Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka endoteelisolujen apoptoosin osallistuu kasvaimen kutistuminen kerta suuren annoksen sädehoito, tiedetään hyvin vähän siitä, verisuonten vaste tavanomaisesti fraktioitu sädehoitoa. Siksi arvioimme hypoksia, verenkierron ja verisuonten microenvironment muutosten mukaan potilaalle tehdä eturauhassyöpämallin tavanomaisesti fraktioitua sädehoitoa kliinisesti asianmukaisilla annoksilla (2 Gy jakeet, 5 jakeet /viikko). Ensinnäkin, tavanomaisesti fraktioitiin sädehoitoa vähentynyt kasvainsoluproliferaation ja lisääntynyt solukuolema kanssa kinetiikan verrattavissa ihmisen eturauhassyövän sädehoitoa. Toiseksi injektio Hoechst 33342 tai fluoresoivasti dekstraanit osoittivat lisääntynyt kasvaimen perfuusio 14 päivän kuluessa säteilytetty kasvaimet, joka korreloi selvästi vähentämään hypoksian. Parannettu perfuusio ja laski hypoksia ei selittää lisääntynyt verisuonten tiheyden, koon tai verkon morfologiaan. Kuitenkin kasvain verisuonten kypsyminen määritellään verisuonia desmiinille + /SMA + solujen kattavuutta havaittiin selvästi yhdessä kasvua endoteeli-, Zonula occludens (ZO) -1 positiivinen, välisissä liitoksissa. Tuloksemme osoittavat, että sen lisäksi, että kasvainsolun tappamisen, verisuonten kypsymisestä lähettää paljastetun osassa kasvaimen uudelleenhapetukselle aikana fraktioitua sädehoitoa.

Citation: Potiron VA, Abderrahmani R, Clément-Colmou K, Marionneau-LAMBOT S, Oullier T, Paris F, et ai. (2013) Parannettu toiminnallisuus verisuonistossa aikana Perinteisesti Fraktioitu Sädehoito Eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (12): e84076. doi: 10,1371 /journal.pone.0084076

Editor: Zhaozhong Han, Alexion Pharmaceuticals, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 20 marraskuu 2013; Julkaistu: 31 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Potiron et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Institut National du Cancer (INCA PAIR-eturauhasen 2010), Association pour la Recherche sur le Cancer, Ligue Nationale Contre le Syöpä ja Région Pays de Loire. Rahoituslähde ei ollut mukana kerääminen, analysointi ja tulkinta tietojen valmistelu käsikirjoituksen ja päätös julkaista.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka herkkyys kasvainten sädehoitoa (RT) on suurelta osin riippuvainen luontaisista radioresistance syövän kantasoluja [1], muut tiedot viittaavat siihen, että herkkyys endoteelin myös tärkeä rooli [2] . Tämän seurauksena liiallinen tuotanto angiogeenisten molekyylien, verisuonten kiinteiden kasvainten näyttää tunnusomaiset piirteet, kuten laajentuneet mikrosuonten, epätäydellinen endoteelivuorauksen, puristus kasvainsolut, liiallinen haarautuminen ja erittäin epäsäännöllinen arkkitehtuuria. Solutasolla, epätäydellinen kypsymistä kapillaareja on pannut poissa tai irrotettu verisuonia soluja, poissa tai liian paksua tyvikalvon ja puute endoteelisolujen risteyksessä. Tämä epänormaali verisuoniston aiheuttaa hypoksian, että edelleen vaikuttaa tehoa säteilytys, koska 1) hapen puutteesta vähentää reaktiivisten happiradikaalien indusoimaa säteilytys ja 2) hypoksia valitsee säteilyresistenteille mutanttisolut [3]. Aikana fraktioitua sädehoitoa, osuus hypoksisten solujen nopeasti kasvattaa käsittelyn jälkeen jae koska normoxic solut edullisesti ja nopeasti tappoi säteilytys. Seuraavassa tuntia, johtuen alentuneesta hapen kulutusta vaurioituneita soluja, parantaa perfuusio, ja vähentää solutiheys, hypoksisia kasvainsoluja voi saamaan helpommin hapetus, ja siksi tullut herkempiä myöhemmin osa säteilytys. Tämä prosessi uudelleenhapetukselle uskotaan antavan terapeuttista etua CFRT kautta etenevä väheneminen normoxic kasvainsolujen ja helpommin hypoksisten solujen hapen [3].

Verisuonet vaikuttavat suuresti RT lukumäärästä riippuen fraktioiden, annosnopeus, yhteenlaskettu säteilyannos ja fraktion koko [4], [5]. Yhden suuren annoksen säteilytys voivat aiheuttaa nopea apoptoosin verisuoniston [6], [7]. Lisäksi sekä yhden suuren annoksen ja hypofractionated säteilytys indusoi endoteelisolujen apoptoosia, mikä vähentää verisuonten tiheyden [8], jossa on elossa alusten enemmän laajentuneet [9], [10]. Kuitenkin merkitys verisuonten vaurioita kasvaimissa vastaanottamisesta tavanomaisesti fraktioitua sädehoitoa (CFRT: 1,8-2 Gy per jae) on kiistanalainen [11], [12]. Normaalissa aivojen verisuonten, aivan äskettäin tietojen mukaan päinvastoin suurempia annoksia, joka on 2 Gy-säteilytys indusoi minimaalinen endoteelisolujen apoptoosia seuraa myöhemmin suonen halkaisijan suureneminen, mikrovaskulaariset tiheys ja alus leakiness [13]. Kuitenkin lepotilassa endoteelisolut ovat vastustuskykyisempiä säteilytyksen kuin lisääntyviä endoteelisoluja [14], [15]. Näin ollen, vaikutukset CFRT kasvaimen endoteelin voi poiketa normaalista endoteeliin. Lisäksi ymmärtää vaikutukset kliinisen sädehoidon, erityisiä tutkimuksia kasvaimen verisuonten ovat voidaan suorittaa potilaalle tehdä malleissa lähtien laajuus hypoksia ja verisuonitus pitkälti vaikuttaa sivuston kasvaimen siirteen [16], [17].

tutkia, mitä vaikutuksia CFRT kasvaimen verisuonistoon ja hypoksia, valitsimme eturauhassyövän malli, koska CFRT enintään yhteensä annoksilla 74-80 Gy on merkittävä rooli paikallinen eturauhassyöpä potilailla [18], ja koska vaste eturauhasen kasvaimia säteilytys on erittäin herkkä hypoksia [19], [20]. Lisäksi eturauhasen syöpiä näyttöpääte kasvun pysähtymisen ominaisuudet kuin hallitseva tila säteilyn aiheuttamaa solukuolemaa [21], [22], ja tämä hidas liike solukuolema RT voivat suurelta osin vaikuttaa kasvaimen uudelleenhapetukselle. Analysoimme kehitys kasvain ja verisuoniston rakenteellisia ja toiminnallisia muutoksia ja niiden vaikutusta kasvaimen microenvironment käyttäen kliinisesti relevantti fraktiointiin järjestelmä (2 Gy x 5 jakeet /viikossa 2 viikkoa) käytettäessä potilaalle tehdä eturauhassyöpää malli. Tuloksemme viittaavat siihen, että toisaalta sen hypofractionated sädehoito, CFRT ei vaikuta suonitiheys, mutta remodels kasvaimen verisuoniston lisäämällä verisuonia kattavuutta, parantaa aluksen perfuusio ja mikä alentaa hypoksia.

Tulokset

Tavanomaisesti fraktioitua säteily terapiassa valvonta eturauhasen kasvaimen kasvua

tutkia muutoksia kasvaimen ja sen mikroympäristölle aikana kliinisesti merkittävää protokolla sädehoitoa, me aiheuttama potilaalle tehdä eturauhassyöpää hiirillä. Kaksi viikkoa sen jälkeen, kun soluja injektoitiin, kasvain eläimet saivat päivittäisen annoksen 2 Gy Säteilytyksen keskitetty alavatsan, jokaisena päivänä viikossa kahden viikon ajan (tavallisesti fraktioitu sädehoito, CFRT, Fig. 1A). Tämä protokolla jäljittelee kahden ensimmäisen viikon sädehoidon eturauhassyöpäpotilailla. Eläimet lopetettiin ja analysoitiin 0 (ei säteilytetty), 1 (2 Gy), 3 (6 Gy), 7 (10 Gy) ja 14 päivää (20 Gy) hoidon aikana. Kuten odotettua, säteilytys johti huomattavaan vähenemiseen kasvaimen painoa verrattuna ei-käsiteltyihin eläimiin (säteilytetty: 237 ± 37 mg vs. ei-säteilytetty: 777 ± 135 mg, p 0,01, Fig. 1 B). Myös säteilytys oli etuoikeutettu vaikutus jakautuviin tuumorisoluihin verrattuna viereisten terveiden kudosten (Fig. 1 C). Vähentäminen soluproliferaation näkyi päivästä 1, ja selvempiä ajan (-54% at T14 vs. t0, p 0,01, Fig. 1 D, E). Samanaikaisesti solukuoleman kasvaneet nopeasti päivänä 3 (+ 109%, p 0,05) ja pysyi kuin huomattavasti korkeampi kuin perustason jälkeen (Kuva. 1 D, F). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset ovat linjassa hitaasti kineettinen vasteet havaittiin eturauhasen syöpäpotilaille.

(A) Kaavio tavanomaisen fraktioitua sädehoitoa (CFRT) -protokollaa käytetään hoitoon vakiintuneiden eturauhasen kasvaimia. (B) Paino dissekoitujen kasvainten jälkeen ilmoitetun ajan CFRT. Arvot = keskiarvo n≥6 ± sem. Tilastollinen vertailu vs. t14 säteilytetty. (C) Esimerkki kasvaimen käsitelty viikon, joka esittää TUNEL + kasvainsoluja ( ”T”) ja normaalin viereisiin kudoksiin ( ”N”) pääasiassa TUNEL-. Kasvain ja normaalit kudokset tunnistettiin DAPI perustuu ydinten morfologia, koko, värjäyksen voimakkuus ja alueellinen organisaatio soluja. (D) Pseudo-konfokaali kuviin kasvaimista aikana CFRT, värjättiin Ki-67 /TUNEL /CD31. (E, F) Kuva kvantifiointiin solujen lisääntymistä (Ki-67-indeksi, E) ja solukuolemaa (TUNEL indeksi, F). Tilastollinen vertailut vs. t0.

CFRT vähentää hypoksia ja lisää kasvaimen perfuusio

Hypoksia tulokset hapesta liikakulutus kasvainsolujen sekä kasvaimen verisuonten poikkeavuus. Voit selvittää mallia hypoksia, suuri radioresistance tekijä aikana CFRT, käytimme ulkoista merkki EF5 [23], jossa korostetaan vakavia ( 0,2% O

2), radiobiologically-asiaan hypoksian (Kuva. S1A-C ). EF5-positiivinen pinta kohtalaisesti lisääntynyt päivänä 1 (+ 45%), mutta ei merkittävästi, joidenkin hypoksinen lähialueilla verisuonten, mikä viittaa siihen, että kaikki suonet perfusoitiin (Fig. 2A-B). Kuitenkin hypoksia vähenivät kaikissa myöhemmissä ajankohdissa, saavuttaa vain 11,4% t0 2 viikon (p 0,05, Fig. 2A-B).

(A) Pseudo-konfokaali kuviin kasvaimista aikana CFRT, värjättiin hypoksia (EF5) ja endoteelisolujen (CD31). (B) Kuva määrällistä EF5 + pinnan kasvaimissa aikana CFRT. Arvot edustavat keskiarvoa n≥13 per piste ± sem. (C) Pseudo-konfokaali kuviin kasvaimista perfusoitiin Hoechst 33342 ja 10 kDa /2 MDa dekstraaneja ennen (t0) tai 2 viikon kuluttua CFRT (T14). SYBR green käytettiin vastavärinä koko solutumien. (D, E, F) Kuva kvantifiointia Hoechst + (D), ja väliaine (E) ja suuri (F) dekstraani + pinnat kasvainten aikana CFRT (n = 6). (B, D, E, F). Tilastollinen vertailut vs. t0.

arvioimiseksi aluksen toiminnallisuutta, fluoresoivat molekyylit erikokoista laskimoon. Suuri (2 MDa dekstraani) molekyylejä, jotka jäävät suonensisäinen tilin perfuusion, keskipitkän (10 kDa dekstraani) välimainosten diffuusio ja pienet (Hoechst 33342, 616 Da) ja läpäisevyys. Vaikka ei säteilytetty kasvaimia, vain erillisinä alueina positiivisesti värjättyä, jakelu pinnan kaikkien molekyylien pitkälti lisääntyi 2 viikon kuluttua CFRT ja oli homogeeninen (Fig. 2C-F). Jakelu Hoechst saavuttanut arvon, joka on lähellä normaalin eturauhasen (t0: 0,10 vs. t14: 0,33, p 0,01, Fig. 2C-D, normaali: 0,41, Fig. S2). Yleinen pinta väliaineen (10 kD) ja suuri (2 MDA) Dekstraanien lisääntyi myös (t0: 0,011 vs. T14: 0,029, p 0,05, Fig. 2C, E ja t0: 0,0054 vs. T14: 0,010, p 0,05, Fig. 2C, F), vaikka ei verrattavissa normaaleissa kudoksissa (0,12 ja 0,02, Fig. S2) kuin mikroverisuonitiheys (MVD) on ≈ 3 kertaa pienempi kasvaimia (Fig. S3A-C). Molemmat dekstraanit pysyi välimerkein, osoittaa mitään merkkejä merkittävää diffuusio, jotka edustavat alus leakiness (2 MDA) tai epänormaali läpäisevyys (10 kD). Samanlainen kasvu riippumatta molekyylin koko on sopusoinnussa kasvu perfuusio (esim. Lisääntynyt veren virtaus). Kiinnostavaa kyllä, mitään merkittävää kasvua perfuusio havaittiin normaalissa eturauhasessa acini (Fig. S4A-D). Siten CFRT ensisijaisesti parantaa aluksen perfuusiota yhteydessä kasvaimen microenvironment.

CFRT ei aiheuta muutoksia suonitiheys, koon tai jakeluun

Parannettu perfuusiota yhteydessä kasvain kemoterapia on liittynyt verisuoni normalisoituminen sekä voimistaa sädehoidon [24]. Kuitenkin, muutokset kasvaimeen liittyvän verisuoniston aikana CFRT ei ole tutkittu. Siksi tutkittiin mikroverisuonitiheys ja rakenne kasvaimissa säteilytetään eri aikoina. MVD oli vakaa aikana kokeen, 51 ± 8 mikrosuonten /mm

2 t0 54 ± 7 at t14 (Fig. 3A), toisin kuin säteilyttämätön kasvaimet, joka osoitti merkittävää kasvua (47 ± 7 80 ± 8, p 0,01, Fig. S5a, B). Huomattavaa on, että tämä on selvästi pienempi kuin havaittiin normaalissa eturauhasessa kanssa MVD 166 ± 6 (Fig. S3C, p 0,01 vs. kasvainta t0), mikä voi selittää hypoksiaa havaittu hoitamattomilla kasvaimia. Ylläpitäminen MVD sai meidät onko endoteelisolujen kuolema tapahtuu aikana CFRT. Siksi mittasimme TUNEL indeksi CD31 + soluihin. CFRT ei aiheuttanut EY kuolema (Fig. 3C, D), vaikka taipumus päivänä 1 (+ 28%, p = 0,37), joka oli johdonmukainen ei-merkitsevä MVD minimi päivänä 3 (Fig. 3A). Lisäksi määrä Tunel + värjäys ei vastannut massiivinen endoteelisolujen vaurioita. Seuraavaksi jotta otetaan huomioon verisuonten jakelu heterogeenisyys, määritimme etäisyyttä solujen (tunnistetaan DAPI) lähimpään alukselle. Käyttäen tämän analyysin vähäistä ja ohimenevää MVD vähentäminen havaittiin päivänä 3 (Fig. 3A) johti lievän, mutta unsignificant siirtyminen solujen kohti teoreettisesti hapenpuuteympäristössä ( 100 pm päässä lähimmästä aluksesta, Fig. 3B). Kuitenkin aika, jolloin hypoksia ei ollut läsnä, ja perfuusio oli täydennetty (T14), etäisyys profiilia solujen verisuonten oli identtinen säteilyttämätön kasvain (t0: 21,3 vs. t14: 24,9% soluista yli 100 um). Lisäksi arvot olivat suurelta osin kauempana kuin kohdataan normaalissa eturauhasessa (S3A, F). Siten lisääntynyt toimitus Hoechst /Dekstraanien havaittu säteilytyksen jälkeen saattaa johtua aluksen määrän sijasta laatuun. Siksi olemme analysoineet aluksen verkon morfologia skannaamalla kudoksissa yli 100 um paksuus. Kuitenkin, verrattuna säteilyttämätön kasvaimia, kasvaimet kerättiin päivänä 14 aikana CFRT eivät osoittaneet eroa astiassa aluevaltaus (t0: 8.9 haara /mm vs. T14: 7,6, p = 0,32; Fig. 3E, F), halkaisija (t0: 9.5 um vs. t14: 8,6 pm, p = 0,21). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että alennettu hypoksia /täydennetty perfuusion aikana CFRT ei korreloi paremmin verisuonitiheydessä, topografia tai morfologiaan.

(A) mikroverisuonitiheys kasvaimissa aikana CFRT. Arvot edustavat keskiarvoa n≥13 per piste ± sem. (B) Etäisyys profiilin solujen välillä ja lähimmän verisuonen tuumoreista aikana CFRT. Profiilit perustuvat n≥13. Tilastollinen vertailut vs. t0. (C) Pseudo-konfokaali kuvia kasvaimeen liittyvistä verisuonista (CD31 +) värjättiin TUNEL aikana CFRT. Nuolet: TUNEL + /CD31 + solut. (D) Kuva määrällistä CD31 + /TUNEL + pinta. Arvot edustavat keskiarvoa n≥13 per piste ± sem. (E) edustaja Z-pino kuvia 100 pm paksu tuumorisektioiden ennen (t0) tai 2 viikon kuluttua CFRT (T14) ja värjättiin verisuonten (CD31 + /Fli-1 +). (F) Kuva-analyysi verisuonten verkon 100 pm paksu tuumorisektioiden. Arvot edustavat keskiarvoa n = 9 per piste ± sem.

CFRT indusoi kypsyminen verisuonen seinämään

Epänormaali tuumoriverisuoniin esiintyy usein ei-jatkuva endoteelin seinään, jolloin pahentunut läpäisevyyden ja leakiness. Ymmärtääkseen endoteelin seinä koheesio, me värjättiin Zonula-occludens (ZO) -1, proteiini osallistuu tiukka liittymissä. Endoteelin (CD31 +) – erityiset ZO-1-indeksi oli merkittävästi voimistunut 2 viikon kuluttua CFRT (+ 38% t0, p 0,05; Fig. 4A, B). Vielä tärkeämpää on, tämä oli yhteydessä lisääntyneeseen kattavuus endoteelisolujen alpha sileän lihaksen aktiini (SMA) positiivisia soluja (+ 111% t0, p 0,05; Fig. 4A, C). Konfokaalimikroskopialla ja histogrammi analyysi, ZO-1 vahvistettiin endoteelin (sisällä CD31-ilmentäviä soluja) ja jatkuvasti ilmaistuna, erityisesti säteilytyksen jälkeen (kuva. S6A-B). Vastakkaisiin, SMA oli ei-endoteeli- ja asetettu rinnakkain endoteelin seinään. Tarkat luonne verisuonia soluja, kudokset yhteistyössä värjättiin desmiinille, eli pericyte merkki [25]. Sen lisäksi, että SMA-indeksi, desmiinille + verisuonia solut kasvanut (t0: 0,034 vs. T14: 0,065, p 0,01; Fig. 4D). Lisäksi SMA ja desmiinin koekspressoitiin saman solut (Fig. 4E, F). Myös taajuus desmiinille + /SMA + katettu alusten kaksinkertaistui vuosien päivinä 0 ja 14 CFRT (t0: 20,0 vs. T14: 39,4, p 0,05). Huomattavaa on, että SMA ja desmiinille myös koekspressoidusta harvinainen katettu ei säteilytetty alusta (Kuva. S7). Normaalissa eturauhasessa, desmiini ilmaistiin sekä mikro- (intra-acini) ja makro (inter-acini) paineastiat, vaikka SMA on tiukasti rajoitettu makro-alusten (Fig.S3A, D-E, kuva. S8A-B). Myöskään säätelyä SMA havaittiin säteilytettyä normaalissa pienten verisuonten (Fig. S9A, C), eikä ei säteilytetty kasvain pienten verisuonten (Fig. S5c, D). Täten kasvua perivaskulaaristen desmiinille + /SMA + soluja on erityinen säteilytettyä kasvaimen mikroverisuonten.

(A) Pseudo-konfokaali kuvia kasvaimen verisuonten aikana CFRT ja värjättiin ZO-1 /CD31 (ylhäällä) tai SMA /CD31 (alhaalla). (B, C). Kuva kvantifiointi ZO-1 + /CD31 + (B) ja peri-CD31 + SMA pinnat (C). Arvot edustavat keskiarvoa n≥13 per piste ± sem. (D) Kuva kvantifiointia peri-CD31 + desmiinille pinta ja tiheys desmiinille + /SMA + alusta. (B, E, D) Tilastollinen vertailut vs. t0. (E) edustaja konfokaali kuvia verisuonen peräisin 14 päivän kasvaimen värjättiin CD31 /desmiinille /SMA. (F) histogrammin analyysi CD31 /desmiinille /SMA pseudovärin profiilia konfokaali kuvan poikkileikkauksen.

Keskustelu

Vaikka useat tutkimukset viittaavat siihen, että säteilytys johtaa aluksen tuhoutuminen, vaikutus tavanomaisesti fraktioitu säteilytys on ollut paljolti hyödyntämättä. Käytimme potilaalle tehdä malli eturauhassyövän kanssa kliinisesti relevantti fraktiointiin järjestelmä, joka indusoi vaatimattomia solukuoleman, lisäämällä leviämisen pidätys annokseen ja ero vaikutuksen välillä normaali /syöpäsoluja. Huomaamme, että CFRT lähes kumottu kasvaimen hypoksia 2 viikon kuluttua hoidon sekä lisääntynyt perfuusio. Yllättäen nämä vaikutukset eivät liittyneet merkittäviä muutoksia astiassa morfologiassa tai tiheys vaan pikemminkin fenotyyppisiä kypsymistä verisuonen seinämään, kuten endoteelisolujen (CD31 + /ZO-1 +) ja perisyyteissä (desmiinille + /SMA +). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että verisuonten sopeutuminen näyttelee kattamaton osassa kasvaimen uudelleenhapetukselle aikana fraktioitua sädehoitoa.

Emme havainneet jyrkkä nousu apoptoottisten endoteelisoluissa 24 jälkeen päivittäin 2 Gy säteilytyksillä, ja MVD pysyi vakaana, johdonmukainen viimeaikaisen tiedot normaalissa aivojen verisuonissa [13]. Nämä tulokset ovat vastakkaisia ​​aikaisempien tutkimusten avulla suurempi annos säteilytyksen, jossa endoteelisolujen kuolemaan ja lasku suonitiheys raportoitu, vaikka aiemmin ajankohtina [2], [4]. Erityisesti jakeet 4 ja 12 Gy 2-3 viikon lisännyt endoteelisolujen kuolemaan ja laski MVD ihonalainen kasvaimissa [8], [9], [10]. Tämä on yllättävää, koska endoteelin apoptoosin ajatellaan tapahtua vain kerta-annoksilla ≥ 10-15 Gy [2], [4]. Kuitenkin EY kuolema saattaa riippua kasvain asetus, koska vain pieniä verisuonten muutoksia todettiin 24 kerta-annoksen jälkeen 15 Gy toisessa eturauhassyöpämallin [26]. Eri endoteelisolujen valtioiden välillä tutkimuksia voi selittää erot radioherkkyyttä, sillä lepotilassa endoteelisolujen ovat vastustuskykyisempiä DNA aiheuttaman vaurion säteilytys, mutta ei lyhyen aikavälin kalvo-solukuolema [14] [15]. Tämä saattaa selittää, että havaittu nousu perisyytti- kattavuuden ja perfuusio oli merkittävä vain säteilytettyyn kasvain lokero, jossa microvascular ympäristöön voivat olla herkemmin /sallivampi. Nämä tulokset havainnollistavat monimutkaisuutta kasvaimen verisuonistoon ja sen heterogeeninen vastaus hoitoja. Ehkä tärkeyttä potilaalle tehdä asetus on usein aliarvostettu, koska verisuonet näyttää vahva heterogeenisuus välillä elinten (esim androgeenireseptorin lauseke eturauhasen endoteelin, veri-aivoesteen jne ..). Todellakin, PC3 johdettu kasvaimia kasvanut ihon alle on olennaisesti suurempi aluksen koon ja tiheyden (≈ x3, tuloksia ei ole esitetty). Tärkeintä on, viimeaikaiset tutkimukset käyttämällä suurempia murto annokset ovat yhtä mieltä meidän työtä laskua kasvaimen hypoksia ja lisääntynyt verenkierron yhdessä pericyte kattavuus [9], [10], paitsi yksi ilmoittaa käyttävänsä erittäin korkea (30 Gy) kerta-annos säteilytys [ ,,,0],27]. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että lisääntynyt verisuonia kattavuus voisi olla keskeinen rooli astiaan perfuusio ja uudelleenhapetukselle jälkeen fraktioidaan säteilytys.

säilyttäminen verisuonisto on nyt suhtauduttava myönteisesti syövän hoitoon, koska käsite verisuonten normalisointi. Käsite pidemmälle havainto oli, että tuhoaa verisuoniston tuottaisi hypoksia, joka tekee säteilytys vähemmän tehokkaita. Alkuperäinen havainto oli, että esto overproductive angiogeneesin anti-VEGFR2-vasta väliaikaisesti rekrytoi perisyyteissä ja downregulates kasvaimen hypoksia [24]. Koska hallitsematon EY itämistä on liittynyt ei-toiminnalliset angiogeneesiä, säteilytys aiheuttama karsinta verisuonten ituja voi heikentää verkon monimutkaisuus ja parannettu perfuusiota [15]. Emme kuitenkaan ole löytänyt keskeisiä piirteitä, jotka luonnehtivat normalisoitu verisuonia vuodesta aluevaltaus, MVD, mutkittelevuus ja suonen halkaisijan pysyivät ennallaan. Vaikka perfuusio oli samanlainen joitakin kuin normaalin eturauhasen, alus fenotyyppi oli selvä, korkeammat ZO-1 säteilytettyyn aluksia kuin mitä normaalisti kohdataan. Lisäksi normaalin eturauhasen, kehä mikro-alusten oli johdonmukaisesti desmiini + /SMA-, kun taas SMA ilmentyminen tiukasti rajoitettu suurten muun-acini aluksia. Tämä verisuonten hierarkia on myös löydetty ihmisen näytteissä [28]. Sen sijaan säteilytetty kasvain mikro-aluksia (≈ 10 pm halkaisijaltaan) saadut verisuonia SMA ilme. Nämä tulokset osoittavat, että astian seinä voi eriyttää yksilöllisesti säteilytyksen jälkeen, sopusoinnussa muiden raporttien verisuonia soluvasteen tulehduksellinen stressiin (TGFb, PDGFb).

Aberrant endoteelin junktionaalinen proteiineja, kuten ZO-1, voi esiintyä puuttuessa endoteelisolujen polarisaation [29] tai pian (esim min.) säteilytyksen jälkeen [30]. Kuitenkin lisääntynyt endoteelisolujen ZO-1 havaittu tässä 2 viikon kuluttua on todennäköisesti liittyvät aluksen vakauttamiseen vuodesta 1) meidän perfuusion tiedot viittaavat siihen, että useimmat alukset tehokkaasti lumenized ja 2) rakenteessa ZO-1 on kalvomainen, lineaarinen ja jatkuva. Mitä verisuonia kypsymisen, läheinen yhdessä CD31-vasta- endoteelisolujen ja läsnäolo kaksi markkereita (desmiinille /SMA) tunnistaa ympäröivän solujen perisyyteissä [25]. Perivaskulaarinen solut ovat tärkeitä säätelijöitä verisuonten muodostumista, vakauttaminen, remontin ja toiminta tuottaa kypsä, lepotilassa verisuoniston [31]. Kypsytys alusten tapahtuu vastavuoroinen paracrine signalointi, jossa EY-johdettu tekijät houkuttelevat perisyyteissä ja myöhemmin hyväksi perustamista endoteelisolujen liittymien [32]. On tärkeää, pericyte-erittämä vihjeet suojaavat hankittua säteilyltä aiheuttama kuolema

in vitro

[33]. Tämä viittaa siihen, että aluksella ei pericyte kattavuus olisi alttiimpia säteilytys, kuten arveltu äskettäin Chen et al [9]. Siksi fraktioitu säteilytys hoito, joka mahdollistaa verisuonten kypsymisestä, voi parantaa kasvaimen verisuonten toimintaa.

Tuloksemme osoittavat vähentämisestä hypoksisen fraktion kahden viikon kuluttua hoidon ja ovat yhtä mieltä viimeaikaisten tietojen ihonalainen kasvaimissa [9 ], [10], [34]. Kasvaimen uudelleenhapetukselle määriteltiin käsite että kroonisesti hypoksisia kasvainsoluja saada paremman pääsyn happea aikana fraktioitua sädehoitoa koska aerobinen kasvainsoluja eliminoidaan edellinen jakeet [35]. Mallissa, kasvaimen uudelleenhapetukselle tapahtui paitsi yhteydessä laski kasvainsolujen proliferaatiota ja lisää solukuolemaa, mutta myös parantunut toiminnallisuus verisuoniston osoituksena perfuusio ja levittämisen pieniä molekyylejä. Tämä tarkoittaa sitä, että kasvaimen uudelleenhapetukselle ei ole vain lisääntyneen kasvainsolujen tappamista ja vähemmän hapen kulutusta, vaan myös parempi jakautuminen happea verisuonia. Eri kokeellisen kasvaimen malleja sekä kliinisissä tutkimuksissa, intertumoral heterogeenisyys kinetiikka hapetuksessa fraktioitua joutui [36], [37], [38], [39]. Esimerkiksi okasolukarsinoomia, hypoksia laskivat CFRT useimmissa kasvainlinjojen, kun taas joissain kasvainsolulinjoissa ajallista kasvua tai mitään muutosta ei havaittu ja osa perfusoitiin alusten ja verisuoni alue osoitti vain vähäisiä muutoksia [34]. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että aikana CFRT, vakauttaminen alusten on välttämätöntä, jotta 2

nd viikko jakeet tehostuu. Vaikka on yhä enemmän kiinnostusta suuren annoksen hypofractionated protokollia, erityisesti eturauhassyövän potilailla [40], nämä tiedot esittää kysymys, onko tällainen protokollien säilyttää etu kasvaa happipitoisuus ja siten terapeuttinen indeksi [41]. Muissa kasvainmuodosta kuitenkin hypofractionated (3 Gy /jae sädehoidon) hapetuksen tehostaminen vasta alkuvaiheessa hoidon, mutta johti huomattava lasku kasvaimen hapettuminen myöhemmässä vaiheessa säteilytys ( 45 Gy) [42]. Siten enemmän tietoa tarvitaan suhteen vaikutus verisuonten kypsyminen on radioherkkyyttä syöpäsolujen.

Yhteenvetona olemme huomanneet, että perinteisesti fraktioitu säteilytys indusoi verisuonten kypsymistä sekä lisääntynyt perfuusio /vähentynyt hypoksiaa. Nämä tulokset merkitsevät sitä, että verisuonten mikroympäristö on rooli kasvaimen uudelleenhapetukselle, lisäksi tunnettuja vaikutuksia kasvainsoluihin. On epäselvää hypofractionated protokollia voi mahdollistaa verisuonten kypsyminen tai sen sijaan johtaa verisuonten sterilointia ja hypoksiaa. Kuvatun kaltainen protokollien kasvaimen verisuonten ja kliiniseen tulokseen pitäisi olla mahdollisuus lisätutkimuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Orthotopic eturauhasen kasvainten synnyssä ja kudosten kerääminen

Seven -week vuotias mies NMRI-nude-hiirten (Janvier, Saint Berthevin, Ranska) nukutettiin käyttäen ketamiini /ksylatsiinin (50/15 mg /kg) ja 2 x 10

6 PC3-luc soluja (Caliper Life Sciences, Villepinte, Ranska ) injektoitiin vasempaan dorsolateral etu- rauhasen lohkoon leikkauksella. Kahden viikon kuluttua kasvain otto todennettiin luminesenssi käyttäen PhotonImager (BiospaceLab, Pariisi, Ranska) ja ryhmät, joilla on samankaltaisia ​​kasvaimen bioluminenssina signaali muodostettiin. Kokeet aloitettiin 3 päivää myöhemmin. Tarvittaessa eläimet tapettiin, kudokset leikattiin irti ja painotettu tarvittaessa ja pakastettiin (-80 ° C) upotettiin OCT väliaineessa (Sakura Finetek, Villeneuve D’Ascq, Ranska). Näytteitä kerättiin tuolloin seuraavan CFRT jae, analysoida kasvaimen valtiolle aika, jolloin se tulisi käsitellä.

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Eurooppa-neuvoston direktiivi 2010/63 /UE ja hyväksymä paikallinen Animal Care ja Käytä komitean (Comité d’Ethique en kokeilua Animale des Pays-de-la Loire, C2EA-06).

In vivo

hypoksia ja perfuusio

Hypoksia ja perfuusiota määritettiin käyttämällä markkereita, jotka annettiin iv suolaliuoksessa puskurissa. Hypoksian, 300 ui 3 mg /ml EF5 (hypoxia-imaging.org) injektoitiin 2 tuntia ennen uhraamista [23], [43], kun taas 300 ui sekoitettua perfuusion markkereita (1,6 mg /ml Hoechst 33342, 0,6 mg /ml Alexa

647-10 kDa dekst- ja 3 mg /ml rodamiini-2 MDa dekstraani, Life Technologies, Saint Aubin, Ranska) injektoitiin 3 min ennen kudoksen keräys [44] kudokset olivat snap-jäädytetty, cryosected, vastavärjättiin SYBR Green (Fisher Scientific, Illkirch, Ranska) koko solutumien ja asennettu Prolong Gold ilman DAPI (Life Technologies).

Sädehoito

Säteilytykset suoritettiin käyttäen CP-160 X-ray säteilyttäjällä (Faxitron-yksikköön, Lincolnshire, IL), jossa on 0,3 mm Cu-suodatin, kiihdytysjännitteellä 160 kV ja annos oli 1,3 Gy /min. Eläimet saivat annoksen (murto) 2 Gy päivittäin maanantaista perjantaihin kaksi viikkoa, keskitetty alavatsan alalla 2 cm x 2 cm käyttäen johtavat suojukset suunniteltu minimoimaan säteilytys normaaleissa kudoksissa ja luut (lantio). Tämä järjestelmä (jolla tässä tarkoitetaan perinteisesti fraktioitua sädehoitoa, CFRT) on Normaali hoitokäytäntö eturauhassyöpään.

immunohistokemia

Kudokset cryosected 5 um paksuus (lukuunottamatta verkkoanalyysissa: 100 m) , kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja permeabilisoitiin 0,05% Triton-X100. IHC tehtiin käyttämällä standardia värjäystä ja pesukäsittelyjä [45]. Useiden värjäystä vasta-inkuboitiin peräkkäin: ensimmäinen, yön yli sen jälkeen toissijaisen ja vahvistamisesta, sitten CD31 toisena ja SMA kolmantena. Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: rotan anti-hiiri-CD31 (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Ranska), kanin anti-ZO-1 (Life Technologies), kanin anti-desmiini (Ozyme, St-Quentin-en- Yvelines, Ranska), kanin anti-Ki67 (Dako, Les Ulis, Ranska), kanin anti-Fli1 (Fisher Scientific) Alexa488 konjugoidulla hiiren anti-EF5, Cy3-konjugoitu hiiren anti-alfa sileän lihaksen aktiini (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Ranska). Toissijainen vasta-aineet olivat: Alexa

647-konjugoitua vuohen anti-kani, Alexa

488-konjugoitua vuohen anti-rotta (Life Technologies). TUNEL suoritettiin valmistajan suosittelema (Roche, Boulogne-Billancourt, Ranska) viimeisenä värjäysvaihetta. Kalvot kiinnitettiin Prolong Gold DAPI (Life Technologies) ja ytimet counterstaining (paitsi perfuusion määritystä).

Kalvot havaittiin alle Axiovert 200M ApoTome ( ”pseudo-konfokaali”) mikroskooppi, jossa Axiovision 4.8 ohjelmisto ( Carl Zeiss, Le Pecq, Ranska). Mosaiikki Kenttien enintään 4 mm

2 kirjattiin vuoden 63x öljy tavoite, ja neljä Z-vaiheet 1 um pinottu yhdeksi kuvaksi. Viipaletta 100 pm paksuus oli yleensä kirjattu ≈ 60 Z-vaiheet 1 um, mikä johtuu kudosten madaltuminen jälkeen nestehukka. Konfokaalimikroskopia tehtiin kanssa A1R (Nikon Instruments, Champigny-sur-Marne, Ranska), jossa Nis-Elements, numeerinen aukko on 1 ja viipale skannaus keskiarvoistamista 4.

Kuva-analyysi

Analyysit tehdään pakkaamatonta alkuperäinen 16-bittinen korkearesoluutiokuvien mosaiikit (pseudo-konfokaali), lukuun ottamatta jakaantumismalli pitkin astian poikkileikkaus (konfokaali; ”histogrammi analyysi”, katso myöhemmin). Kahdenlaisia ​​arvot rekisteröitiin: arvot pinta-analyysin perusteella vastaavat värjäystä pintoihin (im

2) pidetään positiivisena värjäytymistä kiinnostavaan (ex, CD31 alue) jaettuna pinta kiinnostuksen kohteena olevan alueen (ROI; ex yhteensä kudos); arvot oliopohjaisille analyysit vastaavat absoluuttinen useita tekijöitä pitää positiivisena (entinen, alusten lukumäärä) jaettuna pinta ROI (ex yhteensä kudosta).

Surface-pohjainen analyysit suoritettiin käyttäen ImageJ 1.46r ohjelmisto (National Institutes of Health, USA).