Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisääntynyt oksidatiivisen stressin alla hyperglycemic olosuhteissa, vuorovaikutuksen kautta AGE kanssa RAGE-reseptorien ja aktivoimalla interleukiini välitteisen transkription signalointi, on raportoitu syöpää. Proteiinit muutokset tutkitaan niiden roolit kehittymistä ja etenemistä syövän ja autovasta vastaan ​​niitä on saamassa kiinnostusta koettimena varhaista havaitsemista taudin. Tässä tutkimuksessa on analysoitu muutoksia histoni H1 upon muutokseen, methylglyoxal (MG) ja sen vaikutuksia automaattinen immunopatogeneesi syövän. Modified histoni osoittivat muutoksia aromaattisten tähteiden, muuttui tyrosiini microenvironment, molekyylien välistä silloittumista ja sukupolvi AGE. Se osoitti peittää hydrofobisten laastaria ja hypsochromic muutos vuonna ANS erityisiä fluoresenssi. MG aggressiivisesti hapettunut histoni H1 johtaa kertymistä reaktiivisen karbonyylien. Far UV CD mittaukset osoittivat di-karbonyyli aiheuttama parantaminen alfa rakenteen ja induktio beta-levyn konformaatio; ja lämpödenaturaatio (Tm) tutkimukset vahvistivat lämpöstabiilisuuden modifioituun histoniin. FTIR-analyysi osoitti amidi I band shift, sukupolven karboksietyyliryhmä ja N-Ca värähtelyjä modifioitu histoni. LCMS analyysi vahvisti muodostumista Nε- (karboksietyyli) lysiiniä ja elektronimikroskooppivalokuvaa tutkimukset paljastivat amorfinen aggregaatin muodostumista. Modifioitu histoni osoitti muuttuneessa osuuskunta sitova DNA. Modified H1 aiheuttama korkea vasta-ainetitteri kaneissa ja IgG eristetyssä muodossa seerumista immunisoidut kanit muokattu H1 näytteillä spesifinen sitoutuminen sen immunogeeninä Western blot analyysissä. IgG eristettiin potilaiden seerumeista keuhkosyöpä, eturauhassyöpä, rintasyöpä ja syöpä pään ja kaulan alueen osoitti parempaa tunnustusta neo-epitooppeja modifioitu histoni, mikä läsnäolo verenkierrossa autovasta-aineiden syöpää. Koska raportit viittaavat linkkinä AGE-RAGE akseli ja Karsinogeneesin glycoxidation histoni H1 ja sen immunogeenisuutta tasoittaa tapoja ymmärtää rooli glycoxidatively vaurioitunut tumaproteiinit syövässä.

Citation: Mir AR, Uddin M, Khan F, Alam K, Ali A (2015) Dikarbonyyli aiheuttama Rakenteelliset häiriöt Tee histoni H1 erittäin immunogeenisiä ja Luo Auto-immuunivasteen Cancer. PLoS ONE 10 (8): e0136197. doi: 10,1371 /journal.pone.0136197

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: 18 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 31 heinäkuu 2015; Julkaistu: 28 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Mir et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on yksi tappavimmista taudeista vastuussa suuresta kuolleiden määrä eri puolilla maailmaa ja sen varhainen havaitseminen vie keskiöön vähentämään täytäntöön yleinen vaikutus [1-2]. Tältä osin tunnistaminen ja arviointi autovasta-aineita modifioidut proteiinit syöpäpotilailla omistaa näkyvyyttä biologisten merkkiaineiden kehitystyö varhaista havaitsemista taudin. Erilaisia ​​translaation jälkeinen proteiinin muunnokset (PTMs) aikana esiintyvien syöpien kehittymisessä oletetaan olevan merkittäviä niiden diagnostista merkitystä [3-4].

Tiedot PTMs, kuten muodostumista glykaation lopputuotteiden (AGE: ) kanssa rooli kehityksen ja etenemisen syöpien myös syntymässä [5]. On raportoitu, että cancerscreate suotuisan ympäristön tuotantoon AGE koska niiden korkeamman glukoosin täyttämään energiantarvetta [6-8]. Glykoitumiseen tuotteet muodostivat on mahdollista sitoa makrofagien läpi makrofagien raadonsyöjä reseptori ja, että raivoaa ja siten edistää syövän kehitystä niiden proinflammatoristen ominaisuudet ja hyödyntämällä vaatimus aktivointia interleukiini 6 (IL-6) -välitteisen mitokondrioiden signaalimuunta- ja aktivaattoreita transkription 3 (STST3) [9-11]. Epidemiologiset todisteet molekyylitasolla heterogeenisyys syöpien genotoksisten akuutin karbonyyli stressi, mikä diabetespotilaat altis erilaisten syöpien [12]. AGE aiheuttama genotoksisuus in tubulussolut kanssa mahdollisia vaikutuksia tiiviimpään syövän kehityksen kehittynyt munuaisten sairaudet myös osoittaa kohti saman korrelaatio [13].

havaitseminen autovasta syntyy vastaan ​​poikkeuksellisesti jalostettuja proteiineja syöpä, jotka ovat immunogeenisiä ja stimuloivat solujen ja humoraalinen immuunivaste ovat johtaneet sarjan tutkimuksia, joiden tarkoituksena on havaita syövän autoantigeenien kaavaan nivelreuman, jossa anti-IgG-vasta-aineiden on raportoitu diagnostinen biomerkkiaine [14]. Niiden proteiinien, translaation jälkeisiä modifikaatioita histonien, erityisesti on tärkeä rooli geenien ilmentymisen ja siten myös syövän kehittymisessä ja etenemisessä, ja niiden muutokset Lisäksi tutkitaan mahdollisina biomarkkereita taudin etenemisen ja ennusteen [15-16].

Lisäksi joukossa glycating aineet methylglyoxal (MG), joka on dikarbonyyliyhdisteellä syntyy eri metaboliareitit on havaittu olevan merkittävä esiasteena muuttaminen erilaisia ​​proteiineja, 50000 kertaa morereactivity kuin glukoosia, sekä solunsisäinen ja solunulkoisia proteiineja, fysiologisessa keskittyminen [17] sekä korkeilla pitoisuuksilla [18] ja on liittynyt rooli lukuisia sairauksia [9, 19]. Metyyliglyoksaali välitteinen häiriöt voivat aiheuttaa rakenteellisia ja toiminnallisia muutoksia tumaproteiini histoni H1 mahdollisia vaikutuksia immunologiseen biologian eri syöpiä.

Tässä tutkimuksessa, histoni H1 inkuboitiin kasvavilla pitoisuuksilla methylglyoxal tuottaa Iät. MG indusoi rakenteellisia muutoksia histoni H1 analysoitiin UV, fluoresenssi ja CD-spektroskopia, poly akryyliamidigeelielektroforeesia, Fourier-muunnos infrapunaspektroskopia-analyysissä (FTIR), karbonyyli sisällön määrittämistä, pinta Hydrofobisuusanalyysi (H

0) arvion Nestekromatografia massa spektroskopia (m /z-analyysi), skannaus elektronimikroskoopilla ja tutkimalla muuttuneen vuorovaikutukset sitovan DNA. Mahdollisia immunogeenisyyttä natiivin ja modifioidun histonien varmistettiin kaneilla. Kiertävä autovasta läsnä potilailla withvarious syöpien arvioitiin niiden sitoutumista natiivi ja MG modifioitu histoni H1 kautta suoran sitoutumisen ja kilpaileva esto tutkimukset ELISA ja jonka geeliretardaatiomäärityksen.

Materiaalit ja menetelmät

histoni H1, 2,4-dinitrofenyyli hydratsiinia (DNPH), 1-aniliininaftaleeni-8-sulfonihappo (ANS), natriumdodekyylisulfaattia (SDS), metyyliglyoksaali aminoguanidiinihydrokloridia, dietyleenitriamiinipenta-etikkahappo (DTPA), natrium- atsidi, etidiumbromidia, proteiini A-agaroosi-(2,5 ml valmiiksi pakattu pylväs), agaroosi, natriumatsidi, Tween-20, dialyysi putkia, anti-ihmis- ja anti-kani-IgG, alkalinen fosfataasi-konjugaattia, para-nitrofenyylifosfaatti, Freundin täydellisen ja epätäydellisiä adjuvantteja, ostettiin Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA. Akryyliamidi, bisakryyliamidia, ammoniumpersulfaatti (APS) ja N, N, N ’, N’-tetrametyyli- etyleenidiamiinia (TEMED) olivat Bio-Rad Laboratories, USA natriumhydroksidi, etyleenidiamiinitetraetikkahappo (dinatriumsuola), metanoli, jääetikkaa, iso- propanoli, natriumkloridi, natriumkarbonaatti, natriumnitriitti, hopeanitraatti, ksyleeni, natriumhydroksidi, formaldehydi, natriumbikarbonaattia, etanolia, ammoniumsulfaattia ja ammoniumpersulfaattia saatiin Qualigens, Intia. Polystyreenimikrotiitteri- tasapohjainen ELISA-levyt ja moduulit ostettiin NUNC, Tanska. Kaikki muut kemikaalit /reagenssit olivat korkeinta analyyttistä laatua saatavilla.

määritys Proteiinipitoisuus histoni H1

molaarinen ekstinktiokerroin vasikan kateenkorvan histoni H1 (1280 M

-1cm

-1) käytettiin määrittämään proteiinin konsentraatio mittaamalla absorbanssi proteiinin liuosten 280 nm: ssä. Vasikan kateenkorvan histoni H1 molekyylipaino laskelmien oli 21500 Dalton.

muuttaminen H1 histoni tekijänä methylglyoxal

menettely antama Roberts

et al

. [20] seuraaja. Histoni H1 muutos suoritettiin fosfaattipuskurisuolaliuoksessa (10 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 7,4, joka sisälsi 150 mM NaCl). Histoni H1 (42 uM) näytteet modifioitu inkuboimalla vaihtelevilla methylglyoxal (2,5, 5, 7,5 ja 10 mM) 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Kaikki näytteet dialysoitiin inkubaation jälkeen.

Absorbanssi spektroskopia

imeytymisprofiili natiivin ja methylglyoxal modifioitua H1 histones kirjattiin Shimadzu Spektrofotometri (UV 1700 malli) aallonpituusalueella 250 -500 nm käyttäen kvartsi kyvetti 1 cm: n valotien pituus vakiolämpötilassa.

Fluoresenssi tutkimukset

Fluoresenssi-spektrit rekisteröitiin Shimadzu (RF-5301-PC) spectrofluorophotometer 25 ± 0,1 ° C: ssa 1 cm polun pituus solun 3 nm raon leveys.

mitattuna luontaisen fluoresenssin virittämällä proteiini näytteitä 275 nm ja tallennus emissiospektrit on 300-400 nm alueella.

menettäminen fluoresenssi-intensiteetti (FI) laskettiin käyttäen seuraavaa yhtälöä:

natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi

Methylglyoxal välittämää muutoksia histoni H1 analysoitiin käyttämällä ei denaturanttia ei vähentää vertikaalista natriumdodekyylisulfaattia -polyacrylamide geelielektroforeesi (PAGE), kuten

Laemilli

, vähäisin muutoksin. [21] 25 ug natiivia ja modifioitu histoni näytteitä sekoitettiin yksi neljäsosa tilavuuteen näytepuskuria (50% glyserolia ja 0,002% bromofenolisinistä 1 M Tris HCI, pH 6,8) ja laitettiin kuoppiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä. Geeli ajettiin 80 voltilla 4 tuntia huoneenlämpötilassa ja sitten värjättiin hopeanitraatilla ja valokuvannut Molecular Imager Gel Doc XR järjestelmä.

Lisätutkimuksia tehtiin histoni H1 muutettuna 7,5 mM methylglyoxal natiivin histoni H1 palvelee kontrollina.

AGE Pitoisuus

AGE-spesifinen fluoresenssi mitattiin aallonpituudella 440 nm virittämisen jälkeen 370 nm: ssä ja fluoresenssin intensiteetin lisääntymisen (FI) laskettiin seuraavalla yhtälöllä:

määritys Surface Hydrofobisuusanalyysi (H

0) B

pinta hydrofobisuus määritettiin kanssa fluoresoiva koetin 1-anilinonapthalene- 8-sulfonihappo (ANS) fluoresenssispekroskopian kohti vakiintunut protokolla [22]. Moolisuhde H1 histoni ja ANS otettiin 01:10 ja päästöjen spektrit rekisteröitiin välillä 400-600 nm. Prosentuaalinen muutos fluoresenssin intensiteetti (FI) laskettiin seuraavalla yhtälöllä:

määritys reaktiivisia karbonyyli- sisältö

kriittinen arviointi proteiinin karbonyyli- sisältö toimii biomarkkerit proteiinin hapettumista. Analysoimme karbonyylipitoisuus natiivin ja methylglyoxal modifioitu histoni H1 (MG-H1) kohti julkaistun protokollan pienin muutoksin. [23] Native ja methylglyoxal (7,5 mM) modifioitu histoni H1 näytteet lisättiin saman verran 10 mM DNPH 2,5 M HCI. Näytteitä vorteksoitiin säännöllisin väliajoin, ja inkuboitiin pimeässä 15 minuuttia huoneenlämpötilassa. Näitä inkuboitiin 10% TCA: lla 15 minuutin ajan -20 ° C: ssa ja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan 9000 g. Proteiini pelletit pestiin kolme kertaa jääkylmällä etanolilla /etyyliasetaatti (1: 1) sen jälkeen, hylätään supernatantti ja sentrifugoidaan 2 min 9000 g: kaikkien pesujen. Viimeisen pesun jälkeen pelletti suspendoitiin 1 ml: aan 6 M guanidiini-HCl: a ja sekoitetaan kunnolla. Proteiini Sitten näytteet täysin liuennut jättämällä 37 ° C: ssa 15-30 min. Kun proteiini pelletit täysin liuennut, pitoisuus DNPH määritettiin absorbanssin mittaus 360 nm: ssä guanidiniumkloridia (tyhjinä) käyttäen molaarista ekstinktiokerrointa 22000 M

-1cm

-1. Absorbanssi näytteitä otettiin 276 nm: ssä ja proteiini karbonyyli pitoisuus ilmaistuna nmol mg

-1 proteiinia.

Ympyrädikroismi määrittäminen

Ympyrädikroismi arvioi muutokset proteiinin johdetun rakenne, taitto ja niiden sitoutumisominaisuudet. Suoritimme Kauko-UV-CD spektrianalyysi natiivin histoni H1 ja sen MG muuntamaton vastineensa käyttäen J-815 JASCO spektropolarimetrillä. Laite oli liitetty mikrotietokoneeseen, jossa on termostaatilla kyvettiteline kiinnitetty Neslab n RTE 110 vesihauteessa, jonka lämpötila on ± 0,1 ° C. Skannaukset tehtiin aallonpituudella välein 1 nm 25 ° C: ssa. Kaikki skannaukset kirjattiin aallonpituudella välein 1 nm. Spectra kerättiin 50 nm min

-1 selausnopeuksia, 0,1 nm data piki ja vasteaika 2s. Spektrit rekisteröitiin osin UV-alueella välillä aallonpituuksien 190-250 nm ja proteiinikonsentraatio oli 0,2 mg /ml. Tulokset saatiin molaarinen jäljellä elliptisyys (θ) (° /cm

2 /dmol) aallonpituudella λ, joka perustuu yhtälöön alla [24] .Where θ

obs on havaittu elliptisyys asteina,

C

p on mooliosuus ja

l

on pituus valon kulkema senttimetri. Α-kierteiset sisältöä eri histoni H1 näytteet laskettiin θ arvoista 222 nm (MRE

222) käyttämällä seuraavaa yhtälöä.

lämpödenaturaatiota Studies (Tm) Far-UV-CD

thermo-vakaus sekundaarinen rakenne histoni H1 ja MG muokattu muoto analysoitiin Far-UV-CD-spektroskopialla 222 nm: ssä 20 ° C: sta 90 ° C: ssa käyttämällä lämpötilan kaltevuus 1 ° C /min.

Fourier-muunnos infrapunaspektroskopia-analyysissä-Heikennettyä Yhteensä heijastuskyky (FTIR-ATR) B

Fourier infrapuna (FTIR) spektroskopia suoritettiin analysoida sekundaarinen rakenne histoni H1 ja MG modifioitu histoni käyttäen Perkin Elmer FT-IR-spektrofotometrillä. Infrapunaspektritiedot lukemat kirjattiin välillä 1000 cm

-1-4000 cm

-1. FTIR tutkimuksia tehtiin 10 mg /ml proteiinipitoisuuden.

Nestekromatografia massaspektroskopia (m /z-analyysi) B

HPLC-systeemi oli kytketty aika-of-lennon massaspektrometri (LCMS-IT-TOF, Shimadzu) varustettu elektronisuihkurajapinnalla toiminut positiivisen ionin tilassa jännite asetettu 4,5 kV. Lämpötila turbo ioni kaasu oli 250 ° C. Full scan MS-analyysi suoritettiin alueella 0-240 m /z suhteen. MS saadut tulokset histoniproteiineista verrattiin kuin CEL standardin [25].

pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM) tutkimukset

pieneliöt arkkitehtoniset yksityiskohdat natiivin ja MG muutettu histonit havaittiin käyttämällä läpivalaisu- elektroni. Ilmakuivattua näytettä adsorboitiin selluloosa ultrasuodatuskalvolle. Näytteet päällystettiin kullalla ja asennettu hiilellä nauhalle pinnoitettu ruostumaton teräs ristikot toimivat kiihdytysjännitteellä 15 kV ja alhaisessa vakuumissa kunnossa. Kuvat otettiin käyttäen JSM-6510LV (JEOL JAPAN) pyyhkäisyelektronimikroskoopilla käynnissä [26].

Muutokset vuorovaikutusta DNA: ympyrädikroismilla (CD) analyysi

Vuorovaikutus kotoperäisten ja MG modifioitu histoni H1 DNA analysoitiin CD-spektroskopialla. 50 ug /ml DNA: ta inkuboitiin 1 tunnin ajan 0,2 mg /ml natiivin H1 ja MG muutettu H1 vastaavasti 0,05 M Tris-puskuria, pH 7,4. Näytteet sentrifugoitiin 14000 rpm: llä 8 minuuttia ja CD-spektrit kirjattiin supernatantti. Native DNA sama pitoisuus otettiin ohjaus. Välttämiseksi häiriöitä proteiinia, kaikki mittaukset tehtiin suuremmilla aallonpituuksilla välillä 220 cm

-1-+330 cm

-1.

Immunologiset tutkimukset ja Western-blottaus

Satunnaisesti kasvatetaan naaras New Zealand white rabbits painavat 1-1,5 kg valittiin immunizationas kohti vakiintunutta protokollaa meidän lab [27]. Seerumin immunoglobuliini G (IgG) päässä koe-eläimistä eristettiin affiniteettikromatografialla proteiini A-agaroosi-kolonniin [28] ja Western blottaus suoritettiin kuten per-protokolla annetaan teknisissä kirjasen ECL Plus Western Blotting-järjestelmä (Amersham, UK) ja vahvistaa vasta-aineiden spesifisyys syntyy natiivia ja muutettu histones H1 että kanit [29].

kerääminen verinäytteitä kliinisen tutkimuksen

jotta koetin läsnäolon autovasta-aineiden natiivia ja MG modifioitu histoni H1, seerumit saatiin syöpäpotilailla (n = 83) eri ikäryhmien osallistuvat JN Medical College Hospital, Aligarh, Intia, kun tietoon perustuvan suostumuksen. Näytteet saatiin huolellisen kliinisen tutkimuksen potilaista, joilla on todistettu histopatologinen diagnoosi. Potilaspopulaatiosta keuhkosyöpään potilailla (n = 27), eturauhasen (n = 19), rinta (n = 22) ja potilaat, joilla on syöpiä pään ja kaulan alueella (n = 15) .On olivat 49 naarasta, joiden keski-ikä oli 38,5 ± 22,9 vuotta ja 34 miehiä 36 ± 18,3 vuotta keski-ikä. Ikä kaikki potilaat osui välille 15-63 vuotta. Näytteitä terveistä yksilöistä (n = 40; 20 urosta 20 naarasta, joiden keski-ikä oli 36 ± 18,6 vuotta) toimi kontrollina. Seerumin Näytteitä kuumennettiin 56 ° C: ssa 30 min komplementin inaktivoimiseksi proteiineja ja säilytettiin -20 ° C: ssa 0,2% natriumatsidia. Seerumin vasta-aineen sitoutuminen arvioitiin ELISA.

Ethics lausunto

Tämän tutkimuksen asianmukaisesti hyväksynyt institutionaalisten eettisen lautakunnan (1617 /FM /22-01-2013) ja eläinten eettisen lautakunnan (8289 /OAH /21-02-2013) asianmukaisesti rekisteröity komitea tarkoitus ohjaus ja valvonta eläinkokeiden (CPCSEA) Intia (rekisteröinti nro. 401 /RO /C /2001 /CPCSEA), atthe JN Medical College, tiedekunta Medicine, UMA.

verinäytteet kerättiin potilaiden ja terveiden koehenkilöiden jälkeen tietoon suullinen suostumus. Tila suostumus asianmukaisesti hyväksynyt eettinen komitea. Asianmukainen kirjaa kaikista potilaista ja terveistä yksilöistä on säilytetty.

eristäminen IgG affiniteettikromatografialla

seerumi-immunoglobuliini G (IgG) eristettiin affiniteettikromatografialla proteiini A-agaroosi-kolonniin [ ,,,0],28]. Seerumia (0,5 ml), laimennettiin yhtä suurella tilavuudella PBS: ää (pH 7,4), levitettiin kolonnin huipulle ennalta tasapainotettu samalla puskurilla. Pesun kautta kierrätettiin 2-3 kertaa ja sitoutumaton materiaali poistettiin pesun PBS: llä. Sitoutunut IgG eluoitiin 0,58% etikkahappoa 0,85% natriumkloridia ja kerättiin putkeen, joka sisälsi 1,0 ml 1,0 M Tris-HCl (pH 8,5). 3 ml: n fraktiot kerättiin ja luettiin 280 nm: ssä. IgG pitoisuus määritettiin harkitsee 1,4 OD280 = 1,0 mg IgG /ml. Eristetty IgG dialysoitiin PBS: ää vastaan ​​ja varastoitiin -20 ° C: ssa 0,1% natriumatsidia.

Direct Binding ELISA

ELISA tehtiin tasapohjaisille polystyreenikalvon levyt kuten aiemmin on kuvattu [27] . Polystyreenikalvon Polysorp Mikrotiitterilevyn kuopat vastaavasti päällystettiin 100 ul natiivin tai methylglyoxal modifioidut proteiinit (10 ug /ml). Absorbanssi (A) kunkin kuopan seurattiin 410 nm: ssä automaattisella mikrolevynlukijalla. Kukin näyte ajettiin kahtena ja tulokset ilmaistiin keskiarvona kahdessa käsittelyssä.

Competition ELISA

antigeeninen vasta-aineiden spesifisyys määritettiin kilpailu ELISA [27] .Varying määriä estäjien (0-20 ug /ml) sekoitettiin vakiomäärän affiniteettipuhdistettua IgG ja seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan ja yli yön 4 ° C: ssa. Immuunijärjestelmän täten muodostunut kompleksi päällystettiin kuopissa sijasta IgG. Jäljellä olevat vaiheet olivat samat kuin suoraan sitova ELISA. Prosentuaalinen esto laskettiin käyttämällä kaavaa:

Band shift assay

visuaalinen antigeenin vasta-aineen sitoutuminen ja immuunikompleksin muodostumisen, geeliretardaatiomäärityksen suoritettiin [30]. Immuuni- komplekseja valmistettiin inkuboimalla vakiomäärä natiivin ja MG-modifioitu histonien vaihtelevia määriä affiniteettipuhdistettua immuuni IgG seerumista syöpäpotilaiden TBS: ssa 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja yön yli 4 ° C: ssa. Yhden neljänneksen näytteen väriaine lisättiin seokseen ja elektroforeesi 10% SDS-PAGE: ssa 4 tunnin ajan 80 V: Geelit visualisoitiin käyttäen hopeanitraattivärjäyksen [21].

Tilastollinen analyysi Tulokset

Kaikki mittaukset tehtiin kaksoiskappaleet. Tulokset on esitetty keskiarvo ± S.D. Kahden pyrstö

p

arvo pienempi kuin 0,05 otettiin olevan huomattava.

Tulokset

Absorbanssi spektroskopia

UV-absorptiospektri natiivin histoni H1 osoitti tunnusomainen piikki proteiinien 277 nm. Histoni H1 modifioitu 2,5, 5, 7,5 ja 10 mM metyyliglyoksaalin näytteillä 67,87%, 90,16%, 94,54% ja 96,64% hyperchromicities spektrin huiput vastaavasti. Piikki kuten huippu tuli näkyvästi 340 nm modifioitu proteiinien suuremmilla pitoisuuksilla MG. Tulokset on esitetty kuvassa 1.

luontaisen fluoresenssin

Fluoresenssin maksimit native histoni H1 saatiin 305 nm-luonteenomainen piirre tyrosiinin päästöjä. Inkuboinnin histoni H1: n kasvavilla pitoisuuksilla methylglyoxal johti merkittävästi pienemmän fluoresenssin intensiteetin. 2,5, 5, 7,5 ja 10 mM methylglyoxal muutettu H1 histoni osoitti laskua 31,31%, 49,68%, 81,78% ja 95,31% vuonna luontaisen fluoresenssin intensiteetti verrattuna natiivin H1 histoni. Lisääntyvä keskittyminen methylglyoxal proteiinin näytteet johtivat punasiirtymä 3, 6, 8 ja 10 nm emissio aallonpituudella. Lisäksi ylimääräinen kyttyrä kuten piikkejä havaittiin modifioidun proteiinin 440 nm. Tulokset on esitetty kuviossa 2.

elektroforeettinen analyysi

PAGE tulokset osoittivat lisääntynyttä elektroforeettinen liikkuvuus modifioidun proteiinin näytteet verrattuna natiivi histoni. Modifioitu proteiinit esitti kasvanut bändi ulottuu niin vastaan ​​natiivi histoni. Ylimääräinen bändi esiintyi myös modifioidun proteiineja molekyylipaino suurempi kuin natiivi histoni H1. Tulokset on esitetty kuviossa 3.

PAGE-analyysi natiivin ja MG modifioitu histoni H1: 25 ug kunkin natiivin histoni H1 ja 2,5, 5, 7,5 ja 10 mM metyyliglyoksaalin muutettu kollegansa ladattiin kuoppiin 10 % polyakryyliamidigeelillä muin kuin denaturoivissa olosuhteissa (kaista 1-5), kaista 6 esittää molekyylipainomerkkiaineen.

AGE määritys

sissa olosuhteissa natiivi histoni H1 ei antanut havaittavaa AGE fluoresenssi. Havaitut fluoresenssivoimakkuuksien native ja modifioitu histoni H1 oli 7,886 430 nm ja 39.21 klo 446 nm vastaavasti. MG-H1 näytteille 79.88% lisäys AGE fluoresenssin intensiteettiä. Tulokset on esitetty kuviossa 4.

Surface hydrofobisuus (H

0) B

Merkittävä lasku ANS fluoresenssin intensiteetti MG muutettu H1 verrattuna alkuperäiseen histoni oli havaittu. Native ja MG muutettu H1 osoitti fluoresenssin 26.12 klo 279 nm ja 5,21 276 nm: ssä, joka vastaa vähenemistä ANS fluoresenssin intensiteetissä 79,97% tapauksessa modifioidun histoni. Sininen siirtymä 3 nm nähtiin myös tapauksessa modifioidun proteiinin. Tulokset on esitetty kuviossa 5.

Reactive karbonyyli sisällön

Spektrofotometrinen määrällisesti reaktiivisen proteiinin sitoutuneen karbonyylien kanssa tapahtuneen reaktion jälkeen 2,4-dinitrofenyylihydratsiinin (DNPH) osoitti absorbanssi-arvot 0,055 ja 0,624 syntyperäinen ja modifioitu histoni H1 vastaavasti 370 nm. Karbonyylin pitoisuus oli 2,47 nmoolia /mg proteiinin natiivin histoni H1 ja 28,36 nmol /mg proteiinin tapauksessa methylglyoxal modifioitu histoni H1 kuvaavan 11,48 kertaa kasvu reaktiivinen karbonyylien. Tulokset on esitetty kuviossa 6.

Sirkulaaridikroismispektrit

CD spektrianalyysi osoitti näkyvää eroa molaarinen ellipticities natiivin ja modifioitu histoni kolmella aallonpituudella nimittäin., 190 nm, 201 nm ja 222 nm. Havaitsimme kasvu positiivinen elliptisyys 190 nm: ssä, lasku negatiivinen elliptisyys 200 nm: ssä ja kasvu negatiivisen elliptisyydestä 222 nm: ssä. Havaitut elliptisyydestä 190 nm natiivi histoni ja methylglyoxal muutettu H1 oli 0,909 mdeg ja 1,249 mdeg vastaavasti. Negatiivinen elliptisyys saatiin 200 nm ja 222 nm. 200 nm CD (θ) arvot native histoni ja methylglyoxal muutettu H1 olivat – 33,615 mdeg ja – 33,132 mdeg ja 222 nm arvot olivat -8,39 ja -10,2 vastaavasti. Tulokset on esitetty kuviossa 7.

lämpödenaturaatiota Studies (Tm) Far-UV CD

muutokset toissijaisen rakenteelliset ominaisuudet saatu sulamislämpötila tutkimusten noudattamalla kehittymässä kuviot proteiinien kautta menetys elliptisyydestä 222 nm, osoitti alussa spiraali aukko natiivi histoni verrattuna MG modifioitu histoni. Puolivälissä sulamislämpötila (T m) natiivin ja MG modifioitu histoni H1 tuli olla 53 ° C ja 64 ° C vastaavasti. Tulokset esitetään kuvassa 8.

FTIR-ATR-analyysiä varten

FTIR tulokset natiivin histoni H1 osoitti värähtelevän venytys C = O, ominaisuus amidi I yhtyeen 1635 cm

-1. Kuitenkin postmodifikaatio, amidi I bändi sai siirtynyt 1640 cm

-1. Vaikka ei esiintynyt mitään syviä bändejä amidi II alueella, mutta ero prosentin läpäisykyky tällä alueella oli nähtävissä. Me kirjattiin vähemmän läpäisykyky native histoni verrattuna sen muutetussa muodossa. Lisäksi havaitsimme ylimääräinen ryhmä modifioitu proteiini, joka osoitti venyttely yhtyeen 1731 cm

-1. Tämä venytys ei havaittu natiivissa muodossa. Modifioitu histoni myös näytteillä ylimääräinen bändi 1066 cm

-1, mikä puuttui natiivimuotoon tällä alueella. Suuri bändit havaittiin alueella aalto väliltä 3000 cm

-1-3500 cm

-1. Tämä alue oli laajempi modifioitua histoni kuin natiivin proteiinin. Tulokset esitetään kuviossa 9.

Nestekromatografia massaspektrometria

Massaspektrit standardin CEL otettiin tutkimiseksi läsnäolon CEL ja sen törmäyksen aiheuttama hajonnut lomakkeita natiivi ja modifioitu histonit. Peruspiikkiin ja kaksi tuote-ionimassaspektrit standardin CEL havaittiin m /z-arvot 219.0145, 84,1024 ja 130,1032 vastaavasti (kuvio 10A). Mikään näistä huiput havaittiin standardin CEL löydettiin tapauksessa natiivi histoni H1 (kuvio 10B); modifioitu histoni H1 antoi näkyvin ioni tuote m /z 84,1086. Vähemmän voimakas piikkejä havaittiin kohdissa m /z 130.1208 ja 219.1432 (kuvio 10C).

pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM) B

Pyyhkäisyelektronimikroskopia on laajalti käytetty paljastava korkea resoluution rakenteelliset yksityiskohdat proteiineja. Kuten havaittiin Pyyhkäisyelektronimikroskooppilla, aggregaatin muodostuminen on selvää johtuu muutoksista histoni H1 MG (kuvio 11A). Native histoni näkyy aivan erilainen kuin sen muutetussa muodossaan (kuvio 11B).

CD tulokset DNA-proteiini vuorovaikutusten

Pyöreä dikromaattinen välisten vuorovaikutussuhteiden selvittämisen histoni H1 ja DNA todettiin selvää muunnelmat in spektrin ominaisuudet natiivi histoni, sen muutetussa muodossa ja natiivi-DNA. Native DNA osoitti positiivisen bändi 277 nm (θ = 8,542) ja negatiivisen bändi 243nm (θ = 5.851). Välisten vuorovaikutusten histoni H1 DNA johtaa laskuun positiivinen piikki 276 (θ = 4,9123) ja kasvu negatiivinen piikki 245 (θ = 5.092). Tulokset MG modifioitu histoni ja DNA olivat erilaisia ​​kuin DNA: n ja H1-DNA, koska se, saatiin välituote piikki 277 (θ = 5,882), ja kasvu negatiivinen piikki 243 (θ = 4,394), vastaavasti. Tulokset esitetään kuviossa 12.

Western blotting tutkimukset

25 ug natiivi ja MG-H1 näkyi selvä bändejä polyakryyliamidigeelissä jälkeen hopeavärjäyksellä. Modifioitu proteiini osoitti band venytys, muodostumista suurempi molekyylipaino kokonaisuus ja lisääntynyt kirkkaus verrattuna natiivi vastine. Vuonna imunoblot analyysissä vasta aiheuttama vastaan ​​MG-H1 osoitti erityinen sitova immunogeeni vähän tunnustusta epitooppien muunneltua histoni H1. Tämä toistaa meidän ELSIA tuloksia. Tulos on esitetty kuvassa 13.

A1 ja A2 representSDS PAGE natiivin ja MG-H1 vastaavasti. B1 ja B2 ovat immunobloteilla kuvaavat sitoutuminen anti-MG-H1 vasta natiivi H1 ja MG-H1 vastaavasti.

Sidonta seerumin autovasta syöpäpotilailla luontaiseen H1 ja MG muokattu histoni H1

huomattavasti suurempi osuus seerumin autovasta-aineiden kaikista syövän tyypit osoitti parannettu sitova methylglyoxal muokattu H1 verrattuna natiivi muodossa suoran sitoutumisen ELISA kokeiluja. Kokonaismäärästä 83 seeruminäytteet, 54 näytettä (65.06%) oli huomattavasti suurempi sitoutuminen MG-H1as vastaan ​​sen alkuperäisessä vastine, mikä osoittaa parempaa tunnustusta modifioidun histoni H1. Näitä ovat 19 näytettä keuhkosyöpä, 12 näytettä eturauhassyövän, 15 näytettä rintasyövän ja 8 näytettä ofhead ja kaulan alueen syöpä. Tulokset on esitetty kuviossa 14A-14D.

(A) sitoutuminen seerumin autovasta-aineiden keuhkosyöpäpotilaita (seerumit no. 1-27) ja natiivi (□) ja MG modifioitu histoni H1 (■). Normaalia ihmisen seerumia (NHS) toimi negatiivisena kontrollina. Histogrammi osoittaa tarkoita absorbanssiarvot. (B) sitoutuminen seerumin autovasta eturauhassyöpäpotilailla (seerumit no. 28-46) ja natiivi (□) ja MG modifioitu histoni H1 (■). Normaalia ihmisen seerumia (NHS) toimi negatiivisena kontrollina. Histogrammi osoittaa tarkoita absorbanssiarvot. (C) sitoutuminen seerumin autovasta-aineiden rintasyöpäpotilaiden (seerumit no. 47-68) ja natiivi (□) ja MG modifioitu histoni H1 (■). Normaalia ihmisen seerumia (NHS) toimi negatiivisena kontrollina. Histogrammi osoittaa tarkoita absorbanssiarvot. (D) sitoutuminen seerumin autovasta-aineiden pään ja kaulan alueen syöpä potilas (seerumit no. 69-83) ja natiivi (□) ja MG modifioitu histoni H1 (■). Normaalia ihmisen seerumia (NHS) toimi negatiivisena kontrollina. Histogrammi osoittaa tarkoita absorbanssiarvot.

Sidonta IgG syöpäpotilaille natiivi H1 ja MG modifioitu histoni H1

edelleen arvioimiseksi hienospesifisyyttä autovasta-aineiden syöpäpotilailla, IgG eristetty seeruminäytteistä osoittaa korkeampi sitova kohti MG modifioitu histoni H1 ja arvioitiin esto ELISA. IgG sekoitettiin vaihtelevia määriä natiivia ja MG-H1 (0-20 ug /ml) ja inkuboitiin 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja yön yli 4 ° C: ssa. Havaitut vasta-esto fornative H1 ja MG-H1 histones oli välillä 19,4% -36,2% ja 49,2% -76,5% respectively.The tarkoittaa inhibitioprosentti syntyperäisten H1 sitoutumiseen autovasta-aineiden keuhko-, eturauhas-, rinta-, ja pää