PLoS ONE: Structure-Activity Relationship of Synteettinen 2-Phenylnaphthalenes hydroksyyliryhmien kanssa, jotka estävät leviämisen ja indusoida MCF-7 Cancer Cells
tiivistelmä
Tässä tutkimuksessa kuusi 2-phenylnaphthalenes hydroksyyliryhmillä syntetisoitiin korkeilla saannoilla, jonka demetylaation vastaavan metoksi-2-phenylnaphthalenes, ja yhden 2-phenylnaphthalene aminoryhmän kanssa saatiin hydraamalla. Kaikki 2-phenylnaphthalene johdannaiset arvioitiin sytotoksisuus, ja rakenne-aktiivisuussuhde (SAR) vastaan ihmisen rintasyövän (MCF-7-solut) määritettiin myös. SAR Tulokset paljastivat, että sytotoksisuus oli merkittävästi edistää hydroksyyliryhmä C-7 asemassa naftaleenirenkaan. Käyttöönotto hydroksyyliryhmät C-6-asemassa naftaleenirenkaan ja C-4-asemassa fenyylirenkaassa melko parannettu sytotoksisuus, mutta käyttöönotto on hydroksyyliryhmä C-3-asemassa fenyylirenkaan väheni hieman sytotoksisuus. Kaiken 6,7-dihydroksi-2- (4′-hydroksifenyyli) naftaleeni (PNAP-6h) oli paras sytotoksisuutta, ja IC
50-arvo 4,8 uM vastaan MCF-7-solulinja, ja osoitti alhainen myrkyllisyys kohti normaaleja ihmisen nisäepiteelisoluissa (MCF-10A). PNAP-6h johti solun pidätys on S-vaiheeseen, todennäköisesti johtuu lisääntyvää p21 ja p27 ja vähenevän sykliini D1, CDK4, sykliini E ja CDK2. Lisäksi PNAP-6h laski CDK1 ja sykliini B1 ilme, todennäköisimmin johtaa G
2 /M pidätys, ja indusoi morfologiset muutokset, kuten ydin- kutistuminen, ydinvoima pirstoutuminen, ja ydinvoiman hypercondensation, havaittuna Hoechst 33342 värjäystä. PNAP-6h: n indusoiman apoptoosin, todennäköisesti edistämällä Fas ilmaisun, lisääntynyt PARP-aktiivisuutta, kaspaasi-7, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 ilmaisu, Bax /Bcl-2-suhde, ja fosforylaatiota p38, ja vähensi fosforylaatiota ERK. Tutkimus tarjoaa ensimmäinen osoitus sytotoksisuutta PNAPs vastaan MCF-7-solut ja selvennetään mekanismin taustalla PNAP aiheuttama sytotoksisuuden.
Citation: Chang CF, Ke CY, Wu YC, Chuang TH (2015) rakenne- Activity Relationship of Synthetic 2-Phenylnaphthalenes, joissa on hydroksyyliryhmiä, jotka inhiboivat ja indusoida apoptoosia MCF-7-syöpäsoluja. PLoS ONE 10 (10): e0141184. doi: 10,1371 /journal.pone.0141184
Editor: Yi-Hsien Hsieh, Institute of Biochemistry and Biotechnology, Taiwan
vastaanotettu: 13 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 06 lokakuu 2015; Julkaistu 22 lokakuuta 2015
Copyright: © 2015 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään
Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.
Rahoitus: kirjoittajat kiittää ministeriön Science and Technology, Taiwan (MOST 103-2320-B-039-027-; MOST 103-2113- M-039-003- ja MOST 103-2738-M-039-001-), Kiina Medical University (CMU103-N-05), ja osittain avustusta Chinese Medicine Research Center, Kiina Medical University (Ministry of Education, Aim Top yliopiston suunnitelma) taloudellista tukea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Rintasyöpä on yleisin syy syövän kuoleman naisilla; Siksi, etsiä uutta ja tehokas syöpälääke on välttämätöntä. Naftaleenijohdannaisten näyttää voimakas anti-rytmihäiriö, anti-kasvain, ja antioksidantti toimintaa [1]. Farmakologisesti, 2-phenylnaphthalenes (PNAPs) on samankaltainen tilallinen ja konformationaaliset vaatimukset genisteiiniksi (isoflavone) ja niillä on suuri määrä biologisia ja biolääketieteen vaikutuksia [2]. Kemiallisesti, 1-substituoitu naftaleeni, ei 2-substituoitu naftaleeni, saadaan elektrofiilisen aromaattisen substituution naftaleenin. Parhaan tietomme mukaan tutkimukset suhteesta rakenteen ja sytotoksisuutta monisubstituoitua PNAPs ovat harvinaisia. Tässä tutkimuksessa olemme syntetisoitiin substituoimaton PNAP-1, seitsemän metoksi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8), kuuden, joka vastaa hydroksi-PNAPs (PNAP-2h-PNAP-7h), ja yksi aminohappo-PNAP (PNAP-8h) ja tutkittiin niiden syövänvastainen rakenteen ja aktiivisuuden välisiä suhteita ja toimintamekanismeja MCF-7 solulinja.
Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että genistein ja yhdisteet, fenyyli-1-bentsopyran-4-oni selkäranka kasvua estäviä syöpäsolut kautta solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosin induktion [3-5]. Sykliiniriippu- sykliiniriippuvainen kinaasi (CDK) kompleksit ovat tärkeimmät sääntelyviranomaisten solusyklin, joka on hyvin monimutkainen ja tiukasti säänneltyjä prosessi [6,7]. G
1 /S faasimuutos säätelee aktivoituminen sykliini D1-CDK4 /6 monimutkaisia ja sykliini E-CDK2 kompleksi [8,9], kun taas G
2 /M faasimuutos säädellään aktivointi sykliini B1-CDK1 kompleksi [10,11]. Vapauttaminen solusyklin aiheuttaa puutetta erilaistumisen ja poikkeava kasvu.
Apoptoosi on kehitysprosessi, joka johtaa ohjelmoitua solukuolemaa [12]. Prosessi apoptoosin sisältää morfologisia muutoksia (esim. Solun kutistuminen, kalvo kupliminen, kromatiinin kondensaatio ja ydinvoiman pirstoutuminen) ja biokemiallisia muutoksia (esim DNA erittely, proteiinia pilkkominen ja proteiinien silloittuminen) [13,14]. Monet syöpälääkkeiden indusoivat solukuoleman aktivoimalla caspases, jotka ovat osa yhteistä apoptoottisen reitin [15,16]. Ulkoisten ja sisäisten reittejä, jotka säätelevät kaspaasi-riippuvaista apoptoosia on havaittu [17]. Ulkoisessa reitissä Fas, kuoleman reseptori, johtaa muodostumista kuoleman indusoivaa FADD-kaspaasi-8 signalointikompleksiin [18]. Sisäisen reaktiotien ohjataan Bcl-2-perheen proteiinien. Ensinnäkin, Bax /Bcl-2-suhde kasvaa, ja tämä lisäys seuraa vapautumisen sytokromi c: n, joka johtaa kaspaasi-9 ja kaspaasi-3: [19]. MAPK-reitin on tunnettu sen säätelyyn solujen eloonjäämisen ja apoptoosin. MAPK perhe koostuu kolmesta suuresta kinaasien: ERK, p38, ja JNK [20]. ERK etusijassa aktivoidaan kasvutekijöitä, jotka johtavat solujen kasvua ja selviytymistä. p38 ja JNK ensisijassa aktivoi sytokiinien stimulaation ja oksidatiivisen stressin, mikä johtaa solujen erilaistumista ja apoptoosia [21,22]. On epäselvää luontainen /ulkoinen tie tai MAPK-reitin aktivoidaan PNAP välittämän apoptoosin. Tässä tutkimuksessa arvioimme sytotoksisuus useita PNAPs vastaan MCF-7-soluissa ja selvitetty mekanismi taustalla PNAP-indusoidun sytotoksisuuden.
Materiaalit ja menetelmät
Chemistry
lähestymistapoja käytettiin syntetisoimaan viisitoista PNAP johdannaiset on esitetty kuviossa 1. 2-Phenylnaphthalene (PNAP-1) ja seitsemän metoksi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8) syntetisoitiin kaupallisesti saatavilla olevista phenylacetonitriles ja bentsaldehydejä mukaisesti aiemmin raportoitujen menetelmien [23]. Kuusi vastaavaa hydroksi-PNAPs (PNAP-2h-PNAP-7h) saatiin demetylaatiota PNAP-2-PNAP-7 erinomaisilla saannoilla (91%: sta 100%). Yksi amino-PNAP (PNAP-8h) saatiin hydraamalla PNAP-8: n saannolla 86%. Tunniste
1 H ja
13C-NMR spektri PNAP-2h-PNAP-8h ovat saatavilla olevat tiedot (kuviot A-G S1 File). Kaikki PNAPs liuotettiin DMSO: hon konsentraatioon 50 mM kantaliuoksen valmistamisessa, joita säilytettiin -20 ° C: ssa.
Kahdeksan 2-phenylnaphthalenes (PNAP-1-PNAP-8) olivat helposti saatu phenylacetonitriles ja bentsaldehydejä läpi kuusi askelta. Tämän jälkeen kuuden hydroksi-PNAPs (PNAP-2h-PNAP-7h) saatiin demetyloimalla vastaava metoksi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7). Valitettavasti, yritykset demetylaatiota PNAP-8 samoissa olosuhteissa johtivat monimutkaisia seoksia. Toinen hydrofiilinen amino-PNAP (PNAP-8h) valmistettiin pelkistämällä nitro-PNAP (PNAP-8).
Yleinen menettely valmistus hydroksi-PNAPs.
BBr
3 CH
2CI
2 pitoisuutena 1 M (5 ml, 5 mmol) lisättiin hitaasti liuokseen, jossa oli metoksi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7, 0,5 mmol) CH
2CI
2 (20 ml) 0 ° C: ssa. Seoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä sekoitettiin 1 tunti. Saatu liuos kaadettiin H
2O (50 ml). H
2O kerros uutettiin EtOAc: lla (3 x 50 ml), ja yhdistetyt uutteet pestiin H
2O (3 x 50 ml), kuivattiin vedettömällä MgSO
4, ja suodatettiin. Suodos väkevöitiin, ja jäännös puhdistettiin pylväskromatografialla silikageelillä ja eluoitiin EtOAc: lla, jolloin saadaan hydroksi-PNAPs (PNAP-2h-PNAP-7h). Koko spektritiedot näistä yhdisteistä kuvataan seuraavasti.
6-hydroksi-2-phenylnaphthalene (PNAP-2h).
Saanto 91%; valkoinen kiinteä aine, sp 176-177 ° C (kirj [24], sp 169-170 ° C).
1H-NMR (500 MHz, CDCI
3)
δ
5,12 (1 H, br s), 7,12 (1 H, dd,
J
= 8,8, 2,4 Hz), 7,17 (1 H, s), 7,36 (2H, t,
J
= 7,4 Hz), 7,47 (1 H, t,
J
= 7,4 Hz), 7,69-7,71 (3H, m ), 7,75 (1 H, d,
J
= 8,8 Hz), 7,80 (1 H, d,
J
= 8,8 Hz), 7,97 (1 H, s);
13C-NMR (125 MHz, CDCI
3)
δ
109,3, 118,2, 125,7, 126,3, 126,9, 127,1, 127,2 (2 x C), 128,8 (2 x C), 129,2, 130,2, 133,8, 136,4, 141,2, 153,5; IR (KBr) 3339, 3046, 1618, 1495, 1292, 1194 cm
-1; ESIMS
m /z
(suht int) 219 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
laskettu C
16H
11 o: 219,08044; havaittu: 219,08036 [M-H]
-.
6,7-dihydroksi-2-phenylnaphthalene (PNAP-3h).
Saanto 98%; valkoinen kiinteä aine, sp 205-207 ° C.
1H-NMR (500 MHz, DMSO
d
6)
δ
7,12 (1 H, s), 7,20 (1 H, s), 7,32 (1 H, t,
J
= 7,5 Hz), 7,45 (2H, t,
J
= 7,5 Hz), 7,50 (1 H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,65 ( 1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,72 (2H, d,
J
= 7,5 Hz), 7,86 (1 H, s), 9,57 (2H, br s);
13C-NMR (125 MHz, DMSO
d
6)
δ
109,5, 110,2, 112,2, 123,4, 126,4, 126,8 (2 x C), 127,0, 128,3 , 129,0 (2 x C), 129,3, 134,7, 140,9, 147,3, 147,4; IR (KBr) 3495, 3395, 1628, 1528, 1119 cm
-1; ESIMS
m /z
(suht int) 235 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
laskettu C
16H
11 o
2: 235,0754; havaittu: 235.0755 [M-H]
-.
2- (4′-hydroksifenyyli) naftaleeni (PNAP-4h).
Saanto 100%; valkoinen kiinteä aine, sp 166-167 ° C (kirj [25], sp 167-169 ° C).
1H-NMR (500 MHz, CDCI
3)
δ
4,89 (1 H, br s), 6,95 (2H, d,
J
= 8,6 Hz), 7.44- 7,50 (2H, m), 7,61 (2H, d,
J
= 8,6 Hz), 7,70 (1 H, dd,
J
= 8,5, 1,7 Hz), 7,84-7,90 (3H , m), 7,97 (1 H, s);
13C-NMR (125 MHz, CDCI
3)
δ
115,7 (2 x C), 125,0, 125,4, 125,7, 126,2, 127,6, 128,0, 128,3, 128,7 (2 x C), 132,3, 133,7, 133,9, 138,1, 155,1; IR (KBr) 3564, 3055, 1603, 1512, 1180 cm
-1; ESIMS
m /z
(suht int) 219 (41, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
laskettu C
16H
11 o: 219,08044; havaittu: 219,08043 [M-H]
-.
6-hydroksi-2- (4′-hydroksifenyyli) naftaleeni (PNAP-5h).
Saanto 93%; valkoinen kiinteä aine, sp 127-128 ° C (kirj [26], sp 258-262 ° C).
1H-NMR (500 MHz, DMSO
d
6)
δ
6,86 (2H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,01 ( 1H, dd,
J
= 8,8, 2,0 Hz), 7,10 (1 H, s), 7,56 (2H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,63 (1 H, dd,
J
= 8,6, 1,6 Hz), 7,70 (1 H, d,
J
= 8,6 Hz), 7,78 (1 H, d,
J
= 8,8 Hz), 7,94 (1 H, s), 9,51 (1 H, br s), 9,70 (1 H, br s);
13C-NMR (125 MHz, DMSO
d
6)
δ
108,6, 115,9 (2 x C), 119,1, 124,1, 125,2, 126,7, 127,8 (2 × C), 128,3, 129,7, 131,2, 133,5, 134,6, 155,3, 157,0; IR (KBr) 3183, 3030, 1603, 1512, 1265, 1204 cm
-1; ESIMS
m /z
(suht int) 235 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
laskettu C
16H
11 o
2: 235,0754; havaittu: 235.0751 [M-H]
-.
6,7-dihydroksi-2- (4′-hydroksifenyyli) naftaleeni (PNAP-6h).
Saanto 98%; valkoinen kiinteä aine, sp 280-282 ° C.
1H-NMR (500 MHz, DMSO
d
6)
δ
6,84 (2H, d,
J
= 8,1 Hz), 7,08 ( 1H, s), 7,13 (1 H, s), 7,42 (1 H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,53 (2H, d,
J
= 8,1 Hz), 7,58 ( 1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,73 (1 H, s), 9,46 (3H, br s);
13C-NMR (125 MHz, DMSO
d
6)
δ
109,5, 109,9, 115,8 (2 x C), 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 127,8 (2 x C), 129,3, 131,6, 134,8, 146,8, 147,3, 156,8; IR (KBr) 3495, 3341, 1597, 1520, 1119 cm
-1; ESIMS
m /z
(suht int) 251 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
laskettu C
16H
11 o
3: 251,07027; havaittu: 251,07032 [MH]
-.
6,7-dihydroksi-2- (3 ’, 4’-dihydroksifenyyli) naftaleeni (PNAP-7h).
Saanto 100% ; valkoinen kiinteä aine, sp 230 ° C (haj.).
1H-NMR (500 MHz, DMSO
d
6)
δ
6,80 (1 H, d,
J
= 8,2 Hz), 6,98 ( 1H, dd,
J
= 8,2, 2,0 Hz), 7,08 (1 H, s), 7,09 (1 H, d,
J
= 2,0 Hz), 7,13 (1 H, s), 7,37 (1 H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,57 (1 H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,68 (1 H, s), 8,94 (2H, br s) , 9,46 (2H, br s);
13C-NMR (125 MHz, DMSO
d
6)
δ
109,5, 110,0, 114,1, 116,2, 117,7, 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 129,3, 132,3, 135,1, 144,9, 145,7, 146,8, 147,3; IR (KBr) 3372, 3329, 1602, 1234, 1111 cm
-1; ESIMS
m /z
(suht int) 267 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
laskettu C
16H
11 o
4: 267,0652; havaittu: 267.0647 [MH]
-.
2- (4′-aminofenyyli) -6,7-dimetoksinaftaleenia (PNAP-8h).
PNAP-8 (77 mg, 0,25 mmol), hydrattiin (50 psi) käyttäen 10% Pd /C katalyyttinä tetrahydrofuraanissa (THF, 10 ml) ja EtOH: ssa (1 ml) huoneenlämpötilassa 12 tuntia. Reaktioseos suodatettiin, ja suodos konsentroitiin. Jäännös puhdistettiin pylväskromatografisesti silikageelillä ja eluoitiin EtOAc: lla, jolloin saatiin PNAP-8h. Saanto 86%; vaalean keltaisena kiinteänä aineena, sp 190-191 ° C.
1H-NMR (500 MHz, CDCI
3)
δ
3,74 (2H, br s), 4,01 (6H, s), 6,79 (2H, d,
J
= 8,1 Hz), 7,12 (1 H, s), 7,15 (1 H, s), 7,52 (2H, d,
J
= 8,1 Hz), 7,56 (1 H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,71 (1 H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,82 (1 H, s);
13C-NMR (125 MHz, CDCI
3)
δ
55,9 (2 x C), 106,1, 106,5, 115,5 (2 x C), 123,2, 123,6, 126,7, 127,8, 128,1 ( 2 x C), 129,6, 131,8, 137,0, 145,6, 149,2, 149,7; IR (KBr) 3460, 3439, 3018, 2995, 1624, 1504, 1244, 1130 cm
-1; ESIMS
m /z
(suht int) 280 (100, [M + H]
+); HRESIMS
m /z
laskettu C
18H
17NO
2: 251,07027; havaittu: 251,07032 [M + H]
+.
Soluviljely
MCF-7-solut hankittiin laboratoriosta Dr. Yang Chang Wu (School of Pharmacy, Kiina Medical University, Taiwan) ja MCF-10A-solut hankittiin laboratoriosta Dr. Wei-Chien Huang (Graduate Institute of Cancer Biology, Kiina Medical University, Taiwan). MCF-7-soluja ylläpidettiin DMEM /F12-alustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. MCF-10A-soluja ylläpidettiin DMEM /F12-alustassa, joka sisälsi 1,05 mM CaCl
2, 100 mg /ml koleratoksiinia, 5% hevosen seerumia, 10 ug /ml insuliinia, 500 ng /ml hydrokortisonia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. Näitä soluja viljeltiin soluviljelmässä inkubaattoreissa, joka oli asetettu lämpötilaan 37 ° C ja jota on täydennetty 5% CO
2.
solunelinkykyisyysmääritys
MCF-7-solut maljattiin tiheydellä 5 x 10
3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille, niitä inkuboitiin yön yli ja sitten sitä käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, ja 50 uM) viisitoista PNAPs (PNAP-1-PNAP-8 ja PNAP-2h-PNAP-8h). Lisäksi MCF-10A-solut maljattiin tiheydellä 5 x 10
3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille, niitä inkuboitiin yön yli ja sitten sitä käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 uM) kolmen PNAPs (PNAP-3h, 6H, ja -7h). 48 tunnin kuluttua hoidon, 10 ui MTT-liuosta (5 mg /ml PBS: ssä) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin vielä 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sitten kasvualusta kokonaan poistettu, ja 50 ui DMSO: ta lisättiin liuottamaan MTT formatsaanikiteet. Absorbanssi aallonpituudella 550 nm mitattiin sitten käyttämällä MQX200R mikrolevynlukijaa (BioTek, VT, USA).
Solusyklianalyysiä
MCF-7-solut ympättiin tiheydellä 3 x 10
5 solua kuoppaa kohti kuuden kuopan levyillä, inkuboitiin yön yli ja sitten sitä käsiteltiin PNAP-1, -3H, ja -6H kolmessa eri pitoisuuksilla (5, 10, ja 25 uM). 48 tunnin kuluttua hoidon jälkeen solut trypsinoitiin, pestiin kerran PBS: llä ja kiinnitettiin 70% etanolissa 1 tunti -20 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut pestiin jääkylmällä PBS: llä, suspendoitiin 0,5 ml: aan PBS: ää, joka sisälsi 0,2 mg /ml RNaasi ja 0,1% Triton X-100: ssa 30 min ajan huoneenlämpötilassa, ja värjättiin 20 ug /ml propidiumjodidia. Värjätyt solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, CA, USA). Fluoresenssin säteilevä propidiumjodidista-DNA-kompleksi arvioitiin vähintään 10000 solua näytettä kohti ja analysoitiin käyttäen Cell Quest Alias-ohjelmiston (BD Biosciences, USA).
Western blot-analyysi
MCF-7-solut ympättiin tiheydellä 3 x 10
5 solua kuoppaa kohti kuuden kuopan levyillä, inkuboitiin yön yli ja sitten sitä käsiteltiin PNAP-1, -3H, ja -6H kolmessa eri pitoisuuksilla (5, 10 , ja 25 uM) 48 tuntia. Solut pestiin PBS: llä ja hajotettiin jääkylmässä RIPA-puskuria 30 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin ja sentrifugoitiin 15000 rpm ja 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Proteiinikonsentraatio mitattiin Bio-Rad määritys käyttäen MQX200R mikrolevynlukijaa (BioTek, VT, USA). Solulysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE ja siirrettiin elektroforeettisesti päälle polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA). Usean pesun jälkeen membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% TBST (Tris-puskuroitu suolaliuos, joka sisälsi 0,1% Tween-20) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa eri ensisijaisen vasta-aineita sykliini D1, CDK4, sykliini E CDK2, p21, p27, sykliini B1, CDK1, pilkottiin kaspaasi-7, -8, -9, PARP, Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bid, Fas, p-p38, p38, p-JNK , JNK, p-ERK tai ERK (laimennus 1: 1000). Kalvot pestiin sitten kolme kertaa TBST: llä ja tutkittiin piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1: 2000) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kolmen pesun jälkeen TBST: ssä, sitoutunut vasta-aine visualisoitiin käyttäen ECL Western Blotting Reagent (PerkinElmer, Boston, MA, USA), ja kemiluminesenssi tunnistettiin käyttäen Fuji Medical röntgenfilmille (Tokio, Japani).
Solumorfologia tutkimukset
solut maljattiin 12-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10
5 solua /kuoppa, inkuboitiin yön yli ja sitten sitä käsiteltiin PNAP-1, -3H, ja -6H kolmessa eri pitoisuuksilla (5, 10, ja 25 uM) 48 tuntia. Solut pestiin kerran PBS: llä, ja solujen alijoukon, värjättiin Hoechst 33342 (10 ug /ml 15 minuutin ajan). Morfologiset muutokset olivat sitten havaittu valomikroskoopilla 100 x suurennus ja fluoresenssimikroskopiaan 200 x suurennus.
Tilastollinen
Kaikki tulokset on ilmoitettu keskiarvoina ± SEM kolmesta rinnakkaisia kokeita . Erot ryhmien kesken verrattiin varianssianalyysillä (ANOVA) ja post-hoc Tukey rehellisesti merkitsevä ero (HSD) testi SPSS 12.0 ohjelmisto Windows (USA). P-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.
Tulokset ja keskustelu
vaikutus PNAPs MCF-7 solulinjan elinkelpoisuutta ja tutkimus niiden rakenteen ja tehokkuuden suhteen
tutkia vaikutuksia 2-phenylnaphthalenes PNAP-1-PNAP-8, niiden demetylaatio johdannaiset PNAP-2h-PNAP-7h, ja amino-PNAP (PNAP-8h) solun selviytymisen, MCF-7-soluja käsiteltiin eri annoksilla kunkin yhdisteen (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, ja 50 uM) 48 tunnin ajan. Määrien elinkelpoisuus määritettiin kautta MTT-määritystä, ja tulokset on esitetty taulukossa 1. Ensimmäisen, PNAP-1 ei osoittanut mitään merkittävää aktiivisuutta MCF-7-soluissa, ja PNAP-2-PNAP-8, jotka sisältävät metoksi- ryhmiä, aiheutti sademäärä solussa media pitoisuuksina yli 5 uM (taulukko 1). Näin ollen, mitä enemmän hydrofiilinen PNAP johdannaiset PNAP-2h-PNAP-8h suunniteltiin ja syntetisoitiin. Itse asiassa ei saostumista havaittiin PNAP-2h-PNAP-8h, todennäköisesti johtuu muodostumista molekyylien välisiä vetysidoksia veden ja hydroksyyliryhmä (tai amino) ryhmien 2-phenylnaphthalenes. Kolme johdannaiset (PNAP-3h, 6H, ja -7h) oli merkittävä annoksesta riippuvainen toksisuus MCF-7-soluissa, IC
50-arvot 17,9, 4,8, ja 31,8 uM, vastaavasti (taulukko 1), kun taas IC
50 arvoja vastaan MCF-10A solut olivat 71,0, 50,9 ja 55,1 uM. Tulokset osoittavat, että PNAP-3h ja -6H hallussaan parannettu ja selektiivinen sytotoksisuus MCF-7-soluissa ja osoittaa alhaisen toksisuuden kohti MCF-10A-soluissa.
Edellä kuvatut tulokset osoittivat, että PNAP-5h, joka on hydroksyyliryhmät C-6-asemassa naftaleenirenkaan ja C-4-asemassa fenyylirenkaassa, näytteillä parempi sytotoksisuus kuin PNAP-1, -2H ja -4H meidän testeissä. Tämä ilmiö osoittaa, että käyttöön hydroksyyliryhmät C-6-asemassa naftaleenirenkaan ja C-4-asemassa fenyylirenkaassa sytotoksisuutta tehostavan. Kiehtovan, kaksi 2-phenylnaphthalenes PNAP-3h ja 6H, jotka sisältävät hydroksyyliryhmän C-7 asemassa naftaleenirenkaan, näytteille parempaa sytotoksista aktiivisuutta vastaan MCF-7 solulinja (vertaa PNAP-3h -2H ja vertaa PNAP-6h -5H). Nämä tulokset viittaavat siihen, että sytotoksisuus on merkittävästi edistää, kun läsnä on hydroksyyliryhmä asemassa C-7 naftaleenirenkaan. Lisäksi on huomattava, että PNAP-6h osoitti parhaan aktiivisuutta MCF-7-solulinja (IC
50 = 4,8 uM). Tämä tulos osoitti myös, että käyttöönotto hydroksyyliryhmä C-4-asemassa fenyylirenkaassa tehostaisi toimintaa vastaan MCF-7 solulinja. Sitä vastoin, kun läsnä on hydroksyyliryhmä C-3-asemassa fenyylirenkaaseen PNAP-7h voivat merkittävästi vähentää sytotoksisuutta (vertaa PNAP-6h ja -7h). Lisäksi vertailu sytotoksisen toiminnan PNAP-6h ja PNAP-8h viittaa siihen, että läsnä on hydroksyyliryhmä, joka toimii H-sidoksen luovuttajan, on naftaleenirengas tuottaa parempia toimintoja kuin läsnä on metoksiryhmä, joka toimii H-sidoksen akseptori. Perustuen solujen elävyys ja SAR tuloksia, me tutki tarkemmin mahdollisia syitä vähentää solujen elinkelpoisuuden aiheuttama PNAP-3h ja -6H ja selvitetty taustalla olevaa mekanismia.
vaikutus PNAPs on morfologisiin ominaisuuksiin MCF -7 solut
Ensimmäinen vaikutus PNAP-1, -3h ja -6H solu- morfologia havaittiin faasikontrastimikroskopiaan. MCF-7-solut, joita käsiteltiin joko ajoneuvon ohjaus (0,05% DMSO) tai 5-25 uM PNAP-1 osoitti tiheää solupopulaatioiden alle faasikontrastimikroskoopissa (kuvio 2A-2D). MCF-7-soluja säännöllisen muotoisia ja kooltaan, jossa eksentrinen ytimet ja suhteellisen pieni määrä sytoplasmaan. Solutiheys ja rakenne soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 5-25 uM PNAP-3h ja -6H osoittivat selviä muutoksia (kuvio 2E-2J). Solut tuli pyöristetty ja kutistunut ja menettänyt yhteyden viereisten solujen. Lisäksi apoptoottiset solut eivät enää kiinni alustaan, jolloin ne irtoavat viljelymaljoilta ja kellua viljelyalustassa. Siten PNAP-3h ja -6H johti vähenemiseen elinkelpoisten MCF-7 solujen määrä konsentraatiosta riippuvalla tavalla, kuten on esitetty taulukossa 1.
MCF-7-soluja käsiteltiin PNAP-1, -3H, ja -6H kolmena konsentraationa (5, 10, ja 25 uM) 48 tunnin ajan, ja sitten, (A-J) morfologian havaittiin valomikroskoopilla (100 x). Solut värjättiin Hoechst 33342, ja sen jälkeen, (K-T) morfologian havaittiin fluoresenssimikroskopialla (200 x). (A /K) ohjaus; (B /L) 5 uM PNAP-1; (C /M) 10 uM PNAP-1; (D /N) 25 uM PNAP-1; (E /O) 5 uM PNAP-3h; (F /P) 10 uM PNAP-3h; (G /Q) 25 uM PNAP-3h; (H /R) 5 uM PNAP-6h; (I /S) 10pM PNAP-6h; ja (J /T) 25 uM PNAP-6h.
Havaitsimme myös ydin- morfologia MCF-7-soluissa suoritettiin Hoechst 33342 fluoresenssivärjäys hoidon jälkeen 48 h kolme pitoisuuksilla (5, 10 , ja 25 uM) PNAP-1, 3H, ja -6H (kuvio 2L-2T). Ytimet Ajoneuvon ohjaus soluilla ehjä soikea muoto ja esiteltiin heikko sininen fluoresenssi (kuvio 2K). Kuitenkin solut käsiteltiin PNAP-3h (25 uM) ja PNAP-6h (5, 10, ja 25 uM) oli tyypillinen apoptoottinen ominaisuuksia, kuten ydin- kutistuminen, ydinvoima pirstoutuminen, ja ydin- hypercondensation (Kuva 2Q-2T). Perustuen näihin mikroskooppisen havaintojen ehdotamme, että havaittu sytotoksisuus voidaan osittain välittyvät PNAP-3H- ja -6H aiheuttama apoptoosin.
vaikutus PNAPs MCF-7 solukierron vaihejakauman
Koska solujen lisääntymistä säätelee solusyklin, vaikutus PNAP-1, -3h ja -6H solusyklin etenemisen MCF-7 solulinja tutkittiin virtaussytometrialla ja western blot-analyysit. Tulokset virtaussytometrianalyysin-analyysi osoitti, että hoito PNAP-6h 48 h lisätä osa-G
1 populaation (kuvio 3A). Osa-G
1 huippu, joka koostui soluista, joilla on alentunut DNA-sisältöä edustivat läsnäolo apoptoottisten solujen [27,28]. Lisäksi PNAP-6h aiheuttama solun pidätys on G
2 /M vaihe on saatu pienemmillä pitoisuuksilla (5 ja 10 uM) mukana on lasku solujen prosenttiosuus osoitteessa Go /G1 vaiheeseen. PNAP-5h ja -6H aiheutti S vaiheen pysähtymisen suurempina pitoisuuksina (25 uM), johti pienempi määrä jäljittelevän solujen ja tukahdutetaan solujen lisääntymistä. Kuitenkin PNAP-1-käsiteltyjä soluja ei osoittanut merkittävää muutosta solusyklin jakautumisen verrattuna vehikkelikontrolliin soluja.
MCF-7-soluja käsiteltiin PNAP-1, -3H, ja -6H kolmella pitoisuudet (5, 10, ja 25 uM) 48 tunnin ajan, ja sitten (A) jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin propidiumjodidilla analysoida DNA-pitoisuuden virtaussytometrialla. (B, C) Cell cycle liittyvien proteiinien (sykliini D1, CDK4, sykliini E CDK2, p21, p27, sykliini B1, ja CDK1) havaittiin ja analysoitiin western blot. Ilmaisu määrä määritettiin tietokoneistetun Gel-Pro Analyzer kuva-analyysin järjestelmän. Tiedot ilmaistaan keskiarvoina ± SEM kolmesta itsenäisestä määrityksissä. * P 0,05 ** P 0,01 poikkeavat merkittävästi valvonnasta.
Näiden havaintojen perusteella solusyklin jakautumista MCF-7-soluissa, olemme analysoineet muutokset runsaasti solun sykli säätelyproteiineja. Sykliini-CDK-kompleksit ovat pääasiallisia säätelijöitä solusyklin etenemisen [7], ja aktiivisuus sykliini /CDK-komplekseja säätelee negatiivisesti CDK-inhibiittorit, kuten p21 ja p27 [29]. PNAP-3h (25 uM) ja PNAP-6h johti solun pidätys on S-vaiheeseen, todennäköisesti johtuu kohonneeseen p21 ja p27 ja alhaisempia sykliini D1, CDK4, sykliini E ja CDK2, määritettynä kautta western blot-analyysi (kuvio 3B ja 3C). Lisäksi, PNAP-6h indusoi inhibition CDK1 kinaasiaktiivisuuden ja lasku sykliini B1 ilmaisun, todennäköisimmin johtaa G
2 /M pidätys. Siksi ehdotamme, että inhibitio solujen elinkelpoisuuden PNAP-3h ja -6H voidaan osittain välittyvät solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin.
PNAPs aktivoida kaspaasi-reitin ja lisätä ilmentymisen suhteellinen apoptoottisten proteiinien
edellä esitetyn perusteella tuloksia, havaitsimme, että PNAPs voi estää proliferaatiota, apoptoosin, ja vähentää solujen elinkelpoisuuden MCF-7-solulinja. On hyvin tunnettua, että lukuisat syöpälääkkeiden välittävät apoptoosia aktivoimalla kaspaasien [16]. Sen osoittamiseksi, että PNAP-indusoitua apoptoosia in MCF-7-solujen kautta tapahtuvaa kaspaasin aktivaatio, tutkimme ilmentymisen avaimen säätelyproteiineja liittyy kaspaasi reittejä MCF-7-soluissa altistettaessa 5-25 uM PNAP-1, 3H, ja -6H. Puuttumisesta huolimatta kaspaasi-3: MCF-7-soluissa, kaspaasi-7, apoptoosin executioner, voi toimia korvaavana [30]. Kaspaasi-7 pystyy pilkkomaan erityisiä tetrapeptidin substraatteja (esim., PARP), ja PARP lohkaisu on merkittävä tunnusmerkki apoptoosin [31]. Altistuminen MCF-7-solujen kolme pitoisuuksina (5, 10, ja 25 uM) PNAP-3h ja -6H 48 h huomattavasti tasot katkaistun kaspaasi-7 ja PARP ja lisääntynyt aktiivisuus katkaistun kaspaasi-7, ja PARP annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4A). Lisäksi apoptoosin voitaisiin tukea kautta ulkoisten ja sisäisten polkuja. Kaspaasi-8 yleisesti pidetään apoptoosin aktivaattorina ulkoinen tie, ja kaspaasi-9: llä on tärkeä rooli sisäisen reaktiotien [32]. Nämä tiedot osoittavat, että ekspressio katkaistun kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 MCF-7-solujen määrä nousi hoidon jälkeen PNAP-3h ja -6H annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi pilkottiin kaspaasi 8 ja kaspaasi-9-oli inhiboi osittain kaspaasi-8-spesifinen estäjä Z-IETD-FMK ja kaspaasi-9-spesifinen estäjä Z-LEHD-FMK. Lisäksi kaksi inhibiittorit myös inhiboivat osittain kaspaasi 7 lohkaisu PNAP johdannainen indusoiman apoptoosin (kuvio 5A ja 5B) sekä osittain päinvastaiseksi PNAP-6 aiheuttama lasku solujen elinkelpoisuuden, kuten havaittiin mikroskoopilla ja MTT-määritystä (kuvio 5C) . Nämä tulokset viittaavat siihen, että kaspaasi-7-, kaspaasi-8- ja kaspaasi-9-välitteisen polkuja voi olla osittain mukana asetuksen PNAP: n indusoiman apoptoosin.
(A) MCF-7-soluja käsiteltiin jossa PNAP-1, -3H, ja -6H kolmena konsentraationa (5, 10, ja 25 uM) 48 tunnin ajan, ja ilmaus pilkottiin kaspaasi-7, -8, -9 ja PARP määritettiin western blottauksella. (C) MCF-7-soluja käsiteltiin 25 uM PNAP-1, -3H, ja -6H kolmena konsentraationa (5, 10, ja 25 uM) 48 tunnin ajan, ja Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bax /Bcl-2, Bid, ja Fas tasot sitten havaitaan western blot. (B, D) Ilmaisu kvantitoitiin käyttäen atk Gel-Pro Analyzer kuva-analyysin järjestelmän. Tiedot ilmaistaan keskiarvoina ± SEM kolmesta itsenäisestä määrityksissä. * P 0,05 ja ** P 0,01 ovat merkittävästi erilaisia kuin kontrolli.
MCF-7-soluja inkuboitiin, kun läsnä ollessa tai ilman (A) kaspaasi-8-estäjä Z-IETD- FMK tai (B) kaspaasi-9-inhibiittori z-LEHD-FMK 1,5 tuntia, ennen kuin lisättiin PNAP-6h. Western blot analyysit tehtiin vasta-aineilla kaspaasi-7, -8, ja -9, ja aktiini. (C) MCF-7-soluja käsiteltiin PNAP-6h läsnä ollessa tai poissa ollessa kaspaasi-8-estäjä, tai kaspaasi-9-estäjä, ja morfologiaa tarkasteltiin sitten valomikroskoopilla.
kaspaasi-8 on ensimmäinen askel kaskadin apoptoottisten tapahtumien aiheuttama Fas stimulaatio [33], ja kaspaasi-9 säätelee Bcl-2-perheen jäseniä [34-36]. Kuitenkin hoito MCF-7-solujen kanssa 25 uM PNAP johdannaiset kohdistuu vähäinen vaikutus ekspressioon Bcl-xl, Bax ja Bid proteiineja kolmena ajankohtana (12, 24, ja 48 h) (kuvio 4C ja 4D) .