Krooninen sairaus

tiivistelmä

syöpäsoluinvaasiota, yksi keskeisistä tapahtumista paikallisia kasvua ja metastaaseja kasvainten, hallussaan laaja kirjo mekanismeja, erityisesti muuttunut ilmentyminen metalloproteinaasien. LFG-500 on uusi syntetisoitu flavonoidi on vahva syövän vastaista aktiivisuutta, jonka tarkka molekyylimekanismi on edelleen puutteellisesti. Tämä nykyinen tutkimus suunniteltiin tutkimaan vaikutuksia LFG-500 kasvaimen etäpesäkkeitä käyttämällä

in vitro

ja

in vivo

määrityksissä. LFG-500 voi estää tarttumista, muuttoliike ja hyökkäys MDA-MB-231 ihmisen rintasyöpä soluja. Samaan aikaan se vähentää toimintaa ja MMP-2 ja MMP-9 kautta tukahduttaa transkription NF-KB: n sijaan AP-1 tai STAT3. Lisäksi LFG-500 tukahdutettu TNF-α aiheuttama soluinvaasiota estämällä NF-KB: n ja myöhempien MMP-9 toimintaa. Edelleen selvittäminen mekanismin osoitti, että PI3K /AKT, mutta ei MAPK -signalointireitistä oli mukana inhiboiva vaikutus LFG-500 NF-KB: n aktivaation. LFG-500 voi myös tukahduttaa keuhkometastaasitestissä B16F10 hiiren melanoomasolujen

in vivo

. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että LFG-500 voi estää syöpäsolujen invaasiota kautta alas-säätely PI3K /AKT /NF-KB signalointireitistä, joka tarjoaa uusia todisteita syövän vastaista aktiivisuutta LFG-500.

Citation: Li C, Li F, Zhao K, Yao J, Cheng Y, Zhao L, et al. (2014) LFG-500 Estää Invasion syöpäsolujen kautta Down-asetus PI3K /AKT /NF-KB Signaling Pathway. PLoS ONE 9 (3): e91332. doi: 10,1371 /journal.pone.0091332

Editor: Zhe Zhang, Xuzhou Medical College, Kiina

vastaanotettu: 01 marraskuu 2013; Hyväksytty: 09 helmikuu 2014; Julkaistu: 11 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Natural Science Foundation of China (nro 21072232), Project ohjelma valtion Key Laboratory of Natural Lääkkeet, Kiina Pharmaceutical yliopisto (nro JKGZ201101, SKLNMZZ201210, SKLNMZZCX201303, SKLNMZZJQ201302), Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (nro . BK2011620, BK20130220), Program for Changjiang Tutkijat ja Innovative Research Team University (IRT1193), National Science Technology Major Project (nro 2013ZX0 9103-001-007, 2012ZX09304-001), Kiina Postdoctoral tiedesäätiön rahoittama hanke (2013M 541733), Jiangsu Suunnitellut hankkeet Postdoctoral Research Funds (1301015B), ja Natural Science Foundation of Higher oppilaitoksia Jiangsun maakunnassa (13KJB350007). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aktivointi ja metastaasit, avain tunnusmerkki syöpä [1], on laajalti tunnustettu ensisijainen syy syöpään liittyvää kuolleisuutta. Liiallinen tyvikalvoissa ja soluväliaineen (ECM) hajoaminen on ratkaisevaa kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [2]. Matriksin metalloproteinaasien (MMP: t), perheen sinkki-riippuvaisten endopeptidaasit, jotka liittyvät tuumorin invaasio ja metastaasi [3], [4]. Kasvainta erittyy MMP: t voivat hydrolysoida ECM komponenttien ympäröiviin kudoksiin kasvaimen, joka helpottaa hyökkäys kasvainsoluja tyvikalvon läpi kaukaisiin elimiin ja aiheuttaa etäpesäkkeitä [5]. Niistä MMP MMP-2 (gelatinaasi A, 72 kDa) ja MMP-9 (gelatinaasi B, 92 kDa) pelata keskeisiä rooleja ECM hajoaminen [6]. Näin ollen ne ovat runsaasti ilmaistaan ​​eri pahanlaatuisia kasvaimia [7]. Siksi MMP: ja niiden säätelyreittejä pidetään lupaavana tavoitteet syöpälääkkeet ja kemoterapeuttiset aineet [8].

On yleisesti osoitettu, että inositoli-3-kinaasi (PI3K) /AKT ja mitogen- aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) signalointireiteissä säädellä etäpesäkkeiden erilaisia ​​syöpäsoluja [9], [10]. Aktivointi loppupään transkriptiotekijöiden kuten aktivaattori proteiini-1 (AP-1), STAT3 ja Nukleaaritekijä-KB (NF-KB) raportoidaan stimuloivan ilmentymisen MMP at transkription tasolla [11]. Erityisesti, NF-KB: n, erittäin tärkeän transkriptiotekijän syöpäsoluissa, on liitetty moniin tunnusmerkkejä syövän kehitystä, mukaan lukien kasvutekijän riippumaton proliferaatio, estää apoptoosia, rajoittamaton replikatiivisia mahdollisuudet ja kudosten ja metastaasit [12], [13] . NF-KB-proteiinit käsittävät perheen rakenteellisesti samankaltaisten transkriptiotekijöiden, kuten p50 (NF-κB1), p65 (RelA), c-Rel, p52, ja RelB. Näistä tekijöistä vain p65, RelB, ja c-Rel sisältävät voimakkaita transaktivointidomainien sisällä sekvenssejä C-terminaalista Rel-homologiadomeeni (RHD), joka sisältää DNA: ta sitovan ja dimerisaatio alueilla. Aktivoitu NF-KB: tä on läsnä tumaan, jossa se sitoutuu spesifisiin DNA-sekvensseihin kutsutaan vaste-elementtien ja säätelee kohdegeenien transkription. Kun taas sytoplasmaan, NF-KB pysyy aktiivisessa tilassa, joka kompleksoituu inhiboivan IkB proteiineja. NF-KB voidaan aktivoida kautta klassisen IKK-riippuvaisen reitin johtaa tumaansiirtymiseen p50 /p65-heterodimeerejä [14].

Flavonoidit ovat ryhmä yhdisteitä runsaasti siemeniä, sitrushedelmät, oliiviöljy, teetä, ja punaviini. Viime vuosina, anti-kasvain vaikutuksia flavonoidien on laajalti tunnustettu, ja tutkittu, erityisesti niiden voimakas anti-metastaasin aktiivisuus [15], [16]. Aiempien tutkimusten, flavonoidit voivat estää invadopodia muodostumista ja MMP eritystä [17] ja estää migraatiota jopa-ekspressiota sääteleviä transgelin [18]. Moninkertainen toimet johtuvat niiden poly-fenoli rakenne. Kuitenkin, flavonoidit ovat erittäin alhainen oraalinen hyötyosuus johtuu sen ensikierron metabolia, mikä todennäköisesti tapahtuu niiden hydroksyyliryhmää. Siksi perustuu rakenteeseen flavonoideja, LFG-500 (C

30H

32N

2O

5, Fig. 1A) oli parantaa hyötyosuus suun kautta ja estää aineenvaihduntaa flavonoidien sen hydroksyyli ryhmiä ottamalla käyttöön piperatsiinia ja bentsyyli- ryhmiä. Nämä vaihdot antoi myös LFG-500 paremmin rasvaliukoisuudesta, joten se helpommin tehdä solunsisäiseen tilaan. Edellisessä tutkimus osoitti, että LFG-500: n indusoiman apoptoosin kautta reaktiivisen hapen (ROS) -mitochondrial-välitteisen väylän HepG2-soluissa [19]. Koska etäpesäke on erittäin tärkeää syövän etenemisessä, on välttämätöntä tutkia vaikutusta LFG-500 syövän etäpesäkkeitä ja mekanismista. Tästä johtuvat havainnot voivat tarjota uusia todisteita syövän vastaisen aktiivisuuden LFG-500 sekä flavonoideja.

(A) kemiallinen rakenne LFG-500. (B) inhiboiva vaikutus LFG-500 kasvuun MDA-MB-231-soluja 24 tuntia. MTT-analyysi oli työssä. (C) trypaanisinisen eksluusio määrityksessä LFG-500 kasvuun MDA-MB-231-soluja. -Soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla LFG-500: ssa 24 tuntia. (D) LFG-500 (8 uM) ei ole vaikutusta normaaliin kokoon ja muotoon solujen (x 200, mittakaava pylväs edustaa 30 um). (E) inhiboiva vaikutus LFG-500 tarttumista MDA-MB-231-solujen fibronektiiniin. Solususpensio (100 ui, 2 x 10

5 solua /ml) lisättiin fibronektiiniin pre-päällystetyille levyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h. Sitten elatusaineet oli huolellisesti imettävä pois. Kukin kuoppa pestiin kolme kertaa PBS: llä. MTT-analyysi tehtiin määrittämiseksi Tarttuvien solujen lukumäärä. (F) LFG-500 estää solujen vaeltamiseen. Yksisolukerros haavoituin 200 ui keltainen pipetin kärki seuraa käsittely eri pitoisuuksilla (2, 4, ja 8 uM) LFG-500: ssa 24 tuntia. Määrä solujen paljaaksi vyöhykkeellä kvantifioitiin alle käännettyä mikroskooppia. Valkoinen viivat osoittavat haavan reunalla. Siirrettyjä soluja yli valkoisia viivoja laskettiin kuudessa satunnainen kentille kunkin hoidon. Valokuvia haavan käsiteltyjen solujen LFG-500, x 100 (vasemmalla). Kvantifiointi siirtynyt solujen (oikealla). (G) LFG-500 estää solujen invaasiota. Valokuvia tunkeutuu solun värjätään hematoksyliinillä ja eosiinilla, × 200 (vasemmalla). Kvantifiointi hyökkäsi soluja (oikealla).

* P

0,05 tai

** P

0,01 edustaa merkittävää eroa kontrolliryhmän.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden Kiinan Pharmaceutical yliopisto. Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Materiaalit

LFG-500 (99,1%: n puhtaus), toimittanut professori Zhiyu Li (Kiina Pharmaceutical yliopisto, Kiina), liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) konsentraatioon 10 mM ensisijaisena kantaliuosta. Liuosta säilytettiin -20 ° C: ssa, ja laimennettiin väliaineen ennen kutakin koetta. Kontrollit käsiteltiin samalla määrällä DMSO: ta (0,1%), jota käytetään vastaavalla kokeissa. Sillä

in vivo

tutkimuksessa LFG-500 valmistettiin School of Pharmacy Kiinassa Pharmaceutical yliopisto. Dakarbatsiinia (DTTC, Nanjing lääkeyritys, Kiina) hyväksyttiin positiivinen kontrolli, joka liuotettiin 0,9% NaCl ennen käyttöä. Fibronektiiniä ja matrigeeliä hankittiin BD Biosciences (Bedford, MA, USA) [20]. Vasta-aineita MMP-9 (H-129) (sc-10737), MMP-2 (H-76) (sc-10736), c-Jun (D) (sc-44), c-Fos (4) (sc -52), NF-KB p65 (C-20) (sc-372), Lamin A (133A2) (sc-56137), IKKα /β (H-470) (sc-7607), IgG (H-270) (sc-66913), GFP (FL) (sc-8334), p-ERK1 /2 (Thr 177 /Thr 160) -R (sc23759-R), JNK (D-2) (sc-7345), p- JNK (G-7) (sc-6254), p38 (H-147) (sc-7149), p-p38 (Thr 180) (sc-101758), AKT1 /2/3 (H-136) (SC- 8312), β-aktiini (sc-130301), ja proteiini A-agaroosi (sc-2001) saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineita STAT3 (T721) (BS-1336), p-STAT3 (S727) (BS-4180), p-STAT3 (Y705) (BS-4181), ERK1 /2 (L352) (BS1112), PI3K p85α /γ (Y463) (BS-3006), ja p-AKT (S246) (BS-4286) ostettiin Bioworld (St. Louis Park.nneapoli, MN, USA). Vasta-aineita p-IKKα /β (Ser176 /180) (16A6) (# 2697), IκBα (44D4) (# 4812), ja p-IκBα (Ser32) (14D4) (# 2859) saatiin Cell Signaling Technology, Inc . (Beverly, MA, USA). MTT, trypaanisinistä, gelatiini, paraformaldehydi, formaldehydi, glysiini, Triton X-100, DAPI, Tris, NaCl, Hepes, KOH, KCI, EDTA, NP-40, PMSF, NaF, SDS, DTT: tä ja NaHCO

3 ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Eläimet

C57BL /6-hiiriä (6-8 viikkoa vanhoja) painottamalla 20-25 g saatiin Shanghai Laboratory Animal Center (Shanghai, Kiina). Eläimiä pidettiin lämpötilan ja kosteuden suhteen kontrolloidussa ympäristössä, jossa on 12: 12-tunnin valo /pimeä-sykli. Rehun ja veden olivat saatavilla

halun

. Kaikki eläinkokeiden ja kirurgisten toimenpiteiden tiukasti suoritettiin noudattaen Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals.

Soluviljely

MDA-MB-231 (ihmisen rinsyöpäsolulinja) ja B16F10 (erittäin metastaattinen hiiren melanoomasolulinjalla) ostettiin Cell Bank of Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, Kiina). MDA-MB-231-soluja ja B16F10-soluja viljeltiin Leibovitzin L15 ja DMEM-väliaineessa (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), vastaavasti, jotka molemmat sisältävät 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), 100 U /ml penisilliiniä (Beyotime, Nantong, Kiina), ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Beyotime, Nantong, Kiina). Soluja pidettiin kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa /5% CO

2 37 ° C: ssa.

Kolorimetrinen MTT-määritystä

Solut (10

4 /kuoppa) ympättiin Falcon 96-kuoppaisille levyille (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) 24 tunnin ajan ja altistettiin sitten eri pitoisuuksilla LFG-500. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, 20 ui 5 mg /ml MTT lisättiin väliaineeseen, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 4 tuntia. Sitten viljelyalusta heitettiin pois, ja 100 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan sakan liuottamiseksi. Absorbanssi (A) mitattiin aallonpituudella 570 nm käyttäen automaattista Microplated Reader ELx800 (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA). Solujen kasvua estävä määrä (I%) laskettiin seuraavalla yhtälöllä: missä A

käsitelty ja A

valvonta olivat keskimääräistä absorbanssia kolme rinnakkaista kokeissa hoidettujen ja kontrolliryhmiin, vastaavasti. IC

50 otettiin konsentraatio, joka aiheutti 50% solujen kasvun esto ja laskettiin logit menetelmällä.

trypaanisinisen väriaineen ekskluusiomääritystä

jälkeen altistetaan LFG-500 on ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia, solut kerättiin ja sekoitettiin 0,4% trypaanisinisellä. Sitten molemmat värjäämätön (elinkelpoinen) ja värjätään (käyttökelvottomaksi) solut laskettiin erikseen solun laskenta kammio (Qiujing, Shanghai, Kiina) mikroskoopilla (CX21, Olympus, Tokio, Japani).

Cell morfologiset arviointi

Solut ympättiin 6-kuoppaisille soluviljelylevyille (Corning, New York, NY, USA) ja käsiteltiin LFG-500 (8 uM) 24 tuntia. Lopussa inkuboinnin solujen morfologiaa tarkkailtiin käyttäen käänteisvalomikroskoopilla (IX51, Olympus Corp., Tokio, Japani).

Soluadheesioanalyysi

Soluadheesioanalyysi suoritettiin, kuten on kuvattu [ ,,,0],20] muutoksin. 96-kuoppaisia ​​levyjä päällystettiin fibronektiinillä (5 ug /ml) 4 ° C: ssa yön yli ja sitten estettiin BSA (1%) 1 h. Seerumin puutteessa solut altistettiin LFG-500 (2, 4, tai 8 uM) 24 tunnin ajan ennen kylvö. Target solut kerättiin ja suspendoitiin seerumittomassa elatusaineessa. Solut (2 x 10

5 /ml), ympättiin fibronektiinilla päällystetyille levyille ja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 1 h. Ei-tarttuvat solut poistettiin varovasti PBS: llä pesun. Sitten kolorimetristä MTT-määritystä käytettiin analysoimaan adheesiota solujen kykyä.

Haavan paranemista määrityksessä

Solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja annettiin kasvaa 80% konfluenssiin. Sen jälkeen yksisolukerros oli naarmuuntunut pipetillä kärki (Axygen, Union City, CA, USA) luoda kapean haava kaltainen aukko. Pian haavoittamisen jälkeen, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin LFG-500 (2, 4, tai 8 uM). Levyt valokuvattiin 0, 12, ja 24 h käyttäen käänteisvalomikroskoopilla. Lukumäärä siirtynyt solujen kvantifioitiin manuaalinen laskenta ja kuusi satunnaisesti valitun kentät analysoitiin kullekin hyvin [21].

Cell invaasiomääritys

TranswellTM kammio (10 mm halkaisijaltaan, 8 um huokosia kokoa polykarbonaattikalvon, Corning Costar, Cambridge, MA) päällystetään matrigeelin käytettiin tutkimaan invasiivisen kykyä syöpäsolujen

in vitro

kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, siirtokuoppaan kammiot alun perin pinnoitettu matrigeelin (40 ug /100 ui /kammio) 37 ° C: ssa 1 h. Käsiteltyjen solujen kanssa tai ilman LFG-500 (2, 4, tai 8 uM, 24 h) suspendoitiin Leibovitzin L15 (5 x 10

5 solua /ml) ja ympättiin ylemmässä osastossa, kun taas alustaa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia lisättiin alempaan osastoon. Inkuboinnin jälkeen kostutetussa atmosfäärissä 95% ilmaa /5% CO

2 37 ° C: ssa 24 h, ei-hyökkäsi solujen ylä- puolella kaivoa poistettiin pumpulipuikolla. Tunkeutuneet solut alapintaan kiinnitettiin 100% metanolilla ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (Nanjing Sunshine Biotechnology Ltd., Nanjing, Kiina). Tunkeutuneet solut kvantitoitiin manuaalinen laskenta ja kuusi satunnaisesti valitun kentät analysoitiin kussakin ryhmässä.

gelatiinitsymografialla määritys

Soluja käsiteltiin tai ilman LFG-500 (2, 4 tai 8 uM) seerumittomassa väliaineessa 24 tunnin ajan, ja sitten supernatantit kerättiin näytteitä. Gelatiinitsymografialla määritys suoritettiin edelliseen menetelmän [16]. Hoidon jälkeen entsyymi pilkottu alueilla havaittiin valkoisina nauhat vasten sinistä taustaa. Vyöhykkeet entsymaattisen aktiivisuuden nähtiin negatiivisesti värjättyjä juovia.

Reaaliaikainen PCR-analyysi

Soluja käsiteltiin LFG-500 (2, 4, tai 8 uM) 12 tuntia, ja sitten MMP-9: n ja MMP-2: n mRNA määritettiin. Alukesekvenssejä syntetisoitiin Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kiina) on listattu seuraavasti: MMP-9: 5′-GCA GAG GAA TAC CTG TAC CGC-3 ’(eteenpäin) ja 5’-AGG TTT GGA ATC TGC CCA GGT-3 ’(reverse); MMP-2: 5’-CAG GCT CTT CTC CTT TCA CAA C-3 ’(eteenpäin) ja 5′-AAG CCA CGG CTT GGT TTT CCT C-3′ (reverse); p-aktiini: 5’- CTG TCC CTG TAT GCC TCT G-3 ’(eteenpäin) ja 5′-ATG TCA CGC ACG ATT TCC-3’ (reverse). Reaktiot suoritettiin, kuten on kuvattu [23]. Näytteet ajettiin ABI 7500 Real-Time PCR -järjestelmää (ABI, Foster City, CA, USA) seuraavasti: 30 s 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 34 s . Kukin reaktio tehtiin kolmena kappaleena. Kynnysarvot (Cs) kunkin mRNA vähennettiin kuin β-aktiini-mRNA, keskimäärin, ja muuntaa log-lineaarisesta lineaarisia termejä. Aineisto analysoitiin SDS 2,1-ohjelman.

Western blot-analyysi

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla LFG-500 (2, 4, tai 8 uM) 24 tunnin ajan, sitten kerättiin ja hajotettiin. Western blotting-analyysi tehtiin mukaan aikaisempiin menetelmiin [24]. Detection suoritettiin Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA). Kaikki blotit stripattiin ja uudelleenseulottiin polyklonaalista β-aktiini tarkistaa yhtä suuri Proteiinilisäyksen.

valmistelu sytosolin ja tumaekstrakteilla

Kerätyt solut hajotettiin puskurilla A (10 mM Hepes-KOH (pH 7,9), 10 mM KCI, 0,1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1 mM DTT: tä, ja 0,5 mM PMSF), jäillä 15 minuutin ajan, jotta solujen turpoamista, ja sitten sentrifugoitiin 14 000 x

g

4 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Supernatantit tallennetaan sytosolin jakeet. Tumapelletit inkuboitiin korkea-puskuria (20 mM Hepes, 0,5 M KCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT: tä, ja 1 mM PMSF, pH 7,9) jäiden päällä 30 min, ja sitten sentrifugoitiin 12 000 rpm 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan, jolloin saatiin ydin- jakeet.

Immunofluoresenssi havaitseminen

Solut ympättiin lasipeitinlevyille ja inkuboitiin kanssa tai ilman 8 uM LFG-500: ssa 24 tuntia. Seuraavat vaiheet suoritettiin, kuten on kuvattu [24] muutoksin. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 1 tunnin väliajoin läpäiseviksi 0,5% Triton X-100, ja blokattiin 2% BSA: ssa 30 minuuttia. Inkubointi primaarisen vasta-aineen vastaan ​​NF-KB p65 (laimennettu 1:50) tehtiin yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen solut altistettiin peräkkäisessä järjestyksessä FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-aineita (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, L42001) ja DAPI. Kuvat havaittiin ja kiinni konfokaalisella laserkeilauksen mikroskooppi (FV1000, Olympus, Tokio, Japani).

elektroforeettinen liikkuvuus shift (EMSA) B

Soluja käsiteltiin 2, 4 ja 8 uM LFG-500: ssa 24 tuntia. DNA sitova toiminta NF-KB: tumauutteita arvioitiin EMSA [25] käyttäen EMSA Kit (Beyotime, Nantong, Kiina) biotiini-leimattu kaksijuosteinen NF-KB oligonukleotidit (Beyotime, Nantong, Kiina). Sekvenssit oligonukleotidien antoi olivat seuraavat: 5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3 ’ja 3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’. Lyhyesti, tumauutteita (6 ug /näyte) inkuboitiin oligonukleotidien reaktiossa puskureihin 30 min. Proteiini-DNA-kompleksit erotettiin 6% ei- denaturoivalla akryyliamidigeelillä, siirrettiin positiivisesti varautuneita nailonkalvoille, ja silloitettu on Stratagene ristisitojaa. Band vuorossa havaittiin kemiluminesenssin menetelmällä Chemidoc XRS + System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Kromatiini immunosaostuksella (chip) määritys

Soluja inkuboitiin LFG-500 ( 2, 4, tai 8 uM) 24 tunnin ajan, ja sitten ChlP määritys suoritettiin, kuten on kuvattu [26], jossa joitakin muutoksia. Lyhyesti, solut silloitettu formaldehydillä, reaktio lopetettiin glysiinillä, sonikoitiin jäillä ja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa. Alikvootteja lysaatit sisälsi 200 ug proteiinia käytettiin kutakin immunopresipitaatioreaktion anti-NF-KB p65 tai pre-immuuni IgG. Seokset pyöritettiin 4 ° C: ssa yön yli ja inkuboitiin sitten proteiini-A-agaroosi-6 tuntia. Lopuksi jää immuunikompleksien eluoitiin eluutiopuskurilla (1% SDS: ää ja 0,1 M NaHCO

3) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Proteiini-DNA-siltoja purettiin 65 ° C: ssa 4 h korkean suolan puskuria (0,2 M NaCl, 50 mM Tris, pH 6,5, 10 mM EDTA, ja 0,2 mg /ml proteinaasi K). Uutetaan ja liuenneen immunosaostettiin DNA kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR-analyysi alukkeilla kattaa NF-KB: n sitoutumiskohtia. Alukkeet MMP-9 promoottori kvantifiointi olivat 5′-CAG TGG AAT TCC CCA GCC TTG CCT-3 ’ja 5′-CCA CAC TCC AGG CTC TGT CCT C-3’.

Solun transfektio ja NF KB-riippuvaisia ​​reportteri geeni-ilmentymisen määritys

vaikutus LFG-500 NF-KB-riippuvaista reportterigeenin transkription analysoitiin lusiferaasireportterigeenianalyysissä [27]. -Soluja (5 x 10

5 solua /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Sitten PNF-KB-luc (Beyotime, Nantong, Kiina), joka sisältää neljä NF-KB: n sitoutumisen motiiveja (GGGAATTTCC) transfektoitiin soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 -reagenssia (Invitrogen Inc., Grand Island, NY, USA), mukaan valmistajan ohje. PCDNA3.2 plasmidia lisättiin tehdä kokonaismäärään DNA yhtä suuri (4 ug /kuoppa 6-kuoppaisella levyllä) GFP toiminut normalisointia ohjaus. Seuraavat LFG-500 (2, 4, tai 8 uM) hoitoa 24 h, lusiferaasi määritykset suoritettiin kanssa Luciferase Reporter Gene Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA) käyttämällä Luminoskan nousu (Thermo, Waltham, MA, USA) .

in vivo kasvaimen etäpesäke määritys

B16F10 melanooma-solut kerättiin sopivana konsentraationa PBS: ään ja injektoitiin häntälaskimoon syngeenisiin C57BL /6-hiiristä. Hiiret yhtä satunnaistettiin viiteen ryhmään (10 hiirtä /ryhmä): 0,9% normaalia suolaliuosta kontrolliryhmän, DTTC 100 mg /kg /2 päivä positiivinen kontrolliryhmä, LFG-500 12,5 mg /kg /vrk ryhmässä, LFG-500 25 mg /kg /vrk ryhmässä, ja LFG-500 50 mg /kg /vrk ryhmässä. Siirrostuksen jälkeen ja 24 tunnin jälkeen, hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti testiyhdisteiden kanssa 21 päivää. Sitten hiiret punnittiin ja tapettiin. Valkosolu (WBC) analysoitiin Sysmex K-4500 hematologian analysaattori (Sysmex Inc., Kobe, Japani). Keuhkot poistettiin ja pestiin PBS: llä. Määrä pinta kasvaimen kyhmyjä laskettiin alla preparointimikroskooppia [20].

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot eri koeryhmien ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.E.M. Esitetyt tiedot saatiin vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Erot ryhmien välillä arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA ja Dunnettin post hoc testi. Merkittäviä eroja olivat edustettuina

* P

0,05 tai

** P

0,01.

Tulokset

LFG-500 estää tartunta, muuttoliike ja invaasio MDA-MB-231-solujen in vitro

MTT-määritys osoitti, että solujen kasvu hidastui järjestelmällisesti kasvavien pitoisuuksien kanssa LFG-500 (Fig. 1 B). IC

50 arvo LFG-500 MDA-MB-231-solujen 24 tunnin oli 15,67 ± 0,82 uM. Kuitenkin LFG-500 (jopa 8 uM) ei ollut mitään selvää vaikutusta kasvuun MDA-MB-231-soluja (Fig. 1 B), joka vahvistettiin trypaanisinivärin syrjäytymisen määrityksessä (Fig. 1 C). Solujen morfologia tutkimus osoitti myös, että LFG-500 (8 uM) ei vaikuta normaaliin koko ja muoto-soluissa (kuvio. 1D). Siksi 8 uM LFG-500 määritettiin korkeimman pitoisuuden myöhemmissä kokeissa.

Kasvaimen etäpesäkkeiden tapahtuu läpi monimutkaisen sarjan tapahtumia. Kasvain soluilla erilaisia ​​ominaisuuksia, kuten muuttunut tarttuvuus, lisääntynyt liikkuvuus ja invasiivisia kapasiteetin loppuun metastaattisen prosessin [28]. Siksi kasvain soluadheesion ECM ja tyvikalvon pidetään ratkaisevana askeleena syövän etäpesäkkeiden. Olemme tutkineet vaikutusta LGF-500 liima kyky MDA-MB-231-solujen substraattien esipäällystetty fibronektiinin, yksi tärkeä osa ECM. LFG-500 käsittelyä (4 ja 8 uM) tukahdutetaan MDA-MB-231-solujen fibronektiiniin tarttumisen 33,6 ± 8,6% (n = 3,

P

0,05) ja 42,7 ± 9,1% (n = 3

P

0,05), tässä järjestyksessä (Kuva. 1 E). Lisäksi vaikutukset LFG-500 solumigraation ja invaasion havaitaan. Kuten on esitetty kuviossa. 1F, siirrettyjä soluja poikki haavoittuneita tila pienenivät 41,2 ± 8,4% (n = 3,

P

0,05), 64,9 ± 9,2% (n = 3,

P

0,01), vastaavasti, kun soluja käsiteltiin 2, 4 ja 8 uM LFG-500: ssa 24 tuntia. Lisäksi LFG-500 (4 ja 8 uM) vähensi hyökkäyksen kyky MDA-MB-231-solujen 51,9 ± 9,3% (n = 3,

P

0,05) ja 74,7 ± 10,2% ( n = 3,

P

0,01), tässä järjestyksessä (Kuva. 1 G).

LFG-500 estää toimintaa ja MMP-2/9 MDA-MB-231-solujen

MMP-2/9, secreted ja aktivoidaan syöpäsolujen hydrolysoivat tyvikalvon ja ECM, joka helpottaa hyökkäyksen pahanlaatuisia soluja ja aiheuttaa etäpesäkkeitä [29]. Tutkia mahdollisia anti-etäpesäke mekanismi LFG-500, The Gelatinolyyttinen MMP-2/9 erittyy MDA-MB-231-solujen havaittiin seuraavat LFG-500 käsittelyä. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, LFG-500 (8 uM) ilmeisesti tukahdutti MMP-2 ja MMP-9, jossa inhibitio hinnat 62 ± 8,2% (n = 3,

P

0,01) ja 81 ± 7,9 % (n = 3,

P

0,01), vastaavasti. Lisäksi inhiboiva vaikutus MMP-9 oli merkittävästi.

(A) LFG-500 inhiboi MMP-2/9 MDA-MB-231-soluja. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (2, 4, ja 8 uM) LFG-500: ssa 24 tuntia. Esikäsitelty väliaine kerättiin, ja sitten MMP-2/9 aktiivisuus määritettiin gelatiinitsymografialla määrityksessä. (B) LFG-500 vähentää MMP-2/9 mRNA: ta. Soluja inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla LFG-500: ssa 12 h. MRNA-tasot havaittiin reaaliaikaisella PCR-analyysillä. (C) LFG-500 estää proteiinin MMP-2/9. MDA-MB-231 solun lysaatit altistettiin immunoblottaus vasta-aineiden MMP-2 (1:400) ja MMP-9 (1:400).

* P

0,05 tai

** P

0,01 edustaa merkittävää eroa kontrolliryhmän.

Jotta edelleen ymmärtää alas-sääntelyyn vaikutukset LFG-500 MMP-2 ja MMP-9, reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, estyminen geenin ilmentymisen havaittiin ilmeisesti, jonka taso MMP-2: n mRNA pienennetään 47,5 ± 9,5% (n = 3,

P

0,05) ja MMP-9 mRNA: n määrä väheni 68,1 ± 7,1% (n = 3,

P

0,01), vastaavasti, sen jälkeen, kun hoito 8 uM LFG-500: ssa 12 h. LFG-500-välitteisen muutoksia MMP-2 ja MMP-9 mRNA olivat yhdenmukaisia ​​myös niiden proteiinin ekspression, mistä on osoituksena Western blot -analyysillä (kuvio. 2C). Nämä tulokset osoittivat, että LFG-500 saattaa säädellä MMP-2/9 transkriptiotasolla. Vielä tärkeämpää on, estäviä vaikutuksia MMP-9 olivat havaittavissa.

LFG-500 tukahduttaa solujen invaasiota estämällä transkription NF-KB: n ja sen jälkeen MMP-9 -aktiivisuuden

Se on yleensä raportoitu, että transkription säätelyyn aktivoimalla transkriptiotekijät, mukaan lukien AP-1 [30], STAT3 [31], tai NF-KB: n [32] tapahtuu modulaation MMP-9-geenin ilmentymistä. Selventää edelleen mekanismia taustalla LFG-500 tukahduttaa MDA-MB-231 soluinvaasiota, tutkimme vaikutuksia LFG-500 näistä transkriptiotekijät. Tiedot on esitetty. 3A osoittaa, että LFG-500 ei ollut merkittäviä vaikutuksia ydinvoiman taan C-Jun tai c-Fos (komponentit AP-1). Sitä paitsi, ei ollut havaittavaa muutosta fosforylaation STAT3, kun annetaan sama käsittely (Fig. 3A). Kuitenkin LFG-500 esti tumaansiirtymiseen NF-KB: n p65, jolla on vähentynyt ydinvoiman tasolle vaan lisääntynyt soluliman tasolla (Fig. 3B), joka vahvistettiin immunofluoresenssimäärityksellä (Fig. 3C). Lisäksi kokonaismäärä NF-KB: n p65 oli laskenut sen jälkeen, kun LFG-500 käsittelyä (Fig. 3d). Siitä syystä, että NF-KB: n aktivaation tulosta nopean fosforylaation, ubikitinaation ja lopulta proteolyyttisen hajoamisen lKB [33], samoin kuin IKK tarvitaan fosforylaation lKB [34], fosforylaation tasot IKKα /β ja IκBα havaittiin . LFG-500 (4 uM ja 8 uM) tehokkaasti esti fosforylaatiota IKKα /β ja IκBα, kun taas koko vakaan tilan tasot pysyivät ennallaan (kuvio. 3D). Nämä tulokset osoittivat, että NF-KB sijaan AP-1 tai STAT3 saattaa liittyä anti-invasiivisen aiheutuvaa LFG-500.

(A) LFG-500 ei ole merkittäviä vaikutuksia AP-1 tai STAT3. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (2, 4, ja 8 uM) LFG-500: ssa 24 tuntia. Ydinvoiman tasot proteiinit havaittiin Western blot -määritys käyttäen spesifisiä vasta-aineita. Lamin-A käytettiin ydin- latauskontrollina. (B) LFG-500 estää tumaansiirtymiseen NF-KB. Soluliman ja tumaekstrakteilla soluissa valmistettiin mukaan ”Materiaalit ja menetelmät”. Ydin- ja sytoplasman tasot NF-KB p65 määritettiin Western blot -määritys. (C) inhiboiva vaikutus LFG-500 on tumaansiirtymiseen NF-KB. MDA-MB-231-soluja immunovärjättiin anti-NF-KB p65 (01:50) ja DAPI (× 400, mittakaava pylväs edustaa 30 um). (D) vaikutukset LFG-500 fosforylaatiota tasoilla IKKα /β ja IκBα. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (2, 4, ja 8 uM) LFG-500: ssa 24 tuntia, ja kohdeproteiinien ilmentymisen havaittiin Western-blottauksella käyttämällä spesifisiä vasta-aineita, joissa β-aktiini käytettiin loading ohjaus.

* P

0,05 tai

** P

0,01 edustaa merkittävää eroa kontrolliryhmän.

Tämän jälkeen DNA-sitova aktiivisuus siirtämisellä NF-KB arvioitiin edelleen.

In vitro

, ydin- uutteita inkuboitiin DNA-koettimien spesifisiä NF-KB, ja niiden sitoutuminen arvioitiin liikkuvuuden siirtymän. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, LFG-500 merkittävästi esti DNA: ta sitova aktiivisuus NF-KB: n. Edelleen vahvistaa tämän havainnon ChIP määritys suoritettiin testata sitoutumisen aktiivisuutta NF-KB: n on promoottori MMP-9, joka on NF-KB: n kohdegeenin. Tulokset osoittivat, että sitoutumisaktiivisuus inhiboitui merkittävästi seuraavat LFG-500 käsittelyä (Fig. 4B). Koska DNA-sitova yksin ei aina korreloi NF-KB-riippuvaista geenin transkriptio [35], vaikutukset LFG-500 NF-KB-riippuvaista reportteriaktiivisuutta analysoitiin myös. MDA-MB-231-soluja kotransfektoitiin GFP ja PNF-KB-luc plasmidit. LFG-500 ilmeisesti tukahdutetaan lusiferaasiaktiivisuuden, noin 3-kertainen pieneneminen seuraavat 8 uM hoidon (Fig. 4C).