Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tauti aggressiivisuus edelleen kriittinen tekijä etenemistä eturauhassyöpää. Transformation of epiteelisolujen mesenkymaaliset linjaa, liittyy menetys E-kadheriinin, tarjoaa merkittäviä invasiivisia potentiaali ja migraatiokykyä. Äskettäin Special AT-rikas sitova proteiini (SATB1) on yhdistetty kasvaimen etenemistä. SATB1 on solutyypissä rajoitettu tumaproteiini, joka toimii kudosspesifiseksi järjestäjä DNA-sekvenssien aikana solun erilaistumisen. Tuloksemme osoittavat, että SATB1 näyttelee merkittävää roolia eturauhasen syövän leviämisen ja muuttoliike ja sen tumaanohjaussignaali korreloi taudin aggressiivisuus. Kliinisestä näytteestä analyysi osoitti, että SATB1 oli pääasiallisesti ilmaistu tumassa korkealaatuisesta kasvaimet verrattuna matala-asteinen kasvain ja hyvänlaatuinen kudosta. Progressiivinen kasvu ydinvoiman tasojen SATB1 havaittiin syövän kudoksissa verrattuna hyvänlaatuinen yksilöitä. Vastaavasti, SATB1 proteiinin tasot olivat korkeammat useissa eturauhasen syöpäsolujen

eli

. HPV-CA-10, DU145, DUPro, PC-3, PC-3M, LNCaP ja C4-2B, verrattuna ei-tuumorigeenisiä PZ-HPV-7-soluissa. Nuclear ilmentyminen SATB1 oli korkeampi biologisesti aggressiivinen subklooneja eturauhassyöpäsolujen omien vanhempien solulinjoja. Lisäksi kohdunulkoinen SATB1 transfektion siirrettävä lisääntynyt solun liikkuvuus ja invasiivisuus kuolemattomiksi tehdyissä ihmisen eturauhasen epiteelisolujen PZ-HPV-7-soluissa, jotka korreloivat menetys E-kadheriinin ilmentymisen. Niinpä knockdovvn SATB1 erittäin aggressiivinen ihmisen eturauhassyöpä PC-3M soluihin esti invasiivisuus ja kasvaimen kasvua

in vivo

yhdessä lisääntyminen E-kadheriinin proteiinin ilmentymisen. Meidän havainnot osoittavat, että SATB1 on kyky edistää eturauhassyövän aggressiivisuuden epiteelin-mesenkymaalitransitioon.

Citation: Shukla S, Sharma H, Abbas A, MacLennan GT, Fu P, Danielpour D, et al. (2013) lisääntymisen merkkejä SATB1 liittyy Eturauhassyöpä Aggressiivisuus ja sairauden eteneminen. PLoS ONE 8 (1): e53527. doi: 10,1371 /journal.pone.0053527

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 elokuu 2012; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2012 Julkaistu: 07 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Shukla et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus United States Public Health Service avustukset RO1CA115491 ja Endowment varoja SG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat miehillä Yhdysvalloissa, jossa lähes 33720 kuoli vuonna 2011 [1]. Huonon ennusteen eturauhassyövän liittyy aggressiivisuus syöpäsoluja, jotka itse antaa niille paremmat mahdollisuudet intravasate verisuonistoon ja imusuonten osastoja, etäpesäkkeitä kaukaisiin sivustoja, ja aiheuttaa toistumisen jälkeenkin lopullinen hoitomuotojen kuten leikkaus ja säteily [2], [3 ]. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on keskeinen tapahtuma kasvaimen invaasio prosessia, jossa epiteelisoluperäisen kasvain hankkii mesenkymaalisten ominaisuuksia, menettävät polariteetti ja solu-solu kontakteja ja muututtava tukirankansa remontin [4] – [6]. Menetys E-kadheriinin ilmentymisen on tunnusmerkki EMT [7], [8]. E-kadheriinin (CDH1) on keskeinen rooli solu-adheesion liittymän ylläpitoon solun polariteetin ja ympäristö [7]. Menetys E-kadheriinin ilmentyminen liittyy yleisesti kasvainten invasiivisuus, etäpesäke ja huonon ennusteen eri ihmisen syövissä, mukaan lukien eturauhassyöpä [8], [9]. Proteiinien tunnistamiseksi, jotka aiheuttavat molekyyli- kyseeseen EMT voisi johtaa niiden tunnistamista prognostisia biomarkkereita ja terapeuttisina kohteina, mikä mahdollistaa uudenlaisten strategioiden vähentää eturauhassyövän aggressiivisuuden.

Special AT-rikas sitova proteiini 1 (SATB1) on transkriptiotekijä, joka toimii genomin järjestäjän [10], [11]. Se on yleensä sitoa AT rikas pohja parittomia sekvenssit kohdegeenin [11]. SATB1 hankkii ”3 D chickenwire” rakenne muodostamalla ankkuri silmukoita ympäri kromatiinin rekrytoi chromatin remodeling komplekseja ankkurointi sivustoja, ja säätelee histonimodifikaation tekemällä DNA-sekvenssit käytettävissä tai saavuttamattomissa transkriptio [12], [13]. Transkriptio GenBank viittaa kahteen SATB mRNA transkriptivariantissa ihmisillä: SATB1 ja SATB2 [14]. Konstitutiivisen aktivaation SATB1 on osoitettu ensisijaisesti soluissa hematopoieettisperäisen ja on mukana vaiheessa T-solujen kehityksen ja erilaistumisen: n ekspression kontrollointiin BCL-2-geenin kautta BCL-2 suuria katkeamispistealueella (mbr), joka sijaitsee 3′- UTR [15], [16]. SATB2 on sekaantunut kuin kehityshäiriöitä säätelijänä hermosolujen erilaistumiseen [17]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, poikkeava ekspressio SATB1 eri epiteelin syövät, mukaan lukien melanooma, kurkunpään okasolusyöpä, ja rinta-, koolon-, keuhko-, munasarja-, ja maksan [18] – [24]. Yliekspressio SATB1 on todettu riippumattomaksi prognostinen markkeri mahasyövän [25], ja sen on osoitettu olevan rooli rintamaidon syövän etenemisen prosessin kautta uudelleenohjelmointi geenin ilmentymisen ja näin edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [26]. Tiedetään vain vähän vaikutusta SATB1 ilmaisua biologinen käyttäytyminen eturauhassyövän.

Vaikka SATB1 on raportoitu aktivoida eri syöpätyyppien, sen rooli syövän etenemisessä ei ole selvä. Kattava geeniekspressioanalyysiä kliinisistä eturauhassyövän näytteistä paljastui selvästi transkription uudelleenohjelmointi liittyy metastaattista potentiaalia [27]. Toiminnallinen profilointi geenien ehdotti yhdistys SATB1 kromatiinin muutokseen vaikuttavat transkription säätely säätelevien geenien Soluadheesiomolekyylien ja EMT [9], [12]. Koska merkittävä rooli EMT eturauhassyövässä invasiivisuus, on oletettu, että yli-ilmentyminen SATB1 eturauhassyövässä voitaisiin edistää invasiivisuus eturauhassyövän downregulation E-kadheriinin. Tähän mennessä ei ole ollut tietoa roolista SATB1 eturauhassyövässä. Tässä tutkimuksessa SATB1 ilmaisun, ydin- ja sytoplasman lokalisointi arvioitiin useilla ensisijainen eturauhassyövän kudosnäytteet ja vakiintuneet solulinjat yhdistämällä Immunohistokemian ja Western blotting. Tuloksemme osoittavat, että ydinvoiman läsnäolo SATB1 korreloi merkitsevästi eturauhassyövän aggressiivisuuteen ja sairauden etenemistä. Yhdenmukainen kliinisten havaintojen kohdunulkoinen muutokset SATB1 ilmaisun aiheutti muutoksia solun liikkuvuus ja invaasio sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tämä linja todisteiden osoittaa ennustetekijöiden merkitystä SATB1 eturauhassyövässä ja selventää vaikutuksen SATB1 edistämisessä eturauhassyövän invasiivisuus.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Human eturauhasen syöpäsolujen, LNCaP, 22Rv1, DU145, PZ-HPV-7, CA-HPV-10 ja PC-3 hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ihmisen eturauhasen syöpäsolujen

eli

. PC-3M saatiin tri ME Kaighn National Cancer Institute [28]; C4-2B solut tohtori Robert Sikes yliopiston Delawaren [29], ja DUPro solut tohtori Rajvir Dahiya at University of California at San Francisco [30]. Aiemmin raportit ovat dokumentoineet perustamisen näistä solulinjoista [28] – [30]. Soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, 100 ug /ml penisilliiniä-streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA), pidettiin inkubaattorissa, jossa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2 37 ° C: ssa. Viljellyt solut kasvatettiin -60% konfluenssiin ja lysaatit (yhteensä lysaatit, soluliman ja ydin- lysaatit) valmistettiin aikaisemmin protokollan tarkempaa analysointia.

Ihmisen eturauhasen kudosnäytteitä ja immunohistokemia

Näytteet poistettujen ihmisen eturauhasessa saatiin kudoksen Facility yliopistollisen sairaalan Case Medical Center ja Keskilännen Division Cooperative Human Tissue Network. Ei suostumus saatiin nämä poistetut kudokset kohti niiden sairaala politiikkaa ja Institutional Review Board protokollia. Nämä tutkimukset hyväksyi Institutional Review Board yliopiston Hospitals Asia Medical Center. Potilaat, joilta nämä kudokset hankittiin olivat läpikäyneet kirurgisia toimenpiteitä varten eturauhasen sairaus ja ei ollut saanut minkäänlaista adjuvanttihoito. Gleason arvosana ja pistemäärä adenokarsinooma dosnäytteistä määrittämä kirurgisen patologi kokenut urogenitaalinen patologian. Välittömästi hankinnan jälkeen näytteet jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa nestemäisessä typessä, kunnes sitä tarvitaan. IHC tutkimukset ihmisen eturauhasessa mikrosiru (Cat # 73-5063) hankittiin Zymed Laboratories (San Francisco, CA), joka sisältää ytimet normaalin eturauhasen, hyvänlaatuinen hyperplastinen eturauhasen kudosta, matala-asteista syöpien ja korkealaatuisesta eturauhasen syöpiä. Näissä yksilöitä, immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin valmistajan protokollan (Biocaren Medicals, Concord, CA).

Ohimenevä transfektio

androgeenisesti tulenkestävä erittäin metastaattinen ihmisen eturauhassyöpä PC-3M, joilla korkeampi ilmentyminen SATB1, kun taas, PZ-HPV-7, joka on hyvin alhainen perustason taso SATB1in ytimen käytettiin tutkimuksessa. Lyhyesti, nämä solut maljattiin 100 mm: n maljoille ja niiden annettiin kiinnittyä yön yli. Noin 70% konfluentteja PZ-HPV-7-solut transfektoitiin väliaikaisesti 8 mu g joko pCMV6-AC True Clone Human sisältävän plasmidi-DNA SATB1 (SC320672) ilmentyminen hankittiin Origene (Rockville, MD) tai tyhjän vektorin, kun taas PC-3M soluja infektoitiin shRNA (SATB1) ihmisen plasmidi DNA pudotus SATB1 geeniekspression; joka sisältää pooli 3 kohdespesifisen lentivirusvektorilla kukin koodaus 19-25 nt (plus hiusneula) (SC-36460-SH) ja tyhjän vektorin shRNA plasmidi-A (SC-108060) (Santa Cruz Biotechnology, CA) käyttäen Fugene 6 transfektioreagenssia. 6 tunnin kuluttua väliaine täydennettiin seerumia viljelyväliaineessa, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 48 tuntia. Myöhemmin solut prosessoitiin immunoblottausanalyysillä sekä solumigraatioon ja invaasion määrityksissä.

Western-blottaus

kasvain lysaatit sekä solulysaateissa (yhteensä, soluliman ja ydinvoima) valmistettiin ja alistettiin ja immunoblot-analyysillä. Proteiini (40 mu g) peräisin kokosoluliuotteista tai ihmisen eturauhassyövän lysaatit erotettiin yli 4-20% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Sen jälkeen, kun esto estopuskurilla (PBS, joka sisältää 0,1% Tween-20 ja 10% FBS: ää) 2 h, membraania inkuboitiin primaarisen vasta-aineen 2 h huoneen lämpötilassa. Käytetyt vasta-aineet olivat SATB1 (Cat # ab49061, Abcam, Cambridge, MA); Histoni H4 (Cat # 07-108, Millipore, Denvers, MA); E-kadheriinin (Cat # SC-8426); MMP-9 (Cat # SC-10737); beeta aktiini (Cat # SC-47778) ja sytokeratiinivasta-18 (Cat # SC-6259) Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Sitten membraania inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa vielä 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Proteiini todettiin ECL-substraatin reagenssit (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL).

Cell Invasion määritys

Väliaikaisesti transfektoimaan SATB1 PZ-HPV-7 (SATB1over-ilmentäviä soluja) ja PC -3M tartunnan (SATB1 knockdown solut) otettiin tutkimuksessa tutkia vaikutusta SATB1 geenin soluinvaasiota sekä muuttoliike. Jälkeen 48 h SATB1 geenin infektion soluissa, jotka sisälsivät seerumi poistettiin soluista ja täydennettiin tuoreen ilman seerumia RPMI: ssa 6 tuntia. Lisäksi solut trypsinoitiin, laskettiin ja päällystetty osaksi siirtoaltaat, joka sisälsi 1 x 10

6 solua /ml. Invaasio kammio iinianalyysikitissä käytettiin QCMTM ECMatrix Cell invaasiomääritys, 24 syvennyksen (8 mu m) (Millipore Corporation, Denvers, MA, Cat # ECM550), joka perustuu periaatteeseen Boyden kammion. Kollageeni kerros tukkii kalvon huokoset estäen ei-invasiivisia solujen läpi kulkeutumista kalvon läpi. Invasiivisia solut, toisaalta, kulkeutuvat polymeroidun kollageenin kerroksen ja takertuvat pohjaan polykarbonaattikalvon. Tunkeutuneet solujen insertin pohjaan kalvo inkuboitiin Cell Stain liuosta, sitten uutetaan sen jälkeen ja havaitaan standardin mikrolevylukijalla (560 nm). Koko menettelyä noudatettiin mukaisesti valmistajan protokollan.

Cell Migration määritys

Migration Määritys suoritettiin PZ-HPV-7 (SATB1over-ilmentäviä soluja) ja PC-3M tartunnan (SATB1 pudotus solut) solut käyttämällä QCMTM, 24-kuoppaisen kolorimetrisellä solujen migraatiomääritys kit (Millipore Corporation, Denvers, MA, cat # ECM508) seuraavasti toimittajan protokollan.

Reverse Transcription-polymeraasiketjureaktio

Semi -quantitative RT-PCR (RT-PCR) suoritettiin sen määrittämiseksi, transkriptio tasot SATB1 ihmisen eturauhasen kudosnäytteitä eri Gleason laadut ja GAPDH: n monistamista transkriptien käytettiin kontrollina normalisoimiseksi transkriptin tasot SATB1. Kudokset leikattiin pieniksi paloiksi ja sijoitetaan Sulata yhteensä nukleiinihappo eristäminen järjestelmä (Ambion, Austin, TX), mukaan valmistajan protokollaa. RT suoritettiin käyttäen oligo-dT-aluketta (Invitrogen), ja 0,5 mu g kokonais-RNA: ta 25 mu l reaktioseosta, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCI, 10 mM DTT, 5 mM MgCl

2, 2,5 ml dNTP (10 mM), 10 U RNAsin, ja 200 U MMLV-käänteistranskriptaasia (Invitrogen). RT-reaktio suoritettiin 39 ° C: ssa 1 h syntetisoimiseksi cDNA. Sitten suoritettiin PCR monistaa cDNA: t 25 mu l reaktioseosta, joka sisälsi 50 nmol kutakin geenispesifistä aluketta, 3 ml RT tuote, 2,5 mM dNTP: tä, 1 x PCR-puskuria (5 mM Tris-HCI, pH 8,3, 42,5 mM KCI , 0,1% Triton X-100), 0,5 ml Taq-polymeraasia (Promega, Madison, WI) 2 mM MgCl

2 sekä alukkeita, joita käytetään PCR-reaktiossa. Sekvenssit geenin-spesifisiä alukkeita SATB1 eteenpäin: 5′-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 ’ja reverse: 5′-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3′; GAPDH eteenpäin: 5’-ATGACC CCTTCATTGACCTCA-3 ’ja reverse: 5′-GAGATGATGA CCCTTTTGGCT-3’. SATB1 transkriptien monistettiin 30 sykliä (1 min 94 ° C: ssa, 1 min 59 ° C: ssa, ja 1 min 72 ° C: ssa), ja cDNA: GAPDH transkriptien monistettiin 25 sykliä (1 min 94 ° C: ssa, 1 min 55 ° C: ssa, ja 1 minuutti 72). PCR pyöräily numerot oli optimoitu välttää vahvistusta kylläisyyttä. Kymmenen mikrolitraa RT-PCR-tuote erotettiin 2% agaroosigeeleillä, jotka myöhemmin värjättiin etidiumbromidilla. Geelit visualisoitiin ja juovien voimakkuudet mitattiin alle Kodak 2000R kuvan aseman.

SATB1 pudotus

PC-3M solut transduktio SATB1 shRNA lentiviruksen hiukkaset, jotka on allas viruspartikkelin, jotka sisältävät 3 tavoitteelliseen erityisiä konstruktit, jotka koodaavat 19-25 nt (plus hiusneula) shRNA suunniteltu kaataa geeniekspression (Santa Cruz Biotechnology, CA, sc36460-v). PC-3M-soluja maljattiin 12-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen virusinfektio. Transductions tehtiin RPMI, joka sisälsi 10% täydellistä väliainetta (jossa on seerumia ja antibiootteja), ja inkuboi soluja yön yli. RPMI Täydellinen väliaine poistettiin ja täydennetty polybreenin (5 mu g /ml) täydellistä RPMI-väliainetta. PC-3M-solut infektoitiin lisäämällä shRNA lentiviruksen hiukkasia sisältävien solujen väliaineessa. Kaikki menettely suoritettiin valmistajan protokollan.

pesäkemuodostusta

Noin 400 solua PC-3M ja PC-3M (SATB1 kaataa) solut otettiin 100 mm petrimalja ( Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ), ja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2 ja 95% ilmaa. 12 päivän jälkeen solut pestiin fosfaattipuskurilla ja sitten värjättiin Coomassie-sinisellä. Solut pesäkkeet laskettiin ja valokuvattiin.

-tuumoriksenografti Studies

Nude hiiret ostettiin Case Kattava Cancer Center, kateenkorvattomia nude-hiirten laitos ja ylläpitää mikroisolaattorihäkkeihin häkeissä. Kaikkia eläimiä käytettiin vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti ja nykyisen kokeet hyväksynyt Käytä komitean Animal Care on Case Western Reserve University. Kasvain solut, PC-3M ja PC-3M (SATB1 Knockout) suspendoitiin RPMI 1640 täydellistä viljelyalustaa 25% matrigeelin (BD Biosciences) ja ympättiin 1 x 10

6 solua ihonalaisesti oikeaan ja vasempaan kyljissä 6 7 viikon ikäisiä karvattomia hiiriä. Hiiriä seurattiin päivittäin palpoitavissa kasvaimen muodostumisen ja kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa käyttäen mikrometrillä, punnitaan ja valokuvattiin.

Tilastollinen analyysi

SATB1 ydin- lauseke tietoja yhteenvedon keskiarvo (vaihteluväli ) sekä rasiakuvaaja. Muutokset kasvaimen tilavuuden ja painon aikana kokeiden visualisoitiin sirontakuvaajaan. Erot SATB1 ydin- ilmaisun (1000 ytimet), kasvaimen tilavuus (mm3), ja kehon painon kokeiden päättyessä kesken eri ryhmien tutkittiin käyttäen varianssin analyysiä (ANOVA), jota seurasi Tukeyn moninkertainen vertailu menettelyä. Tilastollinen merkitys eroja valvonnan ja hoitoryhmässä määritettiin T-testi tietoja riippumattomien näytteiden tai pariksi T-testi tietoja vastaaviin näytteistä. Kaikki testit olivat kaksisuuntaisia ​​ja p-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmentäminen SATB1 proteiinin Benigni ja Kasvain näytteet

Ilmaus profiilia SATB1 määritettiin kliinisissä näytteissä poistettiin kirurgisesti. Suoritimme Western blot analyysi SATB1 ja CK18 kuten epiteelin latauskontrollina 14 hyvänlaatuinen, 14 huonolaatuisen eturauhassyöpä (Gleason ≤7), ja 6 korkealaatuista kasvain näytteet (Gleason pisteet 8-10). Tyypillinen blot kuviossa 1A, SATB1 havaittiin ilmentyvän sekä hyvän- ja syöpä- eturauhassyöpäkudoksille. Tasot SATB1 olivat merkittävästi korkeammat syövän yksilöiden verrattuna hyvänlaatuinen kudokseen. Densitometri-analyysi osoitti 1,6-kertainen SATB1 ilmentymisen huonolaatuisen kasvain näytteet ja 2,62-kertaisesti korkealaatuisesta kasvain yksilöitä, verrattuna hyvänlaatuinen kudokseen. Seuraavaksi määritetään, onko SATB1 ylössäädellään viestitasolla. Suoritimme RT-PCR mRNA: n ekspression osalta SATB1 ja GAPDH latauskontrollina. Kuten kuviossa 1B, mRNA-transkriptin SATB1 merkittävästi yläreguloituja korkealaatuisesta kasvaimet verrattuna huonolaatuisen kasvaimia ja hyvänlaatuisia kudosta. Densitometri-analyysi osoitti 1,64-kertainen SATB1 mRNA: n ekspression huonolaatuisen kasvain näytteet ja 1,51-kertaisesti korkealaatuisesta kasvaimet, verrattuna hyvänlaatuinen kudokseen. Koska SATB1 on ydin- proteiinia ja edistää kopiointia ajatellen aktiivisen kromatiinirakenteeseen vuorovaikutuksessa AT-rikas DNA-sekvenssit, yläreguloituja syövän vuoksi määritimme tasoa tämän proteiinin sytosoliin ja tumafraktios- hyvänlaatuisia ja kasvain näytteet on saatu samasta yksilöstä. Itse asiassa korkeampi SATB1 proteiinia oli läsnä tumafraktios- verrattuna sytosoliin kasvainkudoksessa verrattuna hyvänlaatuinen kudokseen (kuvio 1C).

(A) proteiini ilmentymistä SATB1 eri laadut eturauhasen kasvaimia ja hyvänlaatuinen kudosta analysoitiin Western-blottauksella; cytokeratin18 ilmaisu toimi latauskontrollina. (B) SATB1 mRNA: n ilmentymisen eri laatuja eturauhasen kasvaimia ja hyvänlaatuinen kudos; GAPDH mRNA ilmaisu toimi latauskontrollina. (C) SATB1 proteiinin ilmentymistä pariksi hyvänlaatuinen ja syöpä näytteitä samasta yksilöstä analysoitiin sytoplasmista ja ydinvoiman jakelu. Densitometri-analyysi jokaisen blot näkyy oikeanpuoleisessa paneelissa. Yksityiskohdat kuvataan ”materiaalit ja menetelmät -osiossa.

Seuraavaksi analysoimme SATB1 ilmentymistä immunohistokemiallisella värjäyksellä parafinoidut kudosleikkeiden koostuu 19 hyvänlaatuinen, 5 huonolaatuisen kasvain (Gleason pisteet 5- 6), 10 mediaani-luokan kasvain (Gleason pisteet 7-8) ja 5 korkea-asteen kasvaimet (Gleason pisteet 9-10) kudoksessa mikrosirulla (kuva 2). SATB1 ilmentyminen havaittiin joko tumassa tai sytoplasmassa tai molempia, mutta pääasiassa nähdään tumassa syöpäsoluja. Verrattuna hyvänlaatuinen kudokseen, progressiivinen kasvu SATB1 ilmentyminen havaittiin tumassa kanssa kasvaimen lisääntyvän. Alhainen SATB1 ilmentymistä havaittiin kohtalaisen eriytetty kasvaimia. Edustavia immunovärjäyty- kuvia SATB1 ilmaisun hyvänlaatuisia ja eri kasvain laadut on esitetty kuvassa 2A. Olemme myös arvioineet ydin- tasot SATB1 eri histologinen osien kudosnäytteiden laskemalla ytimien positiivisia SATB1 ilmentymistä suurennos X40, ja analysoitiin laskee tilastollisesti keskiarvo ja keskihajonta sekä boxplot analyysi (kuvio 2B). Erot SATB1 ydin- ilmaisun (1000 ytimet) kesken hyvänlaatuisia ja muut luokan Tuumorinäytteet tutkittiin analysoimalla varianssianalyysillä (ANOVA), jota seurasi Tukeyn pareittain useita vertailun mukaisesti. Hyvänlaatuinen näyte (n = 15) osoitti keskiarvo 56,93 värjättyä ytimet (vaihteluväli 37-79), matala-asteista kasvaimista Gleason pisteet 5-6 (n = 13) osoitti keskimäärin 90,54 värjättyä ytimet (vaihteluväli 56-115) ; kohtuullisesti erilaistunut kasvainten Gleason pisteet 7-8 (n = 12) osoitti keskimäärin 146,33 värjättyä ytimet (vaihteluväli 93-198); ja korkea-asteen kasvain Gleason pisteet 9-10 (n = 11) osoitti keskimäärin 205,27 (158-298) värjättiin ytimiä SATB1. Ydin- SATB1 ilmaisu joukossa 4 ryhmien välillä oli tilastollisesti erittäin merkitsevä (P 0,0001). Lisäksi Tukeyn pareittain monivertailu menettely osoitti, että SATB1 ilmaisun ennätyksensä kasvaimen yksilöitä oli merkittävästi suurempi kuin alhaiset pisteet yksilöt (P 0,05).

(A) parafinoidut (4,0 um) kohdat hyvänlaatuisesta ja eturauhassyövän erilaisten Gleason-pistemäärät käytettiin SATB1 ilmaisua immunohistokemiallisesti. Vahva ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä havaittiin Gleason pisteet 3 + 3, kun taas lisääntynyt ydinvoiman SATB1 värjäytyminen havaittiin korkealaatuista syöpä (Gleason pisteet 3 + 4 ja 4 + 5, tässä järjestyksessä). Suurennettu at x20 ja x40 (B) tilastollinen analyysi SATB1 ydin- läsnäolo tehtiin vertaamalla SATB1 positiiviset ydin- värjättyjen solujen eri paikoista peräisin hyvänlaatuinen, pisteet 5-6, pisteet 7-8 ja pisteet 9-10 yksilöitä. Data edustaa keskiarvoa ± SE. *

P

0,05

verrattuna

vastaava valvonta. P 0,05, Tiedot on kuvattu ”materiaalit ja menetelmät -osiossa.

SATB1 Expression in Human Eturauhassyöpä Cells

Tutkimme SATB1 ilmentymisen 8 eturauhasen epiteelisolujen solulinjoissa, mukaan lukien ei -tumorigenic viruksen transformoitu ihmisen eturauhasen epiteelisoluissa (PZ-HPV-7) ja sen syövän vastine (CA-HPV-10), 3 ensisijainen eturauhassyöpäsolulinjoissa eli. DU145, LNCaP ja PC-3 ja niiden biologisesti aggressiivinen subklooneja: DUPro, C4-2B ja PC-3M, vastaavasti. Kuten kuviossa 3A, SATB1 proteiinin tasot olivat korkeampia kaikissa eturauhassyövän solulinjoissa verrattuna ei-tuumorigeenisen PZ-HPV-7-soluissa. Ensisijainen syöpäsolulinjoja eli. CA-HPV-10, DU145, LNCaP-ja PC-3-solut ilmentävät 7.94- ja 16,82-kertainen SATB1 ilmentymisen verrattuna PZ-HPV-7-soluissa. Aggressiivinen subklooneja näytteille 17.0- ja 20,53-kertainen SATB1 ilmaisua, verrattuna ei-tuumorigeenisiä soluja. Vertasimme myös sytosolin ja ydinvoima ilmentymistä SATB1 LNCaP-ja PC-3 niiden alaklooneja C4-2B, ja PC-3M soluissa. Kuten kuviossa 3B, ilmaus SATB1 LNCaP-ja PC-3-solut olivat suhteellisen samanlaisia ​​soluliman ja ydin- jakeet. Sitä vastoin korkea SATB1 proteiinin ekspressio havaittiin ydin- osa aggressiivinen subkloonista C4-2B ja PC-3M-soluja. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä kudosnäytteet jossa merkittävästi ydinvoiman SATB1 ilmentyminen korreloi taudin aggressiivisuus.

(A) Western blottauksella varten SATB1 proteiinin ilmentymistä eri eturauhassyövän solut; CA-HPV-10, DUPro, DU145, PC-3, PC-3M, LNCaP ja C4-2B lukien muunnellut epiteelin (PZ-HPV-7), soluihin. (B) Sytoplastiset ja ydinvoiman SATB1 proteiinin ilmentyminen analysoitiin eturauhassyövän vanhempien solulinjaan ja niiden aggressiivinen alakloonien LNCaP ja C4-2B; PC-3 ja PC-3M, joka edustaa korkeampaa ydinvoiman läsnäolo SATB1 aggressiivisissa alakloonit. Histoni H4 toimi latauskontrollina. Densitometri-analyysi jokaisen blot näkyy oikeanpuoleisessa paneelissa. Yksityiskohdat kuvataan ”materiaalit ja menetelmät -osiossa.

SATB1 Knockdown Vähentää aggressiivisuus eturauhassyöpäsolujen

olivatko SATB1 tarvitaan invasiivisia fenotyyppi eturauhassyöpäsolujen. Kokeessa, PC-3M soluja, jotka ilmentävät korkeita konstitutiivisen tason SATB1 käytettiin ja lyhyen hiusneula-RNA: iden (shRNA) ja pudotus SATB1 ilmentymisen. Käytimme shRNA kahdesta eri SATB1 sekvenssit (shRNA1 ja shRNA2) ja valvonta shRNA että erittäin aggressiivinen PC-3M soluissa. Kuten kuviossa 4A on esitetty, SATB1 ilmentyminen väheni merkitsevästi 85,5% ja 77,5% sekä SATB1 shRNA1 ja shRNA2, vastaavasti, kun taas mitään merkittäviä muutoksia on SATB1 ilmentyminen havaittiin PC-3M-solut käsiteltiin kontrolli shRNA. Lisäksi SATB1 Knockdown vähensi muuttoliikettä ja hyökkäys ominaisuuksia PC-3M soluissa verrattuna emosolulinjassa ja ohjaus shRNA soluja. Siirtyminen ja invasiivisen kapasiteetti in vitro SATB1 mRNA solujen väheni 68-80%, mikä korreloi lisääntyneen ekspression E-kadheriinin ja laski MMP-9 jälkeen shRNA taintumisen (kuva 4B). Vähentäminen SATB1 tasoa PC-3M solujen vähentynyt solujen lisääntymistä, kunnostettu ankkurista riippuva kasvu ja palasi solut polarisoitunut morfologia tarkasteltiin valomikroskoopilla (kuvio 4C).

Eturauhassyöpä PC-3M-soluja transfektoitiin kanssa ja ilman DNA (mock), tai SATB1 kohdistetun shRNA vektori 1 ja 2 ja jatkui viljellään 24 tuntia. (A) SATB1, E-kadheriinin, MMP-9 ja beeta aktiini kokonaisproteiinipitoisuus ilmaisuja analysoitiin Western blottauksella. (B) SATB1 hiljentäminen PC-3M soluissa liittyi alhainen invasiivisia ja muuttoliike mahdollisia. Bars edustaa keskiarvoa ± SE kolmelle eri määrityksiä. **

P

0,001

verrattuna

ohjaus. (C) edustaja PC-3M solut kuvia näytetään ilman SATB1 shRNA transfektion. Yksityiskohdat kuvataan ”materiaalit ja menetelmät -osiossa.

SATB1 Edistää Aggressiivinen fenotyypin eturauhasen epiteelisolujen

seuraava tutki ektooppinen ilmentyminen SATB1 on riittävä indusoimaan invasiivisen aktiivisuuden virally muuttaneet ei-tuumorigeeniset ihmisen eturauhasen epiteelisolujen. Ohjaus PZ-HPV-7-solut transfektoitiin väliaikaisesti pCMV6-A6 True Clone ihmisen sisältävän plasmidi-DNA SATB1 ja SATB1 mock RNA. Transfektion SATB1 ekspressioplasmidin lisäsi ilmentymistä SATB1 in PZ-HPV-7-soluissa ja lisääntynyt maahanmuutto ja invaasion ominaisuudet

in vitro

mukaan 50-67%. SATB1 yliekspressio PZ-HPV-7-soluissa johti vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja kasvu MMP-9 tasoilla näissä soluissa (kuvio 5A-C).

PZ-HPV-7-solut transfektoitiin ja ilman DNA (mock), tai SATB1 kohdistettuja vektori 1 ja jatkui viljellään 24 tuntia. (A) SATB1, E-kadheriinin, MMP-9 ja Histone H4 proteiini ilmaisuja määritettiin soluliman ja tumafraktios- Western-blottauksella. SATB1 yli-ilmentyminen johti laskuun E-kadheriinin ilmentymisen ja ilmen- tymisen lisääntymisen MMP-9 ilmaisun. (B) yli-ilmentyminen SATB1 in PZ-HPV-7-soluissa oli yhteydessä lisääntyneeseen invasiivisia potentiaalia. Bars edustaa keskiarvoa ± SE kolmelle eri määrityksiä. **

P

0,001

verrattuna

ohjaus. (C) edustaja PZ-HPV-7 kuvaa ja ilman SATB1 yli-ilmentymisen vektori trasfection. Yksityiskohdat kuvataan ”materiaalit ja menetelmät -osiossa.

SATB1 väheneminen kasvaimen kasvu estyy in Kateenkorvattomiin Nude hiiret Vieraslajisiirteen

Testasimme onko SATB1 ehtyminen PC-3M soluissa esti kasvaimen kasvua. Näitä tutkimuksia varten kehitimme solulinjoja, jotka oli stabiilisti vaimentaa SATB1 ilmaisun käyttäen shRNA-lentiviral jakelujärjestelmä. Solut valitaan enintään 10 kohdat ja soluja edellä passage 11 käytettiin tutkimuksissa. Merkittävä väheneminen SATB1 ilmentyminen havaittiin PC-3M-KO soluissa. Knockdovvn SATB1 oli huomattavampi tumafraktios- näissä soluissa. SATB1-KO solujen näytteille kasvu kaksinkertaistamiseen aika 26,86 ± 4,89 h, verrattuna PC-3M solujen 20.04 ± 4,34 h. Olemme myös päättäneet invasiivisen kapasiteetti

in vitro

of SATB1-KO soluissa. Johdonmukainen ehtyminen SATB1 vähensi pesäkkeenmuodostusta näiden solujen pehmeässä agarissa, mikä osoittaa, että menetys SATB1 palauttaa niiden ankkurista riippuva kasvu (kuva S1 A-C).

vieressä eteni

in vivo

tutkimuksissa. Ohjaus PC-3M-solujen ja SATB1 KO solut injektoidaan paljaiden hiirien kylkiin ja muodostaa kasvaimia. Kasvaimen tilavuus kirjattiin joka toinen päivä ja koe lopetettiin 31. päivänä kasvaimen koon PC-3M kasvaimia oli suuri, kun taas hiiret injektoitiin SATB1 KO kloonin vähensivät kasvainten kasvua lasku kasvaimen paino ja tilavuus (P 0,003) (kuvio 6 A-C). Olemme myös mitata proteiinin ilmentymistä lisääntyvien solujen tuma-antigeenin (PCNA), E-kadheriinin, MMP-9 ja SATB1 näissä kasvaimissa. Kuten kuviossa 6 on esitetty D; SATB1 Knockdown johti vähentynyt selvästi proteiinin ilmentymistä PCNA että tuumoriksenograftien. Lisääntyminen E-kadheriinin ilmentymisen havaittiin SATB1-KO kasvaimissa verrattuna PC-3M kasvaimia. Nämä tulokset osoittavat, että SATB1 ilmentymistä PC-3M solut voivat olla edellytys sille, että kasvaimen kasvu ja aggressiivisuus näissä soluissa.

(A) SATB1 knockout PC-3M solujen johti pieneneminen kasvaimen tilavuuden. (B) valokuva -tuumoriksenografti PC-3M ja SATB1-KO kasvaimia. (C) Kasvaimet leikattiin, punnittiin ja mitattiin tutkimuksen päättymiseen. Kasvaimen paino väheni merkittävästi SATB1-KO kasvaimia kateenkorvattomissa nude-hiirissä. Noin 1 x 10

6 solua injektoitiin kyljissä kunkin hiiren aloittaa kohdunulkoinen eturauhasen kasvain kuten ’materiaalit ja menetelmät ”. Tuumorin koko mitattiin kaksi kertaa viikossa kaksiulotteisesti koko tutkimuksen ajan. Kasvaimen tilavuus (mm3) ja märkäpaino kasvaimista edustettuina keskiarvo 8-10 kasvainten ohjaus PC-3M ja SATB1-KO PC-3M kasvaimia.