tuotti kennomaisen kuviona on sivusuunnassa kalvon cortex (kuvio 3B). Aktivointi CRF2 mukaan Ucn3 nopeasti muuttaneet tätä mallia. Vain paksuuntunut ja häiritsi lineaarinen kalvon värjäytyminen säilyi samalla lukuisia soluliman keskittymistä ilmestyi, mikä viittaa endosytoosin E-kadheriinin liittyvät AJ häiriöitä. Sykloheksimidi käytettiin estämään kertyminen neosynthesized E-kadheriinin. Internalisaatio joissa käytetään HECD-1-vasta-aineita tehtiin vahvistamaan Ucn3 aiheuttama E-kadheriinin endosytoosin (kuvio täydentävää S4). Soluhajotusprosessin ja endosytoosin E-kadheriinin, kun Ucn3 altistus esti esikäsittely kanssa Src-estäjän PP2, mikä osoittaa, että Src aktivointi tarvitaan Ucn3 välittämiä solun solukontaktien häiriöitä (kuvio 3C). Vuonna SW620-solut, jotka ilmentävät alhainen E-kadheriinin ja suorittaa muutama AJ, saarto CRF2 signaloinnin sen erityinen agonistin astressin2b (A2b) 24 tuntia oli vastuussa lisääntyneestä ilmaus E-kadheriinin (kuvio 3D). Immunofluoresenssianalyysi E-kadheriinin jakelun SW620 solut osoittivat heikkoa kalvo ilmaisun ja solu-solu kontakteja tai ilman Ucn3 (kuvio 3E). Läsnä ollessa A2b, SW620-solut muodostivat klustereita ja E-kadheriinin oli paikallistaa solu-solu-kontaktien. Ucn3 hieman käänteinen A2b aiheuttama soluklusteroitumisella. Modulointi liima proprieties of SW620-soluja myös osoituksena aggregaatiotutkimuksissa, osoittavat, että molemmat kiinnittyneet ja muiden tarttuvien solujen pystyivät aggregoitua läsnäollessa A2b (täydentävä kuva S5).

(A) immunoblottianalyysi Src- P

Tyr418 ja Src kokonais-ilmentymisen HT-29-soluja sen jälkeen, kun aika aikana Ucn3 hoidon. (B) konfokaali analyysi E-kadheriinin jakelun HT-29-soluja esikäsiteltiin sykloheksimidillä ennen Ucn3 hoitoa. Mittakaava, 15 pm. (C) vaikutus PP2 (10 uM, 1 h) E-kadheriinin jakelun HT-29-solujen käsiteltyjen tai ei ole Ucn3, analysoitiin epifluoresenssilla mikroskoopilla. Mittakaava, 20 uM. (D) vaikutus CRF2 antagonisti (A2b, 8 nM, 24 tuntia) E-kadheriinin ilmentymisen SW620-soluissa. Kvantitointi suoritetaan immunobloteilla ja normalisoitiin aktiini. (E) E-kadheriinin jakelun SW620-soluissa esikäsitelty tai ei ole A2b ja edelleen käsitelty tai ei kanssa Ucn3. Analysoi suoritettiin epifluoresenssilla mikroskoopilla. Mittakaava, 10pM.

E-kadheriinin liittyy catenins osoitteessa AJ komplekseja. Häiriöt solu-solu kontakteja johtaa AJ proteiinien dissosiaatiota ja soluliman ja /tai ydinvoiman lokalisointi catenins, jotka edistävät solujen invaasiota CRC [26]. HT-29-soluja käsiteltiin Ucn3, p120ctn kertyi sytoplasmassa ja tumassa (kuvio 4A). Tumaan, p120ctn on kuvattu säätelevät transkriptiotekijän Kaiso. Ucn3 huomattavasti p120ctn ja Kaiso ydinvoiman lauseketta havaittiin immunoblottauksella jälkeen ydin- fraktioinnin (kuva 4B). Tunnistamaan signalointi-molekyylien mukana tässä ydin- shuttling, testasimme vaikutus Src (PP2) ja MEK (U0126) estäjät. Kuten on esitetty kuviossa 4C, olemme huomanneet, että nämä inhibiittorit päinvastaiseksi Ucn3 aiheuttama tumakertymään näiden proteiinien. He myös indusoi kasvua pohjapinta ydin- ilmentymisen p120ctn ja Kaiso, luultavasti koska niiden myrkyllinen vaikutus. Ydin- jakautuminen Kaiso analysoitiin edelleen konfokaalimikroskopiaa (kuvio 4D). Prosenttiosuus ytimiä positiivisia Kaiso kasvoi noin 40% HT-29-solujen käsitelty Ucn3. Mielenkiintoista on, että ohjaus, solut, jotka vastaavat ytimiä positiivisia Kaiso havaittiin kehällä klusterin, joka vastaa solujen vähemmän solujen väliset yhteydet. Under Ucn3, solut keskellä klusterin tulivat positiivisiksi ytimiä merkintöjä Kaiso.

(A) konfokaali analyysi p120ctn paikalla HT-29-solut esikäsitellään sykloheksimi- ennen Ucn3 hoitoa. Asteikko bar, 10 mikrometriä. (B) immunoblottianalyysi p120ctn ja Kaiso proteiinin ilmentyminen ydin- otteita HT-29-solujen käsiteltyjen tai ei ole Ucn3 (lauseke normalisoitiin histonien). (C) vaikutukset Src ja MEK estäjien (PP2 ja U0126: 10 uM, 1 h) päälle p120ctn ja Kaiso proteiinin ilmentyminen ydin- otteita HT-29 käsitelty tai ei kanssa Ucn3. Expression normalisoitiin histonien. (D) konfokaali analyysi solujen jakautumista Kaiso HT-29-soluja. Tumat värjättiin Topro3. Solut negatiivisia ytimiä merkintöjä Kaiso oli ympäröity valkoisella pisteviivalla. Mittakaava, 60 pm.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että CRF2 signaaleja Src reitin aikaansaamiseksi AJ häiritsemiseen E-kadheriinin endosytoosin. Tämän jälkeen p120ctn ja Kaiso tumaansiirtymiseen. Tätä kautta, CRF2 voivat osallistua solujen erilaistamattomuuden ja muuttoliike.

CRF2 signalointi reorganizes soluväliainekonstruktissa kontakteja hyväksi solumigraation ja invaasiota

Syöpä solujen vaeltamiseen tarvitaan etäpesäkkeitä ja tuloksia uudelleenjärjestely solu-solu- ja solu-matriisi kontakteja. Ucn3 aiheuttama soluhajotusprosessin liittyi myös solujen muoto remontin havaittuna aktiinisytoskeletonin värjäys phalloidin-TRITC on pohjapinta napaan HT-29-solut (kuvio 5A). Käsittelemättömissä soluissa, aktiini jaettiin solun reuna ja organisoitu stressi kuidut jakautuvat solut. Kanssa Ucn3, aktiini värjäytyminen oli vähemmän voimakasta solun kehällä, jossa koskettimet ovat liukenevat. Oli myös vähemmän stressiä kuituja, joka ilmestyi lyhyempi ja hajanaista. Remontin solun muodon ohjaavat solunsisäisten kinaasien signalointi. Tässä linja, ERK-reitin usein myös aktivoitu vastauksena CRF2 aktivointia. HT-29 CRF2-GFP solut, osoitimme, että ERK oli fosforyloitiin Tyr

204 lyhyessä ajassa jälkeen Ucn3 altistuksen (kuvio 5B). Suhde fosforyloidun /yhteensä ERK korotettiin 2,5 kertaiseksi välillä 5 ja 15 min ja palautettu perustasolle 30 ja 60 min. PP2, käänteinen ERK aktivaation aiheuttama Ucn3 muuttamatta sen perustason (matala paneeli). MEK-inhibiittori, U0126, indusoi menetys fosforyloidun muotojen ERK perusolosuhteissa ja sen jälkeen Ucn3 hoidon. Soluadheesio remodeling ja muuttoliike käsittää fokaalisen adheesion (FA) kinaasi (FAK). Tämä kinaasi voisi fosforyloitiin Ser

910 ERK Ser /Thr-kinaasi. Olemme siis määrittää tason FAK fosforylaation HT-29 CRF2-GFP solut altistetaan Ucn3 (kuvio 5C). FAK P

Ser910 oli ohimenevästi korottaa enintään 30 min. Tämä fosforylaatio oli hieman inhiboi PP2 ja U0126 perusolosuhteissa ja lakkautetaan alle Ucn3 hoitoa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Ucn3 aktivoi Src /ERK /FAK-fosforylaatio cascade kautta CRF2-reseptorin.

(A) Phaloidin-TRITC fluoresenssi analysoitiin konfokaalimikroskopialla on pohjapinta napa HT-29-CRF2-GFP-soluissa Ucn3 hoitoon. Mittakaava, 5 um. (B) ERK-P

Tyr204 /ERK yhteensä suhde kvantitoidaan immunoblot HT-29-solujen käsitelty Ucn3 (0-60 min) (ylempi paneeli). Vaikutukset Src (PP2: 10 uM, 1 h) tai MEK (U0126: 10 uM, 1 h) estäjät on Ucn3 aiheuttama ERK-P

Tyr204 (Alahavas). (C) Ucn3 välittämää fosforylaatiota FAK- P

Ser910 HT-29. Kvantitatiivinen tehtiin päässä immunobloteilla ja normalisoidaan aktiini (ylempi paneeli). Vaikutukset Src (PP2, 10 uM, 1 h) ja ERK (U0126, 10 uM, 1 h) estäjät on Ucn3 aiheuttama FAK-P

Ser910 (Alahavas). (D) konfokaali analyysi vinkuliini jakauman pohjapinta napaan HT-29 seuraava Ucn3 hoitoa. Mittakaava, 20 um. (E) kvantifiointi laastarin määrää koon 30 min Ucn3 hoitoa.

Focal tarttuvuus rakenteisiin, joita säännellään FAK, osallistuvat solu-ECM vuorovaikutuksia. Nämä vuorovaikutukset välittävät eri transmembraani- reseptoreita, kuten integriinit, jotka liittyvät solun tukirangan komponentteja ja telineen molekyylit, kuten vinkuliinin [27]. Analysoimme vaikutus Ucn3 FA jakamalla vinkuliini (kuvio 5D). Ilman Ucn3, vinkuliini ilmentyi voimakkaan laikkuja jaetaan pääasiassa solun reuna. Jossa Ucn3, pienempiä välimerkein kynnet ilmestyi vinkuliini värjäyksessä, jotka tasaisesti jakautunut koko solun ja silti ole rajoitettu kehällä, erityisesti 30 min. Kvantifiointi Näiden laastarit koon paljasti, että pienet laikkuja lisääntyi, kun taas suuri säilyvät ennallaan (kuvio 5E). Tämä merkintä viittaa muodostumisen orastavan paikallisissa kontakteissa, joka on kuvattu aikaisemmin osallistumaan soluadheesion ja muuttoliike [28]. Olemme suorittaneet soluadheesiota kokeiluja, jotta voidaan testata, jos Ucn3 aiheuttama vinkuliini uudelleenjärjestely voisi muuttaa solun sitoutumista kollageeni IV (CoIV) ja laminiini 332 (LM-332) (kaksi suurta ECM proteiinit paksusuolen n tyvikalvon) (kuvio 6A). Ucn3 pienenee HT-29 soluadheesiota Näiden kahden matriisin komponenttien 20 ja 60 min pinnoitus. Sen määrittämiseksi, jos tämä vaikutus oli liittynyt muuttoliikettä ja /tai invaasion testasimme vaikutus Ucn3 HT-29 soluliikkuvuus mukaan siirtokuoppaan muuttoliike ja matrigeelin invaasiota määritykset (kuviot 6B ja C). Ucn3 hoito lisäsi merkittävästi taso solumigraation ja invaasio vertailuryhmän soluihin. Tätä vaikutusta ei ole tuettu muutos solujen elinkelpoisuuden (kuvio 6D), mutta voidaan säädellä eritystä matriksimetalloproteaaseja (MMP). Olemme siksi tutkineet ilmaisun ja toiminnan MMP. Kuten kuviossa 6E, mRNA-tasot MMP3 ja MMP7 havaittiin ohimenevästi kasvoi Ucn3. Emme havaittu merkittävää modulaatio MMP2 ja MMP9 selostukset (tuloksia ei ole esitetty).