Krooninen sairaus

tiivistelmä

Apoptoosi voidaan laukaista kahdella eri tavalla, läpi luontaisia ​​tai ulkoinen tie. Luontainen reitin välittyy mitokondriot vapautumisen kautta sytokromi C, kun taas ulkoinen tie on taustalla kuoleman reseptori signaaleja ja ohittaa mitokondrioita. Nämä kaksi reitit liittyvät läheisesti solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen signa-, jotka siten muodostavat mahdollisia kohteita syövän hoidossa. Aiemmissa tutkimuksissa olemme esitteli kaksi kasviperäisten isomeeristä flavonoidit, flavone A ja flavone B, joka indusoi apoptoosin erittäin tuumorigeenisen syöpäsoluissa rinta-, paksusuoli-, haima-, ja eturauhasen. Flavonin Näkyvillä voimakas sytotoksinen aktiivisuus enemmän eriytetty karsinoomat paksu (CaCo-2) ja haimassa (Panc28), kun taas flavone B sytotoksinen toiminta on havaittu huonosti eriytetty karsinoomat paksu (HCT 116) ja haima (MIA PaCa). Apoptoosi indusoitiin flavone A eriytetään paksusuolensyöpä CaCo-2 ja haimasyövän Panc 28 solujen sisäistä tietä, estämällä aktivoitujen muotojen ekstrasellulaarisen signaalin säädellään kinaasin (ERK) ja PS6, ja sen jälkeen menetys Bcl -2 liittyvä kuolema promoottori (BAD) proteiini, kun apoptoosin laukaisee flavone B huonosti eriytetty paksusuolisyövän HCT 116 ja MIA PaCa haimasyöpäsoluissa kautta ulkoinen tie samanaikaisen säätelyä fosforyloidun muotojen ERK ja c-Jun seriinin 73. Nämä muutokset proteiinin tasot lopulta johtaa aktivoitumiseen apoptoosin, ilman osallistumista AKT.

Citation: LeJeune TM, Tsui HY, Parsons LB, Miller GE, Whitted C, Lynch KE, et al. (2015) Vaikutusmekanismi of Two flavoni- isomeerien kohdistaminen Syöpäsolut vaihtelevalla Cell Differentiation tila. PLoS ONE 10 (11): e0142928. doi: 10,1371 /journal.pone.0142928

Editor: Yu-Jia Chang, Taipei Medicine University, Taiwan

vastaanotettu: 29 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 28 lokakuu 2015; Julkaistu 25 marraskuuta 2015

Copyright: © 2015 LeJeune et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Department of Pharmaceutical Sciences East Tennessee State University Gatton College of Pharmacy (https://www.etsu.edu/pharmacy/), avustus 82171 päässä East Tennessee State University Research Development komitea Major apurahaohjelmat (https://www.etsu.edu/research/rdc/) ja kemian laitoksen Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales (http: //www. udca.edu.co/).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

esiintyvyys syöpä on kasvanut tasaisesti koko viime vuosikymmeniä [1]. Vaikka nykyiset hoidot ovat tehokkaita eri tasoilla, monet näistä hoidoista ovat myös epäspesifinen suhteessa niiden toimintamekanismin. Tämä puolestaan ​​lisää toivottuja tuloksia kokemat saaneilla potilailla; ankara sivuvaikutuksia ja alhaisen tehokkuuden ovat joitakin niistä monista syistä, miksi tarkempia hoitoja onkologian on etsitty. Näistä ponnisteluista, luonnontuotteet [2] on tutkittu paljon toiveita tunnistamaan uusia molekyyli yhteisöihin antineoplastisten ominaisuuksia. Näistä luonnollisista tuotteista, flavonoideja, yksi luokka polyfenoliyhdisteiden löytyy kasveja, on osoitettu saavan aikaan antineoplastisen [3-9] ominaisuudet, sekä antioksidanttia [10, 11], anti-inflammatoriset [12], antimikrobinen [13] ja viruslääkkeiden [14, 15] toimintaa.

viimeisten viiden vuoden aikana meidän tutkimus on keskittynyt kasveja Andien vuoristossa pitkälti tunnetaan

vira Viras

. Nämä kasvit ovat käyttäneet natiivi tämän alueen ihmisille lääkkeenä kuten syövän hoidossa, kuten on raportoitu eri ethnobotanical tutkimuksissa [16, 17]. Ne kuuluvat perheeseen

Asteraceae

, suvut

Gnaphalium

,

Achyrocline

, ja

Gamochaeta

. Tavoitteenamme nähden vira vira kasveille on saatettu

Gnaphalium elegans

ja

Achyrocline bogotensis

joista kaksi aktiivisia yhdisteitä eristettiin, 5,7-dihydroksi 3,6,8-trimetoksi 2-fenyyli-4H-kromen-4-oni (5,7-dihydroksi-3,6,8-trimethoxyflavone tai flavone A) [18], ja 3,5-dihydroksi-6,7,8-trimetoksi-2- fenyyli-4H-kromen-4-oni (3,5-dihydroksi-6,7,8-trimethoxyflavone tai flavone B), vastaavasti [19]. On ehdotettu edellisessä työssä että nämä kaksi flavone isomeerit voivat olla merkitystä antineoplastisen toimintaa näiden kasvien [20]. Todellakin, flavonit A ja B osoitti sytotoksinen vaikutus johdetut solulinjat paksusuoli-, haima-, rinta-, ja eturauhasen syövät, jotka on luokiteltu olevan erittäin tuumorigeeninen, jossa lupaavimpia tuloksia paksusuoli- ja haima. Korkeita ilmentymisen aldehydidehydrogenaasin (ALDH) pidetään erittäin spesifinen merkki käyttää havaittaessa syöpää aloittamista solujen alapopulaatioiden kasvaimia, ja on osoitettu, erityisesti solulinjoissa tutkittu [21-23]. Näistä erittäin tuumorigeenisia solulinjoista, kaksi flavone isomeerin osoittavat etuoikeutettu antineoplastinen aktiivisuus solujen erilaisten erilaistumista tila. Flavonin aiheuttama apoptoosin eriytetään solulinjoissa, mutta ei huonosti eriytetty solulinjoissa, kun taas flavone B osoitettiin olevan aktiivisia huonosti eriytetty, mutta ei vastaan ​​paremmin erilaisia ​​soluja. Lisäksi nämä kaksi flavone isomeerit eivät indusoi apoptoosia normaaleissa soluissa ja näyttää huomattavasti vähemmän apoptoottista aktiivisuutta vähemmän tuumorigeenisia solulinjoissa [20].

Tiedetään, että mitokondrioiden hallinta apoptoosin voidaan ohjata toimintaa selviytymisen tekijät, kuten kasvutekijöitä tai sytokiinejä, kautta solunulkoiset reseptorit aktivoivat kaskadeja proteiinia tapahtumia, jotka lopulta johtavat kaspaasi-3 pilkkominen. Nämä toteutustavat koetettiin tutkimalla vaikutukset kahden flavoni- isomeerien ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasien (ERK), proteiinikinaasi B (AKT), S6 ribosomaalinen proteiini (S6), ja Bcl-2 liittyvä kuolema promoottori (BAD). Ensisijaisen induktion apoptoosin korkeasti tuumorigeenisia solujen erilaisten erilaistumista tilan flavone A ja flavone B, kaksi rakenteellisesti samankaltaisia ​​yhdisteitä, ehdottavat aktivoinnin eri solureiteillä kukin yhdiste. Tämä tutkimus osoittaa, että flavone kykenee sen sytotoksinen vaikutus eriytetään syöpäsolujen kautta luontainen apoptoottista polku taas flavone B ohittaa mitokondrioiden polku apoptoosin kautta ulkoinen tie huonosti eriytetty syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Extraction, puhdistus ja tunnistaminen flavonoideista

flavoneista saatiin edellä kuvatulla tavalla [20]. Lyhyesti, flavonin A puhdistettiin 1,5 kg

G

.

elegans

kuivatuista kukista uutetaan CHCl

3. Uute konsentroidaan kuiva tyhjiössä, liuotettiin metanoliin ja suodatettiin poistamaan rasva ja hiilivetyjä. Sitten se väkevöitiin ja liuotettiin C

6 H

6 seurasi silikageelikromatografialla käyttäen C

6 H

6: Me

2CO (19: 1) eluenttina. Tästä 50 mg flavonoidi puhdistettiin fraktioista 12 kautta 18 kiteytyksen heksaanissa. Yhdiste tunnistettiin sen fysikaaliset ja spektroskooppiset ominaisuudet kuin 5,7 dihydroksi-3,6,8 trimethoxyflavone, sp 170 171 c, 1H-NMR (300 MHz) 3,86 (3H, s), 3,97 (3H, s), 4,20 (3H, s), 7,50 7,6 (3H, m), 8,08 8,16 (2H, m). Flavonin B puhdistettiin 200 g tuoreita lehtiä on

.

bogotensis

. Lehdet upotettiin CHCl

3: ssa 20 minuuttia ja sitten se suodatettiin, konsentroitiin, ja liuotetaan kuumaan metanoliin. Jotta voidaan poistaa rasvat ja hiilivetyjä, kylmä uute suodatettiin ja konsentroitiin uudelleen. Saatu kiinteä aine liuotettiin sitten kuumaan heksaaniin ja peräkkäisiä uudelleenkiteytyksiä heksaanissa tuotetaan 100 mg puhdistettua flavonoidi. Yhdiste tunnistettiin sen fysikaaliset ja spektroskooppiset ominaisuudet kuin 3,5-dihydroksi-6,7,8-trimethoxyflavone, sp 149 150 ° C, 1H-NMR (300 MHz) 3,86 (3H, s), 3,97 (3H, s), 3,99 ( 3H, s), 4,12 (3H, s), 7,30 7,45 (3H, m), 8,70 8,82 (3H, m), 11,46 (1 H, s).

Solulinjat ja viljelyolosuhteet.

Colon (CaCo-2, HCT116) ja haiman (MIA PaCa-2) solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ja niitä kasvatettiin mukaisesti ATCC ohjeita. Panc28 solulinja oli lahja Dr. Paul Chiao (University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX), ja kasvatettiin samalla tavalla kuin haiman solulinja MIA Paca-2. Soluja kasvatettiin väliaineessa, johon oli lisätty 10% seerumia (Gibco, Grand Island, NY) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (Hyclone, Logan, UT). Kaikki solut ympättiin ja annettiin saavuttaa 75% konfluenssiin ennen käsittelyä flavone A, B, tai vehikkeliä (dimetyylisulfoksidi) lopulliseen enimmäispitoisuus 0,27% käsitellyissä kuopissa (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

Apoptosis Detection fluoresenssimikroskopialla

Apoptoosi havaittiin käyttämällä anneksiini V-FITC kit Abcam (Cambridge, MA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut siirrostettiin tiheydessä 4-5×10

4 /kaivo 12 mm: n pyöreä peitelaseille (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), annettiin saavuttaa 75% konfluenssiin, ja käsiteltiin joko vehikkelillä, flavone A, tai flavoni-B, jonka konsentraatio on 40 uM. Kuusi tuntia annostelun jälkeen, soluja inkuboitiin sitoutumispuskurissa ja FITC-konjugoidulla anneksiini V: viisi minuuttia pimeässä. Sitten solut kiinnitettiin 2% p-formaldehydiä ja kuvat saatiin käyttämällä Evos fluoresenssimikroskooppia (AMG, Bothell, WA).

Cell Cycle ja apoptoosi-analyysi virtaussytometrialla

Soluja kasvatettiin kuusi kuoppalevyille, käsiteltiin joko liuottamalla ajoneuvon, flavone A, tai flavone B. yhdeksän tunnin inkubaation jälkeen solut poistetaan levyltä trypsiinillä, ja niistä määritettiin kvanti- apoptoosin ja solusyklin jakaumat käyttämällä anneksiini V- FITC pakki Abcam (Cambridge, MA) valmistajan mukaan ohjeita. Lyhyesti, solut suspendoitiin sitoutumispuskuriin ja anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidia lisättiin, mitä seurasi 5 minuutin inkubointi pimeässä. Solumäärä saatiin käyttäen BD Accuri C6 virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA) ja analysoitiin CFLOW Plus (BD Biosciences).

Vasta-aineet ja reagenssit

vaikutusmekanismi arvioitiin käyttämällä vasta-aineita ERK2 Santa Cruz (Dallas TX), AKT Milliporesta (Billerica, MA), c-Jun ja BAD Cell Signaling (Beverly, MA), fosforyloitu c-kesäkuu (T91 /93) alkaen Abcam (Cambridge, MA ), fosforyloitu c-kesäkuu (S63 /73), fosforyloidun muodot ERK, S6 ribosomaalinen proteiini (91B2), ja BAD, Cell Signaling, fosforyloitu AKT S473 Milliporesta, BH3-vuorovaikutuksessa domain kuolema agonisti (Bid) R D Systems (Minneapolis, MN), aktiivinen ja aktiivisia muotoja kaspaasi 3 Santa Cruz ja R Rochester, NY). Intensiteetti nauhojen arvioitiin digitoimalla kuva (J Kuva) X-ray elokuva. Jälkeen vähentämällä tausta, kaikki juovien voimakkuudet verrattiin kontrolli.

Immunofluoresenssi

Immunofluoresenssi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, solut kiinnitettiin 3% p-formaldehydiä 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Huuhtelun jälkeen, solut tehtiin läpäiseviksi 0,2% Triton X-100: ssa 5 min ja 0,1% saponiinia koko menettelyn ajan. Läpäiseväksi seurasi sammutusta aldehydiryhmistä 50 mM NH

4cl. Sitten soluja inkuboitiin ensisijaisen vasta-ainetta laimennettuna 1% BSA: ta, 1 tunti huoneen lämpötilassa. Pesujen jälkeen ja inkuboinnin sekundäärisen vasta-aineen, solut kiinnitettiin 10% polyvinyylialkoholia, 30% glyserolia, 1% n-propyyligallaatti ja hidas fade (Molecular Probes, Invitrogen) laimennoksena 5: 1. Fluoresenssi kuvat saatiin käyttämällä Evos fluoresenssimikroskooppia (AMG, Bothell, WA).

Tulokset

flavone A ja flavone B apoptoosin ja solusyklin siirtyminen

Aikaisemmat tiedot viittaavat siihen, että flavoneista A ja B aiheuttavat DNA: n fragmentoituminen paremmasta ja huonosti erilaistuneet solut vastaavasti [20]. Anneksiini V: testit suoritettiin vahvistamaan induktion apoptoosin kasvaimia aiheuttavasta solujen asemasta annostelun jälkeen kanssa flavoneista. Apoptoosi todettiin 6 tunnin kuluttua haimasyöpä Panc-28 (kuvio 1A) ja paksusuolen syövän Caco-2 (kuvio 1 B) solut annosteltiin 40 uM flavoni- A. Samalla tavalla, apoptoosi havaittiin 6 tuntia sen jälkeen, haimasyöpä MIA Paca -2 (kuvio 1C) ja paksusuolen syövän HCT116-soluissa (kuvio 1 D), saivat 40 uM flavoni- B. määrällisesti apoptoottisten muutosten aiheuttama flavoneista, solut annosteltiin ajoneuvon tai flavone, analysoitiin 6, 9 ja 12 tuntia käsittelyn jälkeen kautta virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V /propidiumjodidi. 9 tuntia, Panc 28 solut käsiteltiin flavone A: n täytyi 2,9 kertainen nousu apoptoosin (kuvio 2A ja 2C). Vastaavasti, 9 tuntia, HCT 116-soluja käsiteltiin flavone B oli 2,3-kertainen apoptoosin lisääntyminen (kuvio 2B ja 2C).

apoptoottinen vaikutus flavoni- A: n pitoisuus oli 40 uM, sen eriytetympää haiman Panc28 ja paksusuolen CaCo 2 syöpäsoluja (kuvio 1A ja 1B), määritettynä anneksiini V määrityksellä (vihreä kanava) kuusi tuntia käsittelyn jälkeen. DAPI (sininen kanava) käytetään paikantaa ytimet soluja. Solut, jotka käsitelty vain vehikkelillä (DMSO: n lopullinen pitoisuus on 0,27%), toimi kontrollina. Aktivointi apoptoosin huonosti eriytetty haiman MIA PaCa ja paksusuolen HCT116 syöpäsolujen (kuviot 1C ja 1 D) mukaan flavone B pitoisuutena 40 uM määritettynä anneksiini V määrityksellä (vihreä kanava) kuusi tuntia käsittelyn jälkeen. Ohjaus olosuhteet ovat samat kuin edellä on kuvattu, ja Dapi käytettiin paikantamaan ytimiä.

. Apoptoosi havaittiin käyttäen anneksiini V-FITC ja propidiumjodidilla in Pancin 28 soluissa käsiteltiin 40 uM flavone A, 9 tuntia käsittelyn jälkeen. B. havaitseminen apoptoosin HCT 116 soluissa käsiteltiin 40 uM flavone B, 9 tuntia käsittelyn jälkeen. C. Pylväsdiagrammi edustus apoptoosin Pancin 28 ja HCT 116 solua käsiteltiin flavone A ja B.. D-E. Solusyklin määritys käyttäen propidiumjodidista in Pancin 28 soluissa käsitelty 40 uM flavone A. F-G. Solusyklin määrätietoisesti HCT 116 soluissa käsiteltiin 40 uM flavone B.

Voit testata, onko hoito flavone A tai flavone B vaikuttanut solusyklin jakaumia, virtaussytometria, joissa käytetään propidiumjodidia tehtiin. Eriytetään haiman soluja Pancin 28-soluja käsiteltiin flavone A (kuvio 2D ja 2E). 9 tunnin kuluttua, siirtymistä G0 /G1 S ja G2 vaiheisiin on selvästi nähtävissä. Huonosti eriytetty koolonkarsinoomasoluissa HCT 116 käsiteltiin flavone B. Vastaava siirtyminen G0 /G1 vaiheeseen S ja G2 vaiheisiin ilmenee 9 tuntia käsittelyn jälkeen (kuvio 2F ja 2G).

flavone A: lla estävä vaikutus fosforyloitu ERK ja S6, mutta sillä ei ole vaikutusta AKT tai c-JUN paremmin eriytetty Panc28 ja Caco-2-syöpäsolujen

jotta voidaan määrittää mekanismin vastuussa sytotoksinen vaikutus eriytetään syöpäsolujen havaittiin hoidon jälkeen flavone A, proliferatiivinen, selviytyminen, ja apoptoottisten signalointireitteihin tutkittiin. Paksusuolensyöpä CaCo-2 ja haimasyövän Panc28 solut annosteltiin 40 uM flavone A ja tasoja aktivoitua AKT, ERK, S6, ja c-Jun analysoitiin. Kuten kuviossa 3A ja 3C, annostelu Panc 28-solujen kanssa flavoni indusoi keskimääräinen väheneminen fosforyloidun muodon ERK on 64,27% (51,84% -74,83%; p = 0,0029) ja PS6 on 52,58% (37,90% -62,50 %; p = 0,012) verrattuna kontrolliin. Caco-2-solut, keskimääräinen vähennys fosforyloidun ERK mukaan flavone A oli sen 42.58% (25,38% -55,64%; p = 0,0031), ja 57,99% (43,84% -77,36%; p = 0,0138) ja PS6 verrattuna kontrolliin. Mitään muutosta ei havaittu ilmentymistä tasoilla unphosphosphorylated proteiineja analysoitiin (kuvio 3A). Nämä immunoblottaus tulokset vahvistettiin immunofluoresenssilla. Fosforyloitu ERK tulokset CaCo-2-soluissa on esitetty kuviossa 3E. Lisäksi aktivoituja muotoja AKT seriinin 473 ja c-Jun seriinin 73, tutkittiin myös näiden proteiinien säätelevät sekä solujen eloonjäämistä ja stressin aiheuttama apoptoosin vastaavasti. Kumpikaan näistä osoitti merkittäviä muutoksia Pancin-28 ja Caco-2-solulinjoista (kuvio 3A ja 3C).

A ja B: Detection aktivoitua ja fosforyloitumaton muodot ERK, c-Jun, S6, AKT immunoblottauksella koko SDS otteita. Eriytetään Panc28 ja CaCo 2 soluja käsiteltiin 40 uM of flavoni- A (+ A), ja huonosti eriytetty MIA PaCa ja HCT116-solujen flavone B (+ B) tai DMSO (-) puretuksi ajoneuvo. Hajoamisen jälkeen ja SDS-PAGE, kalvot koetettiin ilmoitetun vasta-aineen. Membraanit uudelleenseulottiin ja aktiini latauskontrollina, ja edustavan kuvan on säädetty. Esitetyt tulokset edustavat kolmea riippumatonta koetta. C ja D: kvantifiointiin (kuvaajat) bändi tiheydet käsitellystä /käsittelemättömiä olosuhteet tunnistetaan (+) tai (-), normalisoituivat ja lasketaan prosentteina arvon käsittelemättömien solujen (100%), ja esitetään keskiarvot ± keskihajonnat kolmen erillisen kokeen (* p 0,05). E ja F: Detection fosforyloidun ERK käsittelyn jälkeen CaCo 2 solujen flavone A ja HCT116-solujen kanssa flavoni-B immunofluoresenssilla.

lisääntynyt ilmentyminen fosfori-c-Jun (S73) ja ERK oli havaittu käsittelyn jälkeen huonosti eriytetty MIA PaCa ja HCT116 syöpäsolujen kanssa flavone B

kasvoi keskimäärin on 190,19% aktivoitujen ERK haimasyövän MIA PaCa soluja (175,32% -204,08%; p = 0,0036, n = 3 ), ja 160,23% paksusuolen syövän HCT116-soluja (144,99% -174,22%; p = 0,012; n = 3) havaittiin käsittelyn jälkeen flavone B (kuvio 3B ja 3D) verrattuna kontrolleihin. Mitään muutosta ei havaittu ilmentymistä tasoilla unphosphosphorylated proteiineja analysoitiin (kuvio 3B). Nämä immunoblot tulokset vahvistettiin fluoresenssimikroskopialla ja fosforyloitu ERK tulokset on esitetty HCT-116-solut (kuvio 3F). Myös havaittu olivat kohonneet fosforyloidun muodon c-Jun (S73) in MIA PaCa on 170,83% ohjauspaneelista tasot (162,27% -181,90%; p = 0,0008, n = 3), ja HCT116 klo 271,34% (222,95 % -312,93%; p = 0,0028, n = 3), kuten kuviossa 3B ja 3D.

flavone B on erilaisia ​​vaikutuksia PS6 vuonna MIA PaCa ja HCT116-soluissa, mutta sillä ei ole vaikutusta fosforyloidun AKT

hoidon jälkeen MIA PaCa solujen flavone B, keskimääräinen taso PS6 pienenevät 51,68% (19,95% -77,77%; p = 0,0237, n = 3) verrattuna kontrolli kuten kuviossa 3D. Kääntäen, kun hoito HCT116-solujen, kasvua 149,88% (136,54-170,22; p = 0,0116, n = 3) havaitaan, verrattuna kontrolleihin. Ilmaisu tasot fosfoseriiniä 473 AKT, pysyivät muuttumattomina käsittelyn jälkeen MIA PaCa ja HCT116-solujen flavone B kuvion 3B ja 3D.

flavone moduloi HUONO fosforylaatio seriinillä 112, mutta ei flavone B

tutkimiseksi edelleen eroja solujen vaikutuksesta flavone A ja flavone B, fosforylaatiota asema BAD seriinin 112 tutkittiin. Solulinjat Pancin-28 ja Caco-2-annosteltiin flavone osoittavat laskua fosforyloidun BAD seriinin 112 (kuvio 4A). Tämä vähennys oli keskimäärin 35,91% (34,21% -37,61%; p = 0,006; n = 3) in Panc-28, ja 57.03% (42.12% -71,62%; p = 0,0068, n = 3) in Caco-2- soluissa (kuvio 4C). Nämä havainnot vahvistettiin kautta immunofluoresenssimenetelmällä varten Pancin-28, kuten kuviossa 4E. Toisaalta annostelu MIA PaCa-2 ja HCT116 tuumorigeenisia solujen 40 uM flavoni- B ei tuottanut merkittävää muutosta kokonaismäärä fosforyloidun BAD seriinin 112, kuten on esitetty western blot (kuvio 4B ja 4D) sekä immunofluoresenssimenetelmällä varten MIA Paca-2 ( Kuva 4F). Vaikka ei ole mitään merkittävää muutosta havaittu ekspressiotasot fosforyloitumaton BAD paremmin erilaistuneita soluja (kuvio 4A), hieman lisääntynyt havaitaan huonosti erilaistuneet solut (kuvio 4B).

A ja B: Detection of menetys fosforylaation BAD immunoblottauksella koko SDS otteita. Parempi eriytetty Pancin 28 ja CaCo 2 soluja käsiteltiin 40 uM of flavoni- A (+ A), ja huonosti eriytetty MIA PaCa ja HCT116-solujen flavone B (+ B) tai DMSO (-) puretuksi ajoneuvo. Hajoamisen jälkeen ja SDS-PAGE, kalvot tutkittiin spesifisen vasta-aineen BAD fosforyloidun seriinin 112 tai fosforyloimattoman proteiinin. Membraanit uudelleenseulottiin ja aktiini latauskontrollina. Esitetyt tulokset edustavat kolmea riippumatonta koetta. C ja D: kvantifiointiin (kuvaajat) bändi tiheydet käsitellystä /käsittelemättömiä olosuhteet tunnistetaan (+) tai (-), normalisoituivat ja lasketaan prosentteina arvon käsittelemättömien solujen (100%), ja esitetään keskiarvot ± keskihajonnat kolmen erillisen kokeen (* p 0,05). E ja F: Detection of fosforyloidun BAD seriinin 112 (punainen kanava) käsittelyn jälkeen Pancin 28 solujen flavone A ja MIA PaCa solujen flavone B immunofluoresenssilla. DAPI (sininen kanava) käytettiin paikantamaan ytimeksi.

flavone A voi apoptoosin kautta kaspaasi 9

Voit selvittää kaspaasi 9 osallistuu apoptoottisessa Cascade aloittaman flavone A, CaCo-2 ja Panc28 solut annostellaan ja analysoitiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblot läsnäolon katkaistun fragmenttien 37 ja 17 kDa: n vasta-aineen kanssa, joka kykenee havaitsemaan aktivoidun kaspaasin. Kuvio 5A esittää edustavan immunoblottaus CaCo-2, ja kuvio 5B Panc28 solujen lysaatit otettu eri ajankohtina annostelun jälkeen flavone A. Molemmat solulinjat näyttää suuri fragmentit, 37 ja 35 kDa, havaittiin että vasta-aineella (kuvio 5A ja 5B). 37 kDa fragmentti on ilmeinen kontrolliryhmässä (solut vehikkeliä) viittaa vapauttaminen proteiinin näissä solulinjoissa. Kuitenkin asteittainen vähentäminen tason ilmentymisen prokaspaasi 9 (47kDa) on ilmeinen alkaa 3 tunnin kuluttua.

Detection aktivoitujen kaspaasi 9 immunoblottauksella SDS uutteiden A. CaCo 2 ja B. Pancin 28 solut 1,5, 3, 6, 9 ja 12 tuntia (kaistat 2-6), hoidon jälkeen flavone A tai vehikkeliä (DMSO) ohjausta varten (C, kaista 1) ja SDS-PAGE. Kalvot tutkittiin vasta-aineen, joka pystyy havaitsemaan sekä prokaspaasi (47 kDa) ja suuret fragmentit tuloksena aktivoinnin jälkeen (37 ja 35 kDa). Membraanit uudelleenseulottiin aktiinin tai tubuliinin latauskontrollina. Esitetyt tulokset edustavat kolmea riippumatonta koetta. Membraanit uudelleenseulottiin aktiinin tai tubuliinin latauskontrollina. Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

flavone B ei fosfory- c-kesäkuu at treoniinien 91 ja 93 eikä aktivoi caspases 8 ja 10 HCT 116 tai MIA PaCa solujen

vahvista flavonin B aktivointi apoptoottisen ohjelman kautta ulkoinen tie ilman osallistumista sisäisen reaktiotien, olemme tutkineet fosforylaatiota muotoja c-Jun merkitystä kytkennän mitokondrioiden kautta lohkaisu kaspaasin 8 [25, 26]. HCT 116 ja MIA PaCa soluja annosteltiin flavone B eivät näytä aktivoitumista c-Jun on treoniinien 91 ja 93, kuten kuviossa 6A kautta immunofluoresenssilla HCT 116-soluissa. Rintasyöpä SKBR3-soluja annosteltiin tamoksifeenin, positiivisena kontrollina tämän aktivoinnin [27], käsiteltiin samalla tavalla kuin on kuvattu edellä (kuvio 6B). Tämä tulos vahvistettiin immunoblottauksella, kuten on esitetty kuviossa 6C. Tutkiminen aktivoinnin tilan kaspaasien 8 ja 10 näissä soluissa hoidon jälkeen flavone B ei osoittanut pilkkominen tämän proteiinin joko HCT 116 tai MIA PaCa soluja. Tämä on ilmeistä, läsnäolo katkaisemattomasta kaspaasien eri ajankohtina ulottuen 1,5-12 tuntia. Edustavia immunobloteista ajankulku kokeita caspases 8 ja 10 HCT 116-soluissa on esitetty kuviossa 6D ja 6E vastaavasti.

A ja B. Immunofluoresenssikoe käsiteltyjen solujen osoittavat ilmentymistä fosfo-c-Jun (T91 /T93 ) SKBR3 soluissa (vihreä kanava) mutta ei HCT116-soluissa. DAPI (sininen kanava) käytettiin paikantamaan ytimet. C. Immunoblotti fosfo-c-Jun (T91 /T93) käyttäen SDS otteet huonosti eriytetty HCT116-solut käsiteltiin 40 uM of flavoni- B (+ B), tai purkamista ajoneuvon DMSO (-). SDS lysaatit SKBR3-soluja käsiteltiin 10 uM tamoksifeenia (+) käytettiin positiivisena kontrollina. SDS-PAGE, nitroselluloosakalvot koetettiin spesifisen vasta-aineen tämän fosforyloitua muotoa. D. Detection kaspaasin 8 immunoblot SDS lysaattien HCT116-soluja 1,5, 3, 6, 9 ja 12 tuntia (kaistat 2-6), hoidon jälkeen flavone B tai vehikkeliä (DMSO) ohjausta varten (C, kaista 1) ja SDS-PAGE. Kalvot tutkittiin vasta-aineen, joka pystyy havaitsemaan sekä prokaspaasi (54/55 kDa) ja fragmentit tuloksena aktivoinnin jälkeen (43 ja 18 kDa). Membraanit uudelleenseulottiin aktiinin tai tubuliinin latauskontrollina. Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

Keskustelu

aiemmin osoittanut ero antineoplastisia vaikutuksia flavonoideista A ja B syövät solujen rinnasta (MCF7, SKBR3-) , paksusuoli (Caco-2-, HCT116), haima (Panc 28, MIA PaCa), ja eturauhasen (LNCaP, PC3) ja erilaisia ​​erilaistumista tila. Flavoneista poimittiin

G

.

elegans

ja

.

bogotensis

, kasveja kuten lääkinnällisiä ominaisuuksia, joita käytetään siis indistinctively mukaan ethnobotanical tutkimuksiin. Kuitenkin flavonit eivät ole yksinomaan näiden lajien. Flavonin A on ollut löydetty

Ainsliaea henryi

[28] ja

Helichrysum decumbens [29]

taas flavone B on eristetty

Helichrysum graveolens

[30], kuten sekä

Helichrysum odoratissimum

[31], ja

Helichrysum compactum

[32]. Flavoneista A ja B osoittivat merkittävää sytotoksista vaikutusta erittäin tuumorigeenisia solulinjoja, säästäen normaalin epiteelisolujen. Erityisesti flavonin osoitettuja korkea sytotoksisuus vastaan ​​eriytetymmällä Panc28 ja Caco-2-soluihin, kun taas flavone B osoitti mieluummin huonosti eriytetty MIA PaCa, HCT 116, ja SKBR3 solujen [20]. Cell kaksinkertaistaa ajan, ja läsnäolo eriytyvät ja polaarisuus markkereita käytetään määrittämään solujen erilaistumista tila. Solujen joukossa testasimme, Panc28 on kuvattu aikaisemmin huonosti eriytetty lähinnä ilman polariteetin merkkiaineiden läsnä muissa haiman solulinjoissa, kuten Capan-1, huolimatta siitä, että se on melko pitkä solun kahdentumisajan. On kuitenkin yleinen yksimielisyys siitä, että Pancin 28 solut on suurempi eriyttäminen asema kuin MIA PACA soluihin [33], ja tulokset viittaavat siihen, että flavoneista voivat olla herkkiä tämän eron. Ymmärtää paremmin mekanismia, jolla apoptoottinen ohjelma aloitetaan flavoneista A ja B niiden kohdesoluissa, arvioimme vaikutus kullakin flavoni- keskeisten ulkoisten ja sisäisten apoptoottisten reitin proteiinit, kuten ERK, PS6, AKT, BAD, ja c -Jun niiden aktivoidut muodot.

Tuloksemme viittaavat siihen, että flavone A voi aiheuttaa apoptoosia eriytetään haiman ja paksusuolen syöpäsoluja kautta mitokondrioiden sisäisen reaktiotien. Tämä on ilmeistä, että lasku fosforyloidun ERK ja S6 ja sen jälkeen menetys aktivoitu BAD. Fosforylaatio pitää BAD sytoplasmassa, ja sen tappio tulokset sitoutumisessa ja inaktivoituminen selviytymisen proteiinien Bcl-x L- ja Bcl-2 ylityksen jälkeen mitokondrion kalvon [34] siten aktivoimaan apoptoosin. Merkittävä väheneminen fosforyloidun BAD seriinin 112 havaitaan haimasyövän Pancin 28 ja paksusuolensyöpä Caco-2-solujen hoidon jälkeen flavone A. aktivointi BAD seriinin 112 välittyy MAPK-reitin, erityisesti aktivaation kautta Ras- Raf-ERK [35]. Siten estyminen fosforyloidun ERK ja S6 hoidon jälkeen flavone A, voisi olla ylävirtaan menetys aktivoitua BAD seriinin 112 ja myöhemmin aloittamista apoptoosin kautta Mitokondrioiden kalvon eheyden ja vapautumista sytokromi c ja muiden apoptoottisten tekijät. Nämä tapahtumat voivat johtaa kaspaasi 9 ja efektori kaspaaseiksi. Kuitenkin kaspaaseiksi ovat erittäin vapautettiin syövän erilaisten mutaatioiden tai menetyksen ilmaisun [36]. Kun kyseessä on kaspaasi 9, nämä ovat harvinaisia, ja se on kumoamisen jälkeistä mitokondriaalisen funktionaalisia toimintoja, jotka suosivat kasvaimen etenemistä [37]. Tämä voi olla kyse meidän kaspaasi 9 tuloksia, jos aktivoitu kaspaasi on läsnä ohjaus ja käsitellyissä soluissa, mikä saattaa viitata siihen menetys apoptoottisen funktion. On tärkeää huomata, että heikentynyt mitokondrioiden eheys voi laukaista oletuksena kaspaasi 9-riippumaton solukuoleman ohjelman [38]. Olipa apoptoosin tapahtuu riippumatta kaspaasi 9 toimintaa tai luomalla suotuisan suhteen aktiivisen vs aktiivinen kaspaasi katsottuna tuloksemme, esitämme todisteita, jotka tukevat aktivaatio luontainen kautta. Lisäksi meidän tulokset osoittavat myös, ettei AKT eikä c-kesäkuu ovat mukana ehdotettu toimintamekanismi flavoni- A.

Käänteisesti flavone B indusoi apoptoosia huonosti eriytetty syöpäsoluissa haiman ja paksusuolen kautta ulkoinen tie.