Krooninen sairaus

tiivistelmä

Bmi1 yli-ilmennetään erilaisissa ihmisen syövissä, mukaan lukien ruoansulatuskanavan syöpään. Korkea ekspressiotaso Bmi1 proteiini assosioituu huonoon ennusteeseen ruoansulatuskanavan syöpäpotilailla. Toisaalta, kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) edistää kasvaimen kasvua, invaasio ja etäpesäkkeiden tuottamalla eri välittäjinä kasvaimen mikroympäristössä. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia TAM välittämää säätely Bmi1 ilmaisun ruoansulatuskanavan syöpään. Suhde TAMeja ja Bmi1 ilmentyminen analysoitiin immunohistokemiallisesti ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR), ja tulokset osoittivat positiivista korrelaatiota kasvainta infiltroituneen makrofageja (CD68 ja CD163) ja Bmi1 ilmentymistä syöpäsoluissa. Rinnakkaisviljelemällä TAMeja laukaisi Bmi1 ilmentymistä syöpäsolulinjoissa ja parannettu pallo muodostumista kyky. miRNA microarray analyysi mahasyövän solulinjaa viljeltiin yhdessä makrofagien tehtiin, ja käyttämällä

in silico

menetelmiä analysoida tuloksia, tunnistimme miR-30e * mahdollisena säätelijänä Bmi1 ilmaisua. Lusiferaasi, joissa käytetään miR-30e * matkivat paljasti, että Bmi1 oli suora kohde miR-30e * vuorovaikutuksilla oletetun miR-30e * sitoutumiskohdat Bmi1 3’alueella. qRT-PCR-analyysi resektoidun syövän yksilöiden osoitti, että miR-30e * ekspressiota säädeltiin kasvaimen alueilla verrattuna ei-kasvain alueilla, ja Bmi1 ilmentyminen korreloi käänteisesti miR-30e * ilmentymisen mahasyövän kudoksissa, mutta ei paksusuolensyöpä kudoksissa . Tulosten perusteella näyttää, että TAM saattaa lisätä Bmi1 ilmaisun miR-30e * tukahduttaminen, mikä johtaa syövän etenemiseen. Tukahduttaminen Bmi1 ekspression välittämän TAM voi siten edustaa mahdollista strategiaa hoitoon ruoansulatuskanavan syöpään.

Citation: Sugihara H, Ishimoton T, Watanabe M, Sawayama H, Iwatsuki M, Baba Y, et ai. (2013) tunnistaminen miR-30e * asetus Bmi1 Expression Tukena kasvaimeen liittyvät makrofagit mahasyövän. PLoS ONE 8 (11): e81839. doi: 10,1371 /journal.pone.0081839

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 04 heinäkuu 2013; Hyväksytty 17. lokakuuta 2013 Julkaistu: 28 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Sugihara et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Okukubo Memorial Fund for Medical Research Kumamoto University School of Medicine, Medical Research kannustaminen palkinnon Japanin Medical Association ja Japanin Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-tuki Scientific Research (kohteeseen TI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Bmi1 on jäsenenä Polycomb–tukahduttavaa kompleksin 1 keskeinen rooli ylläpitää chromatin hiljentäminen [1,2]. Bmi1 soittaa toiminto itseuudistumisen hermosolujen ja hematopoieettisten kantasolujen avulla tukahduttamisen INK4a /ARF lokuksen [3-6]. Lisäksi, Bmi1 ilmentyy suoliston kantasoluja ja liitetty ylläpitää ohutsuolessa epiteelin [7]. Bmi1 tunnistettiin ensin onkogeenin, joka toimii yhdessä c-myc aikana hiiren lymphomagenesis, ja on yli-ilmentynyt useissa eri ihmisen syövissä, mukaan lukien maha-suolikanavan syöpä [8-10]. Lisäksi ilmaisu taso Bmi1 proteiini assosioituu huonoon ennusteeseen ruoansulatuskanavan syöpäpotilailla [9,10]. Kuitenkin mekanismi taustalla Bmi1 asetus syöpäsoluissa on suurelta osin tuntematon.

Kiinteä kasvaimet koostuvat syöpäsolujen ja erilaisten stroomasolujen, fibroblastit, endoteelisolut ja hematopoieettisten solujen, pääasiassa makrofagit ja lymfosyytit. Makrofagit ovat toiminnallisia plastisuus ja kuvataan kaksi eri polarisaatio todetaan: klassisesti aktivoitu (M1) ja vaihtoehtoisesti-aktivoitu (M2) makrofagi fenotyypit. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että M1- ja M2-polarisoitunut makrofagien pelata erilaisia ​​toiminnallisia rooleja kasvaimen mikroympäristössä [11,12]. M1-polarisoitu makrofagit ovat yleensä antigeenejä esitteleville toimintoja ja kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta. Sen sijaan, M2-polarisoitu makrofagien osansa vastaus loisia, haavan paranemista, kudoksen uudelleen, ja edistää kasvua ja vaskularisaatiota kasvaimia. Monissa ihmisen syövissä, kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) edistää kasvaimen kasvua, invaasio ja etäpesäkkeiden erittämällä erilaisia ​​välittäjiä, joten ehdotettiin, että TAM olivat pääasiassa polarisoitunut M2 makrofagien fenotyyppiin [13-17]. Toisaalta, uudempi tutkimukset osoittivat, että makrofagit olivat hyvin muovikennosta, ja niiden epigeneettiset muutokset reprogramed TAMeja peräisin M2 M1-kaltainen fenotyyppi kasvaimissa [17,18].

MikroRNA (miRNA) ovat ei-koodaavat RNA: t (21-23 nukleotidia), jotka sitoutuvat epätäydellisesti että 3’alue (UTR) niiden kohde-mRNA: iden tukahduttaa niiden käännös. miRNA on todettu kohdistaa eri onkogeenien ja tuumorisuppressoreilla, ja kehittyvien näyttöä siitä, että häiriöstä miRNA liittyy patogeneesiin moniin syöpiin [19,20].

Tutkiakseen säätelyyn Bmi1 ilmentymisen syöpäsoluissa tutkimme mahdollista korrelaatiota Bmi1 ilmentymistä mahasyövän ja infiltroi- makrofagien kasvaimen mikroympäristössä, ja tutkittiin mekanismia taustalla säätelyyn Bmi1 ilmentymisen. Tässä osoitamme, että miR-30e * välittämä TAMeja suoraan säätelee Bmi1 ilmentymistä ruoansulatuskanavan syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja käsittely

Solulinjat AGS, NUGC4 , COLO201, ja THP-1-soluja viljeltiin 5% CO

2 37 ° C: ssa RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). HCT116-soluja viljeltiin 5% CO

2 37 ° C: ssa Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa, ravinneseosta F-12 (Sigma, St. Louis, MO, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Solulinjat saatiin Japani Collection of Research Bioresources Cell Bank ja riken Bioresource Centerin Cell Bank.

immunohistokemia (IHC) ja pisteytys

Näytteen käsittely ja IHC suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],21]. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin käyttäen 3% vetyperoksidia. Leikkeitä inkuboitiin ensin laimennettu vasta-aineet, mitä seurasi inkubointi biotiini-free piparjuuriperoksidaasileimattua polymeeri Envision Plus tunnistusjärjestelmä (Dako, Glostrup, Tanska). Positiiviset reaktiot visualisoitiin käyttäen diaminobentsidiiniä ratkaisu, ja vastavärjättiin Meyerin hematoksyliinillä. Negatiivisena kontrollina hiiren primaarinen vasta-aineita käytettiin, ja mitään positiivista tahroja havaittu. Kaikki IHC värjäys pisteytettiin itsenäisesti kahdessa patologia. Nuclear Bmi1 ja sytoplasman CD68 ja CD163 ilmaisuja tulkittiin ohjeiden mukaan julkaistiin edellisessä tutkimuksessa. Ydinmagneettisen Bmi1 ja sytoplasman CD68 ja CD163, me pisteytetään positiivista värjäytymistä tuloksia luokkiin 0 3+ seuraavasti: 0, ei värjäystä; 1+, 1-25% näytteen värjätään; 2+, 26-50%; ja 3+, 50%. Pistemäärä 3+ pidettiin positiivisen IHC tulos.

Vasta-aineet IHC ja immunoblot -analyysejä

Seuraavia vasta-aineita käytettiin IHC-analyysi: hiiren monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen ihmisen Bmi1 ( 1: 100 laimennos, Abcam, Cambridge, UK), hiiren monoklonaalisella vasta-aineella, joka on spesifinen ihmisen CD68 (1: 100 laimennos, Dako, Glostrup, Tanska), ja hiiren monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen ihmisen CD163 (1: 100 laimennos, Novocastra, Newcastle, UK). Seuraavia vasta-aineita käytettiin immunoblot-analyysillä: hiiren monoklonaalisia vasta-aineita Bmi1 (1: 1000), ja kaniinin polyklonaalinen vasta-aine ihmisen β-aktiini (1: 1000, Cell Signaling Technology).

RNA ja miRNA eristäminen

Kokonais-RNA, kuten miRNA, eristettiin solulinjoista käyttämällä Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA), ja eluoitiin 100 ui lämmitetty eluutioliuoksella, mukaan valmistajan protokollaa. miRNA uutettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja ruoansulatuskanavan syöpä kudosten ja niiden yhteensovitettujen viereisen normaalin ruoansulatuskanavan epiteeli käyttäen RECOVERALL- Yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit FFPE (Ambion), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puhtaus ja pitoisuus RNA-näytteet arvioitiin niiden absorbanssisuhde 260/280 nm, määritettiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Rockland, DE, USA).

THP-1 makrofagi valmiste ja co-dosviljelmämäärityksessä

THP-1-solut ympättiin Transvvell- insertit (3540, Corning) 6-kuoppalevyille (1 x 10

6 solua /kaivo). Valmistamiseksi M1-polarisoidun THP-1 makrofagien, 320 nM forbolimyristaattiasetaattia (PMA) lisättiin THP-1-soluja 6 h, jonka jälkeen PMA plus 20 ng /ml interferoni (IFN) -γ ja 100 ng /ml lipopolysakkaridia seuraavien 18 h. Valmistamiseksi M2-polarisoidun THP-1 makrofagien, 320 nM PMA lisättiin THP-1-soluja 6 h, jonka jälkeen PMA plus 20 ng /ml interleukiini (IL) -4 /IL-13 seuraavien 18 h. Kolmen pesun poistamiseksi sytokiinien, M1- tai M2-polarisoitunut THP-1 makrofagit olivat viljellään yhdessä ylempi inserttejä kanssa AGS tai HCT116 solut 6-kuoppalevyillä (1 x 10

5 solua /kuoppa) ei ole suoraa yhteyttä, kussakin väliaineessa ilman 10% FBS: ää, kuten edellä on kuvattu. 24 tunnin yhteistyön kulttuurin, ylempi insertit sisältäviä makrofageja heitettiin pois. AGS ja HCT116-solut pestiin ja niitä käytettiin seuraavissa kokeissa.

Sphere kulttuuri

Kuten edellä on kuvattu, M1- tai M2-polarisoitu THP-1 makrofagien valmistettiin. Kolmen pesun poistamiseksi sytokiinien, M1- tai M2-polarisoitunut THP-1 makrofagit olivat viljellään yhdessä ylempi insertit kanssa AGS ja HCT116-solut (1 x 10

4 solua /kuoppa) ei-liimalla 6-kuoppaisille levyille ( 3471, Corning) ilman suoraa kosketusta, joka on pinnoitettu ohuella agaroosia, jonka tiheys on 2 x 10

4 /mm

3 seerumittomassa DMEM /F12-väliaineessa (Invitrogen), joka sisälsi 1% N2 (Gibco), 2% B27 (Gibco), 20 ng /ml ihmisen fibroblastikasvutekijän (FGF) -2 (Sigma, St. Louis, MO), ja 20 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF) (Sigma). Kukin käsittely suoritettiin kolmena kappaleena. Viljelyväliaine vaihdettiin joka toinen päivä, kunnes pallo muodostumista. 10 päivän jälkeen, pallojen kerättiin.

Makrofagi kulttuuri ja yhdessä viljelemisen määritys

Perifeerisen veren mononukleaariset solut saatiin vapaaehtoisten verenluovuttajien. CD14 + monosyytit eristettiin käyttäen CD14-mikrohelmiä (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa). Monosyytit maljattiin 6-kuoppalevyille (1 x 10

5 /kuoppa) ja viljeltiin granulosyyttien M-CSF: ää (2 ng /ml) (Wako, Tokio, Japani), viiden päivän ajan indusoimaan epäkypsiä makrofageja. Sen jälkeen kun oli pesty PBS: llä, soluja stimuloitiin IFN-γ (1 ng /ml) (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA), joilla M1 makrofageissa. Monosyytit maljattiin ja viljeltiin M-CSF: ää (100 ng /ml) (Wako) viiden päivän ajan indusoimaan epäkypsiä makrofageja. Sen jälkeen kun oli pesty PBS: llä, soluja stimuloitiin IL-10 (10 ng /ml) (PeproTech) aiheuttaa M2 makrofageissa. Mediaa M1- tai M2-polarisoitu makrofagi viljelmät kerättiin ja siirrettiin 6-kuoppaisille levyille, jotka sisältävät AGS ja HCT116-soluja (1 x 10

4 solua /kuoppa). 24 tunnin yhteistyön kulttuurin, AGS ja HCT116-solut pestiin ja käytettiin seuraavissa kokeissa.

miRNA mikrosirujen

syaniini-3 (Cy3) leimattua cRNA valmistettiin 100 ng RNA: sta käyttäen Agilent miRNA Complete Labeling ja Hyb Kit (p /n 5190-0456) mukaan valmistajan ohjeiden. Agilent Human 8 x 60K miRNA Array suoritettiin kaksi yhdistettyä näytettä. Hybridisaatio suoritettiin ohjeiden mukaisesti, että Agilentin miRNA Complete Labeling ja Hyb Kit. Objektilasit skannattiin välittömästi pesun jälkeen on Agilent DNA Microarray Scanner (G2505C) käyttäen yhtä väriä skannausasetus varten 8x60k array dioja (Scan Area 61×21.6 mm, Skannaustarkkuus 5 um, Dye kanava asetetaan Green ja Green PMT on asetettu 100% ). Skannatut kuvat analysoitiin Feature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent) käyttämällä oletusparametrejä (protokolla miRNA_107_Sep09). Probe intensiteetit normalisoitiin käyttäen GeneSpring 12.0 kautta prosenttipiste shift normalisointia. Ilmentyvät eri miRNA tunnistettiin kertaluokkamuutos suodatuksen. Microarray data on talletettu GEO (tulonumero. GSE50601; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50601).

Quantitative real-time käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) B

ekspressiotasot miR-30e * määritettiin TaqMan qRT-PCR: llä käyttäen TaqMan miRNA määritystä sarjat (Ambion), mukaisesti valmistajan protokollan, kuten aiemmin on kuvattu . miR-30e * ilmentymistä normalisoida ilmaus RNU6B pienten ydinaseiden RNA. Ekspressiotasot Bmi1 kvantitoitiin Probes Master qRT-PCR: llä käyttämällä LightCycler 480 Probes Master (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) ja normalisoitiin glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi. Kaikki qRT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttämällä LightCycler 480 II (Roche Diagnostics). Suhteelliset määrät miR-30e * ja Bmi1 mitattiin 2

-ΔΔCT menetelmällä. Kaikki qRT-PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina.

transfektio miRNA

Solut transfektoitiin 5 nM jäljittelevät tai -estäjä miR-30e * (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) käyttäen Lipofectamine RNAiMax transfektioreagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Spesifisyys transfektio varmistettiin käyttäen negatiivista kontrolli matkia (Applied Biosystems). Ilmentymistasojen miR-30e * kvantitoitiin 48 tuntia transfektion jälkeen, ja soluja käytettiin seuraavissa kokeissa.

Generation of Bmi1 3’UTR mutanttien

Vektorit sisältävät mutatoidun miR-30e * kohdesekvenssien ihmisen Bmi1 3’UTR otettiin käyttöön mutageneesillä käyttäen seuraavia PCR-alukkeita: 5′-ccUAUGGACGU-UAAUUGAAAa -3 ’Luc-Bmi1-villityypin ja 5’ccUAUGGACGU-UAUGACUUUa -3’ Luc-Bmi1-mutantti.

lusiferaasianalyysissä

AGS-soluja maljattiin 96-kuoppalevyille ja transfektoitiin MultiFectam (Promega) käyttäen pMIR-REPORT ™ Luciferase miRNA Expression Reporter Vector, joka sisältää tulikärpäsen lusife- valvonnassa nisäkkään promoottori /terminaattori järjestelmän. MiRNA tavoite kloonaamalla alue oli mukana alavirtaan lusiferaasin käännöksen sekvenssin tai tyhjän vektorin (Invitrogen), ja matkivat ohjaus- tai matkivat miR-30e * (Invitrogen). Reportteri-määritykset suoritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen Luc-Screen® System (Applied Biosystems) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Western blot-analyysi

Viljellyt solut kerättiin 6-kuoppaisia ​​levyjä pestiin kerran PBS: ssä ja hajotettiin radioimmunosaostuksella puskurissa, johon oli lisätty proteaasi /fosfataasinestäjällä cocktail (Thermo Scientific , Tokio, Japani). Proteiini näytteet altistettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille, ja kaivoa inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla. Signaalit havaittiin inkuboimalla sekundaarisia vasta-aineita käyttäen ECL Detection System (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).

Potilaiden ja kudosnäytteiden

Ensisijainen ruoansulatuskanavan syöpä kudoksia ja niiden yhteensovitettujen vieressä normaali maha epithelia saatiin 83 mahasyöpäpotilaista ja 49 paksusuolensyöpä potilailla, joille tehtiin mahasyövän resektio ilman leikkausta edeltävän hoidon osastolla Gastroenterologinen kirurgia, Kumamoto University Hospital vuodesta 2005 vuoteen 2008. Signed tietoon perustuvan suostumuksen osallistua saatiin kaikista potilaista. Tutkimuksen hyväksyi lääketieteen eettinen komitea Kumamoto University.

Tilastollinen

Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja esitetyt tiedot edustavat johdonmukaisesti havaittu tuloksia. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD). Chi-squared testejä käytettiin arvioimaan eroja suhteessa välillä Bmi1 ilmaisun ja CD68 /CD163 ilme. Independent Opiskelijan

t

-testaukset käytettiin vertaamaan jatkuvia muuttujia ryhmien välillä, ja Tukey-HSD menettelyä käytettiin vertaamaan jatkuvien muuttujien välillä kolmeen ryhmään. Sillä tilastolliset analyysit, käytimme JMP (versio 9, SAS Institute) ja SAS ohjelmistojen (versio 9.1, SAS Institute). P-arvo on 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmentyminen Bmi1 korreloi tasot TAMeja mahasyövän kudoksissa

TAM edistää kasvaimen kasvua, invaasio ja etäpesäkkeiden moniin syöpiin tuottamalla eri välittäjien [13-17]. Sen määrittämiseksi, onko ilmaus Bmi1 syöpäsoluissa korreloi tasot TAMeja selvitimme Bmi1, CD68, ja CD163 ilmentyminen mahasyövän kudoksissa käyttäen IHC. CD68-värjäys käytettiin tunnistamaan pan-makrofagit, ja M2 väestön arvioitiin käyttäen CD163, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Tulokset osoittivat positiivista suhdetta Bmi1 ja CD68 /CD163 ilmentyminen mahasyövän (kuvio 1A, C) ja paksusuolen syövän (kuvio 1 B, D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että makrofagien kasvaimen stroomassa saattaa olla mukana Bmi1 ilmentymisen maha syöpäsoluja.

(A) Immunohistokemia ja Bmi1, CD68 ja CD163 ilmentyminen 83 mahasyövän kudoksiin. Mittaviivat 100 uM. (B) prosenttiosuus CD68 /163 positiivisia näytteitä suurina Bmi1 ilmentävien mahasyövän. Oli merkittävä korrelaatio Bmi1 ilmaisun ja CD68 /163 lauseke (*

P

0,05, ***

P

0,001, tässä järjestyksessä). (C) immunohistokemia of Bmi1, CD68, ja CD163 ilmentyminen 49 paksusuolensyöpä kudoksiin. Mittaviivat 100 uM. (D) prosenttiosuus CD68 /163 positiivisia näytteitä suurina Bmi1 ilmentävien paksusuolensyöpä. Oli merkittävä korrelaatio näiden kahden ryhmän (**

P

0,01, **

P

0,01, vastaavasti).

Bmi1 ilme lisääntyy ruuansulatuskanavan syövän solulinjoissa viljeltiin yhdessä M1- tai M2-polarisoitunut THP-1 makrofagien johtaa hankittu kyky pallo muodostumista 3D kulttuuri

seuraava suorittamansa

in vitro

yhdessä viljelemisen määrityksessä M1- tai M2-polarisoitunut THP-1 makrofagien tutkia jos makrofagien vaikuttavat Bmi1 ilmentymistä syöpäsoluissa ja syöpäsolun toimintoja. Kuten on esitetty aikaisemmin, THP-1-solut erilaistuvat M1- tai M2-polarisoitu makrofagien erillisiä sytokiinien käsittely (kuvio 2A) [23]. qRT-PCR-analyysi paljasti, että Bmi1 ekspressio lisääntyi merkitsevästi AGS ja HCT116-soluja viljeltiin yhdessä sekä M1- ja M2-polarisoitunut THP-1 makrofagit (kuvio 2B, C). Bmi1 on mukana kyky uusiutua kautta tukahduttamisen INK4a-ARF lokuksen, näin me arveltu, että maha soluja viljeltiin yhdessä TAMeja saattaa olla valmiuksia itseuudistumisen kautta upregulating Bmi1 ilme. Tutkia fenotyypin ruoansulatuskanavan solujen viljeltiin yhdessä TAM, teimme 3D-pallon kulttuurin kasvatettiin seerumittomassa tarttumattomat kulttuurin ruoansulatuskanavan solujen viljeltiin yhdessä M1- tai M2-polarisoitu THP-1 makrofagit (kuvio 2D, E ). Pallo muodostuminen kyky ruoansulatuskanavan soluja viljeltiin yhdessä TAMeja tehostui (kuvio 2F, G). Nämä tulokset viittaavat siihen, TAM voimistunut Bmi1 ilmaisun ja parannettu pallo muodostumista.

(A) Sytokiinituotanto profiilia M1- ja-M2 polarisoitunut THP-1 makrofageja. (B) qRT-PCR-analyysi Bmi1 ilmentymisen AGS soluja viljeltiin yhdessä M1- ja M2-polarisoitunut THP-1 makrofagien, verrattuna Bmi1 ilmentymisen AGS soluissa ainoastaan ​​kontrolliryhmään. Huomattavasti suurempi Bmi1 ekspressiota havaittiin viljeltiin yh- ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään (***

P

0,001, ***

P

0,001, vastaavasti). (C) qRT-PCR-analyysi Bmi1 ilmentymisen HCT116-soluja viljeltiin yhdessä M1- ja M2-polarisoitunut THP-1 makrofagien, verrattuna Bmi1 ilmentymisen HCT116-soluissa vain vertailuryhmällä. Huomattavasti suurempi Bmi1 ekspressiota havaittiin viljeltiin yh- ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään (***

P

0,001, ***

P

0,001, vastaavasti). (D) mikroskooppinen kuvat 3D-pallon viljeltyjen AGS soluja viljeltiin yhdessä makrofagien verrattuna 3D pallo viljellyt AGS soluja vain vertailuryhmällä. Mittaviivat 100 uM. (E) mikroskooppinen kuvat 3D-pallon viljeltyjen HCT116 soluja viljeltiin yhdessä makrofagien verrattuna 3D pallo viljellyt HCT116-solut vain vertailuryhmällä. Mittaviivat 100 uM. (F) Huomattavasti suurempi pallo numeroita havaittiin yhteistyössä viljellyissä ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään AGS soluissa (*

P

0,05, *

P

0,05, vastaavasti). (G) Huomattavasti suurempi pallo numeroita havaittiin yhteistyössä viljellyissä ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään HCT116-soluissa (*

P

0,05, **

P

0,01, vastaavasti) .

tunnistaminen miRNA säätelevät Bmi1 ilmaisua käyttäen syöpään liittyvien miRNA seulonta mahalaukun syöpäsoluissa

Useat miRNA ovat sekaantuneet säätelemään toimintaan syövän kantasoluja, mukaan lukien itsensä uudistaminen ja kasvainten muodostumiseen [19,20]. Siksi testattiin hypoteesia, että sääntely Bmi1 ilmentymisen maha syöpäsoluja saattaa välittää miRNA käyttämällä miRNA mikrosiruanalyysillä. Valitsimme kymmenen eniten vaimentua miRNA ruoansulatuskanavan soluja viljeltiin yhdessä M1- tai M2-polarisoitunut THP-1 makrofagien verrattuna ruoansulatuskanavan soluihin yksin (taulukko 1A, B). Käyttämällä useita online-tietokannat (Miranda, Diana, Targetscan, TargetMiner, miRbase), miR-30e-3p (miR-30e *) oli ainoa ehdokas miRNA kaikkien tunnistettu miRNA todettiin suoraan kohdistaa Bmi1 3 ’UTR. Siksi keskittyneet miR-30e * tarkempaa analysointia.

B

miRNAfold muutos (M1 vs. kontrolli) miRNAfold muutos (M2 vs control)hsa-miR-36820.006816627hsa-miR-36820.005809477hsa-miR-30e-3p0.011009754hsa-miR-373-3p0.015210649hsa-miR-3350.013768308hsa-miR-192-3p0.015870558hsa-miR-335-3p0.016194038hsv1-miR-H6-3p0.016751566hsa-miR-373-3p0.017847616hsa-miR-1225-3p0.017139628hsa-miR-192-3p0.01862193hsa-miR-36760.017353492hsa-miR-296-5p0.019188985hsa-miR-7660.032502682hsa-miR-1225-3p0.020111009hsa-miR-335-3p0.324230407hsa-miR-7660.038137453hsa-miR-769-5p0.445738351hsa-miR-769-5p0.434152471hsa-miR-30e-3p0.54343376Table 1. Microarray-analyysi 1360 miRNA vuonna AGS solulinjoissa viljeltiin yhdessä THP-1 makrofageja.

(A) Kymmenen miRNA vaimentua in AGS solulinjoissa viljeltiin yhdessä M1-polarisoitu makrofageissa verrattuna kontrolleihin. (B) kymmenen miRNA vaimentua in AGS solulinjoissa viljeltiin yhdessä M2-polarisoitu makrofageissa verrattuna kontrolleihin. CSV Lataa CSV

miR-30e * estää Bmi1 ilmentymistä ruoansulatuskanavan soluihin, ja sitä on kohdistettu Bmi1 3 ’UTR

paljastaa toiminnallista merkitystä miR-30e * ilme, tutkimme Bmi1 ilmaisua 6 maha syöpäsolulinjoissa Western blottauksella (kuvio 3A), ja analysoitiin suhde miR-30e * ja Bmi1 ilmaisun korkea Bmi1 ilmentävien syöpä solulinjoja (AGS ja HCT116) transfektoitu miR-30e * jäljittelee, ja alhainen Bmi1 ilmentävien syöpäsolujen linjojen (NUGC4 ja COLO201) transfektoitu miR-30e * inhibiittorit. Western blot-analyysi paljasti merkittävästi vähentää Bmi1 proteiinin tasot AGS ja HCT116-solut transfektoidaan jossa miR-30e * matkii verrattuna kontrolleihin (kuvio 3B, C), ja lisääntynyt tasoilla NUGC4 ja COLO201 transfektoitujen solujen miR-30e * inhibiittorit verrattuna kontrolleihin (Kuva 3D, E). Lisäksi tutkia fenotyypin syöpäsolujen transfektoitu miR-30e * jäljittelee, teimme 3D-pallon kulttuurin kasvatettiin seerumittomassa tarttumattomat kulttuurin AGS transfektoiduissa soluissa miR-30e * matkii (kuvio 4A). Pallo muodostuminen kyky AGS transfektoitujen solujen miR-30e * matkii estyi (kuvio 4B), joten vahvistettiin, että downregulation miR-30e * aiheutti parannettu alalla muodostumista.

(A) Western blot -analyysi of Bmi1 ilmentymisen 6 maha syöpäsolun linjat. (B) Western blot-analyysi Bmi1 ilmentymisen korkea Bmi1 ilmentäviä AGS solulinjoja transfektoitu negatiivisen kontrollin (NC) ja miR-30e * matkii. (C) Western blot-analyysi Bmi1 ilmentymisen korkea Bmi1 ilmentäviä HCT116 solulinjat transfektoidaan NC ja miR-30e * matkii. (D) Western blot analyysi Bmi1 ilmentymisen alhainen Bmi1 ilmentäviä NUGC4 solulinjat transfektoidaan NC ja miR-30e * inhibiittorit. (E) Western blot-analyysi Bmi1 ilmentymisen alhainen Bmi1 ilmentäviä COLO201 solulinjat transfektoitiin NC ja miR-30e * inhibiittorit.

(A) 3D-pallon kulttuurin kasvatettiin seerumittomassa tarttumattoman kulttuurin AGS soluja viljeltiin yhdessä makrofagien ja transfektoitu matkivat miR-30e * verrattuna 3D-pallon kulttuurin kanssa AGS soluja viljeltiin yhdessä makrofagien ja transfektoidaan matkivat NC kuin vertailuryhmällä. Mittaviivat 100 uM. (B) merkittävästi matalan pallo numeroita havaittiin matkivat miR-30e * transfektoitu ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään (* P 0,05, * P 0,05, vastaavasti). (C): n oletettu miR-30e * kohdepaikkaan tai mutatoidun sekvenssin 3′-UTR: Bmi1 kloonattiin välittömästi alavirtaan lusiferaasigeenin. (D) Lusiferaasiaktiivisuus AGS-solujen transfektoitiin yhdessä plasmideilla, jotka sisältävät villityypin miR-30e * kohdesekvenssin 3′-UTR: Bmi1 tai valvonnan plasmideja yhdessä mRNA matkivat NC ja matkivat miR-30e *. (E) Lusiferaasiaktiivisuus AGS-solujen transfektoitiin yhdessä plasmideilla, jotka sisältävät villityypin tai mutantti-miR-30e * kohdesekvenssin 3′-UTR: Bmi1 yhdessä mRNA matkivat NC ja matkivat miR-30e *.

analyysi Bmi1 3 ’UTR käyttämällä online-tietokanta Miranda paljasti ennustettu kohdesekvenssi miR-30e *. Me tutkimme seuraavaksi, jos miR-30e * suoraan kohdistettu 3 ’UTR: Bmi1 käyttämällä konstrukteja, jotka sisältävät otaksutun miR-30e * kohdepaikkaan tai mutatoidun sekvenssin 3’-UTR: Bmi1 kloonattiin välittömästi alavirtaan lusiferaasigeeniin. LUC-Bmi1 rakentamiseksi, joka sisältää ennustetun miR-30e * kohdesekvenssin Bmi1 3 ’UTR on esitetty kuviossa 4C, jossa siemen sekvenssit viivoilla. Transfektio AGS solujen miR-30e * jäljittele suppressoi merkittävästi lusiferaasin aktiivisuutta toimittaja vektori, joka sisältää villityypin Bmi1 3 ’UTR (LUC-Bmi1-WT) kontrolliin verrattuna vektorin (kuvio 4D). Meillä on myös rakennettu reportteri vektorit, jotka sisältävät mutantti-Bmi1 3 ’UTR (LUC-Bmi1-MT). Transfektio miR-30e * matkivat ei tukahduttaa lusiferaasin aktiivisuutta toimittaja vektori, joka sisältää mutatoidun 3 ’UTR: Bmi1 verrattuna villityypin 3’ UTR-vektoriin (kuvio 4E). Nämä tulokset osoittavat, että miR-30e * säätelee Bmi1 ilmentyminen suoraan kohdentamalla sen 3 ’UTR.

Bmi1 ilmentyminen korreloi käänteisesti miR-30e * ilmentymistä potilailla mahalaukun syövän

seuraava analysoitu tasot miR-30e * ilmentyminen syövän kudoksissa ja niiden yhteensovitettujen viereisen normaalin epiteelin avulla qRT-PCR. Expression of miR-30e * oli merkitsevästi pienempi syövän kudoksissa verrattuna niiden Hyväksytty viereisten normaalin epiteelin sekä mahasyövän (kuvio 5A) ja paksusuolen syöpä (kuvio 5C). Lisäksi vertasimme miR-30e * ekspressiotasot korkean ja matalan Bmi1 ilmentävät syöpäkudoksissa. Korkea Bmi1 ekspressiotasoja havaittiin 45% (24/53) mahasyövän näytteitä ja 54% (20/37) paksusuolisyövän näytteitä. Bmi1 ilmentyminen korreloi käänteisesti miR-30e * ilmentymisen mahasyövässä (kuvio 5B). Kuitenkin Bmi1 ilmentyminen ei liittynyt miR-30e * ilmentymistä paksusuolensyöpä (kuvio 5D). Nämä tulokset osoittivat, että Bmi1 ilmentyminen korreloi voimakkaasti miR-30e * ilmentymistä potilailla mahalaukun syöpä, mutta ei potilailla, joilla on paksusuolen syöpä.

(A) tasot miR-30e * ilmentymistä 16 mahasyövän kudoksiin ja niiden yhteensovitettujen vieressä normaali mahan epithelia arvioituna qRT-PCR. (B) tasot miR-30e * ilmentymistä 29 korkea ja 24 matalan Bmi1 ilmentävien mahasyövän kudoksiin arvioituna qRT-PCR. (C) tasot miR-30e * ilmentymistä 37 paksusuolensyöpä kudokset ja niiden yhteensovitettujen viereisen normaalin paksusuolen epiteelin arvioituna qRT-PCR. (D) tasot miR-30e * ilmentymistä 20 korkea ja 17 matalan Bmi1 ilmentävien paksusuolensyöpä kudoksiin arvioituna qRT-PCR.

M1- ja M2-polarisoidun makrofagit puhdistettu ihmisen monosyyteissä aiheuttama downregulation miR-30e * ja säätelyä Bmi1

aikaisemmat tulokset osoittivat, että Bmi1 ilmentyminen merkittävästi lisääntynyt AGS ja HCT116 soluja viljeltiin yhdessä sekä M1- ja M2-polarisoitunut THP-1 makrofageja. Me seuraavaksi viljeltiin yh- AGS ja HCT116-solujen kanssa M1- ja M2-polarisoitu makrofagien puhdistettu ihmisen monosyyteissä. Bmi1 ekspressio oli lisääntynyt AGS soluja viljeltiin yhdessä sekä M1- ja M2-polarisoitu makrofagit puhdistettiin ihmisen monosyytit, ja miR-30e * ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt AGS soluja viljeltiin yhdessä sekä makrofagien (kuvio 6A, C). Sen sijaan, Bmi1 ekspressio lisääntyi merkitsevästi HCT116-soluja viljeltiin yhdessä M1-polarisoitu makrofageja, mutta ei HCT116-soluja viljeltiin yhdessä M2-polarisoitu makrofageissa. Expression of miR-30e * oli merkittävästi vähentynyt HCT116-soluissa viljeltiin yhdessä sekä makrofagien (kuvio 6B, D). Tämä tulos osoitti, että M1- ja M2-polarisoitu makrofagit puhdistettiin ihmisen monosyyteistä indusoiman downregulation miR-30e * ruoansulatuskanavan solulinjoissa, ja säätelyä Bmi1 mahasyövän solulinjassa, mutta ei koolonisyöpäsolulinja.

(A) qRT-PCR-analyysi miR-30e * ilmentymisen AGS soluja viljeltiin yhdessä M1- ja M2-polarisoitu makrofageissa. Huomattavasti pienempi miR-30e * ekspressiota havaittiin viljeltiin yh- ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään (***

P

0,001, *

P

0,05, vastaavasti). (B) qRT-PCR-analyysi miR-30e * ilmentymisen HCT116-soluja viljeltiin yhdessä M1- ja M2-polarisoitu makrofageissa. Huomattavasti pienempi miR-30e * ekspressiota havaittiin viljeltiin yh- ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään (***

P

0,001, **

P

0,01, vastaavasti). (C) qRT-PCR-analyysi Bmi1 ilmentymisen AGS soluja viljeltiin yhdessä M1- ja M2-polarisoitu makrofageissa. Huomattavasti suurempi Bmi1 ekspressiota havaittiin viljeltiin yh- ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään (***

P

0,001, **

P

0,01, vastaavasti). (D) qRT-PCR-analyysi miR-30e * ilmentymisen HCT116-soluja viljeltiin yhdessä M1- ja M2-polarisoitu makrofageissa. Huomattavasti suurempi Bmi1 ekspressiota havaittiin M1 makrofagin viljeltiin yh- ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään (**

P

0,01). (E) Kaavioesitys miR-30e * -Bmi1 signaloinnin välittämiä TAMeja.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että TAM voimistunut Bmi1 ilmaisua, mikä lisää alan muodostumisen kyky. Bmi1 ilmentyminen tukahdutettiin miR-30e * kautta miR-30e * suora sitoutuminen Bmi1 3 ’UTR, ja Bmi1 ilmentyminen korreloi käänteisesti miR-30e * ilmentyminen syövän kudoksissa.