Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain hypoksia säätelemättömään ilmentymistä hypoksian indusoivan tekijän (HIF) ja sen biologinen seuraus johtaa huonoon ennusteeseen potilailla diagnosoitu kiinteitä kasvaimia, jolloin lisääntynyttä kuolleisuutta, mikä viittaa siihen, että ymmärtäminen molekyyli suhde hypoksia muiden solujen ominaisuuksia kasvaimen aggressiivisuus olisi korvaamaton kehittää uudempia täsmähoitoihin kiinteitä kasvaimia. Kehittyvät todisteet viittaavat myös siihen, että hypoksia ja HIF signalointireittejä edistää hankintaan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), ylläpito syövän kantasolujen (CSC) toiminnot, ja myös ylläpitää noidankehän tulehdus, jotka kaikki edistävät säteilylle hoito ja kemoterapiaa vastus. Kuitenkin yksityiskohtaiset mekanismit, joilla hypoksia /HIF ajaa näitä tapahtumia ei täysin ymmärretä. Tässä olemme osoittaneet, että hypoksia johtaa lisääntyneeseen VEGF: n ilmentymistä, IL-6, ja CSC markkerigeenit, kuten Nanog, Oct4 ja EZH2 ja myös lisääntynyt ilmentyminen miR-21, onkogeeninen miRNA, eturauhasen syöpä (PCA) solut (PC-3 ja LNCaP). Hoito Eturauhassyövän soluja CDF, uusi Curcumin johdettu synteettinen analogi aiemmin osoitti antituumorivaikutuksen

in vivo

, esti tuotannot VEGF ja IL-6, ja alassäädetty ilmaisua Nanog, Oct4 , EZH2 mRNA: t, sekä miR-21 alle hypoksinen kunnossa. Lisäksi CDF hoito Eturauhassyövän soluja vähensivät solujen vaeltamiseen hypoksisissa kunnossa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että anti-kasvain vaikutus CDF on osittain välittyvät vapautuminen kasvain hypoksinen polkuja, ja näin CDF voisi tulla hyödyllinen syövän hoidossa.

Citation: Bao B, Ahmad A, Kong D, Ali S, Azmi AS, Li Y, et al. (2012) Hypoksia aiheuttama aggressiivisuus eturauhassyöpäsolujen liittyy sääntelemättömään ilmentymiseen VEGF, IL-6 ja miRNA Tämä vaimennetaan CDF. PLoS ONE 7 (8): e43726. doi: 10,1371 /journal.pone.0043726

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2012; Julkaistu: 27 elokuu 2012

Copyright: © Bao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos Puschelberg ja Guido Foundations heidän antelias rahoitusosuudesta. Grant tuki National Cancer Institute, National Institutes of Health myöntää 5R01CA131151, 5R01CA132794 ja 1R01CA154321 (FHS), ja Yhdysvaltain puolustusministeriön Exploration-hypoteesi Development Award PC101482 (BB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin diagnosoitu syöpä miehillä ja se on toiseksi suurin syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa [1]. Useimmat Eturauhassyövän potilaat ovat hoidettavissa, mutta potilaat yleensä kuolee lääkeresistenssin ja etäpesäkkeitä. Näin ollen on olemassa pakottava tarve kehittää uusia strategioita, joilla lääkeresistenssin ja etäpesäkkeitä voidaan ohjata uusia aineita, jotka voivat parantaa hoitotuloksia. Hypoksia on yksi perustavaa laatua biologisia ilmiöitä, niveltyvät liittyvät kehittämiseen ja aggressiivisuus erilaisten kiinteiden kasvainten kuten PCa. Hypoksian indusoima tekijä (HIF) toimivat master transkriptiotekijä, joka säätelee hypoksia reagoiva geenejä ja on tunnustettu kriittisiä rooleja kasvaimen invaasio, kemoterapia-säteilyn kestävyys, ja lisääntynyt solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, angiogeneesiä ja etäpesäkkeiden [2]; [3]. Siksi kasvain hypoksia säätelemättömään ilmaus HIF ja sen biologinen seuraus johtaa huonoon ennusteeseen potilailla diagnosoitu kiinteitä kasvaimia, jolloin lisääntynyttä kuolleisuutta, mikä viittaa siihen, että ymmärtäminen molekyyli suhde hypoksian muihin solun ominaisuuksia kasvaimen aggressiivisuus olisi korvaamaton kehittää uudempia täsmähoitoihin kiinteisiin kasvaimiin.

on hyvin tunnettua, että syövän kantasolut (CSCS) ja epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppiset solut liittyvät terapeuttisten kestävyys ja edistää aggressiivinen kasvaimen kasvua, invaasio ja etäpesäkkeiden, ja niiden uskotaan olevan syynä kasvaimen uusiutumisen [4]. Kehittyvät todisteet viittaavat siihen, että hypoksia ja HIF-reitin parantaa fenotyyppien ja toiminnot CSCS ja EMT [5] – [9], edistää kasvaimen aggressiivisuutta, joka voi johtua myös vapauttamisen MikroRNA (miRNA). MiRNA tiedetään olevan kriittiset roolit monenlaisia ​​biologisia prosesseja, kuten solun erilaistuminen, proliferaatio, solukuolema, aineenvaihduntaa ja energia homeostaasin [10]; [11]. Kertyvät tutkimusten mukaan miRNA saattaisi olla tärkeä rooli kehityksen ja etenemistä kasvaimia. Muuttunut ilmentyminen miRNA on liittynyt kliinisen ennusteen kasvain, vastustuskyky kemoterapia-sädehoito ja kasvaimen uusiutumisen [12] – [14]. Suuri määrä miRNA on raportoitu reagoivan hypoksia ja HIF-reitin monenlaisia ​​solujen ja kudosten, mukaan lukien syöpäsolut [15] – [18]. On raportoitu, että hypoksia syistä vähentynyt ilmentyminen miR-101, mahdollinen anti-onkogeenisen miRNA, ja lisääntynyt ilmentyminen miR-21 ja miR-210, onkogeenisen miRNA erilaisissa syövissä, mukaan lukien PCa [13]; [19]. Siten hypoksia välittämää vapautuminen miRNA voi olla tärkeä rooli kasvaimen aggressiivisuus välittyvä säätelyyn solujen signalointireittien lukien HIF-reitin. Siksi kohdentamalla hypoksia välittämää miRNA käyttämällä uusia aineita voidaan tarjota innovatiivisia terapeuttinen strategia ehkäisyyn ja /tai hoitoon PCa.

Täällä olemme tutkineet vaikutuksia hypoksia solumigraation, invaasio, angiogeneesi, ja VEGF: n ilmentymistä, IL-6, CSC geenejä, ja miR-21 ja miR-210 PCa soluja hypoksinen kunnossa. Tutkimme myös roolia miR-21 säätelyssä ilmentymisen VEGF, IL-6, CSC markkerigeeni, ja niiden yhteydessä muodostumista prostaspheres PCA soluissa hypoksisissa olosuhteissa. Lisäksi tutkimme vaikutuksia uusi kurkuma johdettu synteettinen analogi (CDF), joka osoitti antituumorivaikutuksen kanssa lisää systeemistä ja kohdekudos hyötyosuus, solun eloonjäämiseen, muuttoliike, invaasio, angiogeneesi, muodostumista prostaspheres, ja ilmaus HIF-1α, VEGF, IL-6, CSC markkerigeeni, ja miRNA PCA soluja hypoksisissa olosuhteissa. Olemme havainneet, että hypoksia lisäsi VEGF: n ilmentymistä, IL-6, ja CSC markkerigeenit, kuten Nanog, Oct4 ja EZH2 ja myös lisääntynyt ilmentyminen miR-21 ihmisen PCa soluissa. Hoito solujen CDF esti tuotannoissa VEGF ja IL-6, ja alassäädetty ilmaisua Nanog, Oct4 ja EZH2 mRNA: t, sekä miR-21 näissä soluissa hypoksisissa kunnossa. CDF myös vähentynyt Solujen migraation Eturauhassyövän soluja hypoksinen kunnossa. Näistä tuloksista päättelemme, että kasvaimen vastainen vaikutus CDF on osittain välittyvät vapautuminen kasvaimen hypoksinen signalointipolkujen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, Drugs ja reagenssit

Ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa PC-3 ja LNCaP-soluja ylläpidettiin tavanomaisissa viljelyolosuhteissa (21% O

2 ja 5% CO

2, 37 ° C). Hypoksinen (1% O

2) ja 5% CO

2 olosuhteet syntyvät ohjaamalla panos virtausnopeudet typen ja hiilidioksidin, vastaavasti kasvatusinkubaattoriin. Kaikki solulinjat pidettiin yllä 10% FBS-RPMI-1640-alustassa tavanomaisissa soluviljelyolosuhteissa kunnossa. CDF syntetisoitiin, kuten on kuvattu aiemmissa julkaisuissa [20]; [21].

Cell eloonläämismääritys

Jotta vaikutuksen tutkimiseksi CDF solun eloonjäämiseen ihmisen PCa soluissa hypoksisissa edellytyksellä, MTT määritys suoritettiin käyttäen ihmisen PCa (PC-3 ja LNCaP-solut). 3000 solua maljattiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin vakio viljelyolosuhteet (21% O

2 ja 5% CO

2) yön yli. Solut käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla CDF (0,5 uM), ja niitä inkuboitiin 8 h hypoksisissa ehto seuraa 16 tunnin ajan normoxic kunnossa joka päivä. 3 päivän kuluttua hoidon jälkeen solut kerättiin standardin MTT-analyysi, kuten kuvattu edellisessä julkaisuissa [22]; [23]. Jokainen koe suoritettiin neljä rinnakkaista ja toistettiin kahdesti itsenäisesti.

klonogeeninen Pitoisuus

klonogeeninen määritys suoritettiin tutkimaan vaikutusta CDF solujen kasvuun Eturauhassyövän soluja hypoksisissa kunnossa, kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],22]. Lyhyesti, 5 x 10

4-solut maljattiin kuuden kuoppalevylle ja sen jälkeen 3 päivää altistuksen 0,5 uM CDF (8 h hypoksisen tilan ja 16 h normoxic ehto päivässä), solut trypsinoitiin, ja 1000 yhden elävät solut maljattiin 100 mm: n petrimaljoille. Sitten soluja inkuboitiin 10-12 päivä 37 ° C: ssa 5% CO

2/5% O

2/90% N

2-inkubaattorissa. Pesäkkeet värjättiin 2% kristalliviolettia, pestiin vedellä, ja laskettiin. Jokainen koe suoritettiin kolme toistoa ja toistettiin kahdesti itsenäisesti.

invaasiomääritys

in vitro

invaasiomääritys Eturauhassyövän soluja suoritettiin hypoksisissa olosuhteissa käyttämällä Costar Transwell 24 kuoppaiset-levyt polykarbonaattikalvon (Corning Incorporated, Corning, NY), kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, 4 x 10

4 syöpäsolujen (PC-3 ja LNCaP) altistettiin 3 päivän inkubaation mukaisesti normoxic tai hypoksinen kunnossa ympättiin kuhunkin kuoppaan Matrigel esipäällystetty Transwell levyille. Pohja kuoppiin järjestelmän täytettiin täydelliseen alustaan. 20 h kuluttua inkuboinnin joko puuttuessa tai läsnä ollessa CDF (0,5 uM), The hyökkäsi syövän solut värjättiin 4 ug /ml kalseiini-AM: n (Invitrogen) PBS-liuoksessa 37 ° C: ssa 1 h, sen jälkeen, kun valmistajan manuaalinen. Kuvat on otettu käyttämällä fluoresenssimikroskooppia. Jokainen koe suoritettiin kolme toistoa ja toistettiin kahdesti itsenäisesti.

haavan paraneminen Pitoisuus

Jotta voidaan tutkia vaikutusta CDF solujen migraatio PCa solujen hypoksisissa kunnossa, teimme haavojen määritys , kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, kun PC-3-solujen tuli 90-95% konfluentteja, haava syntyy esimakua levyjen pipetillä kärjestä. Sitten soluja inkuboitiin poissa ja läsnä ollessa CDF (0,5 uM) ja viljeltiin hypoksisissa ehto 4 h, jonka jälkeen 16 h happiolosuhteissa, ja sitten valokuvattiin Nikon Eclipse TS100 mikroskoopilla, kuten aiemmin on kuvattu [23] . Jokainen koe suoritettiin kolme toistoa ja toistettiin kahdesti itsenäisesti.

putkenmuotoilu- Pitoisuus

Jotta voidaan tutkia vaikutusta CDF angiogeneesiin

in vitro

verisuonten endoteelisoluissa alla hypoksinen kunnossa, teimme putken muodostumiseen määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [25]; [26]. Lyhyesti, 3 x 10

4 kaniinin verisuonten endoteelin solut maljattiin kuhunkin kuoppaan Matrigel-esipäällystetty 96-kuoppaisen levyn 100 ui 10% FBS-DMEM-alustassa, ja altistettiin normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 4 tuntia inkuboinnin 37 ° C: ssa, jonka jälkeen 16 h happiolosuhteissa. Kuva on otettu 4 tuntia ja 20 tuntia, vastaavasti. Kukin koe toistettiin kahdesti itsenäisesti.

ekspressio VEGF: n ja IL-6

ELISA suoritettiin tutkimaan vaikutusta CDF happivajaus aiheuttama VEGF: n ilmentymistä ja IL-6 PCa soluissa. Elatusaineet PCA soluista hypoksisissa tai happiolosuhteissa 16 tunnin kerättiin mittausta varten VEGF ja IL-6 käyttämällä ELISA-määritystä sarjat (R [27]. CD44 tai EpCAM merkitty prostaspheres valokuvattiin alla Nikon ESLIPSE E800 kanssa 100x suurennus. Konfokaalimikroskopia (Leica TCS SP5) suoritettiin MIRL Core laitos, Wayne State University School of Medicine. Jokainen koe toistettiin kahdesti itsenäisesti.

Transient ja stabiili transfektio Eturauhassyövän soluja, joiden cDNA ja miRNA

transfektiosta cDNA ja miRNA tehtiin käyttämällä ExGen 500 transfektioreagenssia (Fermentas, Saksa) ja DharmaFECT transfektioreagenssi (Dharmacon), vastaavasti, seuraavaa käsikirjoihin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Stabiili transfektio cDNA: t, jotka toteutetaan valinnan G418: aa sisältävässä väliaineessa (Sigma), ja varmistettiin Western blot -analyysillä, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kukin koe toistettiin kahdesti itsenäisesti.

Protein Extraction ja Western blot -analyysi

Western blot analyysi suoritettiin mitata suhteelliset tasot HIF-1α-proteiinin PCa soluja hypoksisissa olosuhteissa. Kokosoluliuotteista solujen altistetaan 16 h hypoksinen kunnossa saatiin hajottamalla solut proteiinia lyysipuskuria, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1% NP-40, 0,1% SDS: ää, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 2 mM natriumfluoridia, 2 mM Na

3VO4

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta, ja 1 x proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche Diagnostics, Saksa), ja Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24], ja signaali-intensiteetti mitattiin käyttäen kemiluminesenssi tunnistusjärjestelmä (Pierce Rockford, IL). Jokainen koe toistettiin kahdesti itsenäisesti.

Reaaliaikainen (RT) käänteiskopioijaentsyymi–polymeraasiketjureaktio (PCR) varten mittaaminen ilmentäminen mRNA: iden ja miRNA

määrittämiseksi mRNA ilmaisun, kaksi mikrogrammaa koko-RNA: t uutettiin kustakin näytteestä käytettiin RT reaktiossa 20 ul: n reaktiotilavuudessa käyttäen käänteistranskriptio-järjestelmä (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden. SYBR Green Assay Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) käytettiin reaaliaikaista PCR-reaktiolle käyttäen AB StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) noudattaen valmistajan protokollaa. Sekvenssit PCR-alukkeet on kuvattu aikaisemmin [23]. Tiedot analysoitiin käyttäen C

t menetelmä ja normalisoitiin GAPDH ilmaisu kussakin näytteessä. Ekspression määrittämiseksi ja miRNA soluissa, TaqMan MicroRNA Assay Kit (Applied Biosystems) käytettiin seuraavasti valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA uutettiin soluista ja 5 ng RNA: ta käänteistranskriptio kuten aiemmin on kuvattu [28]. Mirna alukkeet saatiin AB Systems. Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin sitten kokonaistilavuudessa 10 ui reaktioseosta kuten aiemmin on kuvattu [24], käyttämällä StepOnePlus Real Time PCR System (AB Systems). Tiedot analysoitiin käyttäen C

t menetelmä ja normalisoitiin RNU48 ilmaisu kussakin näytteessä. Jokainen koe suoritettiin kolme toistoa ja toistettiin kahdesti itsenäisesti.

lusiferaasireportterigeenillä Assay

Jotta voidaan tutkia vaikutuksen CDF tai miR-21 vajauksen miR-21 sitoutumisaktiivisuutta 3 ’ -UTR PCA-soluissa hypoksisissa edellytyksellä, teimme miR-21-välitteisen lusiferaasireportterigeenin määritys PC-3-soluista käyttämällä miR-21-välitteisen lusiferaasireportterigeenillä vektori (Signosis, Sunnyvale, CA), jossa miR-21 sitovan sen DNA sitoutumispaikasta lusiferaasigeeni vektorin estää lusiferaasiaktiivisuus. Lyhyesti, 10

4 PC-3-soluja siirrostettiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisille levyille, ja niitä inkuboitiin yön yli standardin viljelyolosuhteissa. Sitten solut transfektoitiin miR-21-tukahdutetaan lusiferaasireportterigeenillä vektori (Signosis, Sunnyvale, CA) käyttämällä ExGen 500 transfektioreagenssia (Fermentas, Saksa) tai transfektoitiin yhdessä lusiferaasin vektorin ja anti-miR-21 käyttämällä DharmaFECT transfektioreagenssia (Dharmacon) seuraten valmistajan protokollaa, kuten edellä on kuvattu. Yön yli transfektion transfektantit käsiteltiin CDF vielä 20 h tavanomaisissa viljelyolosuhteissa, ja altistettiin 4 h hypoksinen kunnossa. Lopuksi transfektantit kerättiin lusiferaasin aktiivisuuden määritys käyttäen Luciferase Assay System (Promega), valmistajan ohjeiden käsikirja. Jokainen koe toistettiin kahdesti itsenäisesti.

tilastolliset menetelmät

vertaaminen hoitotuloksia testattiin merkittävää eroa, jonka pariksi

t

testiä. Tilastollinen merkitsevyys otetut

P

arvo on alle 0,05.

Tulokset

vaikutus CDF Cell Survival ja kyky muodostaa klooneja PCa Cells Hypoksisissa kunto

tiedot MTT-määritystä osoittavat, että CDF estettiin merkittävästi solujen eloonjäämistä PC-3 ja LNCaP-solut hypoksisissa olosuhteissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1A). CDF hoito vähensi myös kyky muodostaa klooneja PC-3 ja LNCaP-solut hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 1 B). Nämä havainnot ehdotti, että CDF voi estää solujen eloonjäämistä ja klonogeeniset kasvu Eturauhassyövän soluja hypoksisissa olosuhteissa.

Paneelit A, B, ja C edustavat datan solun selviytymisen, kyky muodostaa klooneja, ja Western blot-analyysi, vastaavasti. Palkit luvut osoittavat keskihajonta n = 4.

vaikutus CDF on HIF-1α proteiini ja Productions VEGF ja IL-6 PCA soluissa Hypoksisissa kunto

Kuten kuviossa 1C, CDF hoito vähensi suhteellista tasoa HIF-1α PC-3 ja LNCaP hypoksisissa kunnossa. Soluja inkuboitiin hypoksisissa edellytyksellä lisännyt VEGF tuotantoa verrattuna soluihin inkuboidaan normoxic ehdon (kuvio 2). CDF käsittely huomattavasti vähentynyt tuotanto hypoksian indusoiman VEGF PCa-soluissa (kuvio 2). HIF-1α yliekspressoivissa PC-3-solut osoittivat lisääntynyttä VEGF tuotantoa hypoksisissa edellytyksellä, verrattuna sen vanhempien PC-3-solut. CDF hoito esti myös hypoksian aiheuttaman VEGF tuotantoa HIF-1α yliekspressoivissa PC-3-solut. Nämä tulokset viittaavat siihen, että solut on viljelty hypoksisissa tila johtaa lisääntyneeseen IL-6: n tuotantoa verrattuna soluihin inkuboidaan normoxic ehdon (kuvio 2). CDF käsittely huomattavasti vähentynyt tuotanto hypoksian indusoiman IL-6 PCa-soluissa (kuvio 2). CDF laski myös hypoksian indusoiman IL-6-tuotannon HIF-1α yli-ilmentävät PC-3-soluja (kuvio 2).

Esikäsitelty väliaine kerättiin soluista viljeltiin normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa, kuten on kuvattu alla menetelmien osiossa. Mittaukset VEGF: n ja IL-6 tehtiin ELISA: lla. Palkit luvut osoittavat keskihajonta n = 3.

vaikutus CDF angiogeneesistä

in vitro

verisuonten endoteelisoluissa Hypoksisissa kunto

tulokset osoittavat, että hypoksinen olosuhteet lisänneet putken muodostumiseen kapasiteetti verisuonten endoteelisolujen 4 h ja 20 h inkubointeja, vastaavasti, verrattuna normoxic kunnossa. CDF hoito esti hypoksian indusoiman putken muodostumiseen verisuonten endoteelisoluissa (kuvio 3A). Selvittää, onko vai ei CDF välittämä molekyylejä tai CDF itsessään edistää estyminen putken muodostumiseen, keräsimme kuin CDF-käsiteltyjen (kontrolli) ja CDF-käsitelty ehto mediaa syöpäsolujen ja johdetaan putken muodostumista määrityksessä alle normoxic kunnossa. Olemme havainneet, että verisuonten endoteelisolujen inkuboitiin ohjattu kunnossa media oli kasvanut putken muodostumiseen 4 h ja 20 h, verrattuna soluihin inkuboitiin CDF-esikäsiteltyjä kunnossa media. Lisäksi CDF valvontaan ehto media inhiboi merkittävästi putken muodostumiseen verrattuna soluja inkuboitiin ohjaus kunnossa median ja CDF-esikäsitelty edellytys media (kuvio 3B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CDF itsessään edistää estyminen putken muodostumiseen.

Paneelit A B, C solumigraation arvioitiin haavan paranemista määritys; invaasio arvioitiin kammio invaasiomääritys.

vaikutus CDF Cell Migration ja Invasion

in vitro

PCA Solut Hypoksisissa kunto

Hypoksia alttiina PC- 3-solut oli kasvanut kapasiteetti haavan paranemista, verrattuna soluihin viljelty normaaleissa happiolosuhteissa (kuvio 3C). CDF hoito esti haavojen paranemista kyky Eturauhassyövän soluja hypoksisissa ehto (kuvio 3C ja D). Kuten on esitetty kuviossa 3D, yli-ilmentyminen HIF-1α kasvanut haavan paranemisen kapasiteetin PC-3-solut altistettiin 16 h hypoksinen kunnossa. CDF hoito esti haavan paranemista kapasiteettia sekä HIF-1α-over-ilmentävät PC-3-solujen hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 3D). Nämä tulokset edellyttäen vakuuttavia tietoja, jotka osoittavat, että CDF voi estää hypoksian aiheuttamaa solumigraation Eturauhassyövän soluja, jopa HIF-1α-over-ilmentävien PCa soluissa.

in vitro

invaasiomääritys osoittaa, että sekä PC-3 ja LNCaP altistettiin hypoksinen ehto oli kasvanut kapasiteetti invaasio, verrattuna soluihin altistuvat normoxic ehto (kuvio 3E). CDF hoito esti kapasiteettia hypoksian aiheuttaman hyökkäyksen Eturauhassyövän soluja.

vaikutus CDF Gene Expression CSC merkkiaineet ja miRNA Expression PCA soluissa Hypoksisissa kunto

Tiedot reaaliajassa RT-PCR-määritys osoittaa, että hypoksian indusoima suhteellisten tasojen Nanog, Oct4 ja EZH2 mRNA: iden sekä miR-21 ja miR-210 PC-3 ja LNCaP-solut taas CDF laski tasot Nanog, Oct4 ja EZH2 mRNA: iden sekä miR-21 ja miR-210 PCa soluissa hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 4).

Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin, kuten on kuvattu alla menetelmät jaksossa. Palkit luvut osoittavat keskihajonta n = 3.

vaikutus CDF tai Anti-miR-21 CSC kyky uusiutua ja solunpintamarkkereiden CD44 ja EpCAM Human PCa solut Hypoksisissa ehto

tiedot alalla muodostuminen määrityksessä osoittaa, että anti-miR-21 vähensi muodostumista prostaspheres PC-3-soluja (kuvio 5A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-21 voi olla tärkeä rooli sääntelyn kyky uusiutua CSC kaltaisia ​​PCa soluissa. CDF hoito myös decesased muodostumista prostaspheres Eturauhassyövän soluja hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 5A). Lisäksi teimme konfokaali kuvantaminen mikroskopia arvioimiseksi ilmentymisen CD44 ja EpCAM alalla muodostavien solujen PC-3-soluja. Tulokset osoittavat, että anti-miR-21 väheni ilmentymistä CD44 ja EpCAM PC-3 pallo-muodostavien solujen hypoksisissa kunnossa, sopusoinnussa CDF hoitoon (kuvio 5B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CDF laski muodostumista prostaspheres ja ilmentymistä CD44 ja EpCAM osittain välittyvät kohdentamalla ilmentymistä miR-21.

Paneelit A ja B edustavat tiedot muodostumisen prostaspheres, The ilmentymä CD44 ja EpCAM sekä tuotannon VEGF ja IL-6 CSC kaltainen pallo muodostavien solujen Eturauhassyövän soluja, tässä järjestyksessä. Pallo muodostuminen -koe sen tutkia kyky uusiutua ja CSCS Eturauhassyövän soluja kuvatulla alla Menetelmät jaksossa. Konfokaalimikroskopia tehtiin mitata ilmentymisen CSC pintamarkkereiden CD44 ja EpCAM alalla muodostavia soluja, jotka ovat peräisin PCa soluja, kuten on kuvattu alla Menetelmät jaksossa. Palkit luvut osoittavat keskihajonta n = 3.

vaikutus CDF tai Anti-miR-21 VEGF ja IL-6 Tuotanto Sphere muodostavien solujen PC-3-soluilla hypoksinen kunto

tutkittiin, mikä vaikutus CDF VEGF ja IL-6 tuotantoja alalla muodostavien solujen PC-3-solut hypoksisissa ehdolla ELISA-määrityksellä. Olemme havainneet, että PC-3 palloja muodostavan solut tuottivat suurempia määriä VEGF hypoksisissa edellytyksellä, verrattuna sen vanhempien PC-3-soluja (3172 pg /ml /10

4 PC-3 pallo-muodostavien solujen vs 3192 pg /ml /10

6 PC-3-soluja, kuvio 2 ja 5C), mikä viittaa siihen, että PC-3 palloja muodostavan solut voivat edistää angiogeneesiä jopa-ekspressiota sääteleviä VEGF tuotantoa. Olemme myös havainneet, että CDF hoito laski hypoksian aiheuttaman VEGF tuotantoa PC-3 pallo muodostavia soluja, vastaa tuloksia, PC-3 palloja muodostavan solujen ehdollinen esto miR-21. Lisäksi olemme havainneet, että samanlainen VEGF tuotantoa, palloja muodostavan solut tuottivat huomattavan suurempi määrä hypoksian indusoiman IL-6, verrattuna sen emosoluista (129,3 pg /ml /10

4 PC-3 palloja muodostavan solut vs 457,6 pg /ml /10

6 PC-3-solut, kuva 2 ja 5C). CDF hoitoon tai ehdollisen puute miR-21 sen estäjä /siRNA vähentynyt tuotanto hypoksian indusoiman IL-6 piiriin muodostavien solujen (kuvio 5C). Olemme myös tutkittava, ovatko CDF hoitoa tai miR-21 puutos voi säädellä geeniekspressiota HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, ja EMT merkkiaineiden PC-3 pallo-muodostavien solujen hypoksisissa kunnossa. Huomasimme, että ehdollinen tukahduttaminen miR-21 johti merkittävään suhteellinen lasku mRNA tasot HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, ja mesenkymaalisten markkereita EMT fenotyyppiä kuten ZEB1, vimentiinistä, ja Twist, ja lisääntynyt suhteellinen mRNA-tasoja epiteelin marker E-kadheriinin PC-3 pallo-muodostavien solujen hypoksisissa olosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty). Vastaavasti, CDF vähensi mRNA-tasoja ja HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, ja mesenkymaaliset markkereita ZEB1, ZEB2, vimentiinin, ja Twist PC-3 pallo-muodostavien solujen hypoksisissa kunnossa. Kuitenkin, CDF myös vähentynyt geenin ilmentyminen E-kadheriinin PC-3 pallo-muodostavien solujen hypoksisissa olosuhteissa (tietoja ei esitetty).

vaikutus CDF on Expression of miRNA PC-3 Sphere muodostavia solut hypoksisissa kunto

tutkittiin, mikä vaikutus CDF on Let-7, miR-21, miR-101, ja miR-210 PC-3 pallo-muodostavien solujen hypoksisissa kunnossa. Tulokset osoittivat, että CDF lisääntynyt suhteellinen miRNA tasoja let-7c, d, ja miR-101 ja laski suhteellinen taso miR-210 PC-3 pallo-muodostavien solujen hypoksisissa ehto (kuvio 6A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CDF voisi vapauttaa ilmentymistä hypoksian liittyvän miRNA CSC kaltaisten solujen Eturauhassyövän soluja.

paneelit A ja B edustavat tiedot miRNA CSC-, kuten alalla muodostavia soluja, jotka ovat peräisin ihmisen PCa solut ja lusiferaasiaktiivisuudet PCA-soluissa, vastaavasti. Transfektio miR-21-välitteisen reportterigeenin sivektorissa ja anti-miR-21 tehtiin PC-3-soluja, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti alla Menetelmät jaksossa. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Promega lusiferaasimäärityssysteamiä kit, valmistajan ohjeiden käsikirja. Palkit luvut osoittavat keskihajonta n = 3.

vaikutus CDF kohtelun tai miR-21 puutos on miR-21 sitoutumisaktiivisuutta 3′-UTR PCA Solut Hypoksisissa kunto arvioimana by lusiferaasimääritys

tutkittiin, mikä vaikutus CDF hoitoa tai miR-21 vajauksen miR-21 sitoutumisaktiivisuutta 3′-UTR PCA soluissa hypoksisissa ehto käyttäen miR-21-välitteisen lusiferaasireportterigeenillä määrityksessä. Kuten kuviossa 6B on esitetty, olemme huomanneet, että hypoksia laski lusiferaasiaktiivisuutta PC-3-solut transfektoitiin miR-21-välitteisen sivektorissa, verrattuna samoihin soluihin, jotka alla normoxic kunnossa, mikä viittaa siihen, että hypoksia lisäsi miR-21 sitoutumisaktiivisuus, mikä lasku lusiferaasiaktiivisuus. Anti-miR-21 lisäsi lusiferaasiaktiivisuuden PC-3-solujen hypoksisissa edellytyksellä, verrattuna samoihin soluihin, ilman hoitoa, viittaa siihen, että anti-miR-21 vähensi miR-21 DNA: ta sitova, mikä johtaa lisääntymiseen lusiferaasiaktiivisuuden PC-3-solut hypoksisissa kunnossa. Vastaavasti, CDF hoito osoittivat lisääntynyttä lusiferaasiaktiivisuuden PC-3-solujen hypoksisissa kunnossa annoksesta riippuvaisella tavalla, mikä viittaa siihen, että CDF voi estää miR-21 DNA: ta sitovan PC-3-soluja.

Keskustelu

Useat epidemiologiset ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että hypoksia ja hypoksian aiheuttamaa signalointireittien liittyy huonoon ennusteeseen potilailla diagnosoitu kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien eturauhassyöpä (PCA). Kehittyvät todisteet viittaavat myös siihen, että hypoksia lisää solun muuttoliike, invaasio, ja angiogeneesin, mikä johtaa kasvaimen aggressiivinen fenotyypit. Täällä vahvistaa, että hypoksia indusoi solujen vaeltamiseen, invaasio ja angiogeneesi, ja lisääntynyt tuotanto VEGF PCA soluissa. Havaitsimme myös, että hypoksia indusoi muodostumista prostaspheres PCA soluissa, sopusoinnussa lisääntyneen ilmentymisen CSC markkereita geenejä, kuten Nanog, Oct4, EZH2, CD44, ja EpCAM PCA soluissa. On osoitettu, että hypoksia avainasemassa säätelyssä CSC ominaisuuksien kautta HIF proteiineja, ja HIF alavirran kohde geenejä, Oct4 ja Notch-1 [6]; [7]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että hypoksia saattaa olla keskeinen rooli sääntelyn CSC ominaisuuksia, mikä johtaa kasvaimen aggressiivinen fenotyyppiin.

Kehittyvät todisteet viittaavat siihen, että miRNA kriittisiä rooleja kehittymistä ja etenemistä kasvaimia säätelemällä mRNA: n hajoamisen tai proteiinin translaation välittyvät niiden sitoutuminen 3′-transloimaton alue (3′-UTR), kohdegeenien. On todistettu, että miR-21 pidetään pro-kasvaimia synnyttävän molekyyliä, jotka edistävät kasvaimen kehittymisen. [24]. [31]. [19]; [21].