Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka syöpä on geneettinen sairaus, epigeneettiset muutokset osallistuvat sen aloittamista ja etenemistä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kyseeseen koolonkarsinoomasoluissa käyttäen Oct3 /4, Sox2, Klf4, ja cMyc vähentää syövän maligniteetti. Siksi syöpä uudelleenohjelmointi voi olla hyödyllinen hoito kemo- tai sädehoitoa kestävästä syöpäsoluja. On myös raportoitu, että käyttöönotto endogeenisen pienikokoisen, ei-koodaavat ribonukleotideihin kuten microRNA (MIR) 302S ja miR-369-3p tai -5p johti induktioon solujen uudelleenohjelmointi. MIRS ovat pienempiä kuin geenejä transkriptiotekijöiden, mikä tekee niistä mahdollisesti sopivia käytettäväksi kliinisissä strategioita. Siksi me ohjelmoida koolonkarsinoomasoluissa käyttäen miR-302S ja miR-369-3p tai -5p. Tämä johti soluproliferaation inhibointi ja invaasion ja stimulaatio mesenkymaalisten-to-epiteelin siirtymistä fenotyypin paksusuolen syöpäsoluja. Tärkeää on, että käyttöönotto ribonukleotidien johti epigeneettisellä uudelleenohjelmointi DNA demetylaatio ja histonimodifikaation tapahtumia. Lisäksi

in vivo

anto ribonukleotidista hiirissä sai aikaan induktioon syöpäsolun apoptoosin, johon liittyy mitokondrion Bcl2 proteiinin perheen. Tämä tutkimus osoittaa, että käyttöönotto miR-302S ja miR-369s voi aiheuttaa solujen uudelleenohjelmointi ja moduloivat pahanlaatuiset fenotyyppien paksu- ja peräsuolisyövän, mikä viittaa siihen, että asianmukainen toimitus toiminnallisten pienikokoisen ribonukleotidit voivat avata uuden keinon hoidon ihmisen pahanlaatuisia kasvaimia .

Citation: Ogawa H, Wu X, Kawamoto K, Nishida N, Konno M, Koseki J, et al. (2015) MikroRNA Pakotettava Epigeneettiset uudelleenohjelmointi ja Estä pahanlaatuiset fenotyyppien ihmisen koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 10 (5): e0127119. doi: 10,1371 /journal.pone.0127119

Academic Editor: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA

vastaanotettu: 19 tammikuu 2015; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2015; Julkaistu: toukokuu 13, 2015

Copyright: © 2015 Ogawa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Institutional kyvyt saatiin osittain Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (https://www.taiho.co.jp/english/), Evidence Based Medical (EBM) Research Center (https://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd. (https://www.chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd. (https://www.yakult.co.jp/english/index.html), ja Merck Co., Ltd. (https://www.merck.co.jp/en/index .html). Tätä työtä tuki myös Grant-in-tuki Scientific Research opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology (https://www.mext.go.jp/english/; # 23390199, # 25112708, # 25134711, # 30253420, # 26670604, MM, KM, HI); Grant-in-Aid alkaen terveysministeriön, Labour and Welfare (https://www.mhlw.go.jp/english/; # H23-003, M. M., H. I.); avustusta National Institute of Biomedical Innovation (https://www.nibio.go.jp/english/index.html, # 12-4, M. M., H. I.); ja avustusta Osakan yliopisto Drug Discovery Funds (https://www.osaka-u.ac.jp/en/index.html; M.M., H. I.). Osittainen tukee saatiin Takeda Science and Medical Research Foundation (https://www.takeda-sci.or.jp/index.html, MM, HI), Prinsessa Takamatsu Cancer Research Fund (http: //www.ptcrf.or .jp /englanti, MM, HI), Suzuken Memorial Foundation (https://www.suzukenzaidan.or.jp, MK), Yasuda Lääketieteen säätiö (https://www.yasuda-mf.or.jp, NN), haima Research Foundation (https://www.jprf.or.jp/shoreisho.html, KK), Nakatani Foundation (https://www.nakatani-foundation.jp, HI), ja Nakatomi Foundation of Japan (https: //www.nakatomi.or.jp/en/index.html, MK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Institutional kyvyt saatiin osittain Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (http: //www.taiho.co.jp/english/), Evidence Based Medical (EBM) Research Center (https://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd. (http: //www. chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd. (https://www.yakult.co.jp/english/index.html), ja Merck Co., Ltd. ( https://www.merck.co.jp/en/index.html); Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Jokainen syöpäsolun johtuu suurimmalta osin kanta- tai progenitorisolujen normaalin somaattisten kudosten kautta geneettinen ja epigeneettiset muutokset. Nämä muutokset inaktivoivat kasvua rajoitus tuumorisuppressorigeeneille (APT) ja aktivoi kasvua edistävien onkogeenien. Normaalit somaattiset solut ovat kehittyneet hedelmöittynyt oosyytti kautta epigenetic ohjelmaa. Erityisesti kohdunulkoinen käyttöönotto määritelty koodaus geenit, Oct3 /4, Sox2, Klf4, ja c-MYC (OSKM), tai OSK, jotka yksinomaan ilmaistaan ​​alkion kantasolut (ESC), indusoi täynnä kyseeseen eriytetyn somaattisten solujen takaisin pluripotenttien kantasolujen. Olemme aiemmin osoittaneet, että käyttöönotto OSKM vuonna epiteelisyöpäsolujen ruoansulatuskanavaan elinten moduloi pahanlaatuinen fenotyyppi. Meidän havainnot ehdotti, että uudelleenohjelmointi voidaan estää syövän invaasio, lääkeresistenssin, ja tuumorigeenisyystesti kautta uudelleen aktivointi tuumorisuppressorigeenin p16INK4A reitin demetyloimalla promoottorisekvenssi [1]. Lisäksi äskettäin hiiri tutkimus Siirtogeenisten OSK tekijät osoittivat, että epigeneettisellä muutokset ovat mukana kasvaimen aloittamiseen ja kehittämiseen

in vivo

. Tämä tutkimus osoitti myös, että yhdessä inaktivoinnissa APT signaalit kuten mutantti APC, muutokset voivat orchestrate epigeneettiset muutokset, joita Polycomb ryhmäkompleksi ytimeen moduuli histoni H3 lysiinin-27 [2]. Yhdessä aiempien havaintojen [1-6], epigeneettiset muutokset, riippumatta syitä tai tuloksista geneettisiä muutoksia, edistää esiintyminen ja pahanlaatuisten kasvainten kehittymiseen ja saattaa olla houkutteleva löytö uusia terapeuttisia kohteita vastaan ​​ihmisen syövän.

terapeuttinen sovelluksia, jotka lisäävät endogeenisen signalointireitteihin pitäisi olla minimaalinen myrkyllisyys

in vivo

. Tältä osin lääkekehityksen endogeenisista MikroRNA (miRNA, miR), pienikokoiset ei-koodaavaa ribonukleotidit (22 emäsparia keskimäärin), ovat mahdollisia lähteitä innovatiivisten hoitostrategioiden [7,8]. Koska syntetisoitiin kypsä MIRS eivät integroidu genomiin, ne pitäisi käyttää niiden tehtävät ilman epätoivottua genomista integraatio tapahtumia ja, jos yhdistettynä lääkkeenantojärjestelmä, Mirs voisi käyttää näitä erityisiä vaikutuksia hoitotavoitteet [7,8].

Viimeaikaiset miR löytö tutkimuksissa on todettu kriittinen klustereita, kuten miR-302S, jotka parantavat uudelleenohjelmointi vaikutus yhteistyössä viruksen välittämää transkriptiotekijä siirto [9-12]. On osoitettu, että joukko kolme Mirs (miR-302S, miR-369s ja miR-200C) on valittu lukuisista MIRS ilmaistu yksinomaan aiheuttama pluripotenttien kantasolujen (iPSCs) /talous- ja sosiaalineuvostojen, herättivät uudelleenohjelmointi [13]; merkittävä rooli miR-367 on myös esitetty [12]. Kertoman, käyttöönotto miR-302S aiheuttama molemmat solukierron pysähtymisen häiritsemällä sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK) ja maailmanlaajuinen demetyloituminen DNA maksasyövän ja melanooma

in vitro

[4,5,14]. Täällä tutkimme vaikutus miR-302S ja miR-369s

in vitro

ja

in vivo

. Nämä tulokset viittaavat siihen, että syövän uudelleenohjelmointi käyttäen miR-302S ja miR-369s voi olla tehokas hoito vaihtoehto syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

peräsuolen syöpäsolun linjat HT29, DLD-1, SW480, HCT116, Caco2, Colo201, RKO, ja Lovo solut ja teratokarsinooma solulinja NTERA (NTera 2 /cl.D1 [NT2 /D1]) saatiin RIKEN (Tsukuba, Japani). Nämä solut viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Nakalai Tesque, Kioto, Japani), jossa oli 10% FBS: ää (Gibco Life Technologies, Tokio, Japani) ja 500 ug /ml penisilliiniä-streptomysiiniä.

transfektio

erityisiä Mirs ja negatiivisen kontrollin (NC) miR käytetään

in vitro

ja

in vivo

analyysissä hankittiin (Gene suunnittelu Inc., Osaka, Japani, S1 taulukko). Solut transfektoitiin erityisiä MIRS ja NC miR käyttäen lipofektio (LP) tai karbonaattia apatiitti (CA). LP-solut transfektoitiin MIRS käyttäen Lipofectamine iMax (Invitrogen, Darmstadt, Saksa) mukaan valmistajan protokollan.

Cell kyseeseen

HT29 ja DLD-1-solut transfektoitiin 10 nM kunkin miR käyttäen CA. Soluja inkuboitiin RPMI-1640, jossa on 10% FBS: ää 24 tuntia ja transfektio toistettiin joka toinen päivä yhteensä kolme kertaa. Kun kolmas transfektion jälkeen solut ympättiin Matrigel-päällystetyt ja mitomysiini C-käsitellyn hiiren alkion fibroblasteja (MEF). Soluja viljeltiin alkion kantasolujen sisältävä viljelyväliaine DMEM /F12 (Gibco Life Technologies, Tokio, Japani), jota oli täydennetty 2 mM GlutaMAX, 20% pudotuspelit seerumia vaihto (Gibco Life Technologies), 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA, Gibco Life Technologies), 10 ng /ml emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF, Wako, Tokio, Japani), 55 uM 2-merkaptoetanolia (Gibco Life Technologies), 1% penisilliini-streptomysiiniä, ja kemialliset estäjät, mukaan lukien 0,5 uM A83-01 (Stemgent , Cambridge, MA), 3 uM CHIR99021 (Stemgent), ja 0,5 uM PD0325901 (Stemgent), 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Kasvualusta vaihdettiin joka toinen päivä ja solut pidettiin 37 ° C: ssa 21% CO

2-inkubaattorissa vielä 21 päivää. Tänä aikana, nämä syöpäsolut seurattiin muodostumista ES-, kuten pesäkkeitä. Nämä poimittiin muiden analyysin alkalisella fosfataasilla (AP) Elävät Stain (500 x) (Invitrogen) käyttämällä all-in-one fluoresenssimikroskooppia (BZ-9000; Keyence, Osaka, Japani), jossa digitaalinen valokuvaus valmiudet valinnan mukaan valmistajan ohjeita. Tutkia Mirs transfektion tehokkuus, DLD-1-solut transfektoitiin BLOCK-IT Alexa Fluorescent ohjaus (Invitrogen) kanssa CA tai LP. Lyhyesti, kylvetään DLD-1-soluja 6-kuoppalevyn transfektoitiin BLOCK-IT Alexa Fluoresoiva Ohjaus ja valokuvattiin transfektion jälkeen käyttäen Keyence BZ-8000 mikroskoopilla. Fluoresenssin intensiteetin transfektoitujen solujen havaittiin käyttämällä FACS BD FACSAria III solulajittelijalla.

lusiferaasianalyysissä

3′-alueen (3′-UTR), CDK2: n, monistettiin RT-PCR: käyttämällä alukkeita 5′-CTAGCTAGCTAGCCTTCTTGAAGCCCCCA-3 ’ja 5′-CTAGCTAGCGAGCTACAAACTAAATTACA-3’. Alukkeet subkloonattiin, ligoitiin pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega) käyttäen NheI, ja varmistettiin suoralla sekvensoinnilla. Lusiferaasimäärityksiä suoritettiin käyttäen 5 x 10

3 DLD-1-soluja maljattiin 96-kuoppalevylle. Solut transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 3000 (Invitrogen) OptiMEM seerumivähennysväliainetta (Gibco), 200 ng tyhjän vektorin tai Luciferase-CDK2 3’UTR vektori ja joko NC miR tai miR-302S (lopullinen konsentraatio, 25 nmol /l). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin 24 tuntia transfektion käyttäen Dual-Glo lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega) mukaan valmistajan protokollaa. Suhteellinen lusiferaasin taso laskettiin (näyte Luc /näyte Renillaa) /(ohjaus Luc /ohjaus Renillaa), jossa Luc on raaka tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuutta ja Renillaa on sisäinen transfektio valvonnan lusiferaasiaktiivisuutta.

Soluproliferaatiomääritys

arvioimiseksi leviämisen ja herkkyys AP-positiivisten ES-kaltaiset pesäkkeitä muodostavien syöpäsolujen 5-fluorourasiilin (5-FU, Kyowa Hakko Kirin Co, Tokio, Japani), 1 x 10

3-soluja altistetaan useita pitoisuuksia 5-FU: ssa 72 tuntia 96-kuoppalevylle. Elävät solut arvioitiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Tokio, Japani). Arvioimaan vaikutuksen näiden merkitty Mirs soluproliferaatioon, HT29 ja DLD-1-solut (5 x 10

4 solua /kuoppa 12-kuoppalevyllä) transfektoitiin joko miR-302S, miR-302S plus miR -369s tai NC miR, kuten edellä on kuvattu. Solut laskettiin päivittäin kolmen päivän ajan, aloittaen 24 h transfektion jälkeen.

Solusyklianalyysiä

solusyklin analyysi virtaussytometrialla, 5 x 10

4 DLD-1-soluissa transfektoitiin kunkin miR 24-kuoppalevylle, käsiteltiin trypsiinillä 72 tunnin kuluttua, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 70% etanolilla jäissä. Sentrifugoinnin jälkeen solut värjättiin 50 mg /ml propidiumjodidilla (PI) liuos (Dojindo Molecular Technologies) ja 0,1 mg /ml RNaasi A: ta (Invitrogen) ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä FACS BD FACSAria III solulajittelijalla. Kukin histogrammi oli rakennettu tiedot vähintään 10.000 tapahtumia ja käytettiin laskemaan prosentuaalinen solupopulaation jokaisessa vaiheessa.

Cell invaasiomääritys

TranswellTM invaasio määritykset suoritettiin 24- hyvin muokattu kammiot esipäällystetty matrigeelin (BD BioCoat, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). DLD-1-soluja ja SW480-solut transfektoitiin joko 10 nM miR-302S, miR-369s, miR-302S plus miR-369s ja NC miR käyttäen CA. 48 tunnin kuluttua solut käsiteltiin trypsiinillä ja suspendoitiin uudelleen pitoisuudella 10 x 10

4 solua /ml seerumittomassa väliaineessa, ja 0,5 ml solususpensiota lisättiin päällekkäin hyvin. 48 tunnin kuluttua inkuboinnin liikkuvien solujen alempaan kammioon, joka sisälsi 10% FBS kuin kemoterapia-houkutinta, kiinnitettiin ja värjättiin Wright-Giemsa tahra (Diff-Quick; Sysmex, Kobe, Japani). Neljä satunnainen kentät laskettiin kolmena kappaleena. Tiedot on ilmaistu mediaani standardin keskivirhe (sem) ja tunkeutuu solujen suhteellinen osuus verrattuna NC miR käsiteltyjen syöpäsolujen.

Cell erilaistumisen tutkimuksen

määrittämiseksi erilaistumista kyky syntyvän ES-, kuten pesäkkeitä muodostavien syöpäsolujen

in vitro

, soluja viljeltiin kelluva viljelyn muodostamiseksi embryonaalisia (EB). Jälkeen 4-5 päivää, EB siirrettiin 0,1% gelatiinilla päällystetyille levyille ja viljeltiin RPMI-1640, jossa on 10% FBS: ää vielä 14 päivää.

RNA-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen, Tokio, Japani). RNA laatu arvioitiin kanssa NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) 260 ja 280 nm (A260 /280). Käänteinen transkriptio (RT) ja miR suoritettiin

in vitro

kanssa Taqman käänteiskopioinnin microRNA Kit (Applied Biosystems, Tokio, Japani). qPCR suoritettiin Universal Taqman PCR Master Mix (Applied Biosystems).

RT-PCR

RNU48 ilmentymistä in vitro ja RNU6B ilmentymistä in vivo käytettiin sisäisenä kontrollina määrittää suhteellinen lauseke Mir. RT miR suoritettiin

in vitro

kanssa miScript II RT Kit (Qiagen, Tokio, Japani). qPCR suoritettiin käyttäen miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen). RNU6B ilmentyminen käytettiin sisäisenä kontrollina. Fold-muutokset laskettiin ja normalisoitu käyttämällä CT menetelmällä. mRNA-tasot määritettiin käyttämällä Reverse Transcription System (Promega, Tokio, Japani) ja LightCyclerTM FastStart Reaction Mix SYBR Green I on Lightcycler (Roche, Tokio, Japani). Kaikki tulokset normalisoidaan GAPDH kontrolli. RNA ilmentymisen tutkimukset itsenäisesti toistettiin vähintään kolme kertaa vahvistaa toistettavuus.

Proteiinianalyysi

Proteiini-tasot määritettiin immunoblottauksella. Vasta-aineet Bak (1: 200, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), Bid (1: 200, Santa Cruz), Bcl-2 (1: 1000, CST, Tokio, Japani), Bcl-xl (1: 1000, CST), Mcl-1 (1: 1000, CST), Caspase8 (1: 1000, CST), Caspase3 (1: 1000, CST), CyclinD1 (1: 200, Santa Cruz), CDK2 (1: 200, Santa Cruz ), CDK4 (1: 200, Santa Cruz), E-kadheriinin (1: 1000, CST), vimentiinistä (1: 1000, CST), Zeb1 (1: 1000, CST), Phospho-Rb (Ser807 /811) ( 1: 1000, CST), ja sisäisen valvonnan ACTB (1: 2000, Sigma Aldrich, Tokio, Japani) käytettiin.

Immunoblottausmääritys

Solupelletit hajotettiin jäissä viileässä radioimmunosaostuskokeella puskuri kanssa proteaasinestäjä. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä Bradfordin menetelmällä. Proteiinit eroteltiin 4-10% Mini-PROTEAN Precast geelit (BioRad, Tokio, Japani). Yön yli elektroforeettinen siirto PVDF-kalvo, kalvot estettiin estäminen Yksi ratkaisu (Nacalai Tesque, Tokio, Japani) 1 tunnin ajan ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, jossa on esitetty primaarisen vasta-aineen. Lopuksi, kalvoja inkuboitiin sekundaarisen anti-hiiri- tai kanin koko IgG kytketty piparjuuriperoksidaasiin (GE Healthcare Life Sciences, Tokio, Japani) 1 h huoneen lämpötilassa. Vasta-aine sitoutumaan kohde proteiineihin tehtiin näkyväksi kemiluminesenssin avulla Amersham ECL Prime Western blotting tunnistus reagenssit (GE Healthcare Life Sciences).

Immunosytokemia

Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydi varten 15 min huoneenlämpötilassa. Sitten solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kyllästetty 0,1% Triton X-100: ssa 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Epäspesifinen sitoutuminen estettiin inkuboimalla vuohen tai hevosen seerumin (Vectastain, Funakoshi, Tokio, Japani) 10 min ajan huoneenlämpötilassa. Soluja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Primaaristen vasta-aineiden käytettiin polyklonaalista kanin anti-humaani Oct3 /4 (1: 400, MBL, Nagoya, Japani), kanin polyklonaalista anti-ihmisen Sox2 (1: 400, MBL), monoklonaalinen hiiren anti-ihmis-Nanog (1: 2000, CST ), monoklonaalinen hiiren anti-ihmisen Ki-67-antigeenin (1: 400, DAKO), ja monoklonaalisia kanin anti-ihmis-E-kadheriinin (1: 200, CST). Seuraavana päivänä solut pestiin kahdesti PBS: llä ja käsiteltiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin anti-kani-IgG (H + L), F (ab ’) 2-fragmentti (Alexa Fluorr 488 Konjugaatti, 1: 1000, CST) tai anti-hiiri-IgG (H + L), F (ab’) 2 fragmentti (Alexa Fluorr 555 Conjugate) (1: 1000, CST). Tumat värjättiin pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää reagenssin DAPI (Invitrogen). Kuvat otettiin, jossa on Keyence BZ-8000 mikroskoopilla.

DNA metylointianalyysi

miR302-transfektoiduissa DLD-1 ja peräsuolen syövän soluja analysoitiin DNA: n metylaation. Lyhyesti, solut transfektoitiin miR-302S tai mock-ohjaus. Metyloitu proteiinit immunosaostettiin solulysaatista käyttämällä metylaatio sitova proteiini. Näytteet sekvensoitiin (Takara, Kioto, Japani), jolloin saadaan koko genomin laajuinen DNA metylaatio tietoja. Dataa kahden näytteen verrattiin määrittämiseksi DNA metylaatio vaste miR-302S transfektiota.

histoni metylointianalyysi

Histone louhinta ja mittaus globaalin metylaatiotasoilla histoni 3 lysiiniä 4 (H3K4 ) suoritettiin käyttäen Global histoni H3-K4 metylointi kit mukaan valmistajan protokollia (Abnova, Taipei, Taiwan).

hiiri tutkimuksen

Eläinkokeiden tehtiin tiukasti periaatteiden mukaisesti ja hyväksymiä valiokunnan Ethics eläinkokeiden Osakan yliopistosta (hyväksymisnumero, 24-122-011). Tuumorigeenisyyden Testi suoritettiin käyttämällä

in vivo

ksenograftimallissa. Ensimmäinen, 5 x 10

6 solua suspendoitiin kokonaistilavuudessa 200 ui DMEM /Matrigel (1: 1 (v /v) suspensio), injektoitiin kyljet 7-8-viikkoisen naaras-hiiret (BALB /cAJcl-nu /nu). Kun kasvain ylsi 100 mm

3, mitattuna jarrusatulat ja lasketaan kaavalla V = (ab

2) /2, jossa on pituus ja b on leveys, kasvaimet kerättiin ja leikattiin 3 -4 mm

3 jaksoissa sarjasiirteillä. Osiot vahvistaisi vasculaturization immunohistokemiallisesti käyttämällä CD31, joka on verisuonen endoteelin merkki. Sarjatuotantona istutetut HT29 ksenografteissa oli runsain verisuonistoon, oli tasaisesti koko kasvain, ja oli vähiten Keski kuolion. Mirs /CA kompleksit annettiin käyttäen 30G neulaa häntälaskimoon. Tuumorin koko ja ruumiinpaino mitattiin kerran 3 päivää. Ksenograftikasvaimissa ja hiiren veri kerättiin aikana uhrauksen ja säilytetty 10% neutraaliksi puskuroidulla formaliinilla histologiaa ja immunohistokemiallisella tutkimuksia tai RNAlater RNA vakautus Reagent (Qiagen, Tokio, Japani).

Carbonate apatite valmistelu

valmistamiseksi CA transfektioseos

in vitro

, 2 ug kutakin miR-302 (-a, -b, -c, -d), miR-369 (-3p, -5p) tai NC miR sekoitettiin 4 ui 1 M CaCI

2 1 ml: ssa seerumitonta vesiliuoksella (44 mM) puskuroitua DMEM-alustassa (pH 7,5), inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja käytettiin transfektioon [15- 17]. Tätä menetelmää käytettiin pääasiassa

in vitro

kokeita. Sillä

in vivo

kokeissa epäorgaanista liuosta (0,9 mM NaH

2PO

4, 1,8 mM CaCI

2, pH 7,5) korvattiin DMEM ratkaisu. Yksi hiiri, seos 15 ug kutakin miR käytettiin yhtenä pistoksena. Liuosta sentrifugoitiin 12000 rpm: ssa 3 minuutin ajan ja pelletti liuotettiin 200 ul: aan suolaliuosta, joka sisälsi 0,5% albumiinia. Tuotteiden liuosta sonikoitiin (38 kHz, 80 W) vesihauteessa 10 minuutin ajan 20 ° C: ssa tuottaa miR /CA-kompleksit, jotka injektoitiin suonensisäisesti 5 min.

Potilasnäytteet

Kliininen kerättiin leikkauksen aikana yhdeksästä potilailla, joille tehdään kirurginen resektio ja peräsuolen syövän Osaka yliopistollisen sairaalan ja siihen liittyvät sairaaloiden vuonna 2005. potilaat on yhteenveto S2 taulukossa. Kaikki potilaat olivat yhtä mieltä käytön resektoitiin yksilöiden tässä tutkimuksessa suuntaviivojen mukaisesti hyväksymien Institutional Research Board (hyväksytty protokolla # 213).

immunohistokemiallinen analyysi

immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin 3,5pm parafinoidut osastoja ksenografteista. Parafinoidut leikkeitä de-paraffinized in Hemo-De (Farma) ja niihin lisätään porrastettuun etanolia sarjassa. Dioja kuumennettiin antigeenin haku puskurissa 40 minuutin ajan, blokattiin vuohen tai hevosen seerumin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ja inkuboitiin hiiren monoklonaalinen anti-ihmis-Ki67-antigeeni (1: 400, DAKO), polyklonaalinen kanin anti-humaani Oct3 /4 (1: 100, MBL), kanin polyklonaalista anti-ihmisen Sox2 (1: 200, MBL) tai monoklonaalinen hiiren anti-ihmis-CK20 (DAKO), vasta-aineita, yön yli 4 ° C: ssa. Vectastain ABC System (Vectastain, Funakoshi, Japani) käytettiin visualisoimaan antigeenin. Counter-värjäys suoritettiin käyttäen hematoksyliinillä.

Immunofluoresenssianalyysi

Immunofluoresenssianalyysi suoritettiin 3,5 gm parafiiniin upotetut leikkeet välillä ksenograftit havaitsemiseksi kasvaimen aluksia. Parafinoidut leikkeitä de-paraffinized ja käsitellään kuten on kuvattu immunohistokemiallisesti. Kohdat blokattiin vuohen seerumissa 20 minuuttia huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin rotan anti-hiiri-CD31-vasta-ainetta (1:20, Dianova, Hampuri, Saksa) yli yön 4 ° C: ssa. Seuraavana päivänä, sekundaarinen vasta-aine anti-rotta-IgG (H + L), F (ab ’) 2-fragmentti (Alexa Fluorr555 Conjugate) (1: 1000, CST) levitettiin. Leikkeitä counter-värjättiin pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagent DAPI. Kuvat otettiin kanssa Keyence BZ-8000 mikroskoopilla.

Alcian sininen värjäys

Alcian sininen värjäys suoritettiin 3,5 gm parafinoidut osastoja ksenograftit havaita limaa. Lyhyesti, objektilasit de-pareffinized in Hemo-De (Farma), kostutetaan porrastettu etanolia sarja, upotettiin 3%: ista etikkahappoa 3 min, ja värjättiin Alcian-sini-liuosta (1 g Alcian sininen 8GX, 3 ml etikkahappoa happo, ja 97 ml: ssa tislattua vettä) 20 min. Sitten leikkeitä pestiin ja ytimet vastavärjättiin Kernechtrot (TCI, Tokio, Japani) 5 min.

apoptoosimäärityksessä

anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (BioVision, Milpitas, CA) käytettiin mukaan valmistajan protokollaa

in vitro

varhaisessa ja myöhäisessä vaiheessa tunnistus apoptoottisten solujen. Lyhyesti, apoptoosin havaitsemiseen

in vitro

, 20 x 10

4 DLD-1-solut transfektoitiin miR-302S, miR-369s, miR-302S plus miR-369s tai NC miR käyttäen CA on 6-kuoppalevylle kolmena kappaleena 60 h ennen määritystä. Solut trypsinoitiin ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä FACS BD FACSAria III solulajittelijalla. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kolmena rinnakkaisena.

DNA: n detektoimiseksi taukoja apoptoottisten solujen

in vitro

, käytimme DeadEnd Fluorometric TUNEL-järjestelmä (Promega) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, soluja transfektoitiin kunkin miR käyttäen CA käyttäen Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System (Fisher Scientific, Tokio, Japani). Objektilasit pestiin 48 h transfektion jälkeen ja kiinnitettiin 4% formaldehydiä PBS: ssä 25 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Objektilasit pestiin kahdesti PBS: ssä ja läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 PBS: ssä 5 min. Objektilasit pestiin sitten PBS: ssä, joka oli tasapainotettu tasapainotuspuskurilla 7 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ja leimattu TdT reaktioseosta 60 minuuttia 37 ° C: ssa kostutetussa kammiossa, jotta vältetään altistuminen valolle. Objektilasit upotettiin 2 x SSC: ssa 15 minuutin ajan reaktion pysäyttämiseksi. Tumat vastavärjättiin käyttäen kanssa pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagent DAPI. Apoptoottiset solut havaitaan Keyence BZ-8000 mikroskoopilla.

havaitsemiseksi apoptoottisten solujen

in vivo

, joka on TUNEL-määritys suoritettiin valmistajan protokollan. Lyhyesti, objektilasit de-paraffinized in Hemo-De, niihin lisätään porrastettu etanolia sarja, upotettiin 0,85% NaCl, ja kiinnitettiin 4% formaldehydiä. Solut permeabilisoitiin 20 ug /ml proteinaasi K: ta liuoksessa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Objektilasit tasapainotettiin tasapainotuspuskurilla 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja leimattiin käyttäen TdT reaktioseosta 60 minuuttia 37 ° C: ssa kostutetussa kammiossa. Objektilasit upotettiin 2 x SSC: ssa 15 minuutin ajan reaktion pysäyttämiseksi. Tumat vastavärjättiin käyttäen pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagent DAPI. Apoptoottiset solut havaitaan Keyence BZ-8000 mikroskoopilla.

Tulokset

endogeeninen ilmentyminen miR-302S ja miR-369s primaarisessa kasvaimia ja syövän solulinjat paksusuolen

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että miR-302a, -b, -c ja-d (miR-302S), miR369-3p, -5p (miR-369s) ja miR-200c voi saada solujen uudelleenohjelmointi normaaleissa somaattisten solujen [13]. Täällä palneed ohjelmoida syöpäsolujen näillä Mirs. Aloitimme tutkimalla endogeeninen ilmentyminen näiden MIRS peräsuolen syövän solulinjojen ja kliinisistä näytteistä paksusuolen syövän (kuvio 1A ja 1 B). Expression of miR-302S paksusuolen syöpä oli erittäin alhainen tai havaita verrattuna ihmisen teratoma NTERA-solut, jotka tiettävästi ilmaista ESC-geenejä, ja niitä käytetään kontrollina solujen arvioimiseksi ESC-like-geenin ilmentyminen useissa tutkimuksissa [2, 3, 5, 11]. Sen sijaan, miR-200c ilmentyminen oli korkea yhdeksän primaareja kasvaimia tutkitaan ja monia solulinjoja, kuten HT29. Ekspressiotasot miR-302S ja miR-369s oli pienempi verrattuna miR-200c, viittaa siihen, että miR-200c ilmaisu on jo korkea monissa paksusuolen syövän soluja, ja se voi olla refraktorinen eksogeeninen yli-ilmentymisen. Seuraavaksi transfektoitu vain miR-302S tai miR-369s paksusuolen syöpäsoluissa. Optimoida

in vivo

kokeissa jotka jäljittelevät primaarikasvainten, tutkimme immunofluoresenssivärjäyksellä malleja CD31, vaskulaarisen endoteelimerkkiaineelle käyttää DAPI vastavärjäämiseksi ytimiä, vuonna ksenografteissa HT29, DLD-1 ja SW480-soluissa (kuvio 1C). HT29 ksenografteissa oli runsain vaskularisaatio, oli tasaisesti jaettu yli koko kasvain, ja vähiten kuolion. Edelleen syövän uudelleenohjelmointi analyysi miR-302S ja miR-369s suoritettiin pääasiassa HT29 ja muita täydentäviä solulinjoja.

A) suhteellinen endogeenistä miR-302S (miR-302a, -b, -c, ja-d), miR-369s (miR-369-3p ja -5p), ja miR-200c primaareja kasvaimia ja paksusuolen syövän solulinjat. Ihmisen teratokarsinoomasta solulinja NTERA käytettiin kontrollina. B) MIRS ilmentyminen HT29, DLD-1 ja SW480-soluissa (n = 3). C) Immunofluoresenssianalyysi CD31 ilmentymisen ksenografteissa alkaen HT29, DLD-1 ja SW480-soluissa. HT29 ksenografteissa näytteillä monet CD31-positiivisia alueita, joilla on vähän kuolion. Mittaviivat 200 um. D) Suhteellinen ilmentyminen miR-302S ja miR-369s in HT29 24 h transfektion jälkeen 30 nM miR-302S plus miR-369s (n = 3). NC, negatiivinen kontrolli. E) Suhteellinen ilmentyminen miR-302S in HT29 päivinä 2 ja 6 transfektion jälkeen miR-302S (n = 3). NC, negatiivinen kontrolli. F) Arvioida transfektion tehokkuus, fluoresoivasti leimattua dsRNA oligomeeriä transfektoitiin karbonaattia apatiitti (CA) tai lipofektio (LP) tulee DLD-1-soluissa. Transfektiotehokkuutta arvioitiin fluoresenssimikroskopialla ja virtaussytometrialla kerta transfektion kuten. G) Suhteellinen ilmentyminen miR-302S in HT29 48 h transfektion CA tai LP (n = 3).

Eksogeeninen käyttöönoton miR-302S ja miR-369s nostattaa solujen uudelleenohjelmointi

transfektoitu miR-302S plus miR-369s osaksi koolonsyöpäsolulinjoissa käyttämällä CA saavuttamiseksi miR samanlaiset ekspressiotasot kuin NTERA soluja, joita käytettiin positiivisena kontrollina (kuvio 1 D) [13]. Olemme vahvisti, että miR-302S oli tehokkaasti transfektoida (kuvio 1 E). Transfektio tehokkuus käyttämällä CA oli korkeampi kuin LP alle meidän olosuhteissa (kuvio 1 F ja 1G). Näin ollen, CA menetelmää käytettiin kaikissa seuraavissa kokeissa.

Sen määrittämiseksi, onko syöpäsoluja voidaan ohjelmoida uudelleen käyttämällä Mirs, tutkimme vaikutus eksogeenisten miR-302S ja ilman miR-369s kolme kertaa transfektion aikana. Päivänä 6 soluja varovasti trypsinoitiin, siirretään MEF feeder-soluja, ja viljeltiin vielä 21 päivää ES väliaineessa, jossa on kolme kemialliset estäjät (3i; 0,5 uM A83-01, joka on ALK4 /5/7 reseptorin estäjä; 3 uM CHIR99021 , GSK-3β estäjä, ja 0,5pM PD0325901, joka on MEK estäjä) (kuvio 2A) [5,13,18]. Pyöreä pesäkkeet indusoituu transfektio HT29 kanssa miR-302S. Nämä pesäkkeet olivat samanlaisia ​​kuin talous- ja sosiaalineuvostojen /iPSCs ja ilmeisesti erilaisia ​​kuin vanhemman-soluissa (kuvio 2B). Talous- ja sosiaalineuvostot /iPSCs tiedetään olevan AFOS-positiivisia, joten värjätään solut käyttäen AP live tahra (kuvio 2C) tunnistaa ja poimia pesäkkeet, jotka koostuivat todella ohjelmoida soluja [19]. Solujen joukossa, jotka muodostavat ES-kaltaiset pesäkkeet, AP

+, mutta ei AP

– solut osoittivat lisäystä ekspressiotasojen Oct3 /4, Sox2 ja Nanog (kuvio 2D) ja miR-302S (kuvio 2E). Solut transfektoidaan miR-302S plus miR-369s tai miR-302S yksin olivat AP

+ kulttuuriin jälkeen 28 päivän uudelleenohjelmointi. Nämä ohjelmoida solut ilmensivät pluripotenttien markkeriproteiinien kuten Oct3 /4, Sox2, Nanog, ja TRA-1-60 (kuvio 2F).

A) kaaviossa syövän uudelleenohjelmointi menetelmiä transfektoimalla miR-302S tai asennuspalveli- 302S plus miR-369s. B) miR-302S-indusoidun morfologisia muutoksia HT29 päivinä 1, 6 ja 28. ohjelmoida HT29 on alkion kantasoluja ulkonäkö. Mittaviivat 100 pm. C) Solut värjättiin käyttäen alkalista fosfataasia (AP) elävät tahra. Mittaviivat 100 pm. D) Suhteellinen ilmentyminen

Oct3 /4

,

Sox2

ja

Nanog

verrattuna AP

– soluja qRT-PCR (n = 3). E) Suhteellinen ilmentyminen miR-302S ja miR-369s AP

+, AP

– ja NTERA soluja. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Aktiini käytettiin latauskontrollina. 0,05. Aktiini käytettiin latauskontrollina.