Krooninen sairaus

tiivistelmä

masennuslääke fluoksetiinin on keskusteltu, koska sen mahdolliset vaikutukset syöpäriskiä. Sen todettiin kehittymisen estämiseksi karsinogeeni aiheuttaman preneoplastiset leesiot paksusuolen kudoksessa, mutta vaikutusmekanismit eivät ole hyvin ymmärretty. Siksi tutkimme antiproliferatiivisia vaikutuksia, ja sitä käytetään HT29 koolontuumorisolut

in vitro

sekä C57BL /6-hiiret altistettiin sisäisen peräsuolen hoidon karsinogeeni N-metyyli-N’-nitro-N -nitrosoguanidine (MNNG) malleina. Fluoksetiini lisäsi prosenttiosuutta HT29 G

0 /G

1 vaiheen solusyklin, ja ilmaisu p27-proteiinin. Tämä ei liittynyt induktio apoptoosin, reaktiivisen hapen tai DNA-vaurioita.

In vivo

, fluoksetiini vähensi kehitystä MNNG aiheuttaman dysplasia ja verisuonten muodostumista liittyviä dysplasia paksusuolen kudosta, joka analysoitiin histopatologinen tekniikoilla. Anti-proliferatiivista potentiaalia fluoksetiinin havaittiin epiteeli- ja strooman alueilla. Sen mukana väheneminen VEGF ilmentymisen ja solujen lukumäärän angiogeeninen potentiaali, kuten CD133, CD34, ja CD31-positiivisten solujen klustereita. Yhdessä meidän tulokset viittaavat siihen Fluoksetiinihoitoon tavoitteet vaiheet varhaisen paksusuolen syövän synnyn. Tämä vahvistaa sen suojaava potentiaali, selittää ainakin osittain alemman paksusuolen syövän riskiä alle depressiolääkkeitä.

Citation: Kannen V, Hintzsche H, Zanette DL, Silva WA Jr, Garcia SB, Waaga-Gasser AM, et al . (2012) Antiproliferative fluoksetiinin vaikutuksista koolonkarsinoomasoluissa ja on Colonic karsinogeeni hiirimallissa. PLoS ONE 7 (11): e50043. doi: 10,1371 /journal.pone.0050043

Toimittaja: Nikos K. Karamanoun, University of Patras, Kreikka

vastaanotettu: toukokuu 30, 2012; Hyväksytty: 15 lokakuu 2012; Julkaistu: 27 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Kannen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat paljastaa saatuaan seuraavat taloudellista tukea tutkimusta tämän artikkelin: DAAD (Deutscher Akademischer Austausch Dienst), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nivel Superior), CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), ja FAPESP (Fundação de amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syöpä on yksi tärkeimmistä ihmisen maligniteettien maailmanlaajuisesti ja paljon vaivaa on sovellettu ymmärtää prosessin paksusuolen syövän synnyn, sekä roolia mahdollisten hoitojen ja co-terapeuttinen aineita sitä vastaan ​​[1] – [3]. Yhä useammat todisteet osoittavat, että käyttö fluoksetiinin (FLX), masennuslääke, joka kuuluu selektiivisten serotoniinin takaisinoton estäjien (SSRI), voi liittyä pienempi paksusuolen syövän riskiä [4] – [6]. Kuitenkin kiistanalainen Lausunnot on julkaistu [7] – [13] ja tunnistaminen mekanismien toiminnan FLX paksusuolen soluissa auttaisi selventämään tämän kiistaa.

Olemme äskettäin havainneet, että FLX vähensi määrä 1,2 dimetyylihydratsiinin (DMH) aiheuttama preneoplastinen paksusuolen leesioita, joita kutsutaan poikkeavaan crypt pesäkkeitä (ACF) ja aiheutti varhainen anti-VEGF toimintaa stroomasolut, vähentämällä pienten suonten numeroita pericryptal paksusuolen stroman (PCCS) [5]. Kasvain strooman muodostaa 60-90% paksusuolen kasvain massa [14], ja PCCS ympäröivä umpipohjukan pohja on raportoitu käynnistämään tiettyjä vaiheita paksusuolen kasvainten kehittymiseen, kuten lisääntynyt leviäminen, pienten suonten muodostuminen, VEGF-synteesi, sääntely itse- uusiminen ja erilaistumista suoliston solujen [15] – [18]. ACFs pidetään kokeellinen malli opiskelun alkuvaiheessa paksusuolen syövän muodostumisen, lähinnä niiden hyvin samankaltaisia ​​kanssa syövän kehittymistä jyrsijöissä ja ihmisissä [17], [19].

(A ja B) ROS tuotanto analysoitiin virtaussytometrialla, sen jälkeen, kun altistus eri FLX pitoisuuksilla 30 min (A), ja 4 h (B; * P 0,05

vs

DMSO). Vetyperoksidia (H

2O

2) käytettiin positiivisena kontrollina ja molemmissa tapauksissa sovelletaan 30 min; mielivaltaisina yksikköinä (A.U.). (C ja D) O

2

– tuotanto havaitaan DHE värjäys 30 min (C; P 0,05

vs

DMSO), ja 4 h (D; P 0,05). (E ja F) DNA-vaurioita analysoitiin comet, altistumisen jälkeen eri FLX pitoisuuksien 30 minuutin (E), ja 4 h,% DNA sisällön hännän edustavat DNA-vaurioita (F * P 0,05

vs

DMSO). Vetyperoksidia (H

2O

2) käytettiin positiivisena kontrollina ja molemmissa tapauksissa sovelletaan 30 min. (G) Elinkelpoisuus ja apoptoosimäärityksessä (anneksiini V /PI) suoritettiin virtaussytometrialla, altistumisen jälkeen eri FLX pitoisuuksina 24 tuntia (

* P 0,05

vs

DMSO). (H) jakelu solujen solusyklin vaiheisiin analysoitiin virtaussytometrialla. Koska on prosenttiosuus HT29 G

0 /G

1, S, ja G2 /M vaiheiden kanssa ja ilman FLX hoitoa 24 tuntia (** P 0,01 vs DMSO). Kaikki luvut osoittavat tulokset vähintään 4 itsenäisen kokeen.

Vaikka FLX tiedetään vähentävän paksusuolen solujen lisääntymistä

in vitro

[20], ja

in vivo

mallit [5], [21], mekanismi sen antiproliferatiivinen vaikutus ei ole hyvin ymmärretty. Täällä, tutkimme antiproliferatiivisia vaikutuksia FLX hoidon olla rooli kemopreventatiivisesti dysplasian paksusuolen kudoksessa ja mitä mukana mekanismit ovat. Tätä varten käytimme ihmisen koolonisyöpäsolulinja (HT29) ja

in vitro

kokeita ja

in vivo

malli opiskeluun karsinogeeni aiheuttama preneoplastista vaurioita.

in vivo

malli koostui C57BL /6 hiirillä sisäisen peräsuolen hoidon alkyloivan perimän vaurioita ja karsinogeeni N-metyyli-N’-nitro-N-nitrosoguanidiini (MNNG). MNNG on raportoitu aiheuttavan ACFs [22] on suurempi kuin 1,2 dimetyylihydratsiinin (DMH), karsinogeenistä aiemmin käytetty paksusuolisyövän malleissa ryhmämme [5], [17], [23].

Tuloksemme osoittavat, että solujen lisääntymistä vastustavat vaikutukset FLX-käsittely eivät indusoi voimistunutta apoptoosia tai reaktiivisten hapen lajien (ROS) tai DNA-vaurio. Sen sijaan FLX vähentää ACF numerot, todennäköisesti ohjaamalla aktiivisuuden stroomasoluissa, jotka liittyvät pienten suonten kehitystä.

suhteellinen ekspressio p27-proteiinin HT29, kuten määritettiin Western blot -analyysillä (P 0,05

vs.

DMSO). Näyte blot ja keskimääräinen tulos 4 itsenäisen kokeen näkyvät.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

fluoksetiini, tempol, vetyperoksidia (H

2O

2), dimetyylisulfoksidi (DMSO), bisbenzimide, DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli), ja MNNG ostettiin Sigma-Aldrich (Louis, MO, USA). DMEM (4,5 g /l glukoosia) keskipitkän hankittiin PAA Laboratories GmbH (Itävalta). Dihydroethidium (dhe) hankittiin Merckiltä Millipore (Saksa). Dikloorifluoreskiiniliuoksella (DCFH-DA) ja anneksiini V apoptoosin havaitseminen kit (FITC), ja Cytofix /Cytoperm kit hankittiin Becton Dickinson (Saksa).

Cell Culture

HT29 ihmisen paksusuolen syöpäsolu linja saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja kasvatettiin standardeissa olosuhteissa, ja niitä kasvatettiin DMEM: ssä (4,5 g /l glukoosia) väliaineessa. Se oli täydennetty 10% FBS: ää, 1% L-glutamiinia, penisilliiniä (100 yksikköä /ml) ja 0,1 mg /ml streptomysiiniä. Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (Sarstedt Inc., USA), käyttäen aluksi pitoisuutena 5 x 10

5 solua /kuoppa, ja ne jätetään hoitamatta 20-24 tuntia. Sitten solut altistettiin 1, 10 tai 100 uM FLX 30 minuuttia, 4 tai 24 tuntia. H

2O

2 (100 tai 200 uM) toimi kontrollina oksidatiivisen vaikutukset ja DNA-vaurioita. Solut altistettiin H

2O

2 30 minuuttia.

virtaussytometria hapettumisstressiä, Elinkelpoisuus ja apoptoosi, ja Cell-cycle Analysis

Analyysi reaktiivisia happiradikaaleja ( ROS) tuotanto toteutettiin mukaisesti meidän standardin menetelmällä virtaussytometrialla ja argonlaserviritys [24]. Lyhyesti, solut leimattiin 10 minuutin ajan DCFH-DA, ja sitten analysoitiin FL1 kaistanpäästösuodattimen (Becton Dickinson [BD] LSR I ™, Saksa). Superoksidi havaittiin värjäyksen jälkeen solut 30 minuuttia DHE (10 uM) Alustassa ilman seerumia. Sadonkorjuun jälkeen solut analysoitiin FL2 kaistanpäästösuodatin [25]. Elinkelpoisuuden ja apoptoosin Analyysi suoritettiin anneksiini V /propidiumjodidilla (PI) sarjasta ja analysoitiin FL1 ja FL2 kaistanpäästösuodattimia, mukaan valmistajan ohjeiden. Solusyklin analyysi, HT29-soluja inkuboitiin FLX (1 uM ja 10 uM) tai liuotinta DMSO: ta (1%). Sen jälkeen solut tehtiin läpäiseviksi (Cytofix /Cytoperm kit) ja värjättiin bisbenzimide 30 min. Kokeet analysoitiin ultravioletti (UV) laservirityksellä ja FL5 kaistanpäästösuodatin. 20000 solut analysoitiin näytettä kohti ja arvioidaan BD CellQuest- Pro ™ ohjelmistoa. Solusyklivaiheista analysoitiin ModFit LT ™ -ohjelmiston (Verity Software House, USA). Ainakin neljä itsenäistä koetta suoritettiin.

(A) edustaja histologinen kuva pahasti dysplastisia alue (MNNG altistuneet hiiri). Kuva upotettavat (suurennettiin boxed alue) esittää ominaista vakava dysplastic ominaisuuksia; esim osittainen menetys solun polariteetin yksikään pikari soluja, läsnäolo Paneth solujen (sininen nuoli), ja mitoosin (valkoiset nuolet). Kuvia otettiin 200x suurennos, asteikko palkit edustavat 20 pm. Suurentavan kuvat otettiin 1000x suurennos. (B) edustaja kuva kohtalainen dysplasia (MNNG + FLX käsitelty hiiri). Insertti osoittaa pakatun umpipohjukan luminaaliselle aukko, pitkänomainen ytimet (punainen nuoli), tungosta ja pseudostrafied alue (leikattu musta viiva), mutta yleisesti säilynyt solun polariteetti, ja pienempi määrä globet soluja (keltainen nuoli). Suurennoksilla on kuvattu edellä. (C) kvantifiointi dysplastic vaurioita. Poikkeava crypt pesäkkeitä indeksi (ACF-i) esitetään useita dysplastisia vaurioiden

per

um

2 (* P 0,05; MNNG ilman FLX,

n

= 5; FLX + MNNG

n =

4). (D) Poikkeava krypta indeksi (AC-i) esitetään useita dysplastisia yhden kryptissa

per

um

2 (* P 0,05; MNNG ilman FLX,

n

= 5; FLX + MNNG,

n =

4). (E) edustaja kuva dysplastisia alueen (leikattu musta viiva), ja sen suhteellinen vascularization leviäminen. Insertti (suurennettiin boxed alue) esittää kahta mikrosuonten kohti sisemmän alueen dysplastic alueella. Keltainen nuoli on pienten suonten seinään, ja punainen nuoli punasolujen sisällä pienten suonten seinämiin. Kuvat otettiin 400x suurennuksella, ja tarkemmin on kuvattu edellä. (F) Suhteellinen dysplastic verisuonten muodostumista, näkyy määrä mikrosuonten

per

vaurio (* P 0,05; MNNG ilman FLX,

n

= 5; FLX + MNNG,

n =

4).

(A) Lisääntyvät solut havaittiin värjäämällä anti-Ki67 vasta-aine (MNNG-käsitelty hiiri). (1) punainen nuolet osoittavat tummanruskeaksi positiivisten solujen vaeltavat ylöspäin epiteelin proliferatiivisen vyöhyke. (2) stroomakasvaimet positiivisia soluja esitetty punainen nuoli lähellä umpipohjukan-pohjaan. Kuvat on otettu, kuten edellä on kuvattu. (B) Lisääntyvät solut (anti-Ki67-vasta, punaiset nuolet) on MNNG + FLX saaneista hiiri näkyvät umpipohjukan alhaalla. Kuvat on otettu, kuten edellä on kuvattu. (C) leviämisen epiteelisolujen alueilla esitetty merkinnöin anti-Ki67 vasta-aine (*** P 0,001; MNNG ilman FLX,

n

= 5; FLX + MNNG,

n =

4 ). (D) leviämisen in PCCS alueilla merkinnöin anti-Ki67 vasta-aine (*** P 0,001; MNNG ilman FLX,

n

= 5; FLX + MNNG,

n =

4) . (E) leviämisen epiteelisolujen alueilla esitetty merkinnöin anti-PCNA-vasta (** P 0,01; MNNG ilman FLX,

n

= 4; FLX + MNNG,

n =

4) . (F) leviämisen in PCCS alueilla esitetty merkinnöin anti-PCNA-vasta (** P 0,01; MNNG ilman FLX,

n

= 4; FLX + MNNG,

n =

4) . (G) Expression of c- Myc in epiteeliin paksusuolikudos (*** P 0,001; MNNG ilman FLX,

n

= 3; FLX + MNNG,

n =

4). (H) Expression of c- Myc in PCCS alueilla paksusuolikudos (*** P 0,001; MNNG ilman FLX,

n

= 3; FLX + MNNG,

n =

4) .

Comet määritys

mukaan edellisessä kuvaus [24], alkalinen versio komeetta määritys suoritettiin. Analyysi käsitti 100 satunnaisesti valitun solua (50 toistoa kohti dia) kullekin näytteelle, jotka analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Labophot 2, Nikon, Saksa) 200-kertainen suurennus käyttäen Komet 5 kuva-analyysi-ohjelmisto (BFI Optilas, Saksa) . DNA: n prosenttiosuus pyrstössä (% Tail DNA) käytettiin määrällisesti DNA muuttoliikettä. Ainakin neljä itsenäistä koetta suoritettiin.

Western blot -analyysi

suoritettiin, kuten on kuvattu NuPAGE Technical Guide (Invitrogen, USA). Lyhyesti, proteiini uutteet ajettiin NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Geelit (Invitrogen), ja siirrettiin kalvoille kanssa iBlot Dry Blotting System (Invitrogen) kantavassa membraaneja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli anti-p27 (D69C12, Cell Signaling, USA), ja anti-GAPDH (9484, Abcam, UK) vasta-aineet. Toissijainen vasta-aineet (vuohen anti-kani-ja vuohen anti-hiiri-IgG HRP-vasta-aineita) inkuboitiin 1 h huoneen lämpötilassa. Bändit leimattuja-vasta-aineet havaittiin käyttämällä SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Scientific, USA). Kalvot skannattiin ja intensiteetti bändejä määrällisesti kanssa ImageJ ohjelmisto. Tiedot 4 itsenäisestä kokeesta on esitetty suhteet arvojen välillä kohdennetun ja endogeenisen ohjaus proteiineja.

(A) Kuvat ovat paksusuolen osat on merkitty anti-CD133 ja anti-VEGF-vasta-aineita, ja tumat värjättiin DAPI. Valkoinen nuolet osoittavat yhden värjätään ja kaksinkertainen värjätään positiiviset solut PCCS alueille paksusuolen osastoja (A1-A3) MNNG ilman FLX hoitoa, ja (A4 A6) MNNG + FLX hoitoryhmissä. Kuvat on otettu FITC (495-521 nm), UV (358-461 nm), ja Texas Red (595-605 nm) suodattimia. Kaikki kuvat otettiin 600x suurennos, asteikko palkit edustavat 20 pm. (B) Kuvat ovat yhden paksusuolen leikkeitä anti-VEGF-vasta-aineen (positiivisia soluja nähdään tummanruskeaksi solulima) välillä (B1) MNNG ilman FLX hoitoa, ja (B2) MNNG + FLX hoitoryhmissä. (B3) suhteellinen määrä soluja, jotka ilmentävät VEGF sisällä PCCS alueilla (*** p 0,001; MNNG ilman FLX,

n

= 3; FLX + MNNG,

n =

4). Kaikki kuvat otettiin 400x suurennos, asteikko palkit kuvaavat 50 pm. (C) Kuvat ovat paksusuolen kohdat merkitty anti-CD133 ja anti-CD34-vasta-aineita, ja ytimet värjättiin DAPI. Valkoinen nuolet osoittavat yhden värjätään ja kaksinkertainen värjätään positiiviset solut PCCS alueille paksusuolen osastoja (C1-C3) MNNG ilman FLX hoitoa, ja (C4-C6) MNNG + FLX hoitoryhmissä. Kuvat on otettu, kuten edellä on kuvattu. (D) Kuvat ovat yhden paksusuolen leikkeitä anti-CD34-vasta-ainetta (positiivisia soluja nähdään tummanruskeaksi solulima) alkaen (D1) MNNG ilman FLX hoitoa, ja (D2) MNNG + FLX hoitoryhmissä. (D3) suhteellinen määrä CD34-positiivisten solujen PCCS alueilla (*** p 0,001; MNNG ilman FLX,

n

= 4; FLX + MNNG,

n =

4). Kaikki kuvat on otettu edellä kuvatulla tavalla.

Hiiret ja hoito pöytäkirjan

Nainen C57BL /6-hiirten (5 viikkoa) toimitti Medical School of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo , Brasilia. Kaikki

in vivo

hoidot olivat yhtä mieltä pöytäkirjan hyväksymän Animal Care ja Käytä komitea (nro 068/2012) päässä Medical School, University of São Paulo, ja opastusta eläinten hallintaan vähintään hyväksyttävä määrä. Hiiriä sopeutetaan 1 viikon ajan ennen koetta. C57BL /6-hiiriä altistettiin tai ei karsinogeeni MNNG ja satunnaisesti yhteen neljästä ryhmästä, kontrollina (CTRL) tai MNNG-hoitoa (neljä peräkkäistä annosta MNNG [5 mg /ml; intrarektaalisen talletukset 100 ui; Sigma- Aldrich, Louis, MO, USA] kahdesti viikossa 2 viikkoa), ja FLX-käsittely (30 mg /kg /päivä, intraperitoneaalisesti, ip, Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA) tai MNNG + FLX-käsittely. Jokainen ryhmä oli viisi hiiret, ja ne sijoitettiin

per

muovinen häkki 22 ± 2 ° C: ssa 55% kosteudessa ja 12 tunnin valo /pimeä sykli. FLX-sovellus käynnistettiin 2 viikon kuluttua lopusta MNNG-hoitoa, ja jatkettiin seuraavien 4 viikon kuluessa. Kaikilla eläimillä oli vapaa pääsy ruokaa ja vettä kokeen aikana. Kaikki hiiret lopetettiin CO

2 altistukseen viikolla 8 kokeen. Yksittäiset ruumiinavauksia tehtiin, ja paksusuolen kudosnäytteet pitkittäin aukeaa ja pysyy tasaisesti 4% neutraaleja paraformaldehydillä-puskuria (24 h). Hiiret hajanaista kudosleikkeiden hylättiin analyysistä.

(A) Kuvat ovat paksusuolen kohdat merkitty anti-CD133 ja anti-CD31-vasta-aineita, ja ytimet värjättiin DAPI. Valkoinen nuolet osoittavat yhden värjätään ja kaksinkertainen värjätään positiiviset solut PCCS alueille paksusuolen osastoja (A1-A3) MNNG ilman FLX hoitoa, ja (A4 A6) MNNG + FLX hoitoryhmissä. (A3 ja A6) Double-värjätty positiiviset solut näkyvät valkoisilla nuolilla pienten suonten kaltaisia ​​rakenteita lähistöllä umpipohjukan pohjat. Kuvat on otettu FITC (495-521 nm), UV (358-461 nm), ja Texas Red (595-605 nm) suodattimia. Kaikki kuvat otettiin 600x suurennos, asteikko palkit edustavat 20 pm. (B) Kuvat ovat yhden paksusuolen leikkeitä anti-CD31-vasta-ainetta (positiivisia soluja nähdään tummanruskeaksi solulima) välillä (B1) MNNG ilman FLX hoitoa, ja (B2) MNNG + FLX hoitoryhmissä. Kuvia otettiin 400x suurennos, asteikko palkit kuvaavat 50 pm. (B3) suhteellinen määrä CD31 positiivisia soluklusterien havaittu

per

PCCS alue (** p 0,01; MNNG ilman FLX,

n

= 4; FLX + MNNG,

n =

4).

Histopatologisten Analysis

Colon kudosnäytteet leikattiin ja värjättiin H

Nikon, Japani), ja sen pinta-ala (mm

2) laskettiin

arvoja (V) x 0,9801 /121

. Suhteelliset arvot ACF-i (index) ja AC-i laskettiin niiden kokonaismäärä

per

mm

2 [5], [17]. Vaskularisaatio liittyvä dysplasia määritettiin

ACF × MV /AC

.

immunohistokemia (IHC) ja Immunofluoresenssi (IMF) B

Aiempien kuvaus [5], [27], IHC ja IMF värjäys suoritettiin parafiinia paksusuolen osaa (4 pm). Ensisijainen vasta ostettiin Novocastra (USA), Santa Cruz Biotechnology (Saksa), ja Biocare Medical (USA). Leikkeitä inkuboitiin anti-Ki67 (klooni MMA at 1:100), anti-PCNA (klooni PC 10 on 1:100), anti-c-

Myc

(klooni 9E11 at 1:100), anti- -VEGF (klooni A-20, joka 1:100), anti-CD34 (klooni QBEnd /10 1:100), anti-CD31 (klooni 1A10 at 1:100), ja anti-CD133 (klooni N /A 1 :100) ensisijainen vasta yön yli. Ruskea väri oli esillä inkuboimalla jaksoon, joissa Kuva-MAX Polymer Kit (Invitrogen, USA). Se osoitti positiivisia reaktioita ruskea sakka ytimessä varten Ki67, ja PCNA ja sytoplasmassa ja /tai perinuclei alue

c-Myc

, VEGF, CD133, CD34, ja CD31.

leviämisen paksusuolen kohdissa analysoitiin anti-Ki-67 ja anti-PCNA-vasta-aineiden epiteelin ja PCCS alueilla. Merkkiaineita, jotka liittyvät verisuonten muodostumista (VEGF, CD133, CD34, ja CD31) laskettiin PCCS alueilla. Kuitenkin, CD31 (tai PECAM-1, verihiutaleiden endoteeli- adheesiomolekyyli-1) laskettiin positiiviseksi soluklusterien (yli 3-positiiviset solut), koska CD31 ilmentyy pääasiassa pinnalla endoteelisolujen [28]. Tunnusluvut laskemasta määritettiin välillä positiivisesti värjättyä ytimien ja yhteensä unstained ytimien epiteeli, kun taas suhdelukuja PCCS alueilla laskettiin positiivisten solujen (tai CD31 klusterit) ja kokonaismäärä laskettiin alueita. Positiivisten solujen

kohden

klusterin CD31, suhde laskettiin lukumäärän välinen leimattujen solujen ja kokonaismäärä klustereita.

Double-leimaus suoritettiin kiinteän paksusuolen näytteistä leimattiin hiiren anti -ihmisen CD133 (1:100; Miltenyl Biotec, 715-090-422, toissijainen anti-hiiri FITC konjugoitua vasta-ainetta, 1:400, Dianova, 715-095-150), kanin anti-hiiri-VEGF (1:100, Santa Cruz , sc-152, toisen anti-rabitt Cy3 konjugoitu vasta-aine, 1:400, Dianova, 111-165-144), rotan anti-hiiri-CD34 (1:100, Applied Biosystems, ab 8158, toisen anti-rotta-Texas Red konjugoitu vasta-aine , 1:400, GeneTex, GTX 26732), ja kanin anti-hiiri-CD31 (1:100, Applied Biosystems, ab 28365; toissijainen anti-rabitt Cy3 konjugoitu vasta-aine, 1:400, Dianova, 111-165-144) vasta-aineet. Tumat värjättiin DAPI. Kuvat otettiin Olympus BX51 mikroskoopilla varustettu Olympus DP71 kamera ja CellSens Dimension ohjelmisto (Olympus, Saksa).

Tilastollinen analyysi

Tiedot analysoitiin käyttämällä tilastollisia GraphPad Prism 5.0 ( graph Pad Software Inc., San Diego, Kalifornia, USA). Kaksisuuntainen ANOVA (Bonferroni jälkikäteen testi) testiä käytettiin analysoimaan tietoja anneksiini V /PI ja solusyklin määrityksissä, ja

in vivo

kokeita, koska se mahdollistaa eri päätepisteet voidaan analysoida erikseen. Oksidatiivisen stressin ja DNA-vaurioita analysoitiin Yksisuuntainen ANOVA (Bonferroni jälkikäteen testi) testi. Esineoplastiset vaurioita (ACF-i, AC-i, ja verisuonten muodostumista liittyvä dysplasia) analysoitiin Mann Whitneyn testi. Todennäköisyyttä P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki arvot ovat keskiarvoja ± keskihajonnat.

Tulokset

FLX Vaikutukset ROS tuotanto, DNA-vaurio, elinkykyyn, apoptoosi, ja Cell-cycle

Kun haluat selvittää, miten terapeuttinen ja yli-terapeuttiset pitoisuudet FLX voisi olla rooli paksusuolen syövän soluproliferaatiota, ihmisen paksusuolen syövän HT29 analysoitiin ROS tuotanto, DNA-vaurioita, elinkelpoisuutta, apoptoosin, ja jakelu solusyklin faasien kulttuuriin. Olemme havainneet, että ROS tuotanto kasvoi 2,5-kertaiseksi HT29 100 uM FLX 30 minuutin kuluttua hoidon, mutta ei merkittävää kasvua havaittiin 1 ja 10 uM FLX (kuvio 1A). Edelleen kokeet osoittivat, että ROS olivat noin 2 kertaa vähemmän HT29 altistuvat 100gM FLX 4 h kuin kuluttua 30 min käsittely (kuvio 1 B). Kun enemmän superoksidi spesifisen väriaineen DHE samanlaista mallia havaittiin (kuvio 1 C ja 1 D). 2,8-kertainen lisäys, jossa on 100 uM FLX (kuvio 1C), mutta ei kasvua, 1 uM ja 10 uM FLX havaittiin 30 minuutin jälkeen, ja 2-kertainen parannus havaittiin 4 h kuluttua (kuvio 1D), jälleen vain 100 uM FLX. Siten lisäys 100 uM FLX oli 1,4 kertaa vähemmän 4 h kohtelun kuin 30 min. Mikään FLX pitoisuuksien indusoi merkittävän DNA-vaurioita HT29 30 minuutin kuluttua tai 4 h kokeissa (kuvio 1 E ja F).

24 tunnin kuluttua, 100 uM FLX laski solujen elinkykyä merkitsevästi, ja indusoi apoptoosia, vaikkakin 1 ja 10gM voineet saada samanlaisia ​​vaikutuksia (kuvio 1G). Toisaalta, 10 uM FLX aiheutti merkittävän viivästymisen soluja G

0 /G

1 Faasispesifisten aikana 24 tunnin hoidon (kuvio 1G). Kun solusyklin etenemisen liittyvä proteiini p27 tutkittiin, 10pM FLX aiheutti lievää voimistumista ja 1,3-kertainen havaittiin 24 tunnin kuluttua hoidon 20pM FLX (Fig. 2). Yhdessä G

0 /G

1 solusyklin viivästyminen tapahtui terapeuttisena FLX pitoisuus, joka ei ole aiheutunut ROS tuotantoa tai induktio DNA-vaurioita.

potentiaali FLX Vastaan muodostaminen esineoplastiset vauriot

Tulosten perusteella edellä osoitettiin, jos kemiallinen estoaktiivisuus vastaan ​​esineoplastiset leesioiden paksusuolikudos todennettiin varten FLX hoidon karsinogeeni-altistuneet hiiret. Hiiret ensin alttiiksi MNNG, käsiteltiin FLX 28 päivän ajan, ja esineoplastiset leesiot laskettiin mukaan histopatologista analyysiä. Havaitsimme vakavia MNNG aiheuttama dysplasia (kuvio 3A) paksusuolen osiin, jota ei havaittu tällaista grade näytteissä FLX-hoidetuista eläimistä (kuvio 3B). Kvantifiointi dysplastic leesioita (ACF) in MNNG ja MNNG + FLX-käsitellyistä hiiristä osoittivat, että FLX vähensi dysplasia 5,39-kertaiseksi (kuvio 3C). FLX hoito vähensi kokonaisarvot AC

per

mm

2 7,94-kertaiseksi (kuvio 3D). Mikrosuonten olivat levisi PCCS kohti dysplastic alueilla (kuvio 3E), ja huomasimme, että FLX hoito pienensi vascularization liittyvä dysplasia 3,13-kertaiseksi (kuvio 3F). Tuloksemme viittaavat siihen, että FLX toimii eri paksusuolen alueilla eli epiteelin ja strooman.

aktiivisuus FLX leviämisen estämistä in epiteeli ja PCCS alueet

Koska tunnistettavissa chemopreventive vaikutuksia alle FLX-käsittely paksusuolikudos , nousi esille kysymys siitä, onko nämä löydökset liittyivät antiproliferatiivista toimintaa kahdessa eri paksusuolen alueilla eli epiteelin ja PCCS alueilla (kuvio 4A.1 ja 2). Merkitty kohdat, joissa anti-Ki67-vasta-ainetta paljasti, että FLX heikennetty (kuvio 4 b) MNNG indusoimaa proliferaatiota, on epiteeli- ja PCCS alueilla (kuvio 4C ja D). PCNA värjäys osoitti myös, että FLX heikensi MNNG aiheuttama proliferatiivinen aktiivisuus sekä paksusuolen alueilla (kuvio 4E ja F). Lisäksi suuri

c-Myc

ekspressio havaittiin sekä paksusuolen alueilla MNNG-hoidetuilla eläimillä, jossa FLX-käsittely esti kasvua ekspression (kuvio 4G ja H). Siten meidän havainnot tukevat hypoteesia, että proliferaation esto on tärkeä rooli chemopreventive vaikutuksia FLX hoidon.

aktiivisuus FLX angiogeneesistä

Koska angiogeneesi tapahtuu PCCS, ja leviämisen sekä kantasolujen merkkiaineita johtune- että [15] – [16], [29] – [30], tutkimme mahdolliset yhteyttä näiden tapahtumien alla FLX hoitoa. CD133-positiiviset solut, jotka ekspressoivat VEGF: ää löytyy PCCS hiirillä suoritettiin joko MNNG tai MNNG + FLX hoitoja (kuvio 4A). FLX hoito laski niiden suhteellinen numero karsinogeeni-altistuvan ryhmän verrattuna MNNG ryhmään ilman FLX (MNNG, 3,73 ± 0,44 [

n

= 4]

vs

MNNG + FLX, 1,97 ± 0,14 [

n

= 4]; P 0,001). Strooman solut, jotka ilmentävät VEGF oli myös vähentynyt MNNG-altistuvat eläimet käsiteltiin FLX ilmentymistä (kuvio 5B). Kiinnostavaa, CD133-positiiviset solut ekspressoivat CD34-glykoproteiinin havaittiin vain joukossa MNNG käsitellyissä hiirissä (kuvio 5C), kun taas FLX hoidon merkittävästi vähentynyt määrä strooman CD34-positiivisia soluja (kuvio 5D). Lisäksi suhteellinen kokonaismäärä CD31-positiivisten solujen lueteltu sisällä PCCS alueilla, ja merkittävä lasku havaittiin MNNG altistuneiden ryhmässä FLX hoito (MNNG, 3,5 ± 0,87 [

n

= 4]

vs

MNNG + FLX, 1,8 ± 0,2 [

n

= 4]; P 0,01). Vertailu CD34 ja CD31-positiivisten solujen osoitti 1,2-kertaisen lisäyksen CD31-positiivisten solujen arvoja joukossa MNNG-alttiina hiirillä.

Koska CD31 on profylaktista markkeri [31], ja parannettu alle MNNG- hoito, kaksinkertainen värjäys suoritettiin ymmärtää onko CD133-positiiviset solut ilmentävät CD31-glykoproteiiniin. Vuonna MNNG ja MNNG + FLX ryhmiä, CD133-positiiviset solut ilmaistaan ​​CD31 pienten suonten kaltaiset rakenteet PCCS alueilla (kuvio 6B). Potentiaaliset kehittää mikroverisuonten havaittiin luetellaan CD31-positiivinen solu klustereiden sisällä PCCS (kuvio 6B.1 ja B.2). CD31-positiivinen solu klustereiden pienenivät merkittävästi alle FLX-käsittely MNNG-altistuneet hiiret (kuvio 6B.3). Siksi nämä tulokset johtavat oletusta, että vähennys pienten suonten muodostumisen saattaa johtua takia valvontaan FLX kun strooman solujen erilaistumisen prosessi.

Keskustelu

Terapeuttinen pitoisuudet FLX alueella 10 30 uM ihmisen aivoissa [32]. Tämä pitoisuus (10 uM) viivästynyt solusyklin etenemisen riippumatta ROS tuotanto ja DNA-vaurioita ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa

in vitro

. Samanlaisia ​​havaintoja FLX estetty solusyklin etenemisen pidättivät rintasyövistä solujen G

O /G

1 vaihe on raportoitu aiemmin [33]. Nämä kirjoittajat joukossa muita todisteita kertymistä p27 ja kehittäneet mallinnukseen perustuva hypoteesi, että FLX voivat häiritä kokoonpano sykliiniriippuvaisten kinaasialayksikön 1 (CKS1) kanssa ubikitiinipromoottori ligaasilla skp2 estäen ubikitinaation ja proteasomaalisten hajoamista p27. Olemme myös havainneet p27 säätelyä, mikä on sopusoinnussa hypoteesin Krishnan et al. [33]. Eräässä toisessa raportissa käyttäen HT29-soluja, FLX: n osoitettiin estävän ERK1 /2: n fosforylaatio hypophosphorylating

c-Myc

ja CREB-proteiinien, mikä johti downregulation sykliini D1 ja A, kun taas solusyklin tarkastuspisteiden geenit ilmentyivät , vähentää solujen lisääntymistä [20].

Tarkasteltaessa meidän

in vitro

tulokset ja chemopreventive aktiivisuus FLX vastaan ​​MNNG aiheuttamaa dysplasia vähentämällä epiteeliproliferaation, näyttää mahdolliselta, että FLX edistää näitä vaikutuksia ohjaamalla solusyklin etenemisen

in vivo

. On tunnettua, että solut mutatoitunut alle MNNG altistuminen voi hankkia lisääntynyttä solujen lisääntymistä kapasiteettia onkogeenien ja miRNA ilmaisuja [34]. Toisaalta, viivästyminen G

2 /M vaiheen solusyklin ilmoitettiin koolonkarsinoomasoluissa altistetaan MNNG [35]. Lisäksi karsinogeeninen aktiivisuus MNNG on kytköksissä korkeaan soluproliferaatiota paksusuolen epiteeli [22], [36] – [37], kun taas kemopreventiossa vastaan ​​aiheuttamaa dysplastic vaikutukset liittyi lasku leviämisen ja ilmaisun onkogeenien, kuten kuten

c-Myc

[36], [38]. Näin ollen, MNNG muuttaa solusyklin etenemisen kautta induktion mutaatioiden mikä lisää proliferatiivista kapasiteettia. FLX havaittiin vähentävän umpipohjukan lisääntymistä vaikuttamalla serotonergisiin aktiivisuus [5] ja ilmentymisen indusoimiseksi tuumorisuppressorien, eli p53, p27, ja p21 [20], [33].

Koska korkean lisääntymistä on tärkeä rooli