Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aktivointi NOTCH reseptorien tukeutuu niiden solunsisäisen proteolyysi gamma-sekretaasin monimutkainen. Tämä pilkkominen vapauttaa loven solunsisäinen domeeni (NIC) sallien translokaatiota NIC kohti ytimen koota osaksi transkription alusta. On vain vähän tietoja, jotka koskevat sääntelyn vaiheet toimivat NIC sen jälkeen vapautuminen transmembraanireseptoriproteiinia jopa sen yhdessä transkription kanssa. Häirintä nämä sääntelyn vaiheet saattavat mahdollisesti vaikuttaa ydinvoiman tulos NOTCH signalointi. Tässä me hyödynnetään luotettavan mallin tutkia molekyylitasolla tapahtumista jälkeen Notch1 pilkkominen. Haiman syöpäsoluja, pulssi Notch1 aktivointi lisäsi ilmentymisen NOTCH kohdegeenien nimittäin HES1 ja c-MYC. Me paljastui, että kun sen julkaisu, Notch1 solunsisäinen domeeni, NIC1, käy läpi sarjan translaation jälkeiset modifikaatiot, jotka sisältävät fosforylaatio. Mitä mielenkiintoisinta, huomasimme, että aktivoituminen MEK /ERK-reitin edistää HES1 ilme. Estämällä gamma-sekretaasin kompleksi estää MEK /ERK-indusoidun HES1 ilmaisu viittaa lovi-riippuvaisen mekanismin. Lopuksi korkeampi NIC1 havaittiin liittyvän skription kumppaneiden [CBF1, Su (H) ja LAG-1] (CSL) ja MASTERMIND-LIKE 1 (MAML1) kun MEK /ERK aktivointi tarjoamalla potentiaalinen mekanismi, jolla MEK /ERK polku edistää ilmentymistä NOTCH kohdegeenien. Ensimmäistä kertaa, meidän data altistuu signalointireitin eli MEK /ERK-reitin, joka positiivisesti vaikuttaa KAATOLOVEN ydin- lopputulokseen.

Citation: Tremblay I, Paré E, Arsenault D, Douziech M, Boucher M-J (2013) MEK /ERK Pathway Edistää NOTCH signalointi haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (12): e85502. doi: 10,1371 /journal.pone.0085502

Editor: Irina V Lebedeva, Columbia University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 elokuu 2013; Hyväksytty: 27 marraskuu 2013; Julkaistu: 31 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Tremblay et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Kanadan Institutes for Health Research (IC1-102949 ja MOP-106456 ja MJB). MJB on oppinut päässä Fonds de Recherche Santé Québec (FRQ-S) ja jäsen FRQ-S-rahoitusta Centre de Recherche Clinique Étienne-Le Bel. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lovi reseptorit järjestää useita kehitysprosesseja lisäksi varmistaa aikuisen kudoksessa homeostaasin [1,2]. Tämä erittäin konservoitunut signalointireitin on suhteellisen yksinkertainen molekyyli arkkitehtuuri. Ligandin sitoutuessa, transmembraanisen NOTCH reseptorit (NOTCH 1-4) käyvät peräkkäinen cleavages Adam-metalloproteaaseiksi ja gamma-sekretaasin monimutkainen. Jälkimmäinen, estää gamma-sekretaasin estäjät, vapauttaa NOTCH solunsisäinen domeeni (NIC), joka on vapaa translokoituvat kohti ydin tehdä yhteistyötä DNA-sitovan proteiinin [CBF1, Su (H) ja LAG-1] (CSL) ja koaktivaattori-MASTERMIND-like-1 (MAML1) moduloida geenin ekspressiota. Paras-ominaista kohdegeenien loven reitin ovat varmasti jäseniä HAIRY PARANNUS Split (HES) perhe, itse sääntelyviranomaisten transkription [1-3]. Yksi selkeä piirre NOTCH signalointireitin on siis kaksoisrooli reseptorin eli tunnistava signaalin sekä saavuttaa vastaus. Tiedetään vain vähän sääntely vaiheet toimivat NIC sen jälkeen vapautuminen transmembraanireseptoriproteiinia sen transkription toimintaa. Kuitenkin ydin tulos NOTCH signalointia, todennäköisesti, tiukasti kontrolloitua, jotta voidaan varmistaa tarkka sääntely signaalin voimakkuus ja kesto. Lisätutkimuksia siis selvästi tarvitaan purkaa mekanismeja, joilla pilkotun reseptorin koordinaatit geeniekspressiota. Lisäksi potentiaalisten modulaattorin NOTCH signalointi pitäisi parantaa ymmärrystämme tämän näennäinen yksinkertainen reitin.

Aberrant NOTCH signalointi osoitettiin tärkeitä rooleja hematologisia syöpäsairauksia [4] ja joitakin kiinteitä kasvaimia [2], kuten haiman adenokarsinooma (PDA). Todellakin, aktivoituminen NOTCH signalointi havaitaan varhain PDA synnyssä ja jatkuu koko sairauden etenemistä [5-8]. Exome sekvensointi Ihmisen PDA kudosten tuki siten kriittisen roolin NOTCH signalointi haiman syövän synnyn [9]. Mielenkiintoista, saarto NOTCH signalointi gamma-sekretaasin estäjä esti etenemistä premalignien haiman vaurioiden PDA hiirimallissa KRAS aiheuttaman PDA [10,11]. Huomionarvoista, KRAS alavirran signalointia näyttelee kriittistä roolia haiman syövän synnyn kuin onkogeeninen mutaatio KRAS löytyy 95% PDA [9,12]. Lisäksi vähennetään NOTCH signalointi ihmisen haimasyövän solulinjoissa korreloi alentunut leviämisen hinnat, lisääntynyt apoptoosi, vähentynyt ankkurista riippumaton kasvu ja vähentynyt hyökkäys ominaisuuksia [11,13-16]. Tämä yhteys NOTCH ja RAS signalointi ei ole ainutlaatuinen haiman syöpäsoluja. Todellakin, RAS ja NOTCH signalointi osoitettiin yhteistyötä edistääkseen syövän syntymistä rintasyövän soluissa, melanooman ja leukemian [17-19]. Maailmanlaajuisesti kohdistaminen NOTCH signalointi näyttää houkuttelevan uusia terapeuttisia strategia erityisesti PDA potilaille [20]. Kuitenkin ymmärtää paremmin polku on kriittinen, jotta voidaan kehittää tehokkaita NOTCH estäjiä ja /tai antagonisteja, koska gamma-sekretaasin estäjät, vaikka se olisi hyödyllistä, ei Notch erityisiä ja umpimähkäisesti vaikuttaa kaikkiin signalointipolkujen säätelee gamma-sekretaasin kompleksi lisäksi käynnistäjinä maha myrkyllisyys [21-23].

Tässä tutkimuksessa olemme hyödyntäneet luotettava malli tutkia molekyylitasolla jälkeisistä tapahtumista pilkkomisen transmembraanisen Notch1 reseptori asti ydinvoiman lokalisoinnin pilkotun Notch1 fragmentti (NIC1). Me paljastui, että kun sen julkaisu, NIC1 läpikäy hierarkkinen fosforylaatiota haiman syöpäsoluja joka korreloi ilmentymistä NOTCH kohdegeenien kuten HES1. Mitä mielenkiintoisinta, huomasimme, että aktivoituminen MEK /ERK-reitin edistää HES1 ilmaisun NOTCH-riippuvainen mekanismeja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja NOTCH Aktivointimenetelmä

HEK293T- ja ihmisen haimasyövän solulinjoissa MIA PaCa-2 ja BxPC-3 saatiin ATCC ja viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [24].

aiheuttaa pulssin NOTCH aktivointia, lisäsimme etyleeniglykoli-bis (2-aminoetyylieetteri) –

N, N, N

’,

N’

tetraetikkahappoa (EGTA) (4 mM) 15 minuuttia eksponentiaalisesti kasvavia MIA PaCa-2-soluissa. EGTA poistettiin sitten korvaamalla median tuoreella normaali elatusaineet (DMEM).

Vasta-aineet ja reagenssit

erityinen tunnistavaa vasta-ainetta ainoastaan ​​halkaistut Notch1 (D3B8) (NIC1) saatiin Cell signalointi. Vasta-aineet dual-fosforyloitu (aktiivinen) ERK1 /2 (pERK1 /2), CSL, MAML1 ja GAPDH ostettiin Cell Signaling. HES1 vasta-aine oli peräisin Abcam. Vasta-aineen havaitsemiseksi koko ERK1 /2 oli Santa Cruz. MYC ja HA vasta saatiin Roche. Gamma-sekretaasi-inhibiittori N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyyli)] – S-fenyyliglysiini

t

butyyliesterisemikarbatsoni (DAPT) ja MEK1 /2-estäjän U0126 hankittiin Calbiochem . Kaikki muut materiaalit olivat Sigma ellei toisin mainita.

Western Blot

Kuten aiemmin julkaistu [24], solut hajotettiin Triton-puskurissa (1% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2 mM vanadaatti, 40 mM β-glyserofosfaatti, 50 mM natriumfluoridi, 10% glyserolia, 1 mM PMSF, 0,5 ng /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiinia ja 0,5 ug /ml aprotiniini), ja poistettu solujätteiden sentrifugoimalla. Sama määrä proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla (polyakryyliamidigeelielektroforeesi) ja proteiinit havaittiin immunologisesti jälkeen Sähkösiirtomenetelmiä nitroselluloosakalvoille.

Transient transfektoinneilla

Kokeet suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24-26]. Lyhyesti, HEK293T-solut transfektoitiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. Vektori, joka koodaa MYC-merkittyjä versio sytoplasmisen domeenin hiiren

Notch1

(pLIA-NIC1) saatiin Addgene (plasmidi 15131). HA-merkitty villin tyypin MEK1 (MEK1 WT) ja konstitutiivisesti aktiivinen mutantin MEK1 (MEK1 CA) koodittava cDNA ystävällisesti N. Rivard (Université de Sherbrooke, Kanada) ja aiemmin kuvattu [27]. Solut hajotettiin kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen ja valmistettiin Western blot.

Immunosaostusanalyysi, fosfataasin ja Kinaasimääritykset

Immunopresipitaatio suoritettiin olennaisesti aikaisemmin kuvatulla [25,26]. Lyhyesti, solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, lyysattiin Triton-puskurissa ja tyhjennetään Soluroskien sentrifugoimalla. Primaarista vasta-ainetta lisättiin 2 mg selvitetty solulysaateista ja inkuboitiin 3 tuntia 4 ° C: ssa sekoittaen. Endogeeninen NIC1 immunosaostettiin käyttäen anti-katkaistuun Notch1 (NIC1) vasta-aine, kun taas anti-MYC-vasta-ainetta käytettiin immunoprecipate yli-ilmennetty NIC1 (MYC-merkittyä). Proteiini-G-Sepharose (GE Healthcare) lisättiin tämän jälkeen 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa sekoittaen. Immunokompleksit pestiin kolmesti jääkylmällä Triton puskuria. Sen jälkeen immunokompleksit oli joko purettava lisäämällä 4X Laemmlin näytepuskuria (1X = 62,5 Tris-HCl pH 6,8, 2,3% SDS, 10% glyseroli, 1 mM PMSF, 0,005% bromifenolisinistä ja 5% β-merkaptoetanolia) tai käyttää fosfataasin ja kinaasimäärityksiä.

fosfataasi määrityksiä, immunokompleksit pestiin edelleen kahdesti 1X NEBbuffer Pack Protein MetalloPhosphatase (New England Biolabs Inc.) täydennettynä 1 mM MnCl

2 ja 1 mM PMSF, 0,5 ng /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiinia ja 0,5 ng /ml aprotiniinia. Sitten helmet tasan kahteen Eppendorf-putkissa. 400 yksikköä lambda proteiinifosfataasi (New England Biolabs Inc.) lisättiin yksi niistä, ja molemmat putkia inkuboitiin 30 minuutin ajan 30 ° C: ssa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 4X Laemmli-näytepuskuria.

kinaasimäärityksiä, Triton-pesty immunokompleksit pestiin edelleen kahdesti ERK1 reaktiopuskuria (25 mM Tris pH 7,5, 0,02 mM EGTA, 0,2 mM ortovanadaattia, 1 mM PMSF, 0,5 ng /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiinia ja 0,5 ng /ml aprotiniinia). Sitten helmet tasan kahteen Eppendorf-putkiin ja niitä inkuboitiin 30 minuutin ajan 30 ° C: ssa ERK1 reaktiopuskurissa, jota oli täydennetty 10 mM magnesiumasetaattia, 0,1 mM ATP: tä ja 2μCi [γ-

32P] ATP: tä, joka sisältää tai ei 0,1 ug aktiivista ERK1 ( Millipore). Reaktio pysäytettiin lisäämällä 4X Laemmli-näytepuskuria. Radioaktiivisella leimalla NIC1 erotettiin SDS-PAGE: lla ja käsitellään autoradiografialla.

Data Presentation

Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolmen erillisen kokeen. Tyypillisiä Western blotit näkyvät. Densitometristä analyysit suoritettiin käyttäen Image J 1.42 ohjelmisto.

Tulokset

Kalsium chelation aktivoi Notch1 reseptorin

ajankohtaisella tutkimuksella Notch1 aktivointia, me hyödyntää mallia mahdollistaa synkroninen aktivointi Notch1 reseptorin. Luonteen vuoksi loven reseptoreita, jotka koostuvat kahdesta alayksiköstä, joita pitää yhdessä ei-kovalenttisesti kalsiumin riippuvainen vuorovaikutus [1,2], se on aiemmin osoitettu, että kalsiumin ehtyminen dissosioituu ja aktivoi NOTCH reseptorit [28]. Strategia osoittautunut luotettava menetelmä NOTCH aktivointi [29-34]. Näin ollen, jatkoimme pulssin NOTCH aktivointi altistamalla haimasyöpä Notch1 ilmentävien solujen kalsiumkelaattoria EGTA. Kuten odotettua, 15 minuutin pulssin EGTA johti reseptorin pilkkominen [28,31], joka johtaa lisääntyneeseen ekspressioon katkaistun fragmentin NIC1 (kuvio 1A). Sen jälkeen EGTA altistuminen, väliaine poistettiin ja solut palautettiin eri ajanjaksoilta (eli 30-240 minuuttia) normaaliin viljellyt ehto, joka sisälsi kalsiumia. Lisääntynyt proteiinin ekspressiotasot NIC1 kohdegeenien HES1 ja c-MYC havaittu, vaikkakin hieman eri ajallisen profiilin (kuvio 1A). Tämä havainto on yhtäpitävä tuoreessa tutkimuksessa osoitetaan selvästi RNA profiilit NOTCH reagoiva geenien; jäsenet

E

(

SPL

) perhe geenejä (

Drosophila

homologit ihmisen

HES

perhe) on ainutlaatuinen nopeus niiden vastauksena KAATOLOVEN aktivointi [30].

. MIA PaCa-2-solut jätettiin käsittelemättä (-) tai käsiteltiin EGTA (4 mM) 15 minuuttia (+). EGTA sisältävä väliaine poistettiin ja korvattiin normaali elatusaineet (Ca

2 +) varten osoitetun ajanjaksoja. B. MIA PaCa-2-soluja esikäsiteltiin (+) tai ei (-) kanssa DAPT (25 uM) 30 minuutin ajan. Sitten solut altistettiin EGTA (4 mM) 15 minuuttia (+). EGTA sisältävä väliaine poistettiin ja korvattiin normaali elatusaineet (Ca

2 +), joka sisälsi DMSO (-) tai DAPT (25 uM) ja 90min. C. MIA PaCa-2-solut jätettiin käsittelemättä (-) tai käsiteltiin EGTA (4 mM) 15 minuuttia (+). EGTA sisältävä väliaine poistettiin ja korvattiin normaalilla elatusaineet (Ca

2+), joka sisälsi DMSO: ta tai aktinomysiini D (1 ug /ml) osoitetun ajanjaksoja. Western blot-analyysit suoritettiin käyttäen sopivia vasta-aineita.

tukiloven-riippuvainen mekanismeja mukana EGTA aiheuttama HES1 ilmentyminen, me esikäsitelty solujen gamma-sekretaasin estäjä DAPT, tunnettu estää KAATOLOVEN pilkkominen. Esikäsittely soluja DAPT esti EGTA aiheuttama NIC1, HES1 ja c-MYC-proteiinia ilmaisuja (kuvio 1 B ja tietoja ei ole esitetty), joka tukee, että EGTA vaikutukset HES1 ilmentymisen aktivaation kautta loven reseptoreihin. Myös lisäämällä transkription estäjänä aktinomysiini D: Seuraavat EGTA altistumisen ei merkittävästi vaikuttaa EGTA aiheuttama NIC1 ilmentymisen mutta estää ilmentymisen HES1 ja c-MYC (kuvio 1C ja tietoja ei ole esitetty). Yhdessä meidän tiedot ovat sopusoinnussa sen kanssa, mitä on aiemmin esitetty muissa solulinjoissa [29-34] eli tilapäinen altistuminen EGTA johtaa Notch1 aktivoituminen vapauttamalla solunsisäisen alueen NIC1, jolloin se voi translokoituvat kohti tumaan moduloida geenin transkription . Subsellulaariset vahvisti, että NIC1 pääasiallisesti tavataan ydin seuraavat EGTA altistuminen (kuva S1).

NIC1 fosforyloituu haiman syöpäsoluissa

Mielenkiintoista on, olemme havainneet eri molekyylipainon muodot NIC1 jälkeen pulssin Notch1 aktivaation EGTA, jossa on lähinnä suuren molekyylipainon omaavat muodot vähitellen havaittu ajan mittaan (kuvio 1A ). Huomionarvoista, 240 minuutin kuluttua EGTA altistuksen NIC1 ilme palasi tasolle verrattavissa käsittelemättömien solujen viittaa nopeasta kierrosta NIC1 jälkeen sen transkription toimintaa. Niinpä HES1, lyhytaikainen proteiini [3], oli vain ekspressoitiin lyhytaikaisesti, korkeimmillaan 90-120 minuutin kuluttua EGTA altistuksen ja palauttamalla noin verrokkitasojen jälkeen 240 minuuttia.

selittää eri molekyylipainon profiilia NIC1, testasimme ovatko NIC1 läpikäy translaation jälkeisiä modifikaatioita sen jälkeen vapautumista transmembraanireseptoriproteiinia. Tarkemmin, olemme analysoineet fosforylaation tasoja NIC1 haiman syöpäsoluissa nimittäin MIA PaCa-2 ja BxPC-3. Nämä solulinjat näyttää pohjapinta aktivoituminen Notch1 reseptorin merkitty ilmentymistä katkaistun Notch1 fragmentti NIC1 (kuvio 2). Huomionarvoista, eksponentiaalisesti kasvava MIA PaCa-2-soluissa näyttää alhaisempi Notch1 aktivoinnin verrattuna BxPC-3. Fosfataasi analyysit paljastivat, että NIC1 fosforyloituu eksponentiaalisesti kasvavissa MIA PaCa-2 ja BxPC-3-soluja (kuvio 2). Lisäksi seuraava EGTA aiheuttama Notch1 aktivaation MIA PaCa-2, NIC1 on pääasiassa havaittu fosforyloidun tilassa (kuvio 2).

NIC1 immunosaostettiin (IP NIC1) alkaen yhteensä lysaatit eksponentiaalisesti kasvavia MIA PaCa-2 (MIA), MIA PaCa-2-solut käsiteltiin EGTA (4 mM) 15 minuuttia ja sitten palasivat normaaliin elatusaineet 90min tai eksponentiaalisesti kasvavia BxPC-3 (Bx). Sen jälkeen NIC1 immunosaostus, fosfataasi määritykset suoritettiin (+) käyttäen lambda fosfataasia (λ fosfataasi). IP NIC1 ei inkuboitu lambda fosfataasin ilmaistaan ​​pNIC1. Edustava Western blot käyttämällä vasta-ainetta NIC1 näkyy.

Pyrkimyksissämme tunnistamaan mahdolliset kinaasien moduloivien NIC1 fosforylaatio, jatkoimme lyhytaikaisissa transfektioissa sisään HEK293T soluissa. Mielenkiintoista on, havaitsimme suuremman molekyylipainon muodot eksogeenisen NIC1, kun solut kotransfektoitiin konstitutiivinen aktiivisen muodon MEK1 (MEK1 CA), jotka johtavat ERK1 /2 aktivaation (kuvio 3A). Fosfataasi määrityksiä esitti näyttöä siitä NIC1 fosforyloituu kun ilmaistu HEK293T soluissa (kuvio 3B vasen, NIC1 + MEK1 WT). Kuitenkin, NIC1 fosforylaation tasot olivat huomattavasti lisääntynyt, kun MEK /ERK-reitin aktivoitiin läsnä MEK1 CA (kuvio 3B oikealla). Vastaavia NIC1 fosforylaatio todetaan havaittiin, kun solut kotransfektoitiin onkogeenisen RAS (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että MEK /ERK-reitin voi vaikuttaa fosforylaation tasoja NIC1. ERK1 /2 ovat hyvin tunnettuja fosforyloivan useita soluliman ja tumaproteiinit, kuten transkription säätävät [35,36]. Sen vuoksi testasimme, oliko NIC1 voisi olla suora kohde ERK1 /2. Mielenkiintoista, aktiivinen ERK1 kykeni fosfory- NIC1 in

in vitro

kinaasimäärityk- (kuvio 3C). Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että NIC1 fosforyloituu haiman syöpäsoluja. Mukaan havaintomme, että NIC1 fosforylaatio todetaan kasvanut ajan myötä seuraavien EGTA altistuksen taas laskussa ilme, se on houkuttelevaa spekuloida, että NIC1 saattavat läpikäydä hierarkkinen fosforylaatiotapahtumien sen jälkeen vapautuminen transmembraanireseptoriproteiinia joka koordinoi NIC1 ilme sekä NIC1-riippuvaisen transkription aktivaatio ja vaimennus. Lisäksi seurauksena meidän tuloksia, mahdollinen osallistuminen MEK /ERK-reitin säätelyssä NIC1 toiminta ansaitsee enemmän huomiota.

. HEK293T transfektoitiin pLIA-NIC1 (MYC-merkittyä) rakentaa yhdessä cDNA koodaa villityypin (WT) tai konstitutiivista aktiivista (CA) versio MEK1 (HA-merkitty). Solut hajotettiin 24 transfektion jälkeen. NIC1 ilmentyminen analysoitiin Western blot käyttäen anti-MYC-vasta-ainetta. Ilmentymistason eksogeenisen MEK1 arvioitiin western blot käyttäen anti-HA-vasta-aine. Dual-fosforyloidun ja yhteensä ERK1 /2 ekspressiotasoja arvioitiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita. MEK1 CA aiheuttama suurempi molekyylipaino muodossa NIC1 on merkitty tähdellä *. B. HEK293T- transfektoitiin pLIA-NIC1 rakentaa yhdessä koodaavan cDNA MEK1 WT tai MEK1 CA. Solut hajotettiin ja NIC1 immunosaostettiin (IP NIC1) käyttäen anti-MYC-vasta-ainetta. Fosfataasi määritykset suoritettiin sitten (+) käyttäen lambda fosfataasia (λ fosfataasi). Fosforyloidun muodot NIC1 on merkitty pNIC1. MEK1 CA aiheuttama suurempi molekyylipaino muodossa NIC1 on merkitty tähdellä *. NIC1 ilmentyminen analysoitiin Western blot käyttäen anti-MYC-vasta-ainetta. C. NIC1 immunosaostettiin (IP NIC1) peräisin pLIA-NIC1 transfektoitu HEK293T- käyttäen anti-MYC vasta-aineella. Kinaasimääritykset suoritettiin sitten, kuten on kuvattu kokeellisissa menettelyissä. Autoradiografiatulokset kuvaava fosforyloitu NIC1 (pNIC1) näytetään. Seuraavat Sähkösiirtomenetelmiä geelin määrä NIC1 immunosaostettiin varmistettiin western blot (WB) käyttäen anti-MYC-vasta-aine.

aktivointi MEK /ERK-reitin edistää KAATOLOVEN signalointi

Me seuraavaksi osoitettu onko MEK /ERK-reitin voi vaikuttaa NOTCH signalointi erityisesti meidän haimasyövän solumallin MIA PaCa-2, joka näyttää pohjapinta Notch1 aktivointi /NIC1 ilmaus mutta indusoituvan Notch1 aktivointi (katso kuvio 1A). Huomionarvoista, kuten useimmat haimasyöpäsoluissa, MIA PaCa-2-solut satama KRAS mutaatio johtaa pohjapinta ERK1 /2 aktivointi, joista jälkimmäinen on välttämätön MIA PaCa-2 solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [37]. Voimakkaasti ja kestävästi stimuloivat MEK /ERK-reitin, käsittelimme MIA PaCa-2-solujen forboli 12-myristaatti 13-asetaattia (PMA). Kuten kuvassa 4A on esitetty, lisäämällä PMA nopeasti johti jatkuvaan ERK1 /2 aktivointi, joka korreloi lisääntyneen HES1 ja c-MYC-proteiinia ekspressiotasot. Sen varmistamiseksi, että vaikutus oli NOTCH-riippuvainen, me esikäsitelty solut DAPT pudota NIC1 ilmentymistä (kuvio 4A) ja todennäköisesti estää katkaisun muiden NOTCH reseptoreihin. Esikäsittely DAPT merkitsevästi esti PMA-indusoidun HES1 ilmaisu, kun taas vaikutus c-MYC oli osittainen (kuvio 4A). Tämä saattaa johtua siitä, että vaikka c-MYC on tunnistettu Notch1 suoraan kohdegeenin [38,39], c-MYC tiedetään myös suoraan säätelee ERK1 /2 [35,36]. Sen vuoksi voisi olla mahdollista, että C-MYC on säätelevät sekä NOTCH- ja ERK-riippuvainen mekanismeja mallissamme. Huomionarvoista, meidän malli, DAPT kumosi kokonaan PMA-indusoidun HES1 ilmaisu viittaa siihen, että PMA pitkälti edistää HES1 itseilmaisu loven reseptorien vastakkaisia ​​aiempien tutkimusten kanssa, mikä viittaa MEK riippuvan NOTCH riippumaton sääntely HES1 [40,41].

. MIA PaCa-2-soluja esikäsiteltiin (+) tai ei (-), jossa DAPT (25 uM) yön yli. Sitten soluja käsiteltiin PMA: lla (100 nM) ja osoitetun ajanjaksoja. B. MIA PaCa-2-solut jätettiin käsittelemättä (-) tai käsiteltiin EGTA (4 mM) 15 minuuttia (+). EGTA sisältävä väliaine poistettiin ja korvattiin normaali elatusaineet (Ca

2 +), joka sisälsi DMSO, PMA (100 nM) tai PMA + U0126 (10gM) varten osoitetun ajanjaksoja. A. ja B. Solut hajotettiin ja Western blot analyysit suoritettiin käyttäen mainituilla vasta-aineilla. C. Alkaen samanlaisia ​​kokeita esitetään B., graafinen esitys, joka kuvaa suhteellista HES1 ilmaisu, kullekin ajanjaksolle, käsitellyissä soluissa (PMA, PMA + U0126) verrattuna kontrollisoluihin (DMSO-käsitelty) on esitetty. D. alkaen samanlaisia ​​kokeita esitetään B., graafinen esitys, joka kuvaa suhteellista c-MYC ilmaisu, kullekin ajanjaksolle, käsitellyissä soluissa (PMA, PMA + U0126) verrattuna kontrollisoluihin (DMSO-käsitelty) on esitetty. C. ja D. Tulokset ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,0005 verrattuna vastaavaan ajanjakson DMSO-käsitellyissä soluissa. # P 0,05, ## p 0,005, ### p 0,0005 verrattuna vastaavaan ajanjakson PMA-käsitellyissä soluissa.

myös tutkia vaikutuksen ERK1 /2 aktivoinnin jälkeen pulssin Notch1 aktivointia, lisäsimme PMA osaksi median pesun jälkeen pois EGTA. Lisäksi PMA edisti EGTA aiheuttama HES1 ja c-MYC ilmaisu, vaikutus, joka on kumottu läsnäolo MEK inhibiittorin U0126 (kuvio 4B-D). On syytä mainita, että me merkitty lisääntyminen ERK1 /2 fosforylaation että vähentynyt vaihdon jälkeen keskipitkän EGTA-käsiteltyjen solujen normaalin elatusaineet (ks kontrolli (DMSO-käsitelty) soluista, kuvio 4B). Tämä lievä nousu saattaa merkitä rajoitus menetelmä (joka edellyttää poistaminen EGTA) ja saattaa vain olla seurauksena korvata EGTA sisältävä media tuoreella kasvatusväliaineita ERK1 /2 fosforylaatio on melko herkkä keskipitkällä muutosta. Me jätetty rooli NOTCH signaloinnin moduloinnissa ERK1 /2 toimintaan, koska i) DAPT käsittely esti EGTA aiheuttama NIC1 ilmaisu (kuvio 1 B) vaikuttamatta ERK1 /2 fosforylaatiota (tuloksia ei esitetty) ja ii) esto NOTCH opastinjärjestelmillä DAPT hoito ei merkittävästi moduloivat ERK1 /2-fosforylaation (kuvio 4A). Yhdessä tuloksemme osoittavat myönteiseen sääntelyä NOTCH riippuvan HES1 ilmentymisen MEK /ERK-reitin.

Olemme perustettu että EGTA aiheuttama HES1 ilme tarvitaan transkription tapahtumia (kuvio 1 C), joka tukee sellaista mallia, että vapautuneen NIC1 translokoituu kohti ydin vaikuttaa (

HES1

) geenien ilmentyminen. Luontainen tähän, yhdistys NIC1 sen DNA: ta sitovan kumppanin CSL ja koaktivaattoria MAML1, minkä seurauksena saadaan toiminnallinen transkriptionaalinen yksikkö, on varmasti edellytys geeni modulaatio [1,2]. Siksi alkaa rajaamista mekanismeja, joiden osuus myönteisiä vaikutuksia MEK /ERK-reitin päälle NOTCH signalointi, tutkimme onko aktivointia MEK /ERK-reitin voisi edistää yhdistyksen NIC1 joko CSL tai MAML1. Toisin kuin NIC1, CSL ja MAML1 ilmentymistasot ei ole moduloitu, kun EGTA hoitoa (kuvio 5A). Niinpä me immu- CSL ja MAML1 ja testattu NIC1 -alueella. Sen jälkeen kun pulssi Notch1 aktivointi, korkeampi NIC1 havaittiin liittyvän joko CSL tai MAML1 (kuvio 5B) edelleen vahvistaen mallia, jossa, kun EGTA-välitteisen Notch1 aktivoinnin vapautuu NIC1 kokoaa aktiiviseksi transkriptionaalisen kompleksin moduloida geenin ekspressiota. Mielenkiintoista, verrattuna DMSO-käsiteltyihin soluihin, hoitoa PMA edistää lähes 2-kertainen yhdistys NIC1 joko CSL (kuvio 5C) tai MAML1 (kuvio 5D). Lisääminen U0126 esti sekä PMA-indusoidun NIC1 /CSL ja NIC1 /MAML1 yhdistys (kuvio 5C-D) tukemaan MEK-riippuvainen mekanismeja.

MIA PaCa-2-solut jätettiin käsittelemättä (-) tai käsiteltiin EGTA (4 mM) 15 minuuttia (+). EGTA sisältävä väliaine poistettiin ja korvattiin normaali elatusaineet (Ca

2 +), joka sisälsi DMSO, PMA (100 nM) tai PMA + U0126 (10 uM) ja 90min. A. NIC1, MAML1 ja CSL ekspressiotasot arvioitiin western blot käyttäen sopivia vasta-aineita. B. CSL ja MAML1 immunosaostettiin (IP) ennen western blot-analyysit käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. C. CSL immunosaostettiin (IP) ja sen jälkeen Western blot analyysit NIC1 (vasemmalla). Graafinen esitys, joka kuvaa suhteellista määrää NIC1 yhteistyössä immunosaostettiin CSL (NIC1 /CSL) näytetään (oikealla). D. MAML1 immunosaostettiin (IP) ja sen jälkeen Western blot analyysit NIC1 (vasemmalla). Graafinen esitys, joka kuvaa suhteellista määrää NIC1 yhteistyössä immunosaostettiin MAML1 (NIC1 /MAML1) näytetään (oikealla). C. ja D. Tulokset ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 verrattuna DMSO-käsiteltyihin soluihin.

Keskustelu

suostumuksella aiemmissa tutkimuksissa [29-34], tuloksemme osoittavat, että ohimenevää altistuminen EGTA on hyödyllinen ja luotettava malli ajankohtaisella tutkimuksella Notch1 aktivaation NOTCH1- ilmentäviä soluja. Itse asiassa se antoi meille mahdollisuuden löytää että vapautuessaan transmembraanireseptoriproteiinia, NIC1 läpikäy sarjan translaation jälkeiset modifikaatiot, jotka sisältävät fosforylaatio. Se tukee myös aiemmin vakiintunut käsite jolloin NIC1 on lyhytikäinen proteiini [1], sisällä 4h ajassa, ilmaus vasta pilkkoa NIC1 lähes kokonaan hävinnyt. Yhdessä lisääntynyt NIC1 ilme, translaation jälkeiset modifikaatiot ja liikevaihto, pystyimme, ensimmäistä kertaa, havaita lisääntynyt endogeenistä NOTCH tavoitteiden viittaa siihen, että EGTA aiheuttama NIC1 ilmaisu kääntyy toiminnallinen transkriptionaalinen yksikkö haiman syöpäsoluja. Tärkein uutuus Tutkimuksemme on osoitus siitä, että MEK /ERK-reitin edistää ilmaus loven tavoite HES1. Vaikka lisätutkimuksia ehdottomasti tarvitaan onko MEK /ERK aktivoinnin vaikutukset kaikki tai vain osan NOTCH tavoitteet, meidän data osoittaa, että MEK /ERK-reitin vahvistaa HES1 ilmaisu todennäköisimmin mekanismien kautta riippuvainen NOTCH reseptoreihin, koska pre- solujen käsittelyä, jossa on gamma-sekretaasin estäjä (DAPT) esti PMA-indusoidun HES1 ilmentymistä. Aikaisemmat tutkimukset myös raportoitu vaikutus RAS reitin päälle NOTCH signalointi [18,42]. Nämä tutkimukset, pääosin tehty alle pitkittynyt RAS aktivointia tai MEK esto, ehdotti, että RAS signalointi edistää Notch1 reseptorin pilkkominen /aktivoitumisen. Meidän havainnot ovat innovatiivisia, sillä ne paljastavat, että MEK /ERK-signalointireitin on tehokasta, minuutin kuluttua Notch1 pilkkominen, vaikuttaa suoraan NIC1 transkription toiminto. Yksi hypoteesi johtuvat tuloksemme on, että MEK /ERK-reitin edistää kokoonpanoa toiminnallisen NIC1 transkriptionaalinen yksikkö CSL ja MAML1. Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan rajata hienomekanismin jolla MEK /ERK-reitin edistää KAATOLOVEN signalointi.

Mielenkiintoista, se oli aiemmin ehdottanut, että translaation jälkeiset modifikaatiot, erityisesti fosforylaatiota, on lähes varmasti moduloi NIC1 riippuva transkriptio [1]. Aluksi

Drosophila

[43], mutta myöhemmin nisäkkäiden, hyperfosforylaatiota solunsisäisen domeenin Notch1 ja NOTCH2 havaittu vapauttamisen jälkeen näitä transmembraani- reseptori [44,45]. Huomionarvoista, hyperfosforylaatiota NIC1 liittyi i) NIC1 tumakertymään [45-48], ii) NIC1 vuorovaikutus CSL [44], iii) kasvoi CSL-riippuvaisen transkription [44,47,48] ja iv) NIC1 muuttamassa kapasiteetti [ ,,,0],48]. Nämä tulokset viittaavat siihen, NIC1 fosforylaatio voisi edistää transkription potentiaali NIC1 /CSL monimutkainen. Tähän mennessä, enimmäkseen kinaasit, että säädellä negatiivisesti NIC1 toiminto on tunnistettu: AKT on osoitettu edistävän NIC1 sytoplasman lokalisointi [49], fosforylaatio NIC1, jonka DYRK1A heikennetty KAATOLOVEN signalointi [50], ja NLK riippuvainen NIC1 fosforylaatiota vähensi muodostumista NIC1 /CSL kompleksin [51]. Capobianco ryhmä äskettäin esittänyt todisteita siitä, että ennen tai sen aikana NIC1 /CSL /MAML1 monimutkainen yhdistys, NIC1 fosforyloituu CK2 sallimalla saatavuutta myöhempään fosforylaatiokohdan [52]. Molemmat fosforylaatiotapahtumien ilmestyi tarvitaan dissosiaatio kompleksi DNA. Lisäksi CycC /CDK8 kompleksin ajatellaan olevan tärkeä rooli häiritsemään NIC1 /CSL /MAML1 kompleksin fosforyloimalla NIC1 sen C-päätteen PEST domain seurannut FBW7 välittämää NIC1 ubikinaation ja hajoaminen [53]. Kuitenkin tähän mennessä mitään positiivista NIC1 sääntelyviranomaisten (kinaasien) tunnistettiin ja lähes kaikki fosforylaatio sivustoja NIC1 jäävät vielä. Tuloksemme nyt tarjota perustan tutkia myönteinen vaikutus MEK /ERK-reitin päälle NOTCH signalointi erityisesti yhteydessä haiman syöpäsoluja. Huomionarvoista, se oli aiemmin osoittaneet, että pakko ilmentymistä NIC1 hiiren haiman epiteelissä edistää muodostumista premalignien haiman leesioiden vireille onkogeeninen

KRAS

[54] viittaa siihen, että KRAS ja KAATOLOVEN signalointi yhteistyössä edistää haiman karsinogeneesiin.