Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Hoito peräsuolen syöpä (CRC) on edelleen kliininen haaste, sillä yli 15% potilaista ovat resistenttejä 5-fluorourasiili (5-FU) -pohjaisen kemoterapeuttiset hoito, ja kasvaimen uusiutumisen kasvu voi olla niinkin korkea kuin 50-60%. Syöpä kantasolut (CSC) kykenevät elossa tavanomaisen kemoterapian joka sallii regenerointi alkuperäisen kasvaimia. Siksi tutkimme tehokkuutta 5-FU ja kasvien polyfenolien (curcumin) in yhteydessä DNA mismatch korjaus (MMR) asema ja CSC aktiivisuus 3D viljelmiä CRC soluja.

Methods

Korkea tiheys 3D viljelmiä CRC solulinjojen HCT116, HCT116 + CH3 (täydennetty kromosomi 3) ja niiden vastaavat isogeenisistä 5-FU-kemiallis-fenikoliresistenttiin klooneja (HCT116R, HCT116 + ch3R) käsiteltiin 5-FU joko ilman tai curcumin vuonna ajasta ja annoksesta riippuvaa määrityksissä.

tulokset

Pre-hoito curcumin merkittävästi parannettu vaikutus 5-FU HCT116R ja HCR116 + ch3R solut, toisin kuin 5-FU yksin osoituksena lisääntynyt hajoaminen colonospheres, parannettu apoptoosin ja estämällä niiden kasvua. Curcumin ja /tai 5-FU vaikuttaa voimakkaasti MMR-puutosta CRC solujen tiheän kulttuureissa, mutta MMR-taitavia CRC solut olivat herkempiä. Nämä vaikutukset curcumin parantamisessa kemosensitiivisyys 5-FU oli edelleen tukea sen kyky tehokkaasti estää CSC altaat ovat osoituksena väheneminen CSC merkki positiivisten solujen, korostaen sopivuus tämän 3D-kulttuurin malli arvioimiseksi CSC merkki ilmentymistä lähellä

vivo

ympäristössä.

Johtopäätös

tulokset kuvaavat uusia ja aikaisemmin tuntemattomia vaikutuksia curcumin parantamisessa Chemosensiti- 5-FU-kemoterapian DNA MMR-puutteellinen ja niiden chemo kestävä kollegansa kohdistamalla CSC osapopulaatiosta. (246 sanaa abstrakti).

Citation: Shakibaei M, Buhrmann C, Kraehe P, Shayan P, Lueders C, Goel A (2014) Curcumin Chemosensitizes 5-fluorourasiili Kestää MMR-puutteellinen ihmisen koolonkarsinoomasoluissa High Density Cultures. PLoS ONE 9 (1): e85397. doi: 10,1371 /journal.pone.0085397

Editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

vastaanotettu: 25 lokakuu 2013; Hyväksytty: 27 marraskuu 2013; Julkaistu: 03 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Shakibaei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä vaikuttaa miehiin ja naisiin yhtä maailmanlaajuisesti [1]. Nykyiset terapiat paksusuolen ja peräsuolen syövän muodostuvat pääosin 5-fluorourasiili-pohjainen kemoterapian, joita käytetään yksin tai yhdessä oksaliplatiinin (FOLFOX) tai anti-angiogeenisen aineita ja /tai anti-epidermaalisen kasvutekijän aineet [2]. Vaikka paksusuolen syövän ilmaantuvuus on vähentynyt hieman, nykyinen hoitomuotojen liittyy merkittäviä sivuvaikutuksia, korkea kustannuksella ja uusiutuminen ylöspäin 50%, mikä johtui pääasiassa kehittämiseen hankitun chemoresistance perinteisiin kemoterapeuttisia [3], [4]. Nämä rajoitukset korostavat välttämätöntä ja kiireellisesti tunnistaa ja kehittää uusia ja turvallinen hoito strategioita, jotka voivat auttaa voittamaan chemoresistance ja parantaa kasvaimen soluvasteen anti-kasvain huumeet.

Karsinogeneesi uskotaan olevan monivaiheinen prosessi, joka johtuu portaittain kertyminen geneettisiä muutoksia eri geenit (esim etäpesäke liittyvien geenien, onkogeenit, tuumorisuppressorigeenit), joka johtaa asteittain muuntaminen terveiden solujen tuumorisoluihin [5], [6]. Nyt on lisäksi tunnustettu, että epigeneettiset muutokset kuten poikkeava DNA: n metylaatio, histonimodifikaation, kromosomi remodeling ja vahingoittaa yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmän (MMR) järjestelmä, myös merkittävästi vaikuttaa CRC kehitys, [5], [7]. Vaurioituminen MMR järjestelmä aiheuttaa geneettinen epävakaus, koska on tärkeää oikolukemiseen DNA-synteesiä virheitä replikaation aikana, mikä johtaa muuttuneeseen solun fenotyyppejä, parannettu herkkyys neoplastisen transformaation ja helpottaa kehittämistä kemiallis-resistenttien solujen [8], [9].

aikana kasvaimen kehittymisen ja kasvaimen levittämistä kuten paksusuolen syöpä, syöpäsolut vaativat itseuudistumisen kyky, samanlainen kuin näytteille kantasoluja. Nyt on yleisesti hyväksytty, että syöpä synnyssä useimmissa kasvaimissa, mukaan lukien CRC, ohjaa alijoukon syöpäsolujen osoittavat kantasolujen samanlaiset ominaisuudet fysiologinen kantasoluja, kuten itseuudistumiseen kykyjä ja pluripotenttisuus [10], [11] ja että näiden syövän kantasolut (CSC) on mahdollista hyökätä ja muodostaa kaukainen etäpesäke [12], [13], [14]. Paksusuolessa, näiden paksusuolen CSC poikkeavasti eriyttää tuottaa pääosa kasvainsolujen kanssa suuremman osan koostuu useammasta erilaistuneita soluja ja pieni osa kantasolujen, joka lopulta korvata terveitä paksusuolen kantasoluja ja koko paksusuolen crypt on asuttaneet syövän kantasoluja solut ja niiden jälkeläiset [10]. Joukko erityisiä markkereita ole havaittu paksusuolen CSC, kuten CD133

+, CD 44

+, CD166

+ ja ALDH1

+ [15], [16]. Uusiutumisen kasvainten jälkeen näennäisesti onnistuneen kemoterapiaa uskotaan olevan nojalla chemo kestävä CSCS joka välttämään kuolemaa kemoterapia lääkkeitä [17]. Siksi tarvitaan uusia terapeuttisia aineita, jotka voivat menestyksekkäästi kohdistaa CSCS, on hyvin todennäköistä, lupaavin terapeuttinen strategia kokouksessa tämän valtavan kliinisen haasteeseen.

Kehittyvät kirjallisuus viittaa siihen, että monet ruokavalion osat voivat suoraan tai epäsuorasti säädellä tulehdusvasteita suoliston by moduloiva suoliston toiminto [18]. Lisäksi useat luonnossa esiintyvät ravinnon yhdisteiden on esitetty syövän terapeuttisina aineina [19], [20], [21], [22]. Osoittaakin on syntymässä että tavanomaiset kemoterapiaa CRC huomattavasti hyödyttää kautta monimuotoiset hoitoja joidenkin tällaisten luonnossa esiintyvien ravinnon polyfenolit [5], [23], [24]. Yksi tällainen kasvitieteellinen, kurkumiini (diferuloylmethane), keltainen mauste johdettu juurakot

kurkumaa longa

, on pitkä perinne tulehdusta aine perinteisessä Intian Ayurvedic järjestelmän lääketieteen. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, että kurkuma toimii voimakas kemo- ja radioherkistäjä useita ihmisen syövissä, [25], [26], ja se voi estää solujen kasvua MMR-järjestelmän puutteellisesta paksusuolen syöpäsoluissa [27], [28]. Aikaisemmassa tutkimuksessa osoitimme, että kurkuma parannettu kemosensitiivisyys 5-FU: n peräsuolen syövän solulinjoissa kohdistamalla NF-KB: n, Src: n ja NF-KB: n riippuvaisen säädellään geenin tuotteita [5]. Lisäksi on osoitettu, että kohdistaminen paksusuolen syövän soluja 5-FU: n ja oksaliplatiinin (FOLFOX) yhdessä curcumin heikennettyä EGF-R, IGF-1 R ja Akt signalointireittiä ja merkittävästi vähentää syövän kantasoluja markkeri-positiivisten solujen ja aiheutti hajoamisen colonospheres [ ,,,0],23], [24].

Olemme äskettäin osoittaneet, että yhdistetty hoito curcumin 5-FU indusoi merkittävämpi sytotoksisuutta DNA MMR puutosta CRC yksikerroksisiin, verrattuna kunkin aineen erikseen [5]. Näin ollen käsillä olevan tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko curcumin yksinään tai yhdessä 5-FU voi vaikuttaa DNA MMR-puutosta koolonsyöpäsoluihin jotka ovat luontaisesti resistenttejä 5-FU moduloinnissa colonosphere muodostumiseen ja CSC toimintaa 3D kulttuureissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja Cell Culture

Ihmisen paksusuolen syövän soluja (HCT116, MMR-puutosta) saatiin European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK). HCT116 + CH3, on MMR-taitavia solulinjaa, joka luotiin laboratoriossamme vakaalla transfektion kromosomi 3 joissa villityypin kopion

hMLH1

geeni, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Meillä on myös tuotettu 5-FU vastustuskykyisiä johdannaisia ​​näistä solulinjoista, kutsutaan HCT116R ja HCT116 + ch3R vastaavasti, jotka on luotu toistuvia käsittelemällä vanhempien solulinjojen kasvavia pitoisuuksia 5-FU yli 10-12kuukausi ajan. Sekä vanhempien ja 5-FU resistenttejä solulinjoja käytettiin tehokkuuden tutkimiseksi yksittäisten ja yhdistettyjen 5-FU: n ja curcumin hoitoja. Soluja pidettiin kudosviljelypulloissa Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; 4,5 g /L D-glukoosi), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% antibiootti /antimykoottia kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2. Väliaine vaihdettiin kolmen päivän välein, ja solut siirrostettiin käyttäen trypsiini /EDTA: lla.

Vasta-aineet

monoklonaalisia vasta-aineita ALDH1 hankittiin acris Antibodies GmbH (Herold, Saksa). Monoklonaalisia vasta-aineita CD133 ja CD44 ostettiin Abcam PLC (Cambridge, UK). Vasta-aineita P-aktiini (A5316) oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Monoklonaalinen anti-PARP [poly (ADP-riboosi) polymeraasin] (7D3-6) vasta-aine hankittiin Becton Dickinson (Heidelberg, Saksa). Alkalinen fosfataasi liittyy lampaan anti-hiiri ja lampaan anti-kaniini-vasta-aineita immunoblottauksella hankittiin Millipore (Schwalbach, Saksa). Kaikki vasta-aineita käytettiin pitoisuuksina ja laimennuksia valmistajan suosittelemia.

Kasvu Media, kemikaalit, ja Sytokiinit

Kasvatusalusta (Hamin F-12 /Dulbeccon modifioitua Eaglen väliainetta (50:50), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 25 ug /ml askorbiinihappoa, 50 IU /ml streptomysiiniä, 50 IU /ml penisilliiniä, 2,5 ug /ml amfoterisiini B: tä, välttämättömiä aminohappoja ja L-glutamiinia) hankittiin Seromed (Munich, Saksa). Trypsiini /EDTA (EY 3.4.21.4) hankittiin Biochrom (Berliini, Saksa). Epon saatiin Plano (Marburg, Saksa). 5-FU ostettiin Sigma (München, Saksa). Curcumin (BCM-95) oli antelias lahja Dolcas Biotech (Landing, NJ, USA). Curcumin valmistettiin liuottamalla se dimetyylisulfoksidi (DMSO), jonka varastossa pitoisuutena 5000 uM ja varastoitiin -20 ° C: ssa. Valmistettiin sarjalaimennokset elatusaineeseen.

100 mM varasto 5-FU valmistettiin absoluuttiseen DMSO: hon ja säilytetään -20 ° C: ssa. DMSO: n konsentraatio oli pienempi kuin 1% lääkehoidon. Hoitoon, 5-FU: lle, laimennettiin DMEM ja lisättiin viljelmiin, jolloin saatiin haluttu lopullinen pitoisuus. Sen jälkeen, kun 70-80% konfluenssiin, solut käsiteltiin 5-FU tai curcumin erikseen, tai niiden yhdistelmän.

solunelinkykyisyysmääritys

solujen elinkelpoisuus arvioitiin 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) oton menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [30]. Lyhyesti, HCT116, HCT116 + CH3-soluja ja 5-FU kemiallis-resistenttejä solulinjoja siirrostettiin 96-kuoppalevylle (1000 kuoppaa kohti), ja altistettiin eri pitoisuuksia yksittäisiä 5-FU tai kurkumiini kolminkertaisesti ilmoitettuun ajanjaksojen saamiseksi IC

50-arvot (50% solujen kasvua estävät pitoisuudet). Lisäksi, toisessa koesarjassa solut esikäsiteltiin 5 uM curcumin 12 tuntia, ja sitten yhdessä käsiteltiin eri pitoisuuksilla 5-FU: ta (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 uM) 24 tunnin ajan, jolloin saatiin optimaalinen annos yhdistelmähoito. Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja sen jälkeen, MTT-liuosta (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyä inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Lyysipuskuri (20% SDS: ää ja 50% dimetyyliformamidia) lisättiin, ja soluja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Absorbanssi solususpensiota mitattiin 570 nm: ssä (OD570) käyttäen Ilm 96-multiscanner levynlukijaa (Bio-Rad Laboratories Inc. Munich, Saksa). Saadut laskettiin ja edustivat prosentteina selviytymisen suhteessa kontrolleihin. Tämä koe toistettiin 3 kertaa itsenäisesti, ja tilastollinen analyysi tehtiin, jolloin saatiin lopullisia arvoja.

muodostuminen ja esto Colonosphere Colonies

kasvaimen colonosphere muodostumista määrityksessä, 10 ui pudota noin 2.000.000 solut, HCT116, HCT116 + CH3 ja niiden 5-FU kemiallis-resistenttejä johdannaisten solulinjojen maljattiin selluloosaa suodattimen päälle teräsverkko silta [31]. Soluviljelyelatusainetta saavutti suodatinvälineen käyttöliittymä ja solut vaalittava diffuusion. Tämä malli mahdollistaa solujen aggregoitua ja muodostaa erillisen pelletti, joka tutkittiin jälkeen 1-10 päivää. HCT116, HCT116 + ch3 ja niiden 5-FU kemiallis-resistenttejä solulinjoja käsiteltiin kurkumiini (20 uM), 5-FU (5 uM) tai niiden yhdistelmän (kurkuma 5 uM ja 5-FU 0,1 uM) 1, 3, 7 ja 10 päivää, tässä järjestyksessä. Applied pitoisuudet laskettiin ja edustettuina prosentteina selviytymisen suhteen käsittelemättömien kontrollien. IC

50 määriteltiin lääkeaineen pitoisuus, joka tarvitaan estämään HCT116, HCT116R tai HCT116 + CH3 ja HCT116 + ch3R 50% suhteessa kontrolleihin. IC

50-arvot arvioitiin annos-vaste-käyrä. Tiedot olivat peräisin vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Colonosphere muodostuminen arvioitiin valomikroskoopilla, DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli, Sigma) ja elektronimikroskoopilla.

transmissioelektronimikroskopialla (TEM) B

Elektronimikroskopia suoritettiin kuten aikaisemmin kuvatulla tavalla [32]. Lyhyesti, tiheän soluviljelmät, käsitellään edellä kuvatulla tavalla, fiksattiin 1 h Karnovsky fiksatiiviin jälkeen postitse-jumiutuminen 1% OsO

4 ratkaisu. Sen jälkeen nestehukka nousevassa alkoholin sarja, viljelmät upotettiin Epon ja leikata ultrathin kanssa Reichert-Jung Ultracut E (Darmstadt, Saksa). Leikkeitä verrata seoksella 2% uranyyliasetaatilla /lyijy sitraatti ja tutkittiin transmissioelektronimikroskoopin (TEM 10, Zeiss, Institute for farmakologian Berliini, Saksa).

kvantifiointi mitokondrio Changes (MC) ja apoptoottinen Cell Death

ultraohuet leikkeet näytteistä valmistettiin ja arvioitiin elektronimikroskoopilla (TEM 10; Zeiss, Institute for farmakologian Berliini, Saksa). Määrällisesti MC ja apoptoottisten solujen määrä solujen morfologisia piirteitä apoptoottisen solukuoleman määritettiin pisteyttämällä 100 solua 25 eri mikroskooppikentästä.

DAPI-värjäyksellä apoptoottisten solujen

Kromatiini tiivistymistä ja apoptoottisia soluja tutkittiin tumavärjäystä DAPI (4 ’, 6’-diamino-2-fenyyli, Sigma), kuten aiemmin on kuvattu [32]. Lyhyesti, korkean tiheyden viljelmiä upotettiin O.C.T. upotuselatusalustaan ​​ja jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä. Kahdeksasta kymmeneen um leikkeet leikattiin. Leikkeitä kiinnitettiin metanolilla 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä. Tämän jälkeen viljelmät pestiin kahdesti PBS: llä, ja sen jälkeen 1 ui DAPI-liuosta (5 mg /ml) viidessä ml: ssa PBS: ää levitettiin viljelmät minkä jälkeen inkuboidaan 20 minuutin ajan pimeässä. Leimatut solut pestiin toistuvasti PBS: llä poistaa ylimääräinen DAPI tahra, peitetty fluoromount peittausainetta ja arvioitiin fluoresenssimikroskoopilla (Leica, Saksa). Kokeita ja analyysi tehtiin kolmena kappaleena.

Western blot -analyysi

vaikutuksen määrittämiseksi curcumin, 5-FU tai kurkumiini /5-FU lohkaisu PARP ja ilmaisu syövän kantasoluja (CSC) markkereita, kokosolulysaateille valmistettiin ja fraktioidaan SDS-PAGE: [33]. Lyhyesti, solut huuhdeltiin PBS: ssä, ja proteiinit uutettiin lyysipuskurilla (50 mM Tris /HCl (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM natriumortovanadaattia, 50 mM natriumpyrofosfaatti, 100 mM natriumfluoridi, 0,01% (v /v) aprotiniinia, pepstatiini A: ta (4 ug /ml), leupeptiiniä (10 ug /ml), ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF)) 30 minuuttia jäillä. Säätämisen jälkeen koko proteiinipitoisuus, yhtä suuret määrät (500 ug proteiinia kaistaa kohti) koko proteiinit erotettiin SDS-PAGE (7,5% tai 12% geelit), pelkistävissä olosuhteissa. Erotetut proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille ja inkuboitiin estopuskurissa (5% (w /v) rasvatonta maitojauhetta PBS: ssä, 0,1% Tween 20) 1 h huoneen lämpötilassa. Membraaneja inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-ainetta laimennettuna blokkauspuskuriin 4 ° C: ssa ravistelijassa, pestiin 3 kertaa blokkauspuskurilla, ja sitten inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen konjugoituna alkaliseen fosfataasiin 90 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Membraanit pestiin 3 kertaa 0,1 M Tris (pH 9,5), joka sisälsi 0,05 M MgCl

2 ja 0,1 M NaCl. Lopuksi, antigeeni-vasta-aine-kompleksit havaita käyttämällä nitrosinitetratsoliumia ja 5-bromi-4-kloori-3-indoylphosphate (

p

toluidiinia suola; Pierce, Rockford, IL, USA) substraatteina alkalisella fosfataasilla.

tilastollinen analyysi

Numeeriset tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina (+/- SD) on edustava koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Välineet verrattiin Studentin

t

testiä olettaen yhtä suuri varianssit. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä, jos

p

arvo oli alle 0,05.

Tulokset

Ihmisen MMR-puutosta ja -proficient CRC soluja (HCT116, HCT116 + CH3 ) ja niiden 5-FU kemiallis-resistenttejä johdannaisten solulinjojen (HCT116R, HCT116 + ch3R) käytettiin tutkimuksessamme vaikutuksen tutkimiseksi kurkumiinin ja /tai 5-FU solujen elinkykyä, apoptoosin ja syövän kantasoluja (CSC) in tiheän kulttuureissa.

MMR- Puutteellinen CRC Solut ja niiden 5-FU Kestää solut ovat herkkiä curcumin

sytotoksisia vaikutuksia 5-FU tai curcumin neljään koolonsyöpäsolulinjaa määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla 5-FU: ta (0, 1, 5, 10 ja 20 uM) tai kurkumiini (0, 1, 5, 10 ja 20 uM), ja solujen elinkyky tutkittiin MTT-määrityksellä (Fig. 1A 0,05. Merkitykselliset arvot on merkitty (*).

arvioimiseksi solun herkkyyttä yhdistelmä kurkumiinin ja 5-FU hoidossa, esikäsittelimme HCT116, HCT116 + ch3 ja vastaavat 5-FU kemiallis-resistenttien solujen ensin 5 uM curcumin seuraa käsittely eri pitoisuuksilla 5-FU: ta (0, 0,1, 1, 2 ja 4 uM) ja 24 h (Fig. 1 C). MTT määritykset suoritettiin ja IC

50-arvot määritettiin. Tulokset osoittavat, että kurkuma merkittävästi parannettu sytotoksisuutta 5-FU sekä solulinjoja (HCT116 ja HCT116 + CH3) noin 0,1 uM 5-FU: ta (Fig. 1 C). Mielenkiintoista, esikäsittely 5pM curcumin pienentää IC

50-arvot 5-FU 2 uM 5-FU kestävä HCT116R ja HCT116 + ch3R solujen linjat (p 0,05; Fig. 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DNA MMR-puutosta HCT116R ja DNA MMR-taitavia HCT116 + ch3R soluja esikäsitellään curcumin olivat herkempiä 5-FU kuin soluja käsiteltiin 5-FU yksin ja käyttöönotto kromosomin 3 HCT116-solut osoittivat lisääntynyttä herkkyyttä solut hoito 5-FU: n ja /tai kurkumiini verrattuna HCT116-soluissa.

curcumin ja /tai 5-FU torjumista Colonosphere kasvu MMR-puutteellisia CRC solut ja niiden 5-FU kestävä solut high Density Cultures

vaikutusten arvioimiseksi 5-FU: n ja /tai kurkumiini joko yksinään tai yhdistelmänä koosta colonospheres, piirre syövän kantasoluja [34], kolmiulotteinen high-density viljelmät [31], että HCT116-ja vastaava chemo-resistenttejä solulinjoja suoritettiin (Fig. 2A-C).

korkean tiheyden viljelmiä HCT116 (A) tai HCT116R soluissa (B) jätettiin joko hoitamatta tai joita oli käsitellään 5-FU (5 uM), kurkumiini (20 uM), tai 5-FU /kurkumiini yhdistelmänä (0,1 /5 uM). Viljelmät arvioitiin jälkeen 1, 3, 7 ja 10 päivää, ja kuvia natiivin kulttuurien otettu. Kuvat ovat edustavia kolmesta erillisestä kokeesta. Colonosphere koko mitattiin ja tulokset esitetään ovat keskiarvoja kanssa keskihajonnat kolmesta itsenäisestä kokeesta. C: Tiheä viljelmät HCT116, HCT116 + CH3 ja niiden 5-FU-solunsalpaajaresistentti solut joko jätettiin käsittelemättä tai käsiteltiin 5-FU (5 uM), kurkumiini (20 uM), tai 5-FU /curcumin yhdistelmänä (0,1 /5 uM). Viljelmät arvioitiin sen jälkeen, kun 10 päivää, colonosphere koko mitattiin ja tulokset esitetään ovat keskiarvoja, joissa standardipoikkeamat kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkitykselliset arvot on merkitty (*).

käsittelemätön kontrolli viljelmissä, tulokset osoittivat, että sekä HCT116 ja HCT116R solut muodostivat pallomainen pesäkkeitä, joilla on ajasta riippuva kasvu koko colonospheres aikana 10 päivän aikana (Fig. 2A, 2B). Hoito HCT116 viljelmien 5-FU yksin, toisin kuin niiden vastaavat 5-FU resistenttejä HCT116R solulinja, vähentynyt huomattavasti koko colonospheres verrattuna vastaavaan kontrolleihin (Fig. 2A, 2B). Kuten odotettua, hoito 5-FU resistenttien solujen kanssa 5-FU erikseen ei ollut kielteistä vaikutusta colonosphere koon (Fig. 2B). Sitä vastoin käsitellyissä viljelmissä kurkumiinin yksin ja /tai 5-FU: colonosphere koko pieneni merkitsevästi verrattuna vastaaviin kontrolleihin (Fig. 2A, 2B, 2C). Käsittely curcumin yksinään tai yhdistelmänä hoidon on osoitettu olevan erittäin tehokkaita estämään alalla muodostavan kyvyn kaikkien neljän CRC solulinjoissa. Koot colonospheres sisään curcumin hoidetuissa ryhmissä olivat huomattavasti pienempiä verrattuna kontrolliryhmiin, mikä osoittaa, että a) kurkuma itse tukahduttaa colonosphere koko DNA MMR puutteellinen HCT 116 soluja, ja b) kurkumiinin herkistyneet HCT116R ja HCT116 + ch3R solujen 5- FU-indusoidun sytotoksisuuden (Fig. 2A, 2B, 2C). Lopussa koejakson (10 päivää), voitiin havaita, että vaikka kontrolli solut muodostivat hyvin kehittynyt colonospheres, 5-FU resistenttejä CRC solut altistetaan curcumin yksinään tai yhdistelmänä hoidossa osoittivat huomattavasti pienempi pallomainen muodostumista (Kuva. 2C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että colonoshere koko oli merkittävästi vähentynyt korkean tiheyden viljelmiä käsiteltiin joko curcumin yksinään tai yhdistelmänä kurkumiinin ja 5-FU, joka osoittaa colonosphere estävä vaikutus kurkumiinin ja /tai 5-FUon HCT116, HCT116 + ch3 ja niiden kunkin 5-FU vastustuskykyisiä johdannaisia.

Curcumin ja /tai 5-FU lisätä sytotoksisuus Colonospheres MMR puutteesta CRC Solut ja niiden 5-FU resistentit solut High Density Cultures

tarkastella onko colonosphere muodostumista estävä vaikutus kurkumiinin ja 5-FU: HCT116, HCT116 + CH3, HCT116R ja HCT116 + ch3R solulinjoja liittyy apoptoosin induktion, käsiteltyjä soluja arvioitiin käyttäen DAPI-värjäyksellä, joka osoitti, että apoptoottisia kappaleita sisältävien ydin- fragmentit ja kromatiinin kondensaatio luotiin sisällä apoptoottisten allas solujen (Fig. 3A, 3B). Itse asiassa, inkubointi HCT116 ja HCT116R soluja seerumin puutteessa väliaine johti muodostumista colonosphere aikana 10 päivää. Kuitenkin inkubaatio HCT116 ja HCT116R solujen 5-FU, curcumin tai curcumin yhdessä 5-FU 10 päivän johti merkittävään hajoamiseen colonosphere (t) verrattuna niiden vastaaviin kontrolleihin (Kuva. 3A, 3B). Korkein hajoamisen havaittiin vastauksena yhdistelmä curcumin ja 5-FU: HCT116 + CH3 ja HCT116 + ch3R solulinjoja (Fig. 3A, 3B).

Tiheä kulttuureissa HCT116, HCT116 + CH 3 (A ), tai HCT116R ja HCT116 + ch3R (B) jätettiin joko hoitamatta tai hoidettiin 5-FU (5 uM), kurkumiini (20 uM), tai 5-FU /kurkumiini yhdistelmänä (0,1 /5 uM). Viljelmät arvioitiin sen jälkeen 1, 3, 7, ja 10 päivää, ja värjättiin Hoechst 33258 (DAPI) paljastaa apoptoottisen muutoksia solutumien. Kuvat ovat edustavia kolmesta erillisestä kokeesta.

Curcumin Parantaa 5-FU-välitteisen apoptoosin MMR puutteesta CRC Solut ja niiden 5-FU resistentit solut High Density Cultures

tutkia, onko kasvua estävää vaikutusta kurkumiinin ja 5-FU: colonosphere muodostumista kolmiulotteinen korkean tiheyden viljelmiä liittyy apoptoosin induktion, Mikroskooppitutkimus arvioinnit suoritettiin (Fig. 4 5) on HCT116, HCT116 + ch3 , HCT116R ja HCT116 + ch3R soluissa, joita käsiteltiin 5-FU (5 uM) ja kurkumiini (20 uM) yksin, tai 5-FU /kurkumiini yhdistelmänä (0,1 /5 uM) ja 1, 3, 7, ja 10 päivää. Kontrolliviljelmissä, HCT116, HCT116 + ch3 ja 5-FU-resistenttejä vastine solulinjat osoittivat suurta pyöristetty elävien solujen (jotka sisältävät erillisiä jakelu Endoplasmakalvosto, mitokondrioiden ja muiden soluelinten) ja nämä solut tehdään intiimi solu-solu-kontakti ( Fig. 4A, 5A). Hoito HCT116-solujen 5-FU tai curcumin pelkällä rappeutumista soluorganellien, mitokondrioiden turvotus ja ulkonäkö useita Vakuoleissa merkittävässä merkkejä apoptoosin erityisesti curcumin hoidetuilla suuren tiheyden kulttuureissa ympäri päivänä 10 (Fig. 4A-B). Näihin sisältyvät alueet tiivistyneen heterochromatin sisällä ytimet, ja useita autophagocytic sytoplasman vakuoleihin. Samanlaisia ​​havaintoja tehtiin HCT116 + CH3-soluja (tietoja ei esitetty). Sitä vastoin näitä vaikutuksia ei voitu havaita 5-FU tai kurkumiini käsiteltiin HCT116R (Fig. 5A-B) tai HCT116 + ch3R soluja (tietoja ei esitetty). Kuitenkin kombinatorinen hoito 5-FU: n ja kurkumiini yli 10 päivää tehosti merkittävästi rappeutumista kaikkien kasvainsolujen. Merkitty degeneratiiviset muutokset ja apoptoottisia soluja havaittiin noin päivä 3 HCT116 (Fig. 4A-B) ja HCT116R solut (Fig. 5A-B), jotka olivat jo nähtävissä noin päivän 1 HCT116 + CH3-solut (Fig. 4A-B) ja HCT116 + ch3R solut (Fig. 5A-B). Kvantifiointi ja tilastollinen analyysi Mikroskooppitutkimus tietojen korostaa näkyvä vaikutukset ja 5-FU ja curcumin käsittely asiakkuutta ja parantamalla mitokondrioiden muutokset (MC) ja apoptoottisten vaikutuksia HCT116-soluissa (kuvio. 4B) ja HCT116R soluja (kuvio. 5B).

V: Tiheä viljelmät HCT116 ja HCT116 + CH3 oli joko jätetään hoitamatta tai hoidettiin 5-FU (5 uM), kurkumiini (20 uM), tai 5-FU /curcumin yhdistettynä (0,1 /5 uM). Viljelmät arvioitiin sen jälkeen 1, 3, 7, ja 10 päivää, ja arvioidaan äärirakenteen kanssa transmissioelektronimikroskoopilla. Aikaisempana ajankohtana vaiheessa, kun apoptoosin (nuolet) havaittiin ensimmäisen kerran, kuvat on korostettu punaisella laatikoihin. Micrographs Esitetyt tulokset edustavat kolmesta erillisestä kokeesta. Suurennus: X5000, bar = 1 pm. B: mitokondrio muutokset (MC) ja apoptoosin kvantitoitiin laskemalla 100 solut morfologisia piirteitä apoptoottisen solukuoleman 25 eri mikroskooppikentäs- ja tulokset esitetään ovat keskiarvoja, joissa standardipoikkeamat kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittävät arvot on merkitty tähdellä (*).

V: Tiheä viljelmät HCT116R ja HCT116 + ch3R jätettiin joko hoitamatta tai hoidettiin 5-FU (5 uM), kurkumiini (20 uM) tai 5-FU /kurkumiini yhdistelmänä (0,1 /5 uM). Viljelmät arvioitiin sen jälkeen 1, 3, 7, ja 10 päivää, ja arvioidaan äärirakenteen elektronimikroskoopilla. Aikaisempana ajankohtana vaiheessa, kun apoptoosin (nuolet) havaittiin ensimmäisen kerran kuvia on korostettu punaisella laatikoihin. Micrographs Esitetyt tulokset edustavat kolmesta erillisestä kokeesta. Suurennus: X5000, bar = 1 pm. B: mitokondrio muutokset (MC) ja apoptoosin kvantitoitiin laskemalla 100 solut morfologisia piirteitä apoptoottisen solukuoleman 25 eri mikroskooppikentäs- ja tulokset esitetään ovat keskiarvoja, joissa standardipoikkeamat kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittävät arvot on merkitty tähdellä (*).

Curcumin Voimistaa Antituumorivaikutus 5-FU kautta apoptoosireittiä HCT116, HCT116 + CH3 Solut ja niiden 5-FU Kestää solut High Density Cultures

Koska Mikroskooppitutkimus arviointi elektronimikroskoopilla tulokset osoittivat, että 5-FU +/- curcumin indusoiman apoptoosin (Fig. 4-5), ja PARP näyttää olevan osallisena apoptoosin kasvainsoluissa [35], siis me tutkimme, curcumin voimistaa PARP pilkkominen sisään 5-FU-käsitellyn HCT116, HCT116 + CH3 ja niiden vastaavat 5-FU-resistenttejä kollegansa. Kuten on esitetty kuviossa. 6, immunoblot-analyysi osoitti, että lohkaisu PARP on parantunut, kun solut altistettiin kurkumiini (20 mM) tai 5-FU (5 mM) yksin tai yhdistelmä kurkumiinin ja 5-FU (0,1 /5 uM) . Nämä vaikutukset olivat selvempiä yhdistettynä hoidon curcumin ja 5-FU kuin yhden hoitoja (Fig. 6).

Tiheä viljelmiä HCT116 ja HCT116 + CH 3 (vasen lanel) sekä HCT116R ja HCT116 + ch3R (oikea paneeli) soluja joko jätetään hoitamatta tai hoidettiin 5-FU (5 uM), kurkumiini (20 uM), tai 5-FU /curcumin yhdistettynä (0,1 /5 uM). Viljelmät arvioitiin 3 päivän kuluttua ja kokosolulysaateista valmistettiin ja analysoitiin western-blottauksella ja pilkkominen PARP. Western blotit esitetään edustavat kolmen erillisen kokeen. Housekeeping proteiini β-aktiini toimi positiivisena latauskontrollina kaikissa kokeissa.

Curcumin on voimakas Chemosensiti- Vaikutus paksusuolen syövän kantasoluja MMR-puutteellinen ja -proficient CRC solut High Density Cultures

osoittamiseksi Chemosensiti- vaikutus curcumin paksusuolen CSC markkereita CD133, CD44 ja ALDH1 ilmaisun tiheän kulttuureissa, western blotting -analyysi suoritettiin (Fig. 7). Tiheä viljelmät HCT116, HCT116 + CH3 ja niiden vastaavat 5-FU-resistenttejä kollegansa olivat joko jätetään hoitamatta tai hoidettiin 5-FU (5 uM) tai curcumin (20 uM) yksin tai 5-FU /curcumin yhdistelmänä (0,1 /5 uM) 12 tuntia.