Krooninen sairaus

tiivistelmä

maksasolusyövän (HCC) on yksi tärkeimmistä maligniteettien maailmanlaajuisesti ja on yhteydessä huonoon ennusteeseen asianmukaisesti korkea ilmaantuvuus etäpesäkkeiden ja kasvaimen uusiutumisen. Edellisessä tutkimus osoitti, että yli-ilmentyminen p21-aktivoidun proteiinikinaasin 1 (PAK1) havaitaan usein HCC ja liittyy tuumorien aggressiivisempaa käyttäytymistä, mikä viittaa siihen, että PAK1 on potentiaalinen terapeuttinen kohde HCC. Nykyisessä tutkimuksessa allosteerisessa pienimolekyylisiä PAK1 estäjä, IPA-3, arvioitiin mahdollisten tukahduttamaan hepatokarsinogeneesin. Johdonmukaisia ​​muiden raporttien, esto PAK1 vaikutus havaittiin useissa ihmisen HCC solulinjoja käsiteltiin erilaisilla annoksilla IPA-3. Käyttämällä solujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumisen ja BrdU määritykset, osoitimme, että IPA-3 hoito esti merkitsevästi kasvua HCC soluja. Mekanismeja, joilla IPA-3 hoito estää HCC solukasvua ovat parannus apoptoosin ja lukkiutuvat NF-KB. Lisäksi meidän tiedot osoittivat, että IPA-3 paitsi estää HCC solujen kasvua, mutta myös estää metastaattista potentiaalia HCC soluja. Nude mouse -ksenografti määrityksessä osoitti, että IPA-3 hoito vähensi kasvaimen kasvua ja laski kasvaimen tilavuus, mikä osoittaa, että IPA-3 voi estää

in vivo

kasvaimen kasvua HCC soluja. Yhdessä meidän osoitus mahdollisesta prekliinisen tehoa IPA-3 HCC antaa perustelut syöpähoidon.

Citation: Wong LL-Y, Lam IP-Y, Wong TY-N, Lai WL, Liu HF, Yeung LL, et al. (2013) IPA-3 estää niiden kasvun maksasyövän Cells tukahduttamalla PAK1 ja NF-KB: n aktivaatio. PLoS ONE 8 (7): e68843. doi: 10,1371 /journal.pone.0068843

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 helmikuu 2013; Hyväksytty: 3 kesäkuu 2013; Julkaistu: 19 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Wong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Hongkongin Research Fund for Control of Infectious Disease (nro 09080782) ja Hong Kong Research Grant neuvosto (HKU 7 /CRF /09), University of Hong Kong (Small projektivarat 201109176021 on LLY Wong ja YP ching). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Yick-Pang Ching on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Koska kuudenneksi yleisin pahanlaatuinen kasvain ja kolmanneksi yleisin syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa, maksasolusyövän (HCC) on vastuussa yli miljoona kuolemaa vuodessa [1]. HCC on yhteydessä huonoon ennusteeseen johtuen korkeasta ilmaantuvuus kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäke [2]. Maksaresektio on yksi tärkeimmistä hoitojen tällä hetkellä, mutta on edelleen epätyydyttävä, koska korkeat uusiutuminen [3]. Näin ollen kehittää uusia hoito-HCC tarvitaan.

yli-ilmentyminen p21-aktivoidun kinaasi 1 (PAK1) on usein HCC [4]. Se on alavirtavaikuttajainhibiittorit pienen Rho GTPaasi, kuten Rac1 ja Cdc42, joka säätelee erilaisia ​​solun prosessit, myös solusyklin etenemisen, solun liikkuvuus, solu napaisuus ja apoptoosin [5]. Aktivoidut Rho GTPaasina sitoutuu PAK on Cdc42 /Rac interaktiivinen sitoutuminen (CRIB) domain, jolloin helpotusta autoinhibitorinen domain (AID), myöhempi autofosforyloinnin katalyyttinen domeeni ja kinaasiaktivaatiota [6]. Niistä useita autofosforylaatiota sivustoja, treoniini-423 (T423) on erityisen tärkeää torjua autoinhibition ja ylläpitää täydellinen aktiivisessa tilassa [7].

IPA-3 (2,2′- dihydroksi-1,1′ dinaphthyldisuifide) on erittäin selektiivinen, ei-ATP-kilpailukykyinen allosteerinen estäjä PAK1 joiden ylivilkkaus on osoitettu olevan läheistä sukua tuumorigeneesiin [8]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että IPA-3 esti Cdc42 aiheuttamaa PAK1 autofosforylaatio päälle T423 ja estivät merkitsevästi PAK1 katalyyttinen aktiivisuus [8], [9]. Estovaikutuksen IPA-3 saavutetaan osittain sitoutumalla kovalenttisesti sääntelyn verkkotunnuksen PAK1 mikä puolestaan ​​esti fyysisen vuorovaikutuksen Cdc42 tai muiden GTPaasina aktivaattoreita [9]. IPA-3-kohdistaminen säätelydomaini on vähemmän konservoitunut kinaasien, mikä antaa huomattavan korkea selektiivisyys tämän estäjä [8].

In vitro

tutkimukset osoittivat, että IPA-3 hoito johti samanlaisiin tuloksiin kuin siRNA vaiennettu PAK1, jossa IPA-3 nimenomaan estetty kalvon kuljettaminen WAVE2 ja lamellipodioihin muodostuminen ihmisen rintasyövän solujen [10], ja esti endosyyttistä sisäänottoa ihmisen adenoviruksen serotyyppi 35 eri solulinjoissa [11]. Kuitenkin vaikutus IPA-3 terapeuttisessa hoidossa ihmisen HCC on edelleen huonosti ymmärretty. Tässä tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan mahdollisuuksia IPA-3 tukahduttamaan lisääntymistä ja etäpesäkkeiden ihmisen HCC solujen läpi sarjan

in vitro

ja

in vivo

kokeita. Osoitimme, että hoito IPA-3 oli merkittävä vaikutus apoptoosin, leviämisen ja motiliteettia HCC soluja. Lisäksi IPA-3 pystyi tukahduttamaan

in vivo

kasvaimen kasvua nude mouse ksenografteissa. Siksi meidän data tukiessa todisteita, että potentiaalinen sovellus IPA-3 hallinnassa kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden HCC.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

2,2′- dihydroksi-1,1′-dinaphthyldisuifide (IPA-3) syntetisoitiin ja tri LL Yeung Hong Kongin tiede ja teknologia. Rakenne IPA-3 varmistettiin massaspektrometrialla analyysi. Kantaliuos IPA-3 (100 mM), valmistettiin juuri DMSO: hon. Muut kemikaalit, ellei sitä nimenomaisesti olivat Sigma-Aldrich korkeimmalla laatu.

Cell Culture

Ihmisen HCC-soluissa H2M-, H2P ja ihmisen ei-tuumorigeenisiä, ikuistettu maksa linja Miha olivat Dr. XY Guan osasto of Clinical Oncology, University of Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong [12]. MHCC97L ja MHCC97H solut olivat Maksa Cancer Institute, Fudanin yliopiston Shanghai, Kiina [13]. HepG2 ja Hep3B-solut ostettiin American Type Culture Collection (ATCC). SMMC-7721 ja Bel-7402 olivat lahjoja Shanghai Institute Biokemian ja solubiologian, Kiinan tiedeakatemia. Kaikki solut kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle minimal essential (DMEM), jossa oli paljon glukoosia, johon on lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 1 mM natriumpyruvaattia ja 100 U penisilliini /streptomysiini, 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa.

MTT-määritys

neljä tuhatta H2M- solua kuoppaa kohti ympättiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin normaalissa kunnossa 24 tuntia. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla IPA-3 1 ja 2 päivää. Soluja käsiteltiin 100 ul: lla 5 mg /ml (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (Invitrogen) liuos 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa, kunnes kiteet olivat muodostunut. MTT-liuos poistettiin kustakin kuopasta ja 100 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan kiteiden liuottamiseksi. värin voimakkuus mitattiin mikrolevylukijaa (Bio-Rad) 570 nm: ssä. kukin koe koostui neljästä toistot ja vähintään kolme riippumattomat kokeet suoritettiin.

proliferaatiomääritystä

menetelmä runsaudenmäärityksessä kuvattiin aiemmin [4]. paras istuvuus kasvukäyrä ja kaksinkertaistaa aika laskettiin GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , Inc., San Diego, CA). Lyhyesti, H2M (1 x 10

4), H2P (1 x 10

4), HepG2 (2 x 10

4), MHCC97L (1 x 10

4) tai Miha (2 x 10

4) solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät täydellistä alustaa päivänä 0. joko ajoneuvon ohjaus (DMSO) tai IPA-3 (5 tai 10 uM) lisättiin keskipitkällä päivänä 1. Media tai ilman IPA-3 oli päivitystiheyttä Päivä 3 ja 5. triplikaatit solut trypsinzed ja laskettiin käyttäen solulaskijaa päivänä 3, 4, 6 ja 7 rakentamiseen kasvukäyrän.

Colony muodostumisen määritys

Testi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [14]. Lyhyesti, solut ympättiin 200 solua per kuoppa 6-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät täydellistä DMEM päivänä 0. DMSO tai IPA-3 (5 tai 10 uM) ylläpitäjä median, jotka päivitetään kaksi kertaa viikossa. Päivänä 14, pesäkkeet kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä 15 minuutin ajan ja ne värjättiin 1% kristallivioletilla ennen kvantifiointia.

BrdU

Testi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [15]. Solujen lisääntyminen kvantifioitiin mittaamalla BrdU DNA-synteesin aikana kanssa Cell Proliferation ELISA, BrdU kolorimetrinen kit (Roche Diagnostics). Määritys suoritettiin valmistajan käsikirjan. Lyhyesti, yhtä monta H2M, H2P, Miha, HepG2 tai MHCC97L solut maljattiin 96-kuoppalevyille ja seerumia yön yli. Seerumistarvaatio indusoi solusykliä synkronointi niin, että suurin osa soluista jäädä G1 /S siirtymä juuri ennen S-faasin merkintä. Sitten soluja käsiteltiin joko DMSO: ssa tai eri pitoisuutta IPA-3 (10 ja 20 uM) 15 minuutin ajan, minkä jälkeen FBS täydennystä ja BrdU merkinnät 2, 4 tai 8 tuntia. BrdU merkinnät signaali kvantifioitiin mittaamalla suhteellinen absorbanssi (Abs

370 nm-Abs

492 nm). Kukin määritys tehtiin kolmena kappaleena. Kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa itsenäisesti.

anneksiini V-7ADD Värjäys määritys

havaitseminen apoptoottisen solukuoleman suoritettiin käyttäen PE anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen). Kolmena kappaleena, H2M-solut maljattiin 60 mm: n malja, seerumia yli yön ja sitten se käsiteltiin DMSO: ssa tai IPA-3 (10 tai 20 uM), elatusaineessa, joka sisälsi seerumia, 24 tunnin ajan. Kelluvat solut pestiin pois, kun taas liitteenä solut trypsinoitiin, huuhdellaan ja resuspendoitiin sitomispuskurissa. Värjäyksen jälkeen anneksiini V-PE ja 7-AAD, näytteet välittömästi analysoitiin virtaussytometrialla. Eksitaatio: 488 nm (anneksiini V-PE ja 7-AAD). Emission: 578 nm (anneksiini V-PE), 675 nm (7-AAD). Solut laskettiin näytettä kohti ja tiedot analysoitiin WinMDI (versio 2.8, Joe Trotter).

konfokaalimikroskopia

jälkeen lääkehoitoa, H2M- tai H2P solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi 15 minuuttia, pestiin ja läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 PBS: ssä 15 minuutin ajan [4], [15]. Objektilasit värjättiin TRITC- phalloidin (Invitrogen) 10 minuutin ajan ja immunofluoresenssilla kuvantaminen oli jää Carl Zeiss LSM700 laser konfokaalinen.

TranswellTM migraatiokokeessa

TranswellTM migraatiokokeessa suoritettiin edellä kuvatulla aiemmin [4]. Lyhyesti, H2M (1 x 10

5) solut maljattiin seerumittomassa DMEM on ylempään osastoon ja seerumin-täydennettyä mediumia lisättiin alempaan osastoon Transwell kammion (Corning). Läsnä ollessa tai poissa ollessa IPA-3 (10 uM), seerumin puutteessa solujen annettiin siirtyä 24 tuntia. Tämän jälkeen solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydiä, värjättiin 1% kristalliviolettia ja laskettiin mikroskooppisella kentässä suurennoksella 40X. Kolme eri alojen valittiin satunnaisesti kunkin insertin.

Quantitative käänteistranskriptio-PCR: llä (qRT-PCR) B

seerumia H2M-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman IPA-3 esikäsittelyn (10 tai 20 uM, 15 minuuttia) ja sen jälkeen TNF-α (10 tai 20 ng /ml, 24 tuntia), FBS täydennystä ja yön yli kasvatettua viljelmää. qRT-PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [4]. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA käänteiskopioitiin ensimmäisen juosteen cDNA käyttäen PrimeScript RT reagenssia Kit (Takara, Japani). Reaaliaikainen qPCR suoritettiin käyttämällä SYBR® Green Real Time järjestelmä (Takara, Japani) kanssa My IQTM2 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina, ja sen annettiin normalisointi näytteitä. DNA-sekvenssit PCR-alukkeiden on lueteltu taulukossa S1. qRT-PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa.

Western-blottaus-analyysi

Proteiinin uutto ja Western blotting suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [4], [15]. Immunoblottaus tehtiin PAK1, P-PAK1 (T423), PARP1, paksilliini, P-paksilliini (S178), SAPK /JNK, P-SAPK /JNK (T183 /Y185), lohkaistaan ​​kaspaasi 3 (Cell Signaling Technology), NF KB (Santa Cruz Biotechnology) ja β-aktiini (Sigma-Aldrich), jota seuraa vastaava piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita (GE Healthcare). Signaalit kohdennettujen proteiinien havaittiin Enhanced Chemiluminsence (GE Healthcare). Voimakkuudet Proteiinivyöhykkeet analysoitiin käyttäen Adobe Photoshop CS4.

Nude Mouse Vieraslajisiirteen

MHCC97L soluja (1 x 10

6) injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen 4 viikon ikäisiä nude mouse. Kasvaimen koko laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [4]. Hiiret, joissa kasvaimet keskikoko oli 100 mm

3 ryhmiteltiin hoidon ikäryhmät. Yhteensä 15 hiirtä käytettiin ja jaettiin kolmeen ryhmään (5 hiirtä ryhmää kohti): ohjaus (DMSO), IPA-3 (2 mg /kg) ja IPA-3 (4 mg /kg). IPA-3 formuloitiin DMSO ja hallinnoi kolme kertaa viikossa (TIW) (2 mg /kg tai 4 mg /kg) injektiolla vatsaonteloon (i.p.) tutkimuksen aikana ja kasvaimen koon kirjattiin kahdesti viikossa. Eläinkokeet oli erikseen hyväksynyt Animal (valvonta Kokeet) koskeva asetus luvun 340, Department of Health, Hong Kongin erityishallintoalue (Ref .: (11-786) DH /HA P /8 /2/3 Pt. 33).

tilastollinen analyysi

Kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena ja tiedot esitettiin keskiarvona ± SD. Opiskelijan

t

-testi käytettiin tilastolliseen analyysiin, ja tiedot yli kaksi ryhmää analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) GraphPad Prism 6 seurasi Dunnettin testi. Tulokset pidettiin merkittävinä, kun

P

0,05.

Tulokset

IPA-3 inhiboi PAK1

HCC-solujen on osoitettu olevan korkean endogeeninen PAK1 tasolla, erityisesti erittäin metastaattinen HCC solulinjat [4], kuten H2M-, mutta ei ei-tuumorigeenisen, ikuisti maksasolut, Miha (Fig. 1A). Vaikutuksen tutkimiseksi IPA-3 kasvuun H2M solujen MTT-analyysi suoritettiin. MTT-analyysi osoitti, että IPA-3 tukahdutti leviämisen H2M solujen ajasta ja annoksesta riippuva tavat (Fig. 1 B). Puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) IPA-3 in H2M- soluissa oli noin 28 uM ja 21 uM päivänä 1 ja 2, vastaavasti. Vahvistaa inhiboiva vaikutus IPA-3 PAK1 toimintaa, H2M-soluja pidettiin seerumin puutteessa ja sitten käsiteltiin IPA-3 täydellisessä väliaineessa yli yön. Western blotting -analyysi osoitti, että IPA-3 vähensi annosriippuvaisesti fosforylaation taso PAK1 (Fig. 1 C). Johdonmukaisesti, tulokset osoittivat IPA-3 aiheuttaa lasku PAK1 fosforylaatio yhdessä lasku H2M- solujen elinkelpoisuuden. Lisäksi, fosforylaatio alavirran substraatin PAK1, c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK), vähensi myös, mikä edelleen tukee vähentämiseen PAK1 kinaasiaktiivisuuden IPA-3 (Fig. 1 C). Light mikroskooppitutkimukset IPA-3-käsitellyt solut paljasti voimakkaampia morfologisia muutoksia. Kuva. 1D osoitti morfologisia muutoksia H2M- soluissa jälkeen käsitelty IPA-3. Suurina annoksina IPA-3 (20 ja 40 uM), merkittävä populaatio H2M- solujen tuli pyöreä-up ja irrottaa lautasen.

(A) Suhteellinen proteiinin tasot PAK1 erilaisissa solulinjoissa. Signaali intensiteetit kvantitoitiin ja normalisoitu ottamalla että taso Miha kuin 1. (B) MTT-määritystä päivänä 1 ja 2. H2M- soluja (4 x 10

3) ympättiin 96-kuoppalevyille ja käsitelty eri annoksilla IPA-3. Solut kerättiin, kun oli inkuboitu ja MTT-analyysi suoritettiin, kuten on mainittu Materiaali ja menetelmä. Kuvaaja osoitti elinkelpoisten solujen prosentuaalinen funktiona annos IPA-3 (C) Western blotting-analyysi P-PAK1, yhteensä PAK1, P-JNK ja yhteensä JNK. Seerumipuutteinen H2M- soluja käsiteltiin joko DMSO tai IPA-3 on osoitettu pitoisuus 15 minuutissa ja tämän jälkeen FBS täydennystä ja yön yli kasvatettua viljelmää. (D) H2M-soluja pidettiin seerumin puutteessa ja käsiteltiin IPA-3 (10, 20 tai 40 uM) täydellisessä väliaineessa ja niiden annettiin kasvaa yön yli. Solun morfologia kuvat otettiin kiinni suurennoksella 40X. Mittakaava, 0,4 mm.

IPA-3 hillitsee HCC Cells

edelleen vaikutuksen arvioimiseksi IPA-3 HCC soluproliferaatioon, kaksi ensisijaista HCC solulinjoissa HepG2 ja H2P kaksi etäpesäkkeiden HCC solulinjoista ,. H2M- ja MHCC97L, ja ei-tuumorigeenisen, kuolemattomaksi maksan solulinjasta, Miha, käsiteltiin erikseen eri annoksilla IPA-3. Vuonna solulisäkasvumääritykselle, hoito IPA-3 vähensi merkittävästi metastaattisen HCC-solut (H2M ja MHCC97L) ja vähemmässä määrin ensisijaisen HCC-solut (HepG2 ja H2P), sijoitettiin annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2A ). Sen sijaan, Miha oli korkein chemoresistance IPA-3, mikä viittaa siihen, että IPA-3 voi estää hepatoomasolulinjassa lisääntymistä hieman vaikutusta normaaleihin hepatosyyteissä. Vahvista vaikutuksen IPA-3, kokosoluliuotteista of H2M- solut kerättiin päivänä 7 ja testattiin PAK1 eston Western blotting-analyysi. Tulos osoitti, että IPA-3 hoitoa merkittävästi esti aktivoivan fosforylaation PAK1, mikä viittaa siihen, että IPA-3 inhiboi soluproliferaatiota vähentämällä PAK1 aktiivisuutta (täydennyskuvio. S1). Johdonmukaisesti, samanaikainen alentaminen fosforylaatiota JNK, loppupään tavoitteet PAK1, havaittiin myös (Kuva. S1). Selvittämään onko antiproliferatiivisia mekanismi IPA-3 HepG2, H2P, H2M- ja MHCC97L solujen johtui laskusta solusyklin alkamista, BrdU merkintöjä määritys suoritettiin. Jotta saavutettaisiin merkittävä vaikutus IPA-3, 10 uM ja suurempi annos (20 uM) käytettiin tutkimuksessa. Tuloksemme osoittivat, että IPA-3 kohtelu synkronoitu H2M- ja MHCC97L solut johti merkittävään vähenemiseen määrä BrdU, verrattuna DMSO ohjaus ajasta ja annoksesta riippuvaa tavat (Fig. 2B). Kuitenkin IPA-3 oli vain marginaalinen vaikutus BrdU määrä H2P ja HepG2-soluissa, syyllistämättä että IPA-3 on erittäin spesifinen Metastasoituneessa HCC solulinjat. Edelleen vahvistaa vaikutuksen IPA-3 tukahduttaminen HCC solujen kasvua, pesäkkeiden muodostumisen analyysi suoritettiin käyttämällä ei-tuumorigeenisiä (Miha), ensisijainen (HepG2) ja metastaattinen (H2M-) HCC-soluissa. Tulos osoitti, että IPA-3 estivät merkittävästi kasvua HepG2 ja H2M- soluja, vaan oli hyvin vähäinen vaikutus Miha soluihin (Fig. 2C). Huomionarvoista, Miha soluja, joilla on hyvin alhainen endogeenisen tason PAK1, osoitti eroa solujen lisääntymisen upon IPA-3 hoitoa. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että IPA-3 hoito tukahdutti HCC soluproliferaatiota laskevassa tärkeysjärjestyksessä metastaattisen HCC ensisijainen HCC ei-transformoitu maksasolujen, ja on PAK1 riippuvalla tavalla.

(A ) vaikutus IPA-3 soluproliferaatioon hinnat Miha (ylempi, vasen paneeli), HepG2 (ylä-, keski- paneeli) H2P (ylempi, oikea paneeli), H2M (alempi, vasen paneeli) ja MHCC97L (alempi, oikea paneeli ) solut. Tilastollinen analyysi suoritettiin vertaamalla arvoa DMSO-kontrollin. *

P

0,05, **

P

0,01 (ANOVA). (B) BrdU merkintöjä määritykset Miha (ylempi, vasen paneeli), HepG2 (ylä-, keski- paneeli), H2P (ylempi, oikea paneeli), H2M (alempi, vasen paneeli) ja MHCC97L (alempi, oikea paneeli) soluja. *

P

0,05 (ANOVA) verrattuna DMSO-kontrollin. Virhepalkit, keskiarvo ± SD kolmesta näytteestä. (C) edustaja levyt pesäkemuodostusta Miha (vasen paneeli), HepG2 (keskimmäinen paneeli) ja H2M- solut (oikea paneeli). Pylväskaavio pesäkemuodostusta (alempi kuva). *

P

0,001, **

P

0,01 (ANOVA) verrattuna DMSO-kontrollin. Virhepalkkien, keskiarvo ± SD kolmesta näytteestä.

IPA-3 indusoi apoptoosia HCC Cells

Sen tutkimiseksi, IPA-3 vaikuttaa apoptoosin HCC-soluissa, anneksiini V-7ADD värjäys määritys suoritettiin. Koska 10 uM IPA-3 estää leviämisen ja korkeammalla pitoisuus eli 20 uM aiheuttaa merkittävän tuloksen BrdU vuonna H2M- soluissa, 10 uM ja 20 uM tutkittaessa käytettiin näkyvä vaikutus IPA-3. Tulos osoitti, että inkubointi H2M- solujen 20 uM IPA-3 johti suurempi osuus soluilla positiivinen signaali anneksiini V värjäystä, verrattuna DMSO-kontrollin, mikä viittaa siihen, että solut koki apoptoosin alla hoidon IPA-3 ( kuva 3A). Lisäksi, mahdollisten pro-apoptoottista aktiivisuutta IPA-3 tutkittiin edelleen, että lohkaisu PARP1 ja kaspaasi 3. käsittely IPA-3 H2M-soluissa johti heikennetyn tason PARP 20 uM, ja lohkaisu muoto PARP1 voisi voidaan havaita 40 uM (Fig. 3B). Tämä oli mukana annoksesta riippuva väheneminen PAK1 fosforylaation tasojen PAK1 (Fig. 3B). Lisäksi tason katkaistun kaspaasi 3 kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että IPA-3 indusoi apoptoosia PAK1 inhibition suurena pitoisuutena.

(A) anneksiini V-7ADD fluoresenssi. Fluoresenssisignaalien anneksiini V-PE ja 7-AAD havaittiin PE-A ja Per-Cy5-5-A-kanavia, vastaavasti (ylempi paneeli). Prosenttiosuus H2M- värjättyjen solujen anneksiini V-PE ainoastaan ​​eri hoitoja näytettiin pylväsdiagrammi (alempi kuva). *

P

0,001 (ANOVA) verrattuna DMSO-kontrollin. (B) ilman seerumia H2M-soluja käsiteltiin lisäämällä annoksilla IPA-3 yhdessä seerumin täydennystä 24 tuntia. Western blotting-analyysi PARP1, P-PAK1 (T423), yhteensä PAK1 ja halkaistut kaspaasi 3 suoritettiin.

IPA-3 vaimentaa HCC Cell Migration

PAK1 on merkittävä rooli solujen vaeltamiseen, erityisesti asetuksessa stressiä kuitujen muodostumisen ja paikallisia tarttumista vaihtuvuus. Näin ollen, immunofluoresenssivärjäys suoritettiin tutkimaan, onko IPA-3 voi vaikuttaa näihin prosesseihin. IPA-3 havaittiin muodostumisen vahvistamiseksi rasitukseen liittyviä säikeitä ja paikallisia tarttumista sekä H2M ja H2P soluja, jotka visualisoitiin phalloidin ja paksilliinin immuno-positiivisia signaaleja stressin kuitujen ja paikallisia tarttumista, kun taas DMSO-kontrollin oli heikko ja hajallaan värjäystä. Lisäksi tulokset osoittivat, että hoito IPA-3 paransi merkittävästi määrä fokaalisen adheesion kompleksien H2M ja H2P solujen paljasti paksilliini värjäytymistä (Fig. 4A). Fosforylaation paksilliini seriinin-178 (S178) on tärkeää PAK1 välittämiä solun muuttoliike, joka on osoitti olevan fosforyloida JNK [4], [16]. Vuonna H2M- soluissa, fosforylaatio paksilliini at S178 väheni merkittävästi yhdessä yön yli hoitoon IPA-3 (Fig. 4B). Siten IPA-3 estää signalointia PAK1 /JNK /paksilliini reitin. Lisäksi Transwell migraatiokokeessa suoritettiin vaikutuksen tutkimiseen IPA-3

in vitro

muuttoliike kyky H2M- soluja. Olemme havainneet, että IPA-3 suppressoi merkitsevästi migraatio H2M solujen lukumäärä siirtynyt solujen huomattavasti vähennetty 79%, verrattuna DMSO-kontrollin (Fig. 4C). Yhdessä nämä tiedot on esitetty, että IPA-3 vähentää merkittävästi PAK1 riippuvainen solun liikkuvuutta HCC-soluissa.

(A) paksilliini proteiinin ekspressio havaittiin immunofluoresenssianalyysillä IPA-3 hoitoa. H2M ja H2P (ylempi paneeli) soluja pidettiin seerumin puutteessa yön yli ja käsiteltiin joko DMSO-kontrollin tai IPA-3 (20 uM) 15 minuutin ajan, minkä jälkeen FBS täydennystä 10 minuuttia. Immunof- signaaleja phalloidin (Red), paksilliini (vihreä) ja DAPI (sininen) edustavat stressi kuitu, fokaalisen adheesion ja nucleus, vastaavasti (suurennos 40X). Määrä fokaalisen adheesion (paksilliini) laskettiin H2M- (alempi, vasen paneeli) ja H2P (alempi, oikea paneeli), ja edustettuina pylväsdiagrammi. Virhepalkit, keskiarvo ± SD kolmesta näytteestä. *

P

0,01 (

t

-testi) verrattuna DMSO-kontrollin. (B) Western blotting analyysi fosforylaation tasoja PAK1 ja paksilliini. Seerumin puutteessa soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla IPA-3 kuten 15 minuuttia, minkä jälkeen FBS täydennystä 10 minuuttia. (C) edustavat kuvat Transwell migraatiokokeessa of H2M- soluja. Soluja käsiteltiin joko DMSO: ssa tai 10 uM IPA-3, ja niiden annettiin kulkeutua 24 tuntia. Kuvat osoittavat solut siirryttyään alempaan kammioon (ylempi paneeli). Lukumäärä siirtyneet solut laskettiin ja edustettuina pylväsdiagrammi (alempi kuva). Virhepalkit, keskiarvo ± SD kolmesta näytteestä. *

P

0,01 (

t

-testi) verrattuna DMSO-kontrollin.

IPA-3 vaimentaa NF-KB tumaansiirtymiseen

Aiemmat raportit osoittivat, että PAK1 stimuloi toimintaa ja subsellulaariseen translokaation Nukleaaritekijä kevytketjun tehostajana aktivoitujen B-solujen (NF-KB), ja edistää solujen eloonjäämistä [17], [18]. Siten tutkimme, onko IPA-3 kykenee inhiboimaan NF-KB: n. H2M, joilla on korkea endogeenisen ilmentymisen taso PAK1 ja kuolemattomaksi maksasoluissa, Miha soluja seerumin puutteessa ja sitten käsiteltiin erikseen IPA-3 ja sen jälkeen tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α). Kuten osoitti kuvassa. 5A, NF-KB: n positiivista värjäytymistä oli pääasiassa havaittu sytoplasmassa DMSO-kontrollin, kun taas NF-KB: n värjäytyminen oli kertynyt tumassa sen jälkeen, kun TNF-α induktio. Mielenkiintoista on, että H2M-soluja esikäsiteltiin IPA-3 johti sytoplasminen värjäys NF-KB: n, joka osoittaa, että IPA-3 tukahdutetaan TNF-α-indusoidun ydin- kohdentamista NF-KB: n. Toisin H2M-solut, IPA-3 ei tukahduttaa TNF-α-indusoidun NF-KB: n aktivaation Miha soluissa, joista puuttuu endogeeninen PAK1. Tämä tulos viittasi siihen, että NF-KB: n aktivaatio IPA-3 on PAK1-riippuvainen. Edelleen tutkia, PAK1 inaktivointi on mukana IPA-3-indusoidun suppression NF-KB: n translokaatio, fosforylaatio PAK1 määritettiin (kuvio. 5B). Yhdenmukainen aikaisemman tutkimuksen, joka osoitti, että PAK1 oli heti aktivoitiin TNF-α erilaisissa solulinjoissa [19], fosfo-PAK1 tason kohosi stimuloitu TNF-α (20 ng /ml). Fosforylointireaktio taso oli korkeimmillaan 0,5 tuntia ja sitten vähitellen pienentää jälkeenpäin. Toisaalta, fosforylaatiota PAK1 oli täysin vaimentaa IPA-3 esikäsitelty soluilla. Tämä tulos viittaa siihen, että IPA-3 pystyy poistamaan PAK1 aktivaation indusoiman TNF-α, joka korreloi hyvin IPA-3-inhibition TNF-α-indusoidun NF-KB: n translokaatio. Induktio metalloproteinaasi (MMP) -9 TNF-α: n osoitettiin välittävän PAK1 [19]. Valaista vaikutus IPA-3 TNF-α-indusoidun MMP-9: n ja COX-2, jotka ovat alavirtaan tavoitteita NF-KB: n [20], [21], suoritimme qRT-PCR määrittää mRNA tuotanto MMP-9: n ja COX-2. Normalisoinnin jälkeen, jossa β-aktiini, H2M solut reagoivat TNF-α, jossa on yhä mRNA tuotantoa MMP-9: n ja COX-2 (Fig. 5C). Tulokset kuitenkin osoittivat, että hoito IPA-3 suppressoi merkitsevästi MMP-9: n ja COX-2-transkriptien annoksesta riippuvaisella tavalla.

(A) vaikutus IPA-3 solunosasijaintia NF KB: n arvioitiin immunofluoresenssivärjäyksen. Yön yli seerumistarvaatio, H2M (vasen paneeli) ja Miha (oikea paneeli) soluja käsiteltiin joko DMSO: ssa tai IPA-3 (20 uM, 15 minuuttia), minkä jälkeen siihen lisättiin TNF-α (20 ng /ml, 15 minuuttia) . NF-KB: n havaittiin spesifistä vasta-ainetta (vihreä) ja tuma värjättiin DAPI (Blue). (B) Western-blottaus-analyysi P-PAK1 (T423) ja yhteensä PAK1 havaittiin H2M solut stimuloitiin TNF-α (20 ng /ml) kanssa tai ilman IPA-3 esikäsittelyn (20 uM, 15 minuuttia). TNF-α sisällytettiin viljelyväliaineessa 0, 0,5, 1, 2 tai 4 tuntia. (C) Expression of kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR suoritettiin analysoida mRNA-tasolla MMP-9 (vasen paneeli) ja COX-2 (oikea paneeli). Seerumin puutteessa H2M-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman IPA-3 esikäsittelyn (10 tai 20 uM, 15 minuuttia) ja sen jälkeen TNF-α (10 tai 20 ng /ml, 24 tuntia). Määrälliset tulokset MMP-9: n ja COX-2: n mRNA-tasot normalisoitiin P-aktiini. Edustamat arvot keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

P

0,001 (ANOVA), ***

P

0,05 (ANOVA) verrattuna TNF-α-ohjaus.

IPA- 3 vaimentaa tuumorigeneesiä nude Mouse ksenograftimallia

leveys IPA-3 antituumorivaikutus

in vivo

arvioitiin käyttäen paljaan hiiren ksenograftimallissa. Koska H2M- solulinjaa voinut kehittää kiinteitä kasvaimia nude-hiirissä, toisen ihmisen HCC linja MHCC97L samanlaisia ​​PAK1 taso käytettiin (Fig. 1A). Sen jälkeen kasvain perustaminen (100 mm

3), viisi hiirtä per ryhmää hoidettiin joko DMSO tai erilaisten annosten IPA-3 (2 mg /kg ja 4 mg /kg) TIW i.p. injektio. Vaikka hoito oli hyvin siedetty Tämän osoittaa mitään merkittävää laihtuminen, IPA-3 merkittävästi tukahdutti kasvaimen kasvua (Fig. 6A) ja vähensi kasvaimen painot (Fig. 6B). Lisäksi Western blotting-analyysi osoitti, että IPA-3 vähensi fosforylaatiota PAK1 ja sen loppupään tavoite JNK (Fig. 6C). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että IPA-3 voi estää kasvaimen kehittymisen

in vivo

vähentämällä PAK1 toimintaa.

(A) MHCC97L soluja käytettiin ksenograftimallissa. Hiiriä käsiteltiin kolme kertaa viikossa joko DMSO: ssa tai IPA-3 (2 mg /kg tai 4 mg /kg, i.p.). *

P

0,001 (ANOVA) verrattuna DMSO kontrolliryhmään. (B) Kasvaimen painot mitattiin tutkimuksen loppuun. *

P

0,001, **

P

0,01, (ANOVA) verrattuna DMSO kontrolliryhmään. (C) edustaja tulokset Western blotting -analyysi. P-PAK1 (T423), yhteensä PAK1, P-JNK ja koko JNK havaittiin. ***

P

0,05 (ANOVA) verrattuna DMSO-kontrollin. Virhepalkkien, keskiarvo ± SD 5 eläintä ryhmää kohti.

Keskustelu

PAK1 on mukana monimutkainen signaalitransduktioreittiin verkko, joka liittyy solujen eri prosesseihin, kuten solun tukirangan mallintaminen, solu liikkuvuutta, selviytyminen ja proliferaatiota, ja solusyklin etenemisen [5]. Vapautettu tai hyper-aktivoitu PAK1 liittyy yleisesti HCC [19]. Siten PAK1 on tullut potentiaalinen terapeuttinen kohde säätelyssä kasvainten synnyssä ja etäpesäke HCC [22]. IPA-3 on tunnistettu olevan allosteric pienmolekyylisalpaaja- of PAK1 [8]. Joilla on vähän tai vähemmän raportteja IPA-3 hoidossa ihmisen HCC käytimme eri

in vitro

ja

in vivo

kokeita tutkia antituumorigeenistä kykyä IPA-3 käsittely ihmisen HCC solulinjat.

tässä tutkimuksessa osoitimme, että IPA-3 voi estää leviämisen nopeus HepG2, H2P, H2M-, ja MHCC97L solujen annoksesta ja ajasta riippuva käytöstapoja.