Krooninen sairaus

tiivistelmä

BPR0L075 [6-metoksi-3- (3 ’, 4′, 5’-trimetoksi-bentsoyyli) -1 H-indoli] on uusi mikrotubulusten vastainen lääke anti-kasvain ja anti-angiogeeninen toiminta

vuonna vitro

ja

in vivo

. Securin vaaditaan genomin vakautta, ja se ilmaistaan ​​runsaasti useimmissa syöpäsoluissa, edistää solujen lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että BPR0L075 tehokkaasti indusoi solukuolemaa HCT116 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja, joilla on korkeammat ekspressiotasot securin. Sytotoksisuus BPR0L075 heikennettiin in isogeenisistä securin-null HCT116-soluissa. BPR0L075 aiheuttama DNA-vaurioita vastaus, G

2 /M pidätys, ja aktivointi kehräkokoonpanon tarkastusasemaa HCT116-soluissa. Mielenkiintoista on, BPR0L075 indusoima fosforylaatio securin. BPR0L075 vetäytyminen johti hajoamiseen securin, mitoosi exit, ja mitoosi katastrofi, joka oli heikennetty securin-null-soluissa. Esto cdc2 väheni securin fosforylaatio, G

2 /M pidätyksen ja solukuoleman aiheuttama BPR0L075. Lisäksi BPR0L075 aiheutti solukuolemaa kautta kaspaasi-riippumaton mekanismi ja aktivointi JNK ja p38 MAPK polkuja. Nämä havainnot esittänyt todisteita ensimmäistä kertaa, että BPR0L075 hoito on hyödyllinen hoidettaessa ihmisen Kolorektaalituumorien korkeasti securin. Niinpä ehdotamme, että ekspressiotasot securin voi olla ennakoiva tekijä sovellettavaksi syövän hoitoon kanssa BPR0L075 ihmisen syöpäsoluja.

Citation: Tseng HH, Chuah QY, Yang PM, Chen CT, Chao JC, Lin MD, et al. (2012) Securin Parantaa Anti-Cancer Effects of 6-metoksi-3- (3 ’, 4′, 5’-trimetoksi-bentsoyyli) -1 H-indoli (BPR0L075) Human peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 7 (4): e36006. doi: 10,1371 /journal.pone.0036006

Editor: Regine Schneider-Stock, Institute of Pathology, Saksa

vastaanotettu: Joulukuu 23, 2011; Hyväksytty: 29 maaliskuu 2012; Julkaistu: 26 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Tseng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant numerot : National Science Council, Taiwan (NSC 99-2314-B-320-004-MY3). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mikrotubulukset ovat osa solun tukirangan ja koostuvat α-tubuliinin ja β-tubuliinia heterdimers [1]. Mikrotubulusten ovat erityisen tärkeitä mitoosin ja solujen jakautumisen, ja tämä on tarkoittanut sitä, että mikrotubulusten on tullut tavoitteeksi syöpälääkkeiden [2], [3]. Mukaan eri tubuliinia sitovat kohdat, mikrotubulusten vastainen lääkkeet luokitellaan kolmeen luokkaan: paklitakselin sivusto, alkaloidi sivuston, ja colchicines domain. Anti-mikrotubulusten lääkkeet voivat aiheuttaa joko mikrotubulusten stabilointi, kuten nähdään paklitakseliin tai epävakautta, kuten nähdään vinblastiiniin ja kolkisiini [4]. BPR0L075 [6-metoksi-3- (3 ’, 4′, 5’-trimetoksi-bentsoyyli) -1 H- indoli], joka on kombretastatiini A-4 (CA-4) analogia, joka on peräisin Etelä-Afrikkalainen puu

Combretum caffrum

, on uusi synteettinen mikrotubulusten vastainen lääke, joka estää tubuliinin polymeroitumisen sitoutumalla kolkisiinia domain [5], ja hyväksyttiin US FDA vaiheen 1 kliiniset kokeet vuonna 2010. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että BPR0L075 kykenee paitsi antimitoottisena ja kasvaimen toiminnasta myös antiangiogeenisen

in vitro

ja

in vivo

[6], [7].

mitoottista katastrofi on solukuoleman muoto, joka johtuu epänormaalista mitoosin [8]. Se voidaan laukaista huumeiden vaikuttamalla mikrotubulus vakautta, eri syöpälääkkeitä, ionisoiva säteily ja mitoosi epäonnistumisen aiheuttama solusyklin Checkpoint vika [8], [9]. Lisäksi mitoosi katastrofi voi olla kaspaasiriippuvaisen tai riippumattaman [10]. Biokemialliset ominaisuudet mitoosi onnettomuuteen pitkäaikainen kehräkokoonpanon tarkistuspisteen (SAC) signalointi, poikkeava taso sykliini B1, ja signaloinnin kautta CDK1 [11]. Solukuoleman aiheuttama mitoosi katastrofin saattaa ilmetä aikana tai sen jälkeen mitoosin [12]. Anti-mikrotubulusten lääkkeet, kuten doketakselin ja Combretastatin-A4 aihiolääke (CA4P), aiheuttaa syöpää solukuoleman kautta mitoosi katastrofin [13], [14]. Nämä havainnot viittaavat mahdollinen rooli BPR0L075 indusoimisessa mitoosi katastrofin ihmisen syöpäsoluja. Vai ei mitoosi katastrofin aiheuttama BPR0L075 hoito vaikuttaa syöpäsolun kuoleman ansaitsee tutkimuksessa.

Securin, joka tunnetaan myös aivolisäkkeen kasvain muuttaa geenin (PTTG1), eristettiin ensin rotan aivolisäkkeen kasvaimen soluihin [15] . Securin on monikäyttöinen proteiini, joka säätelee sisko chromatin eriytyminen mitoosin [16], DNA: n korjaukseen [17], geenin transkriptio [18], aineenvaihduntaa ja urut kehittäminen [19] – [21]. Normaalissa kudoksessa, securin ilmentyminen on korkea kiveksissä ja alhainen kateenkorva, paksusuoli ja ohutsuoli [22]. Sen sijaan, securin on todettu onkogeenin ja merkkiaine invasiivisuus, koska sen yli-ilmentymisen erilaisissa kasvaimissa [23], ja on todettu säätelemään kasvainsolujen proliferaatiota ja kasvaimen kehittymisen [24], [25]. Aiemmissa tutkimuksissa syövän vastaiset aineet kuten oksaliplatiini ja fisetin osoitettiin indusoivan syöpäsolun kuoleman kautta alas-säätely securin ilmaisun [26] – [28]. BPR0L075 jolla on anti-kasvain ja anti-angiogeeneesin toimintaa estämällä toimintaa mikrotubulusten, erityisesti metafaasivaiheen on Anaphase siirtymisen mitoosin [6], [7]. Securin on myös proteiini, joka on mukana valvontaan metafaasivaiheen-Anaphase siirtyminen ja Anaphase puhkeamista. Kuitenkin tehokkuus BPR0L075 potilailla, joilla on syöpiä, erittäin ilmentäviä securin on vielä tuntematon.

Tässä tutkimuksessa tutkimme rooli securin in häiritsee herkkyys BPR0L075 ihmisen syöpäsoluja ja osoittivat ensimmäistä kertaa että fosforylaatio ja epävakauteen securin parantaa herkkyyttä mikrotubuleihin de-stabiloivan yhdisteen BPR0L075 in HCT116 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja. Olemme edelleen selvitetty molekyylitason mekanismeja solukuoleman aiheuttama BPR0L075 sisään HCT116-soluissa. Tuloksemme osoittavat, että securin näyttää olevan sopiva kliininen kohde BPR0L075 hoitoon.

Tulokset

syövän vastainen vaikutus BPR0L075 korreloivat ilmentymistasojen securin ihmisen syöpäsoluja

roolin tutkimiseksi securin on syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on BPR0L075, useita ihmisen syöpäsoluja, joilla on erilaiset securin ekspressiotasoja, mukaan lukien keuhkosyövän (A549), ihmisen rinta- solujen (MCF-7 ja MDA-MB-231), melanooman ( MDA-MB-435) ja peräsuolen syövän soluja (HCT116), käytettiin (Fig. 1A). Hoidon jälkeen BPR0L075 24 tuntia, niiden solujen elinkykyisyys estää tehokkaasti. Niistä, HCT116-solut, joilla on korkein ekspression taso securin näytteillä suurin herkkyys BPR0L075 (Fig. 1 B). Selvittää rooli securin on sytotoksisuutta BPR0L075, HCT116-soluja käsiteltiin BPR0L075 ja solujen elinkyky tutkittiin sitten MTT-määrityksellä. Kuten odotettua, sytotoksisuus BPR0L075 väheni securin-null HCT116-solut (Fig. 1 C), mikä osoittaa, että securin ilmentyminen tehosti syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on BPR0L075.

(A) tasot securin A549, MCF- 7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 ja HCT116-solut karakterisoitiin Western blot-analyysi. (B) Soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla BPR0L075 24 tuntia. Solun elinkelpoisuus tutkittiin MTT: llä. (C) Solujen elinkelpoisuus securin-villityypin ja -null HCT116-soluissa mitattiin MTT-määrityksellä. p 0,01 (**) todetaan merkittävä ero BPR0L075-käsitellyn ja käsittelemättömän näytteen. p 0,01 (##) todetaan merkittävä ero securin-villityypin ja -null HCT116-soluissa.

Menetys securin ilmaisun vaimenee sytotoksisuutta BPR0L075 kautta pienenee G

2 /M pidätys ja apoptoosin HCT116 ja peräsuolen syövän soluja,

edelleen karakterisoimiseksi rooli securin in BPR0L075-indusoidun sytotoksisuuden, solusyklin etenemiseen ja solukuolemaan analysoitiin virtaussytometrialla. BPR0L075 havaittiin indusoivan G

2 /M pidätys (Fig. 2A) ja apoptoosin (Fig. 2B) on HCT116-soluissa, jotka oli heikennetty securin-null-soluissa. Mielenkiintoista, kolkisiinin aiheuttama G

2 /M pidätys oli myös alennettava securin-null HCT116-solut (Fig. 2A), kun taas sisplatiinin aiheuttama samankaltainen jakeet apoptoosin securin-villityypin ja -null HCT116-solut (Fig. 2B ). Nämä tulokset viittaavat siihen, että securin on nimenomaisesti vaatii syöpää ehkäisevistä vaikutuksista mikrotubuluksen-kohdistaminen huumeita.

Soluja käsiteltiin 5-80 nM BPR0L075 24 tuntia. (A) solusyklin jakautumisen analysoitiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuudet G

2 /M-soluja määrällisesti. (B) Solujen apoptoosi määritettiin anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäystä. Apoptoottisia soluja kvantitoitiin molemmat anneksiini V positiivisia ja anneksiini V /PI kaksinkertainen positiivisia soluja. p 0,01 (**) todetaan merkittävä ero verrattuna hoitamattomiin näytteitä. p 0,01 (##) todetaan merkittävä ero securin-villityypin ja -null HCT116-soluissa.

Securin parannettu BPR0L075 aiheuttaman DNA-vaurioita vastaus ja kehräkokoonpanon tarkastusasemaa HCT116-soluissa

syövän aineet voivat aiheuttaa DNA-vaurioita syöpäsolujen ja siten aktivoida solusyklin tarkastuspisteiden, mikä johtaa solusyklin pysähtymiseen, ja jotta solut korjata ennen mitoosin. Jos solut eivät korjata, solukuolemaan apoptoosin kautta tullaan käymään [29], [30]. γ-H2AX pidetään tarkastuspiste pysyvyyskerroin, ja sen defosforylaatio mahdollistaa uudelleen solusyklin jälkeen DNA-vaurio on korjattu [31]. Tutkia, onko BPR0L075 indusoi DNA-vaurioita vasteen HCT116-soluissa, proteiini tasot γ-H2AX jälkeen BPR0L075 hoidon analysoitiin western blot. BPR0L075 indusoi γ-H2AX ilmentymistä sekä securin-villityypin ja -null HCT116-solut (Fig. 3A). Vastauksena DNA vaurioita, kaksi erillistä kinaasisignaloinnin cascades, ATM /Chk2 ja ATR /Chk1 reittejä, aktivoituvat [32]. Tasot fosforylaation Chk1 ja Chk2 kohotettiin jonka BPR0L075 hoitoon sekä securin-villityypin ja -null HCT116-soluissa. Lisäksi aktivointi Chk1 ja Chk2 oli suurempi securin-villityypin soluja kuin securin-null HCT116-soluissa sen jälkeen, kun BPR0L075 hoidon (Fig. 3A).

Soluja käsiteltiin 10~80 nM BPR0L075 24 h. (A) tasot γ-H2AX, fosfo-CHK1, fosfo-Chk2 yhteensä CHK1 ja Chk2 analysoitiin Western blot BPR0L075 saaneilla securin-villityypin ja -null HCT116-soluissa. (B) tasot securin, fosfo-H3 (Ser10), sykliini B1, fosfo-cdc2 (Thr161) ja koko cdc2 todennettiin Western blot-analyysi.

Solujen käsittely mikrotubulusten estäjiä tuloksiin aktivoitumiseen sukkularihmaston kokoonpano tarkistuspisteen (SAC), joka johtaa mitoottisiin pidätykseen ennen Anaphase [33]. Lisäksi aktivointi SAC myös estää anafaasia edistävän kompleksin /cyclosome (APC /C), mikä johtaa vakauttamiseen securin ja sykliini B1 [34]. Selvittämiseksi, onko BPR0L075 aktivoitu SAC, HCT116-soluja käsiteltiin BPR0L075 ja ekspressiotasot SAC liittyvien mitoosi markkereita, kuten fosfo-histoni H3 (Ser10), sykliini B1, ja fosfo-cdc2 (Thr161) tutkittiin. Nämä mitoosi markkereita indusoitiin sekä securin-villityypin ja -null HCT116-solut (Fig. 3B). Kuitenkin laajuus SAC aktivointi oli pienempi securin-null-soluissa (kuvio. 3B). Lisäksi, ekspression fosfo-securin indusoitiin yli 10 nM BPR0L075 villityypin HCT116-solut (Fig. 3B), joka korreloi kasvu G

2 /M pidätys (Fig. 2A). Securin rikastuu G2 /M vaiheessa vajaatoiminnan jälkeen mitoosi exit [35]. Johdonmukaisesti, The securin ilmentyminen väheni 10 nM BPR0L075, jossa G2 /M pidätys ei tapahtunut (Fig. 2A ja 3B). Näin ollen, BPR0L075 indusoidun DNA-vaurioita ja SAC, jota voidaan parantaa, kun läsnä on securin on HCT116-soluissa.

BPR0L075 indusoi securin fosforylaation ja vaikuttaa vakautta mitoosi sääntelyn molekyylien HCT116-soluissa

Todettiin, että securin yleensä huomattavasti bändi-siirtynyt jälkeen BPR0L075 hoidon HCT116-soluissa (kuvio. 3B). Tutkia, onko bändi-shift of securin johtui sen fosforylaatio, BPR0L075 käsiteltyä proteiinia uutteita inkuboitiin alkalisen fosfataasin (AP) ja sitten analysoitiin western blot. Kaistan siirtyminen securin pieneni AP (Fig. 4A), mikä viittaa siihen, että BPR0L075 aiheuttama securin fosforylaatio. Edelleen vahvistaa tämän ilmiön, useita anti-mikrotubulusten lääkkeet, kuten kolkisiini, paklitakseli, ja vinblastiinin, käytettiin aiheuttaa mitoottisiin pidätykseen. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, hoito anti-mikrotubulusten lääkkeet myös johtanut bändi-shift of securin. Kiinnostavaa, välissä liikkuva vyöhyke (merkitty tähdellä) on securin havaittiin BPR0L075-käsitellyissä soluissa (Fig. 4B). Koska kuusi fosforylaatio sivustoja securin on tunnistettu [36], tämä bändi voisi edustaa ohimenevä hypophosphorylated muoto securin. Itse asiassa, joka on

in vitro

securin -fosforylaatiomäärityksessä esitetty kaksi hitaampaa muuttoliike bändejä fosforyloidun securin [37].

(A) Soluja käsiteltiin 20 nM BPR0L075 24 tuntia. Solulysaatit altistettiin alkalisen fosfataasin määritys ja tasot securin määritettiin Western blot. (B) Soluja käsiteltiin 0-80 nM BPR0L075, kolkisiini, paklitakseli ja vinblastiinin 24 tuntia. (C ja D) Soluja käsiteltiin tai ilman MG132 /sykloheksimidiä varten 2-24 h kuluttua 24 h BPR0L075 hoitoon. Solulysaatit altistettiin Western blot-analyysillä käyttäen spesifisiä vasta-aineita sykliini B1, fosfo-H3 (Ser10) ja securin.

vakaus securin riippuu sen fosforylaatiotilaa. Hyperfosforyloidun muodot tuhoutuvat nopeasti kautta Skp1 /Cul1 /F-box-proteiini-kompleksia (SCF) E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla [38]. Sen tutkimiseksi, onko BPR0L075 aiheuttama securin fosforylaatio vaikuttaa sen proteiinin stabiilisuuteen, soluja käsiteltiin 20 nM BPR0L075: ssa 12 h ja sitten talteen elatusaineessa, joka sisälsi joko proteasomin inhibiittoria MG132 tai proteiinisynteesi-inhibiittorin sykloheksimidin (CHX) 2-24 tunnin ajan. Todettiin, että kun BPR0L075 peruuttamisen, fosforyloidun muodon securin oli hajoaa nopeasti, ja lisäämällä MG132 estetty sen hajoamistuotteiden (Fig. 4C). Sen sijaan hypophosphorylated muodossa securin lisättiin aikana solujen talteenotto, joita voitaisiin estää CHX hoitoon (Fig. 4D), mikä viittaa siihen, että securin uudelleen syntetisoidaan toipumisen jälkeen BPR0L075. Hajoamisnopeus securin oli samanlainen kuin muiden mitoosi säätelymolekyyleja kuten sykliini B1 ja fosfo-histoni H3 villityypin HCT116-solut (Fig. 4C ja 4D). Mielenkiintoista, kertyminen fosfo-histoni H3 oli suurempi MG132 saaneilla securin-null-solut (Fig. 4C), ja vähennykset sykliini B1 ja fosfo-histoni H3 olivat alhaisempia CHX saaneilla securin-null-solut (Fig. 4D ). Nämä tulokset osoittivat, että BPR0L075 indusoi epävakaus mitoosi säätelymolekyyleja läsnä ollessa securin.

BPR0L075 indusoi mitoosi katastrofin HCT116-soluissa

Mitoottista katastrofin on solukuoleman muoto, aikana tai sen jälkeen epänormaali mitoosia [8]. Tuloksemme ehdotti, että BPR0L075 aiheuttama fosforylaatiota securin, mikä voi horjuttaa mitoottisia säätelymolekyyleja ja näin edistää mitoottista katastrofin HCT116-soluissa. Käsitellä tätä mahdollisuutta, securin-villityypin ja -null HCT116-solut käsiteltiin 20 nM BPR0L075 12 h otettiin talteen viljelyväliaineessa 12-96 h, ja solusyklin etenemisen ja apoptoosin analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä. Tulokset osoittivat, että kun BPR0L075 poiston G

2 /M-fraktio pieneni ja solusyklin etenemisen jatkettiin vuonna securin-villityypin ja -null HCT116-solut (Fig. 5A). Kuitenkin vähennysten G

2 /M jae securin-villityypin solut olivat merkittävämpiä kuin niille securin-null-soluissa, mikä näkyi lisäyksiä G

0 /G

1 ja S-vaiheessa olevien solujen villityypin solut (Fig. 5A). Lisäksi korotukset Saharan G

1 osa oli myös suurempi securin-villityypin solujen (Kuva. 5A), mikä viittaa siihen, että securin ilmaisua edistetään mitoosi katastrofin HCT116-soluissa. Lisäksi solujen apoptoosia BPR0L075 peruuttamisen analysoitiin anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäystä. Johdonmukaisesti, lisää solujen apoptoosin securin-villityypin soluja indusoitiin jälkeen solujen talteenotto 24 h (Fig. 5B ja 5C).

(A) Soluja käsiteltiin 20 nM BPR0L075: ssa 12 h ja BPR0L075 peruuttamista varten 12-96 tuntia. Solusyklin jakautumisen määritettiin virtaussytometrialla. (B ja C) Soluja käsiteltiin BPR0L075 24 tuntia ja BPR0L075 peruuttaminen tai ei peruuttamista 24 tuntia. Prosenttiosuus kuolleita soluja (anneksiini positiivinen ja anneksiini /PI kaksinkertainen positiivinen) määritettiin anneksiini V /PI värjäystä. p 0,01 (**) todetaan merkittävä ero BPR0L075-käsitellyn ja käsittelemättömän näytteen. p 0,01 (##) todetaan merkittävä ero securin-villityypin ja -null HCT116-soluissa.

BPR0L075 aiheuttama fosforylaatiota securin, G

2 /M pidätyksen ja sytotoksisuuden kautta cdc2 (cdk1): sta riippuvainen reitin

Securin fosforyloituu cdc2 (cdk1) [39]. Sen tutkimiseksi, onko cdc2 signalointi vastaa BPR0L075 aiheuttama fosforylaation securin vaikutukset cdc2, CDK ja cdc25 spesifisiä inhibiittoreita (alsterpaullone, purvalanol tai NSC 663284, vastaavasti) on BPR0L075 aiheuttama fosforylaation securin seurattiin. Fosforylaatio securin osittain laski cdc2 /CDK: n estäjät (Fig. 6A). Lisäksi meillä on myös osoitti, että esto cdc2 tai CDK pienentää BPR0L075 aiheuttama G

2 /M pidätyksen ja sytotoksisuus securin-villityypin HCT116-solut (Fig. 6B ja 6C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että vastauksena BPR0L075 hoitoon, cdc2 fosforyloitu securin, mikä johtaa korkeampiin G

2 /M pidätyksen ja helpotetaan siten sytotoksisuutta BPR0L075 in HCT116-soluissa.

Soluja esikäsiteltiin NSC663284, alsterpaullone ja purvalanol 2 tuntia ennen altistamista 20 nM BPR0L075 24 tuntia. (A) tasot securin, fosfo-cdc2 (Thr161), fosfori-H3 (Ser10) ja koko cdc2 analysoitiin Western blot. (B) solusyklin jakautumisen määritettiin virtaussytometrialla. (C) Solujen elinkykyisyys analysoitiin MTT-määrityksellä. p 0,01 (**) todetaan merkittävä ero alsterpaullone (0,5 uM), Purvalanol (0,5 uM) ja BPR075 (20 nM) yksinään verrattuna kontrolli. p 0,01 (##) todetaan merkittävä ero BPR0L075 yksin ja esikäsittelyssä alsterpaullone ja purvalanol.

BPR0L075 solukuolema aktivaation kautta JNK ja p38 MAPK polkuja ja caspase- riippumattoman mekanismin HCT116-soluissa

vastauksena ulkoisille rasituksille tai vaurioita, solut yleensä aktivoi JNK tai p38 MAPK reittejä, mikä johtaa solun kuolemaan [40], tai ERK-reitin hengissä [41]. On raportoitu, että aktivointi p38 MAPK tai estämiseksi ERK on mukana apoptoosin indusoi mikrotubulusten vastainen lääke nokodatsoli yksin tai yhdistelmänä paklitakselin [42], [43]. Vastatakseen roolia MAPK väyliä BPR0L075 aiheuttama solukuolema securin-villityypin HCT116-solut, aktivointien p38 MAPK, JNK ja ERK analysoitiin western blot. P38 MAPK, JNK ja ERK reittejä aktivoitiin BPR0L075 (Fig. 7A). Erityiset p38 MAPK, JNK ja ERK (SB2021900, SP600125 ja U0126, vastaavasti) esti BPR0L075-indusoidun aktivaation (Fig. 7B ja 7C). Kuitenkin inhibitio p38 MAPK, JNK ja ERK reitit eivät vaikuta BPR0L075 aiheuttama fosforylaation securin (Fig. 7B ja 7C). Lisäksi vain SP600125 inhiboi BPR0L075 aiheuttama fosfo-histoni H3 (Fig. 7B).

(A) Soluja käsiteltiin 0-80 nM BPR0L075 24 tuntia. Tasot fosfo-p38, -JNK1 /2, ja -ERK1 /2, ja yhteensä p38, JNK1 /2 ja ERK1 /2 määritettiin Western blot. (B ja C) Soluja esikäsiteltiin SB202190, SP600125 ja U0126: ssa 2 tuntia ennen altistamista 20 nM BPR0L075 24 tuntia. Tasot fosfo-p38, -JNK1 /2, -ERK1 /2, -cdc2 (Thr161), ja -H3 (Ser10) ja yhteensä p38, JNK1 /2, ERK1 /2 ja cdc2 analysoitiin Western blot. (D) Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. (E ja F) Soluja esikäsiteltiin z-VAD-fmk: ssa 2 tuntia, sitten altistettiin 20 nM BPR0L075 24 tuntia. Tasot fosfo-p38, -ERK1 /2, ja -H3 (Ser10) ja yhteensä p38, ERK1 /2 ja securin analysoitiin Western blot. Solujen elinkykyisyys analysoitiin MTT-määrityksellä. p 0,01 (**) todetaan merkittävä ero BPR0L075-käsitellyn ja käsittelemättömän näytteen. p 0,01 (##) todetaan merkittävä ero BPR0L075 yksin ja esikäsittelyssä SB202190 ja SP600125.

analysoitiin edelleen vaikutuksia MAPK estäjien BPR0L075 aiheuttamaa sytotoksisuutta MTT-määrityksellä. Hoito SB202190, SP600125 tai U0126 yksinään ei vaikuttanut solujen selviytymistä HCT116-soluissa (kuvio. 7D). Lisäksi, SB202190 ja SP600125 pystyivät solujen pelastamiseksi BPR0L075-indusoidun sytotoksisuuden (Fig. 7D). Nämä tulokset osoittavat, että aktivointi p38 MAPK ja JNK väyliä tarvitaan BPR0L075-indusoituvaa solukuolemaa HCT116-soluissa. Edelleen tutkia, kaspaasin aktivaatio osallistuu BPR0L075 solukuolema, solujen elävyys solujen esikäsitelty pannulla kaspaasiestäjä, z-VAD-fmk, yhdistettynä BPR0L075 hoidon analysoitiin MTT-määrityksellä. Olemme havainneet, että inhibitio kaspaasi ei vaikuttanut solujen elinkelpoisuuteen jälkeen BPR0L075 hoidon (Fig. 7E). Lisäksi BPR0L075 aiheuttama aktivointi p38 MAPK ja ERK polkuja, sekä fosforylaation securin ja histoni H3, ei ollut vaikutusta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että BPR0L075 solukuolema kautta kaspaasi-riippumaton reitti on HCT116-soluissa.

Keskustelu

Securin, onkogeenin, on yli-ilmentynyt useissa syöpäsolujen tehtävänä on edistää solujen lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen [24], [25]. Aiemmin on raportoitu, että securin tasot säädellä vähentävästi HCT116 solukuoleman aiheuttama kemoterapeuttisten [26], [44], mikä viittaa siihen, että se voisi olla tavoite syöpähoitoa. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että sytotoksisuus mikrotubulusten vastainen lääke BPR0L075 korreloi positiivisesti ilmentymistasojen securin eri syöpäsoluissa. Securin fosforyloitiin käsittelemällä BPR0L075 sekä muut mikrotubulusten vastainen huumeiden, kuten colchicines, paklitakseli, ja vinblastiini, ja HCT116-soluissa. Fosforyloidun securin liittyi suurempi G2 /M pidätyksen ja sytotoksisuutta. Fosforylaatio securin edelleen johtaa sen epävakautta ja sitten edistää mitoosi exit ja mitoosi katastrofin HCT116-solujen. Siksi ehdotamme, että securin on tärkeä tavoite syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on BPR0L075 ihmisen peräsuolen syövän soluja.

Mitoottista katastrofi voi johtua lääkkeitä, jotka kohdistuvat mikrotubulusten tai vaikuttaa etenemistä mitoosin [8], [9 ]. Monia eri solukohtaloina voi johtua mitoottisiin katastrofin. Ensinnäkin, solut voivat kuolla ilman mitoottisiin exit. Toiseksi, kun mitoosi exit ja päästä G1 vaiheen solut käyvät läpi solukuoleman tai vanhenemista [12]. On raportoitu, että doketakseli, joka on mikrotubulia stabilointiaine, indusoi solukuolemaa läpi mitoottista katastrofin ihmisen rintasyövän solujen [14]. Lisäksi toinen mikrotubulia stabilointiaine, kombretastatiini-A4 aihiolääke (CA4P), indusoi mitoosi katastrofin jälkeen mitoosi pidätyksen kroonisen lymfaattisen leukemian soluja [13]. Tuloksemme osoittavat, että BPR0L075 indusoi laajempi solukuolemaa jälkeen vieroitusoireista in securin-villityypin HCT116 soluissa kuin securin-null-soluissa. Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa kävi ilmi, että pitkäaikainen mitoosi pidätys aiheuttama mikrotubulusten vastainen lääkitys saattaa johtaa entistä solukuolemaan [45]. Lisäksi olemme havainneet, että BPR0L075 hoitoa 12-24 h indusoi lisää solukuolemaa poistamisen jälkeen BPR0L075 verrattuna hoitoon 4 tai 8 tuntia (dataa ei esitetty). Nämä havainnot viittaavat siihen, että BPR0L075 aiheuttama mitoosi katastrofin kautta induktion pitkittyneen mitoottisten pidätyksen paksu- ja syöpäsoluja.

nokodatsoli hoito indusoi mitoosi pidätyksen ja fosforylaatiota securin vuonna HCT116 ja U2OS soluihin [46]. Johdonmukaisesti, tässä tutkimuksessa todettiin, että BPR0L075 ja muut mikrotubulusten vastainen lääkkeiden aiheuttama securin fosforylaation HCT116-soluissa. On raportoitu, että securin fosforyloituu cdc2 (cdk1) [39]. MAPK-kinaasin myös indusoi securin fosforylaation ja säätelee sen transaktivaatiofunktiota [47]. Vastauksena DNA-vaurio, securin fosforyloituu DNA-PK (DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin), jolla edistetään esto sisko kromatiinin erottaminen [17], [48]. Kuten alla tuloksemme, BPR0L075 aiheuttama fosforylaation securin vain osittain inhiboi cdc2 /CDK spesifinen estäjä. Nämä tulokset osoittivat, että BPR0L075 indusoi securin fosforylaatio osittain cdc2 aktivointi. Siksi saattaa olla muita kinaaseja indusoivien fosforylaatiota securin. Kuitenkin BPR0L075 aiheuttama MAPK-kinaasien ei ollut mukana fosforylaatiota securin. Siksi ehdotamme, että BPR0L075 indusoi solukuoleman kautta p38 MAPK ja JNK polkuja, joka on riippumaton fosforylaation securin.

Securin on raportoitu olevan vuorovaikutuksessa DNA korjaukseen proteiinin Ku70. Kun solut kärsivät DNA-vaurioita, DNA-PK fosforyloi securin laukaisemaan solusyklin pysähtymiseen. Sitten vuorovaikutus securin ja Ku70 on tukahdutettu, vapauttaen näin Ku70 edistää DNA: n korjautumiseen [17], [48]. Sen sijaan securin yliekspressio voi viivästyttää mitoosin etenemistä ja sisarkromatidin erottaminen aikana DNA-vaurioita kautta estämällä Ku70 [48]. Tutkimuksessamme BPR0L075 indusoi korkeampia G

2 /M pidätys securin-villityypin HCT116-soluja kuin securin-null-soluissa, mikä viittaa siihen, että suurempi korjaus kyky ja kohonnut tarkistuspisteen aktivointi tulivat esiin, kun läsnä on securin, jotka voivat tulos fosforylaation ja epävakauden securin mukaan BPR0L075.

Expression of securin on havaittu eri syövissä korreloivat huonon kliinisen tuloksen [49], [50]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että BPR0L075 aiheuttama DNA-vaurioita ja moduloidaan mitoosi säätelymolekyyleja aktivoida kehräkokoonpanon tarkastusasemaa HCT116-soluissa. Sen jälkeen BPR0L075 peruuttamista, solut G

2 /M osa koki mitoosi katastrofi, joka parantaa fosforylaation ja epävakauden securin. Lisäksi BPR0L075 aiheutti solukuolemaa kautta kaspaasi-riippumaton mekanismi ja aktivointi JNK ja p38 MAPK väyliä (Fig. 8). Nämä havainnot esittänyt todisteita ensimmäistä kertaa, että BPR0L075 hoito on hyödyllinen hoidettaessa ihmisen Kolorektaalituumorien korkeasti securin. Kuten BPR0L075 hyväksyttiin Yhdysvaltain FDA vaiheen 1 kliinisessä tutkimuksessa vuonna 2010, ekspressiotasot securin voisi olla ennustava tekijä päätettäessä prioriteetti syövän hoitoon käytetään BPR0L075 ihmisen syöpäsoluja. Tuloksemme osoittavat myös, että kohdistaminen securin voi olla sopiva strategia laajentaa kliinisen käytön BPR0L075 eri syöpiä yli-ilmentävät securin.

BPR0L075 aiheuttama DNA-vaurioita, jotka johtavat Chk1 /Chk2 aktivaation inhibitio CDK1 aktiivisuuden ja G2 pidätys . Se on myös moduloitu CDK1-riippuvainen fosforylaatio mitoosi säätelymolekyyleja aktivoida kehräkokoonpanon tarkistuspisteen, joka on heikennetty läsnä ollessa securin. Sen jälkeen BPR0L075 peruuttamista, solut G

2 /M osa koki mitoosi katastrofi, joka parantaa fosforylaation ja epävakauden securin. Lisäksi BPR0L075 aiheutti solukuolemaa kautta kaspaasi-riippumaton mekanismi ja aktivointi JNK ja p38 MAPK polkuja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Yhdiste BPR0L075 oli syntetisoitiin osastolla bioteknologian ja Pharmaceutical Research, National Health Research Institutes, Zhuman, Taiwan, ROC. BPR0L075, valkoinen kiinteä aine, saatiin 72%: n saannolla 6-metoksi-ja 3,4,5-trimetoksibentsoyylikloridia ja liuotettiin dimetyylisulfoksidiin. Propidiumjodidia (PI; p4170), 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5- difenyylitetratsoliumbromidia (MTT; M5655), colchicines (C9754) ja purvalanol (P4484) ostettiin Sigma Chemical Co. spesifisiä vasta-aineita ja ERK (C14), p38a (C-20) ja JNK (C-17) ostettiin Santa Cruz Biotechnology. Anti-fosfo-histoni H2A.X (Ser139) (# 05-636) ja fosfo-histoni H3 (Ser10) (# 05-806) vasta ostettiin Upstate. Anti-securin (ab-3305) vasta-aine hankittiin Abcam. Anti-cdc2 (Ab-1) vasta-aine hankittiin Oncogene Sciences Products. Anti-aktiini (MAB1501) vasta-aine hankittiin Chemicon International. Fosfo-cdc2 (Thr161) (# 9114), fosfo-CHK1 (Ser345) (# 2341), fosfo-Chk2 (Thr68) (# 2661), fosfori-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (# 9251), fosfo- ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (# 9106), fosfori-p38 MAP-kinaasi (Thr180 /Tyr182) (# 9211), CHK1 (# 2345), ja Chk2 (# 2662) vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology. Sykliini B1 (Ab-2) ja p21 (Ab-1) vasta-aineita, NSC663284 (# 217692), alsterpaullone (# 126870), MG132 (# 474790), sykloheksimidi (CHX, # 2379763), SB202190 (# 559388), SP600125 ( # 420119) ja U0126 (# 662005) hankittiin Calbiochem.

Soluviljely

securin-villityypin ja securin-null ihmisen HCT116 peräsuolen syövän solulinjat [27], MCF-7- ja MDA-MB-231 ihmisen rintasyövän solulinjoissa [51], ja MDA-MD-435 ihmisen melanoomasolulinjat [52] oli lahja Dr. Ji-Hshiung Chen (Department of Molecular Biology and Human Genetics, Tzu Chiu University, Taiwan). Securin-villityypin ja securin-null ihmisen HCT116 ja peräsuolen syövän soluja ylläpidettiin rutiinisti McCoy’5A väliaineessa (Sigma, M4892). MCF-7 ja MDA-MB-231 ihmisen rintasyövän soluja ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM; GIBCO, 12800-058). A549 ihmisen keuhkosyövän solulinjassa [53] (lahja tri Lih-Yuan Lin, Department of Life Science, National Tsing Hua University, Taiwan) ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (GIBCO, 23400-021). Täydellinen väliaine täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Unsynchronized soluja käytettiin tässä tutkimuksessa.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT kolorimetrisellä määrityksellä. Lyhyesti, solut siirrostettiin tiheyteen 5,000-10,000 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja 16-24 h. Lopussa BPR0L075 hoidon, solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja niitä uudelleen viljeltiin viljelyalustassa 2-3 päivää. Sen jälkeen elatusaine korvattiin uudella, jota oli täydennetty 0,5 mg /ml MTT: n ja inkuboitiin 4 tuntia.