Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä (PC) on edelleen yksi kaikkein vaarallisin ihmisen maligniteettien huonon ennusteen . Huolimatta kaikista kehitys prekliinisen tutkimuksen, ei ole tapahtunut merkittävää käännöstä Uusien hoitomuotojen osaksi klinikoilla. Kehittäminen geneettisesti hiiren (GEM) malleja, jotka tuottavat spontaani haiman (PDAC) ovat lisänneet ymmärrystämme sairauden patogeneesiin. Vaikka nämä PDAC hiiri mallit ovat ihanteellisia tutkitaan mahdollisia hoitoja ja tiettyjä geneettisiä mutaatioita, on tarpeen kehittää syngeneeisissä solulinjojen näistä malleista. Tässä tutkimuksessa kuvaamme perustamisen onnistuminen ja luonnehdinta kolme solulinjojen peräisin kahdesta (PDAC) hiiri malleja. Solulinjan YK-KC-6141 oli peräisin haiman kasvain, joka Kras

G12D, Pdx1-Cre (KC) hiiri 50 viikon iässä, kun taas YK-KPC-960 ja YK-KPC-961 solulinjoja peräisin haiman kasvaimia Kras

G12D; Trp53

R172H, Pdx1-Cre (KPC) hiirille 17 viikon iässä. Syöpä mutaatiot Näiden vanhemman hiirten siirretään tytär solulinjojen (eli

Kras

G12D

mutaatio havaittiin kaikissa kolmessa solulinjoissa, kun

Trp53

mutaatio havaittiin vain KPC solussa linjat). Solulinjat osoitti tyypillinen mukulakivi epiteelin morfologia kulttuuriin, ja toisin kuin aiemmin perustettu hiiren PDAC solulinjassa Panc02, ilmaisi ductal merkki CK19. Lisäksi nämä solulinjat ilmensivät epiteeli- mesenkymaalinen markkereita E-kadheriinin ja N-kadheriinin, ja myös, MUC1 ja Muc4 musiineja. Lisäksi nämä solulinjat olivat resistenttejä kemoterapia-lääkkeen gemsitabiini. Heidän istutusta

in vivo

tuotetaan ihonalainen sekä kasvaimia haimassa (potilaalle tehdä). Geneettinen mutaatiot näissä solulinjoissa matkivat geneettinen kokoelman ihmisen PDAC, mikä tekee niistä arvokkaita ja tarjoavat korkean potentiaalin translationaalisen merkitystä tutkittaessa diagnostisia markkereita ja lääkeaineet.

Citation: Torres MP, Rachagani S, Souchek JJ, Mallya K, Johansson SL, Batra SK (2013) Novel Haimasyöpä solulinjoissa geneettisesti muokatuista Mouse mallit Spontaani Haiman Adenocarcinoma: sovellukset Diagnosis and Therapy. PLoS ONE 8 (11): e80580. doi: 10,1371 /journal.pone.0080580

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 elokuu 2013; Hyväksytty: 14 lokakuu 2013; Julkaistu: 20 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Torres et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ oli osittain tukee avustuksia NIH (TMEN U54 CA163120, EDRN UO1, CA111294, SPORE P50 CA127297, RO1 CA133774, RO1 CA78590, ja RO3 CA167342). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka monia edistysaskelia ymmärrystä molekyylitason mekanismeja haimasyövän (PC) synnyssä neljän viime vuosikymmenen aikana tauti on edelleen yksi alkuun syöpäsairauksia kanssa huonoin prognoosi [1]. Nämä Synkät tilastot ovat jatkuva muistutus kiireesti selvittämiseksi vielä löytämättä mekanismeja PC patologian jotka edistävät parempaa diagnoosin ja hoito-ohjelmat. Tätä varten kehitetään kokeellisissa malleissa on elintärkeää, koska ne ovat kriittisiä arvioimiseksi uusia terapeuttisia strategioita [2]. Ksenograftikasvaimina atyymisissä nude hiiret ovat hyödyllisiä prekliinisissä, mutta ne eivät voi tarjota roolia immuunijärjestelmän mekanismeja, jotka voivat lisätä tai häiritä toimintaa terapeuttisen ehdokkaita. Viime aikoina geneettisesti hiiriä (GEM) malleja, jotka tuottavat spontaani haiman adenokarsinooman (PDAC) ovat suuresti edistäneet ymmärrystä PC synnyssä ja myös sallittua tutkittaessa uusien terapeuttisten lähestymistapojen [3] – [6]. Lisäksi, syngeenisiä solulinjoja voidaan eristää haiman kasvainten tuottamia GEM malleja ja käyttää

in vitro

ja

in vivo

seulontamäärityksissä. Analyysi ja ominaisuudet spesifisten geneettisten mutaatioiden ja PC biomarkkereita läsnä näissä solulinjoissa voi valottaa suunnittelun lupaavia diagnostisia ja terapeuttisia strategioita.

Mutaatiot

KRAS

,

CDKN2A

,

TP53

, ja

Smad4 /DPC4

geenit havainnoidaan yleisesti PDAC kasvainten PC potilaista [7]. Ottaen huomioon nämä tulokset, muutama hiiren malleja, jotka tuottavat spontaani PDAC, on suunniteltu viime vuosikymmenen aikana [3], [4], [6]. Tämä tutkimus keskittyy hiirillä kuljettavat

Kras

ja

Trp53

mutaatioita. Rooli onkogeenisten

Ras

PC tutkittiin ohjaamalla endogeeninen ilmentyminen

Kras

G12D

että kantasolujen haiman Kras

G12D, Pdx1-Cre (KC ) hiirillä [3], kun taas rooli endogeenisen ilmentymisen

Trp53

R172H

ja

Kras

G12D

tutkittiin haimassa Kras

G12D; Trp53

R172H, Pdx1-Cre (KPC) hiirillä [4]. Tulokset osoittavat, että spontaanit haimatuumorien tuottaman hiiren malleissa kerrata kliininen, histopatologinen ja genomista piirteitä ihmisen PDAC.

Hiiri PDAC solulinjoja enemmän kliinistä merkitystä tietokoneeseen ovat erittäin tarvitaan. Tällä hetkellä käytettävissä Panc02 solulinjaa on käytetty kolmen viime vuosikymmenen ajan [8]. Se oli peräisin PDAC kasvaimia indusoitiin istuttamalla 3-metyyli-kolantreeni (3-MCA) kyllästettyä langat puuvillaa haimassa C57BL /6-hiirissä. Huolimatta laajaa käyttöä arvioitaessa eri hoitostrategioita, Panc02 soluista puuttuu vahva kliininen merkitys PC puuttumisen vuoksi mutaatiostatuksesta taajuuksien verrattuna ihmisen sairauksien. Niinpä menestystä kääntää hoitojen merkitty tämä malli on ollut vähäistä. Tässä käsikirjoitus, kuvaamme sukupolvi ja luonnehdinta kolme uutta PDAC solulinjat saatu spontaaneista hiirimalleissa PC. Yksi solulinja, joka on johdettu KC hiirtä 50 viikkoa iässä, ja kaksi muuta olivat peräisin KPC hiirillä 17 viikon iässä. Perustamisen onnistuminen ja

in vitro

ja

in vivo

luonnehdinta näistä solulinjoista kattavasti kuvattu, mukaan lukien markkereita nykyään tunnetaan haiman kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

perustaminen Cell Lines

täydellinen väliaine koostui DMEM, joka sisälsi lämpöinaktivoitua FBS: ää, L-glutamiini (200 mM), 100x ei-välttämättömiä aminohappoja (100 mM), natriumbikarbonaatilla, HEPES-puskuria, gentamisiini (50 mg /ml), ja penisilliini /streptomysiiniä (100 ug /ml). Välittömästi sen jälkeen, resekoimista kasvaimen, 200 mg haiman kasvain kudos siirrettiin petrimaljalle, joka sisälsi steriilin PBS ja gentamysiiniä (20 ug /ml).

talteen kudokset pestiin 3 kertaa PBS-gentamysiini ja siirretään petrimaljalle, joka sisältää täydellisen väliaineen. Kasvain hienoksi-jauhettu steriilillä leikkausveitsellä ja siirrettiin steriiliin sentrifugiputkeen kanssa täydellistä elatusainetta, joka sisälsi kollagenaasi P (Roche, Indianapolis, IN) (10 mg /ml) kantavassa seosta inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Putket ylösalaisin joka kolmas min varmistaa kunnollisen sekoittumisen. Seuraavat kaksi pesukerran täydellisessä väliaineessa, saatu pelletti sentrifugoinnin jälkeen suspendoitiin täydellisessä elatusaineessa. Kun kerroit putki seistä 2 minuuttia, solususpensiota ilman kudosjäte siirrettiin uuteen steriiliin 10 cm petrimaljaan.

Kun oli inkuboitu yön yli 37 ° C: ssa 5% CO

2, väliaine oli korvattiin tuoreella kasvualustalla. Solut trypsinoitiin kerran konfluentteja. Kasvun estämiseksi fibroblastien, ero trypsinoimalla tehtiin, jossa trypsiiniä lisättiin soluihin ja 10 sekunnin kuluttua, solut pestiin PBS: llä ja lisättiin tuoretta väliainetta. Lisäksi, alustaan ​​lisättiin koleratoksiinin (400 ng /ml), ensimmäistä 7 siirrostusta kuin se on aiemmin raportoitu, että sillä on parannettu mitogeeninen vaikutus epiteelisolujen, mutta ei fibroblastisoluissa [9]. 10 siirrostuksen jälkeen, solulinjat siirrettiin normaaliin täydellisessä väliaineessa (eli DMEM, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 100 ug /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä), ja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 kosteassa inkubaattorissa. Kolme solulinjat perustettiin onnistuneesti. Solulinja, joka on johdettu Kras

G12D, Pdx1-Cre (KC) hiiren nimettiin YK-KC-6141 ja kahdessa solulinjassa, jotka ovat peräisin Kras

G12D; Trp53

R172H, Pdx1-Cre (KPC ) hiiret nimettiin YK-KPC-960 ja YK-KPC-961 (YK nimeää University of Nebraska Medical Center).

In vitro

kuvaamista ja tuumorigeenisia tutkimukset tehtiin sen jälkeen, kun 35 kohtia soluviljelmässä. Hiiren PDAC solulinja Panc02 sisällytettiin

in vitro

funktionaalisia määrityksiä.

sekvensointi solulinjojen

Kras

ja

p53

Mutaatiot

subkonfluenteista viljelmistä UN-KC-6141, UN-KPC-960, ja YK-KPC-961 hajotettiin solulyysiliuosta sisältävän beeta-merkaptoetanolia ja kokonais-RNA eristettiin RNeasy Minikit (Qiagen, Germantown , MD). cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: sta käyttäen oligo (dT) 18-aluketta ja SuperScript II käänteistranskriptaasia (Life Technologies ™, Carlsbad, CA). PCR-monistus hiiren

Kras

kodoni 12 (eksoni 1) ja

p53

kodonit 172 (eksoni 5) suoritettiin käyttäen joukkoa alukkeita kunkin geenin (

Kras

-seqF: 5′-ACTTGTGGTGGTTGGAGCTG-3 ’,

Kras

-seqR: 5′-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3′,

p53

-seqF: 5′-CACGTACTCTCCTCCCCTCA-3 ’ja

p53

-seqR: 5′-ATTTCCTTCCACCCGGATAA-3 ’), joka johtaa 168 bp: n (

Kras

) ja 229 bp (

p53

) PCR-tuotteita. PCR-tuotteet puhdistettiin PCR-tuote puhdistuskittiä (Qiagen, Germantown, MD) ja puhdistettua PCR-tuotteet sekvensoitiin käyttämällä

Kras

-seqR: 5′-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3 ’ja

Kras

ja

p53

-seqF: 5′-CACGTACTCTCCTCCCCTCA-3 ’varten

p53

geeni.

kasvukinetiikat

kasvukinetiikat tutkimuksia, kustakin solulinjasta ympättiin neljänä 96-kuoppaiselle levylle (1000 solua /kuoppa) täydellisessä väliaineessa. Yön yli inkuboinnin jälkeen elatusaine korvattiin elatusaineella, johon oli lisätty 1% FBS: ää ja penisilliiniä /streptomysiiniä (100 ug /ml). Joka päivä, 10 ui Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche, Indianapolis, IN) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sen jälkeen 3 h inkubaation, absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä. Absorbanssiarvot vähennettiin arvoista kirjataan viitteen aallonpituudella (600 nm), kuten valmistaja. Menettely toistettiin 7 päivää. Tuplaus aika (T

D) kunkin solulinjan laskettiin aikana eksponentiaalisen kasvuvaiheen kaavalla T

D = 0.693t /ln (N

t /N

0), missä t = aikaeron h, N

t = absorbanssiarvosta hetkellä t, ja N

0 = absorbanssi arvoa alkuperäisen aikaan [10].

Real Time PCR

RNA eristettiin ja puhdistettiin YK-KC-6141, UN-KPC-960, UN-KPC-961, Panc02, ja NIH3T3 (hiiren fibroblasteja) soluihin käyttäen RNeasy Minikit (Qiagen, Germantown, MD). cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA käyttämällä oligo (dT) 18-aluketta ja SuperScript II käänteistranskriptaasia (Life Technologies ™, Carlsbad, CA), kuten on kuvattu meidän aikaisemmassa julkaisussa [11]. Reaaliaikainen PCR suoritettiin LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Vahvistus tehtiin kaksi vaihetta (95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 45 sykliä 95 ° C 10 sekuntia, 60 ° C 10 sekuntia ja 72 ° C: ssa 10 s) käyttäen LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) ja cDNA: ta kustakin näytteestä.

GAPDH

käytettiin sisäisen valvonnan geenin, joka kaikkien geenien normalisoitiin. Kertamuutoksen geenien ilmentymisen

Amylaasi-

ja

CK19

mRNA syöpäsolulinjoissa verrattiin suhteessa mRNA uutetaan normaalin hiiren haimasta käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmällä, kun taas taitettavan muutos

MUC1

ja

Muc4

verrattiin suhteessa mRNA uutetaan hiiren fibroblastisolulinjaa NIH3T3. Sekvenssi alukkeiden käytetään tässä tutkimuksessa on lueteltu taulukossa 1.

Vasta-aineet

Anti-CK19 hybridooma (TROMA-III) ovat kehittäneet Dr. Rolf Kemler saatiin Developmental Studies Hybridoma Bank kehitetty suojeluksessa NICHD ja pidettiin University of Iowa (Iowa City, IA). Vasta-ainetta hiiren E-kadheriinin saatiin Cell Signaling (Danvers, MA). N-kadheriinin aine oli ystävällinen lahjoitus tri Keith R. Johnson UNMC (Omaha, NE). β-aktiinin ja amylaasi vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Sigma Aldrich (St. Louis, MO). For confocal tutkimusten toissijainen vasta-aineita on konjugoitu Alexa Fluor® (568, 488) saatiin Life Technologies ™ (Carlsbad, CA). Toissijainen vasta konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin käytettiin western blot-analyysi saatiin GE Healthcare Life Sciences (Uppsala, Ruotsi). Anti-hiiri-MUC1-vasta-ainetta (hiiren monoklonaalinen vasta-aine tunnustetaan sytoplasminen häntä MUC1) hankittiin Abcam® (Cambridge, MA, USA). Anti-Muc4 (4A-kanin polyklonaaliset) vasta suunniteltiin tässä laboratoriossa ja kehittänyt GenScript (Piscataway, NJ, USA) on kuvattu aiemmin [12].

konfokaalimikroskopia

proteiinin ilmentyminen analysoitiin konfokaalimikroskopialla. 2 x 10

5 solut suspendoitiin täydelliseen alustaan ​​ympättiin lasipeitelevyihin laitettiin 12-kuoppalevylle. Seuraavana päivänä solut kiinnitettiin jääkylmällä metanolilla. Pesun jälkeen PBST: ssä ja estää 10% vuohen seerumia (Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, PA), soluja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa Amylaasi (1: 500), CK19 (1: 1000), E-kadheriinin (01:50 ), N-kadheriinin (01:20), ja MUC1 (1: 100) yön yli. Ne pestiin neljä kertaa PBST: llä, 5 min pesukertaa kohti. Soluja inkuboitiin kunkin sekundaarisen vasta-aineiden (hiiri /kani) konjugoituna Alexa Fluor (568, 488) (Life Technologies ™, Carlsbad, CA) ja sen jälkeen toistetaan pesuvaiheen lasipeitinlevyjä asetettiin lasilevyille, joissa Vectashieldissä asennus keskipitkän (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Solut kuvattiin lasertulostimella -konfokaalimikroskoopilla LSM 510 (Carl Zeiss GmbH, Thornwood, NY) vastaaviin aallonpituuksilla suurennuksella x 63.

Western blot -analyysi

western blot-analyysi solut ympättiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppaisen levyn täydelliseen alustaan. Tällä -80% konfluenssiin, solut lyysattiin radioimmunosaostuskokeella puskurilla (RIPA), joka sisälsi proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit. Lysaatit tehtiin useita jäädytys-sulatus syklien varmistaa täydellisen tuhoutumisen. Pitoisuus lysaatit määritettiin mikro-bikinkoniini- happo-proteiinin arviointi kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Proteiinin konsentraatiot säädettiin ja liuoksia valmistettiin pelkistävissä olosuhteissa (eli β-merkaptoetanolia). 2% SDS-agaroosigeeleillä käytettiin analyysiin Muc4 ilmaisua. 40 ug proteiinia lysaatit ladattiin ja geeliä ajettiin 4 h 100 V: E-kadheriinin ja N-kadheriinin ilmentymisen tasot analysoitiin SDS-PAGE: lla. 40 ug proteiinia lysaatit ladattiin ja erottaminen tehtiin 80 mA 1 tunnin ajan. Erotetut proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja, estetty 5% maitoa PBS: ssa, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön. PBST: llä, vastaavat sekundaariset vasta-aineet lisättiin ja sen jälkeen toistetaan pesuvaiheet, proteiinit havaittiin luminolia (Thermo Scientific, Middletown, VA) altistumisen jälkeen röntgenfilmeille.

Solumyrkkykoe

sytotoksinen vaikutus kemoterapeuttisen lääkkeen Gemsitabiini on KC ja KPC solulinjojen verrattiin sytotoksista vaikutusta Panc02. Injektoitava liuos, gemsitabiini, GEMZAR® (Eli Lilly Company, Indianapolis, IN) luovutti ystävällisesti apteekissa klo Lied Transplant Center UNMC. Sytotoksiseen määritystä, 1 x 10

4 solut suspendoitiin täydelliseen kasvualustaan ​​ympättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla Gemsitabiini-liuosta (100 nM-100 uM) neljänä kuoppiin. Sen jälkeen inkuboimalla soluja Gemsitabiini 48 tuntia, jotka sisälsivät tiatsolyyli blue liumbromidi reagenssia (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) lisättiin soluihin. 4 tunnin kuluttua inkuboinnin formatsaanisakka tuottamien kiteiden metabolisesti aktiiviset solut liuotettiin 100 ul: aan DMSO: ta. Absorbanssiarvot 540 nm: ssä käytetään laskettaessa sytotoksisuuden prosenttiosuudet. Puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC-50) Gemsitabiini määritettiin jokaisessa solussa linjan interpoloimalla arvot kaaviossa (% sytotoksisuus vs. Gemsitabiini Pitoisuus).

tuumorigeenisyystesti tutkimukset

aiheuttavan kasvaimia solulinjat määritettiin jälkeen potilaalle tehdä istuttaminen hiiren PC solulinjojen (UN-KC-6141 /UN-KPC-960 /UN-KPC-961) otetaan pään haima jälkeen 35 kohtia. Perustuen hiiret tausta jossa solulinjoja, UN-KC-6141-soluja (1 x 10

6) injektoitiin C57BL /6-hiirissä, kun taas YK-KPC-960 ja YK-KPC-961-solut ( 1 x 10

6) injektoitiin sekoitettu tausta (eli B6.129) hiiriä (N = 7). Hiiren PC-solut suspendoitiin 50 ul: aan steriiliä PBS: ää injektoitiin ortotooppisesti käyttäen samaa menetelmää kuvataan meille [13], [14]. Ihonalainen kasvaimen kasvua arvioitiin YK-KPC-961 solulinjan vain. 5 x 10

6 solua injektoitiin (N = 12) seka B6.129 taustalla hiiriä sivusuunnassa rinnassa. Kasvaimen kasvua seurattiin tunnustelemalla /mikrometrillä mittausten tapauksessa ihonalaisen kasvaimia. Koko kokeen, eläimet toimitettiin ruokaa ja vettä mielin määrin ja altistettiin 12 tunnin pimeä /valo sykli. Eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Yhdysvaltain Public Health Service ”suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals” hyväksytyn protokollan mukaan University of Nebraska Medical Center Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC). Sen jälkeen euthanization, haiman kasvaimet irrotettiin, punnittiin ja kiinnitettiin 10% formaliinilla (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) ja H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä).

Tulokset

In vitro

perustaminen KC ja KPC solulinjoissa

hiiri PC solulinjat onnistuneesti tuotettu spontaanin haimatuumorien tuottama Kras

G12D, Pdx1-Cre (KC) ja Kras

G12D; Trp53

R172H, Pdx1-Cre (KPC) hiirillä 50 viikkoa ja 17 viikkoa ikäisiä, vastaavasti. Yksi solulinja on johdettu KC hiiristä nimettiin YK-KC-6141, ja kaksi muuta solulinjat on johdettu KPC hiiriä nimettiin YK-KPC-960 ja YK-KPC-961. Kaikki kolme solulinjat kasvoivat yli 50 kohtia normaalissa mediassa ilman merkkejä vanhenemista. Yksikerroksisiin kaikkien kolmen solulinjojen osoitti tyypillinen mukulakivi morfologia suljetulla kytkennällä saaren muodostumiseen (kuvio 1A). Voit varmistaa, että nämä solulinjat säilyttivät geenimutaatioista niiden vanhempien hiirien (KC ja KPC), mutaation tila

Kras

(Fig. 1 B) ja

Trp53

(Fig. 1 C ) loci tutkittiin. Kuten odotettua, kaikki kolme solulinjat kantoi

Kras

G12D

pistemutaatio, kun taas YK-KPC-960 ja YK-KPC-961 suorittaa

Trp53

R172H

aktivoiva mutaatio .

(A) Käänteismikroskooppi kuvia (4X) UN-KC-6141, UN-KPC-960, ja YK-KPC-961 PDAC solulinjoissa jälkeen 35 kohtia. Kolme solulinjat näkyy tyypillinen mukulakivi epiteelin morfologia. Geenisekvenssi analyysi (B)

Kras

G12D

ja (C)

Trp53

R172H

mutaatio hiiren PC solulinjoissa. Blue tummennetut alueet edustavat kodonin jossa mutaatio sijaitsee. Keltainen suorakulmio osoittaa nukleotidin vastaava mutaatio. Haimasta peräisin Pdx1-Cre hiiren (hiiri tag UN-KPC-1207) käytettiin negatiivisena kontrollina

Kras

mutaatio.

kasvukinetiikat näistä kolmesta hiiri PC solulinjoja verrattuna Panc02 soluissa (kuvio 2A). UN-KPC-961 solut lisääntyivät nopein kaksinkertaistui aika (T

D) 33 h (

p

0,0001 verrattuna Panc02). UN-KPC-960 ja Panc02 kasvoi samaa vauhtia (T

D ≈ 60 h), kun taas YK-KC-6141 osoitti hitain kasvuvauhti (T

D 70 h) (kuvio 2B).

(A) Solut ympättiin neljänä kuoppiin 96-kuoppalevyille ja niiden kasvua seurasi päivittäin mittaamalla absorbanssi inkuboinnin jälkeen WST-1-reagenssia. Data edustaa kun absorbanssien keskiarvo (λ

Sample = 450 nm, λ

Ref = 600 nm) neljä rinnakkaisnäytettä ± keskivirhe. Tilastot laskettiin verrattuna kasvukäyrä Panc02 (*

p

0,01, **

p

0,001, ***

p

0,0001 ). (B) kaksinkertaistaminen aika (T

D) solupopulaation laskettiin käyttäen yhtälöä T

D = (0.693t) /ln (N

t /N

0) t = aikaero in h aikana log-vaiheen, N

t = absorbanssiarvosta hetkellä t, ja N

0 = absorbanssi arvoa alkuperäisen aikaan.

KC ja KPC solulinjat ovat ductal- ominaisuuksiltaan

PDACs uskotaan syntyvän epiteelisolujen haiman kanava [7]. Haimassa sisältää sekä rakkulasoluissa ja duktaalisia soluja. Haiman asinaarisoluissa on tunnusomaista amylaasin ilmentyminen ja ekspression puutteeseen joko sytokeratiini 19 (CK19) tai musiineja, ja tiehyen solujen on ominaista ilmentyminen CK19 ja musiineja, mutta ei ilmentymistä amylaasin [15], [16]. Todellakin, aiemmat tutkimukset ovat haimatuumorien KC ja KPC hiiret ilmaisi CK19 ja usein, musiinin, mikä osoittaa niiden ductal perintö [3], [4]. Validoida ovatko KC ja KPC johdettu-solulinjoissa oli näitä ductal ominaisuuksia, tutkimme amylaasin ja CK19 ilmaisun reaaliaikaista PCR ja konfokaalimikroskopialla. Panc02 soluja sisälly näihin analyyseihin vertailua, ja normaali haimakudoksessa käytettiin arviointiin suhteellisen geeniekspression. Reaaliaikainen PCR osoittivat korkeita ilmentymisen CK19 duktaaliseen markkeri meidän kolme uutta PDAC solulinjat (

p

0,005) verrattuna Panc02 (Fig. 3A). Yllätykseksemme Panc02 solut eivät osoittaneet mitään CK19 ilmaisua, vaikka se on viitattu kuin hiiren ductal PDAC solulinjan lähes kolme vuosikymmentä [8]. Yksikään neljästä solulinjat osoittivat amylaasin ilmentyminen, kun taas normaali haima ilmaissut tätä acinar merkki. Nämä tulokset varmistettiin vielä konfokaalimikroskopiaa analyysi (Fig. 3B).

(A) Reaaliaikainen PCR-analyysi

Amylaasi-

ja

CK19

hiiren PDAC soluissa. Nämä mRNA-transkriptien verrattiin suhteessa mRNA-tasot normaaleissa haimassa. Aineisto edustaa keskiarvoa kertainen kolme toistoa ± keskivirhe. Tilastot laskettiin verrattuna normaaliin haiman (*

p

0,005, **

p

0,0001). (B) proteiini ilmentymistä amylaasi ja CK19 arvioitiin hiiren PDAC solulinjoissa konfokaalisella analyysi. Amylaasi visualisoitiin värjäämällä, jossa sekundäärinen vasta-aine on konjugoitu Alexa Fluor® 568 (punainen fluoresoiva) ja CK19 tehtiin näkyväksi värjäämällä Alexa Fluor® 488 (Green Fluorescent). Solutumat värjättiin DAPI.

KC ja KPC solulinjaa on epiteeli- mesenkymaalinen ominaisuudet

epiteeli- mesenkymaalitransitioon indusoi menetys soluadheesion, joka vastaa E-kadheriinin downregulation ja lisääntyneen ekspression N-kadheriinin, joka johtaa aloittamista PDAC etäpesäkkeiden [17]. Tutkimme E-kadheriinin ja N-kadheriiniekspressiota konfokaalimikroskopiaa ja western blot analyysit kolmen vasta perustetun KC ja KPC solulinjoissa. E-kadheriinin ilmentymisen havaittiin YK-KC-6141, UN-KPC-960, ja YK-KPC-961 soluja, ilmaisevan niiden epiteelin luonteesta (Fig. 4A-B). Sen sijaan, Panc02 solut osoittivat vähäistä E-kadheriinin ilmentymisen. Rakenteessa N-kadheriinin ilmentyminen oli samankaltainen, on yhä näkyvämpi KC ja KPC solulinjoihin verrattuna ilmentymisen Panc02 soluissa (Kuva. 4C-D).

(A) Konfokaalimikroskopia kuvia E -cadherin (Alexa Fluor® 568, Red loisteputki) ilmentyminen hiiren solulinjoissa. Solujen tumat värjättiin DAPI. (B) Western blot -analyysi E-kadheriinin hiiren solulinjoja. Proteiini lysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) konfokaali microsocopy kuvia N-kadheriinin (Alexa Fluor® 488, Green Fluorescent) ilmentyminen hiiren solulinjoissa. Solujen tumat värjättiin DAPI. (D) Western blot analyysi N-kadheriinin hiiren solulinjoja. Proteiini lysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

KC ja KPC solulinjat ilmentävät korkeita MUC1 ja Muc4

erityyppisiä musiineja ilmaistaan ​​haimassa aikana PC etenemisen [12 ], [18]. Lisäksi PC esiasteleesioita geenimuunnelluissa hiiren PDAC mallien, kuten KC ja KPC hiiriä, tiedetään tuottavan musiineilla [3], [4]. Viime aikoina olemme myös osoittaneet, että haimassa KC hiiriä, ilmaus MUC1, Muc4, ja MUC5AC asteittain lisätä korrelaatio PDAC kehittämiseen [12]. Tutkimme, onko ilmaus näiden musiineja voidaan vahvistaa sitä KC ja KPC solulinjat. Tätä varten, real-time PCR, Western blot, ja konfokaalimikroskopialla analyysit tehtiin. Tulokset osoittivat, että suhteelliset transkriptipitoisuuksissa transmembraanisen musiineja

MUC1

(

p

0,001) ja

Muc4

(

p

0,05) olivat merkittävästi suuremmat YK-KC-6141, UN-KPC-960 ja YK-KPC-961-solut (Fig. 5A) verrattuna ohjaamaan soluihin (NIH3T3 fibroblasteja). Vuonna Panc02 soluissa suhteellinen transkriptio tasot

MUC1

ja

Muc4

olivat koholla, mutta ne eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Kuitenkin, Panc02 solujen ja kahden solulinjan peräisin KPC hiiret osoittivat korkeampia Muc4 proteiinia kuin KC-solulinjaa (Fig. 5B). Toisaalta, MUC1-proteiinin Panc02 oli pienempi kuin KC ja KPC peräisin olevia soluja (kuvio. 5C). Yllätykseksemme MUC5AC ei ollut havaittavissa missään solulinjoista, joko transkriptin tai proteiinin tasot (tuloksia ei ole esitetty), ja tämä voi olla seurausta evoluution liittyvät muutokset soluviljelmässä.

(A ) Reaaliaikainen PCR-analyysi

MUC1

ja

Muc4

hiiren PDAC solulinjoissa. MRNA-transkriptit normalisoitiin mRNA-tasot hiiren fibroblastisolulinjaa NIH3T3. Aineisto edustaa keskiarvoa kertainen kolme toistoa ± keskivirhe. Tilastolliset merkitykset laskettiin verrattuna NIH3T3 (*

p

0,05, **

p

0,001, **

* p

0,0001). (B) Western blot-analyysi Muc4 hiiren solulinjoissa. Proteiini lysaateille Muc4 analyysiä erotettiin 2% SDS agaroosigeeleillä. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus ja se päätettiin 10% SDS-PAGE. (C) Konfokaalimikroskopia kuvia MUC1 (Alexa Fluor® 568, Red loisteputki) ilmentyminen hiiren solulinjoissa. Solujen tumat värjättiin DAPI.

KC ja KPC solulinjat ovat vastustuskykyisiä Gemsitabiini

Huolimatta viimeaikaisista raporteista, että PC potilaat osoittavat suurempaa selviytymisen hoidetuilla FOLFIRINOX (a oksaliplatiinia, irinotekaani, fluorourasiili ja leukovoriinin) sijasta Gemsitabiini [19], jälkimmäinen on edelleen eniten käytetty huume PC kemoterapiaa [20]. Siksi käytetään MTT-määritystä, tutkimme gemsitabiini sytotoksisuus YK-KC-6141, UN-KPC-960, UN-KPC-961 ja Panc02 soluja (Fig. 6A). Panc02 solut olivat gemsitabiini kestävä kanssa puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC-50) 15 uM 48 tunnin kuluttua hoidon (Fig. 6B). IC-50-arvot KC ja KPC solulinjat vaihteli 0,5 5 um. Vaikka Panc02 solut olivat resistenttejä gemsitabiini, nämä IC-50-arvot ovat verrattavissa erilaisten ihmisten PC solujen [21], [22]. Mielenkiintoista, suuremmilla gemsitabiini pitoisuuksina (30-100 uM) (Fig. 6A), YK-KPC-961-solut osoittivat suurempaa Gemsitabiini vastus kuin Panc02 soluja.

(A) Gemsitabiini sytotoksisuutta hiiren PDAC solulinjoissa määritettiin MTT-sytotoksinen määrityksessä. Solut ympättiin neljänä kuoppiin ja inkuboitiin eri pitoisuuksien Gemsitabiini (100 nM-100 uM) 48 tuntia. Vaihtamisen jälkeen median kanssa MTT reagenssin ja liuottamalla formatsaanikiteet DMSO, sytotoksisuus laskettiin absorbanssiarvot (λ = 540 nm) käsitellyissä soluissa media vain. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo cytotoxicities neljänä kaivoihin ± keskivirhe. Tilastollinen merkittävyys laskettiin verrattuna Panc02 (*

p

0,01, **

p

0,001, ***

p

0,0001). (B) toinen puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC-50) Gemsitabiini kussakin solulinjassa määritettiin jälkeen interpo- kuvaajat% Sytotoksisuus vs. Pitoisuus.

Istuttaa KC ja KPC solulinjoja indusoi haiman hiirissä

perustaminen KC ja KPC solulinjoilla viljelmässä antanut mahdollisuuden tarkastella niiden kasvainten muodostumiseen sopivissa hiiri taustalla, josta ne on johdettu. YK-KC-6141 solut testattiin C57BL /6, kun taas YK-KPC-960 ja YK-KPC-961 solut tutkittiin hiirillä sekoittaa B6.129 tausta. Kuukauden kuluttua potilaalle tehdä kiinnittymisestä UN-KC-6141 solut C57BL /6-hiirissä, kasvaimet muodostivat niiden haimassa (kuvio. 7A), ja etäpesäkeleesioita maksassa, pernassa, ohutsuolessa, suoliliepeen imusolmukkeiden ja vatsakalvon seinän havaittiin. Kasvaimen esiintymistiheys YK-KC-6141-soluissa oli 100%. Kaksi KPC peräisin olevia soluja (UN-KPC-960 ja YK-KPC-961) muodostuu myös kasvaimia jälkeen potilaalle tehdä istutuksen (Fig. 7A), mutta ne ilmestyi hitaammin hinnat ja kasvaimet kesti yli kaksi kuukautta kasvaa. Suhteellisen hitaampi kasvaimen kasvun kinetiikka KPC solut voivat johtuneen geneettisten erojen KC ja KPC soluja, samoin kuin erilaiset taustat niiden hiirten. Mielenkiintoista, YK-KPC-961 solut näyttivät olevan tuumorigeenisemmiksi (kasvaimen esiintymistiheys 86%) kuin YK-KPC-960 soluja (kasvaimen esiintymistiheys 43%). (B) hematoksyliinillä