Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolleisuus, ja noin 85% tapauksista ovat ei-pieni- keuhkosyöpä (NSCLC). Tärkeää on, viimeaikainen edistysaskel syövän tutkimus osoittaa, että muuttamalla syöpäsolu bioenergetiikan voi olla tehokas keino kohdistaa niin pitkälle syöpäsolut ovat hankkineet mutaatioita useisiin solujen sääntelyviranomaiset. Tutkimus pyrkii tunnistamaan bioenergetic muutoksiin keuhkosyöpään soluissa suoraan mitata ja vertailla avaimen aineenvaihdunnan toimintaa pari solulinjojen vastaa tavanomaista ja NSCLC solujen kehitetty samasta potilaasta. Huomasimme, että hinnat hapenkulutuksen ja hemin biosynteesin tehostettiin vuonna NSCLC soluissa. Lisäksi NSCLC-solut osoittivat huomattavasti kohonneeseen riviksi proteiinien edistää hemin synteesiin, otto ja toiminta. Nämä proteiinit sisältävät nopeutta rajoittavaa Hemi biosynteettinen entsyymi ALAS, kuljettaja proteiineja HRG1 ja HCP1 jotka ovat mukana hemin oton, ja erilaisia ​​happea hyödyntäen hemoproteiinien kuten cytoglobin ja sytokromi. Useita ihmisen tuumoriksenografteja näytetään myös kohonneeseen tällaisia ​​proteiineja. Lisäksi olemme havainneet, että alentamalla hemin biosynteesin ja käyttöönottoa, kuten alentamalla mitokondrion hengitystä, vähentää tehokkaasti hapenkulutus, syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota ja pesäkkeiden muodostumista. Sen sijaan, alentamalla hemin hajoaminen ei ole vaikutusta keuhkojen syöpäsoluja. Nämä tulokset osoittavat, että lisääntynyt hemin vuon ja toiminta ovat keskeinen osa NSCLC soluja. Edelleen lisääntynyt sukupolvi ja tarjonta hemin ja hapen hyödyntäen hemoproteiinien syöpäsoluissa johtaa tehostetaan hapen kulutusta ja solujen energian tuotannon mitokondrion hengitystä, mikä polttoaineen syöpäsolujen lisääntymistä ja etenemistä. Tulokset osoittavat, että estämällä hemin ja hengitystoiminnan voivat tehokkaasti pysäyttämään etenemistä keuhkosyövän soluja. Siksi ymmärrys hemin funktio voi vaikuttaa myönteisesti tutkimukseen keuhkosyövän biologian ja terapeuttisia.

Citation: Hooda J, Cadinu D, Alam MM, Shah A, Cao TM, Sullivan LA, et al. (2013) Enhanced Hemi Function ja mitokondrio hengitys edistää etenemistä Lung Cancer Cells. PLoS ONE 8 (5): e63402. doi: 10,1371 /journal.pone.0063402

Editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. helmikuuta 2013 Hyväksytty: 31 maaliskuu 2013; Julkaistu: toukokuu 21, 2013

Copyright: © 2013 Hooda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Cecil H. ja Ida Green varat (LZ) ja NCI SPORE P50CA70907 avustus (RB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvainsoluista on lisääntynyt kysyntä ravinteita, jotka tarjoavat soluenergiaa ja aineenvaihdunnan rakennuspalikoita. Lisääntynyt aineenvaihdunnan kysyntä kasvainsoluissa liittyy usein muuttunut aineenvaihdunta. Vuonna 1920, Otto Warburg osoittaneet, että kasvainsolut metaboloivat glukoosia ja tuottavat laktaattia korkeammilla tasoilla läsnäolosta huolimatta runsaasti happea, ilmiö nimeltään Warburg vaikutus [1], [2]. Uudemmat tutkimukset ovat paljastaneet molekyylitason tapahtumia taustalla monissa aineenvaihdunnan muutoksia syöpäsoluissa [3] – [5]. Esimerkiksi, Anastasiou et ai. [5] osoittivat äskettäin, että entsyymi pyruvaattikinaasia M2 (PKM2), joka on vallitseva pyruvaattikinaasin löytyy syöpäsoluja, on tärkeää ylläpitää solun redox homeostaasin. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että metabolisia entsyymejä voivat toimia tuumorisuppressorien (esim., Fumaraatti hydrataasi ja sukkinaattidehydrogenaasi), tai onkogeenien (esim., Mutantti isositraattidehydrogenaasin 1 ja 2) [6] – [8]. Nämä viimeaikaiset tutkimukset vahvistivat, että muuttunut aineenvaihdunta on todellakin tunnusmerkki syöpä, ja ehdotti, että muutokset aineenvaihduntaa syöpäsoluissa ovat paljon monimutkaisempia kuin ehdotettiin aluksi.

Viimeaikaiset tutkimukset osoittaneet, että tehostettu glykolyyttisissä vuon syöpäsoluissa ei ole riippuvainen vähentynyt hapen kulutukseen tai mitokondrion hengitystä [9] – [11]. Esimerkiksi kahdessa erillisessä tutkimuksessa [12], [13] osoittivat, että mitokondrion hengitystä monistetaan ihmisen rintasyövän soluja. Toinen tutkimus osoitti, että syöpäsolut voivat ylläpitää oksidatiivisen fosforylaation vähentynyt, mutta silti huomattavan korkea jopa 1% happea tasolla [14]. Nämä tulokset korostavat, että mitokondrioiden hengitys ja toiminta ovat ratkaisevia syövän solujen aineenvaihduntaa ja bioenergetiikan. Erityisesti hemin on keskeinen tekijä mitokondrioiden toimintaa ja hapen aineenvaihduntaan [15], [16]. Hemi pelaa kriittinen rooli lähes jokaisessa prosessissa mukana happea aineenvaihduntaan. Hemi toimii proteesin ryhmä hemoglobiinin, myoglobiinin ja muut globiinit, että liikenteen tai tallentaa hapen, mitokondrion Hengitysketjun komplekseja, sytokromi P450 -entsyymien ja muut oksygenaasit jotka käyttävät happea biosynteettisille ja hajoaminen reaktioita ja muita entsyymejä, jotka käyttävät tai myrkyllisyyden happea tällaisten kuten peroksidaasit ja katalaaseja [15], [17]. Samoin, hemi biosynteesin vaatii happea substraattina, vaikka Km hemin biosynteettisen entsyymien happi on hyvin alhainen [18]. Siksi hemin ja hapen ovat tiukasti sidoksissa toisiinsa ja toisistaan ​​riippuvaisia.

Tässä tutkimme toiminta hemin ja mitokondrioiden keuhkosyövän kehittämiseen. Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvän kuolleisuuden Yhdysvalloissa ja muualla maailmassa, ja noin 85% tapauksista ovat ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [19], [20]. Useimmat potilaat ovat paikallisesti edennyt vaiheeseen III /IV kasvaimia aikaan esityksen [21]. Hyväksikäyttö metabolisen haavoittuvuuksista voivat tarjota tehokkaan vaihtoehdon torjuntastrategialle keuhkosyöpä etenemistä. Siksi tunnettu ja verrataan happi aineenvaihduntaa ja hemin funktio HBEC30KT ja HCC4017 solujen [22], [23]. Tämä pari solulinjoja ovat normaali ei-pahanlaatuisten HBEC (HBEC30KT) ja NSCLC (HCC4017) solut kehitettiin samasta potilaasta. Vertasimme aineenvaihdunnan ja molekyyliprofiilien tämän sovitetun parin solulinjoja kasvatetaan samoissa olosuhteissa. Olimme kiinnostuneita määritettäessä, jos ja missä määrin happea aineenvaihduntaa ja Hemi tasot ovat muuttuneet, ja jos tällaiset muutokset edistävät ylläpitoon ja leviämisen keuhkosyövän soluja. Meidän tiedot osoittavat, että hapen kulutus ja hemin synteesin tehostetaan merkittävästi keuhko- syöpäsoluja, verrattuna normaaleihin soluihin. Lisäksi tasot proteiinien mukana solunsisäinen hemin synteesissä ja otto lisääntyvät huomattavasti keuhkojen syöpäsoluja. Lisäksi tasot happea käyttäen hemoproteiinien, kuten cytoglobin, lisääntyivät dramaattisesti syöpäsoluissa. Esto Hemi tai mitokondrioiden toimintaa ensisijaisesti tukahdutetaan hapenkulutusta, syöpäsolujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumisen ja muuttoliike. Nämä tulokset osoittavat, että tehostettu hemin synteesissä ja hemoproteiinien keuhkosyövässä soluissa johtaa tehostetun hapenkulutus ja mitokondriaalisen hengityksen että polttoaine syöpäsolun kehitystä.

Materiaalit ja menetelmät

Lung Cell ylläpito, hoito ja Cell count

HBEC30KT ja HCC4017 solulinjoissa, jotka edustavat normaalin ja NSCLC-solujen [22], [23] saatiin tohtori John Minna laboratoriosta (UTSW) lahjana. Ne kehitettiin samasta potilaasta ja pidettiin ACL4 täydennetty 2% FBS: ää alle 5% CO

2 37 ° C: ssa [23]. Hoidon inhibiittorin hemin synteesin, sukkinyyli asetonia, soluja viljeltiin alustassa, joka sisältää hemin-köyhdytettyä seerumia. Hemi köyhdytettyä seerumi valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Mittaamiseksi vaikutus reagenssit keuhkojen soluproliferaatiota, solut ympättiin 48-kuoppalevylle tiheydellä 10

3 solua /kuoppa. Kun on viljelty 24 tuntia, solut käsiteltiin 0,5 mM sukkinyyli asetonissa tai 10 uM karbonyyli syanidia 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). Jokainen 24 tunnin kuluttua hoidon elävien solujen lukumäärä laskettiin käyttäen trypaanisininen värjäystä ja hemosytometriin.

mittaus glukoosi kulutus hapenkulutus ja Hemi Synthesis

mittaamiseen glukoosinkulutusta, solut (~90% yhtymäkohta) inkuboitiin 24 tuntia tuoreella väliaineella. Glukoositaso elatusaineessa mitattiin käyttämällä glukoosia (GO) Pitoisuus Kit (Sigma). Hapenkulutus mitattiin, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Lyhyesti, solut noin 80% konfluenssiin trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen, Ilmalla kyllästetyn liuoksen. Kunkin mittauksen, 10

6 solua (350 ui) otettiin käyttöön kammiossa Oxygraph järjestelmän (Hansatech Instruments), jossa on Clark-elektrodi sijoitetaan pohjalle hengitysteiden kammion. Mittausten aikana kammion lämpötila säädettiin 37 ° C: ssa kiertävällä vesihauteella. Sähkömagneettinen sekoitin bar käytettiin sisällön sekoittamiseksi kammion. Hemi synteshastighet mitattiin osassa [24]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin 0,5 mM sukkinyyli asetonia, tai 10 uM CCCP 48 tuntia, ja inkuboitiin 0,3 uCi [4-

14C] 5-aminolevuliinihapon (PerkinElmer Life ja analyyttinen Sciences) 24 tuntia. Hemi uutettiin näistä soluista käyttäen asetonia-suolahappoa ja dietyylieetteriä, ja se määrä radioaktiivisesti leimattua hemin mitattiin, kuten on kuvattu [26]. Liittäminen radioaktiivisuutta poimitun Hemi avulla voidaan mitata hemin biosynteesin. Määrä radioaktiivisesti hemin mitattiin tuikelaskennalla.

Reaaliaikainen PCR kvantitointi ja havaitseminen mitokondrio-DNA

Oligonukleotidialukkeet mittaamiseksi transkriptin tasot geenien suunniteltiin käyttämällä Primer3-ohjelman ( https://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). β-aktiini käytettiin kontrollina suhteellisen kvantifioinnin transkriptien. Kokonais-RNA uutettiin käsittelemättömiin soluihin tai niitä käsiteltiin 0,5 mM sukkinyyli asetonia hemi-köyhdytettyä väliaineessa käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen). RNA puhdistettiin käyttämällä Rneasy-kittiä (Qiagen). Käänteinen transkriptio ja PCR suoritettiin yhdessä vaiheessa käyttäen LightCycler RNA Master SYBR Green I Kit (Roche Applied Science), mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR suoritettiin käyttäen Rochen LightCyclerin. Laskelmat tehtiin käyttämällä Roche LightCycler ohjelmisto. Alukesekvensseissä käytetään reaaliaikaista PCR olivat seuraavat: β-aktiini: eteenpäin 5’CACAGGGGAGGTGATAGCAT -3 ’, käänteinen 5’CACGAAGGCTCATCATTCAA -3 ”. ALAS1: eteenpäin 5’-CACACACCCCAGATGATGAA -3 ’, käänteinen 5’CCTGCAGAAGTTGCACTCAG -3 ”. ALAS2: eteenpäin 5’TGTCACCACCTATGCCTGAG -3 ’, käänteinen 5’GGCACACAACAAAGCAGAAG -3 ”.

mtdna pitoisuus mitattiin ja verrattiin mittaamalla tasoja mitokondrioiden 16S rRNA ja ydinvoiman GAPDH-geenin, jonka käyttäen reaaliaikaista PCR: ää, kuten aiemmin on kuvattu [27]. Alukesekvenssit olivat seuraavat (5′-3 ’): GAPDH: eteenpäin TTCAACAGCGACACCCACT, käänteinen CCAGCCACTACCAGGAAAT. 16S rRNA: eteenpäin CCAAACCCACTCCACCTTAC, käänteinen TCATCTTTCCCTTGCGGTA. Reaaliaikainen PCR-monistus suoritettiin käyttäen LightCycler FastStart DNA Master

PLUS SYBR Green I kit (Roche Applied Science), mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen PCR-monistuksen kunkin näytteen suoritettiin tripletteinä. Data kerättiin ja analysoitiin käyttämällä LightCycler Software. Mitokondrioiden (16 rRNA) vs. tuman DNA (GAPDH) laskettiin.

valmistus Protein uutteet, Western-blottaus ja Immunofluoresenssimikroskopia

HBEC30KT ja HCC4017 soluja käsiteltiin, kerättiin, ja hajotettiin käyttämällä RIPA puskuria (Cell Signaling Technology), joka sisältää proteaasiestäjäseostabletit. Ihmisen tuumoriksenograftien ylläpidettiin, ja lysaatit ihmisen tuumorin ksenografteja valmistettiin, kuten on kuvattu [28]. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä BCA-määrityksellä Kit (Thermo Scientific). 50 ug proteiineja hoito-olosuhteilla, ajettiin elektroforeesissa 9% SDS-Polyakryyliamidigeelit, ja sitten se siirretään Immuno-Blot PVDF-kalvolle (Bio-Rad). Kalvot tutkittiin polyklonaalisilla vasta-aineilla, jonka jälkeen tunnistus kemiluminesenssimittaus Western blotting kit (Roche Diagnostics). Signaalit havaittiin käyttämällä Carestream kuvan aseman 4000mm Pro, ja kvantitointi suoritettiin käyttäen Carestream molekyylikuvantaminen ohjelmistoversio 5.0.5.30 (Carestream Health, Inc.). Immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin noudattamalla, jonka vasta-aineen valmistaja. FITC ja DAPI fluoresoivia kuvia siepattiin käyttäen monikanavaista Zeiss Axio Observer.Z1 fluoresenssimikroskoopilla. Polyklonaalisia anti-ALAS1, anti-HRG1, anti-sytokromi c, anti-cytoglobin, anti-CYP1B1, anti-Cox-2 ja anti-HCP1 ostettiin Santa Cruz Biotechnology. Monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology.

Colony Formation and Cell Migration määritykset

pesäkemuodostusta, HCC4017 solut laskettiin ja ympättiin tiheydellä 1000 solua per hyvin 6-kuoppalevyillä. Soluja käsiteltiin ilman tai 0,5 mM sukkinyyli asetonia, sukkinyyli asetonia + Hemi (10 uM), 10 uM Karbonyylisyanidi-M-Kloorifenyylihydratsoni (CCCP) tai 10pM Tin protoporfyriini IX (snpp). Väliaine päivittyy joka neljäs päivä. Sen jälkeen 10-12 päivä, solut kiinnitettiin 70% etanolilla, värjättiin 0,5% kristalliviolettia. Kuvat hankittiin käyttämällä HP Scanjet 8270.

In vitro scratch määritystä käytettiin vaikutuksen tutkimiseen hemin ja hemin vajauksen HCC4017 solujen vaeltamiseen, kuten on kuvattu [29]. Lyhyesti, HCC4017 soluja käsiteltiin ilman tai 0,5 mM sukkinyyli asetonia, sukkinyyli asetonia + hemin (10 uM), tai 10 uM Tin protoporfyriini IX (snpp) ja 6 päivää. Sitten solut trypsinoitiin ja ympättiin viljelylevyille 95% konfluenssiin. Yksisolukerrokset raaputettiin 200 ul: aan steriiliä pipetin kärjen ja sitten pestiin useita kertoja PBS: llä solujäänteiden poistamiseksi. Sitten solut ylläpidettiin vastaavan median, ja muuttoliike solujen tarkkailtiin mikroskoopilla. Kuvat ovat otettiin kiinni pitkin naarmu eri ajankohtina. Jokainen käsittely suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Tulokset

NSCLC Solut Näytä tehostetusti Valuuttojen hapenkulutus

mitattiin ja verrattiin hinnat glukoosin ja hapen kulutusta sopiva pari normaali, ei-pahanlaatuisten keuhkoputken epiteelin (HBEC30KT) ja NSCLC (HCC4017) soluihin [22], [23]. Taulukko 1 osoittaa, että hinnat sekä glukoosin ja hapen kulutusta HCC4017 solut olivat koholla, jossa korkeus hapen kulutuksen lähestyy 2,5-kertaiseksi (taulukko 1). Kuitenkin mitokondrioiden DNA tuman DNA: han, mitataan, kuten on kuvattu [30], ei ollut eroa solulinjoista. Nämä tiedot viittaavat siihen, että vaikka mitokondrioiden toimintaan ei häiriinny, mitokondrioiden hengitys on huomattavasti parannettu NSCLC soluissa.

nopeus Hemi biosynteesin ja Expression tasot Hemi Biosynteettiset Entsyymit ovat lisääntyneet huomattavasti keuhkosyöpäsoluissa

Hemi toimii proteesin ryhmä monissa proteiinit ja entsyymit, jotka kuljettaa, varastoida ja käyttää happea ja voi suoraan säädellä monia prosesseja hapen aineenvaihduntaan [15], [16]. Siksi me perusteltu, että tehostetun hapenkulutus NSCLC solut voivat johtua kohonneeseen hemin ja hemoproteiinien. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, ensin mitataan ja sitä verrataan tasoja hemin synteesin NSCLC ja normaaleissa soluissa. Huomasimme, että korko hemin synteesin nostettiin merkittävästi NSCLC HCC4017 soluja, verrattuna normaaliin HBEC30KT solut (kuvio 1A). Voimakkaan CYP hemin synteesin, sukkinyyli asetonia (SA) [24], [31], esti hemin synteesin NSCLC ja normaaleissa soluissa, odotetusti. Sukkinyyli asetoni on aiemmin osoitettu olevan spesifinen ja voimakas estäjä hemin synteesin erilaisissa soluissa vaihtelevat HeLa-solut, PC12-solut primaarisen hiiren hermosolujen [32] – [37]. Mielenkiintoista on, että mitokondriot uncoupler CCCP (karbonyyli syanidi meta-chlorophenylhydrazone) myös vähensi hemin synteesin, vaikkakin vähemmässä määrin (kuvio 1A). CCCP erotetaan toisistaan ​​ammatillisiin oksidatiivisen fosforylaation ATP sukupolven mitokondrioita [38]. Koska hapen kulutus on erittäin suuri, verrattuna siihen, mitä tarvitaan hemin biosynteesin (taulukko 1), hapen määrää käytetään hemin biosynteesin on merkityksetön [18].

normaali HBEC30KT keuhkoepiteelin (HBEC ) ja NSCLC HCC4017 (HCC) soluja viljeltiin, RNA ja proteiinit uutettiin. Transkriptitasot havaittiin käyttämällä kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä, ja proteiini tasot havaittiin käyttämällä Western-blottauksella. (A) tasot hemin biosynteesin normaaleissa ja NSCLC soluissa. (B) Opintosuoritusotteeseen taso hemin biosynteettisen entsyymin ALAS1 normaaleissa ja NSCLC soluissa. (C) Opintosuoritusotteeseen taso hemin biosynteettisen entsyymin ALAS2 normaaleissa ja NSCLC soluissa. (D) proteiini taso hemin biosynteettisen entsyymin ALAS1 normaaleissa ja NSCLC soluissa. Proteiini taso β-aktiini näytteissä käytettiin normalisointi. Tilastoanalyysiin tasot syövän solut pitoisuuksiin verrattuna normaaleissa soluissa, käyttämällä Welch 2 otoksen t-testiä. *, P-arvo 0,05; **, P-arvo 0,005.

Seuraavaksi mittasimme ilmentymisen taso ALAS1 (5-aminolevuliinihapposyntaasin 1), joka on nopeutta rajoittava entsyymi hemin synteesin nonerythorid soluissa, mukaan lukien keuhkojen soluihin [39]. Alussa mitattiin ALAS1 transkriptin tasot NSCLC ja normaaleissa soluissa käyttäen reaaliaikaista RT-PCR. Kuvio 1B osoittaa, että transkriptio taso nonerythroid ALAS1 geeni todellakin kasvanut syöpäsoluja. Kuten odotettua aikaisemmista tutkimuksista [[40], [41] ja sen viitteet], esto ALAS aktiivisuuden sukkinyyli asetonilla aiheutti induktio ALAS1 sekä syövän ja normaaleja soluja, vaikka laajuus induktion näytti olevan suurempi syöpäsoluja. Erytroidisiin-spesifinen ALAS2 geeni ei ajatellaan ilmentyy normaaleissa keuhkosoluissa; kuitenkin, antamat tiedot Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) ehdotti, että ALAS2 ilmentyy 16% keuhkosyöpää kudoksia. Siksi me myös mittasi ALAS2 transkriptin tasolla keuhkojen soluihin (kuvio 1 C). Todellakin, ALAS2 transkriptin tasolla nostettiin HCC4017 soluissa lähes viisinkertaiseksi. Sukkinyyli asetonia ei ole mitattavaa vaikutusta ALAS2 tasolla, odotetusti, koska ilmaus ALAS2, toisin kuin ALAS1, ei ole säännelty hemin taso [40]. Olemme edelleen vahvisti kasvua ALAS proteiinin tason syövän vs. normaaleissa soluissa. Kuviossa 1D on esitetty, että ALAS1 proteiinin taso on merkittävästi parannettu syöpäsoluissa, ja se lisää vielä sukkinyyli asetonia. Tämä vastaa aiempien tutkimusten osoittavat, että hemi voi säädellä negatiivisesti ALAS1 transkriptionaalisesti ja posttranscriptionally [40], [41]. Emme pystyneet havaitsemaan ALAS2 proteiinin, ehkä johtuu sen alhainen keuhkojen soluja. Vaikka sen transkripti taso havaitaan keuhkosyöpäsoluissa, sen taso näyttää olevan merkittävästi pienempi verrattuna ALAS1.

tasot Hemi otto Proteiinit HCP1 ja HRG1 ja Oxygen-hyödyntämällä hemoproteiineja lisääntyvät Lung Cancer Cells

edelleen selville toiminto hemin in NSCLC soluissa, vertasimme tasot kaksi hemin eläinkuljetusten HCP1 (hemi -kantajaproteiiniin 1) ja HRG1 (hemi reagoiva geeni 1) [42], [43]. Ne ilmaistaan ​​ja osallistuvat hemin oton eri polaroimatonta soluihin [43] – [46]. Olemme havainneet, että tasot HCP1 ja HRG1 oli dramaattisesti lisääntynyt HCC4017 soluissa, verrattuna normaaleihin soluihin (kuvio 2A 2B). Esto hemin synteesin sukkinyyli asetonia ei vaikuttanut merkittävästi HCP1 ja HRG1, jotka olivat yhtäpitäviä aiempien tulosten kanssa nisäkässoluissa [44].

normaali HBEC30KT keuhkojen epiteelin (HBEC) ja NSCLC HCC4017 (HCC) soluja viljeltiin ja käsiteltävä ilmoitetulla. Proteiini-uutteet valmistettiin ja tasot HCP1 ja HRG1 havaittiin Western-blottauksella. Proteiini taso β-aktiini näytteissä käytettiin normalisointi. (A) proteiini taso hemin kuljettajan HCP1 normaaleissa ja NSCLC soluissa. (B) proteiini taso hemin kuljettajan HRG1 normaaleissa ja NSCLC soluissa. Tilastoanalyysiin tasot syövän solut pitoisuuksiin verrattuna normaaleissa soluissa, käyttämällä Welch 2 otoksen t-testiä. **, P-arvo 0,005.

lisäys Hemi oton proteiinien HCP1 ja HRG1 voi tarjota lisää Hemi tuotantoa varten hemoproteiinien. Siksi havaittu tasot useiden hemoproteiinien mukana kuljettamiseen ja hyödyntämiseen happea. Cytoglobin on hemoprotein ilmaistu fibroblasteissa ja todennäköisesti helpottaa hapen kuljetusta ja käyttöä [47], [48]. Normaaleissa keuhkojen epiteelisoluissa, cytoglobin ei havaittu, mutta ekspressoitui voimakkaasti in HCC4017 soluissa (kuvio 3A). Samoin, tasot kolmen muun hemoproteiinien mukana hapen käyttö, sytokromi c, CYP1B1 ja Cox-2, oli myös merkittävästi parannettu (kuvio 3B-3D). Ilmeisesti, kun taas tasojen cytoglobin ja sytokromi c: vähenivät, kun solunsisäinen hemi tarjonta laskettiin solujen viljelemisen hemi-köyhdytettyä keskipitkällä ja käsittelemällä hemin synteesin estäjä sukkinyyli asetonia, vaikuttaa hemi tasoa, tasojen CYP1B1 ja Cox-2: eivät olleet. Tämä voi johtua eri mekanismeja sekä sääntely näiden proteiinien. Ehkä Hemi suoraan säätelee ilmentymistä cytoglobin ja sytokromi c: n, kun taas hemi-riippumaton mekanismi myötävaikuttaa kohonneeseen CYP1B1 ja Cox-2: n syöpäsoluja. Vaihtoehtoisesti, hemi voi säätelemään CYP1B1 ja Cox-2, mutta hemin sääntely pitoisuus voi olla huomattavasti pienempi kuin ekspressiota varten cytoglobin ja sytokromi c: n. Näin ollen alemman hemin tasolla sukkinyyli asetoni-käsitellyissä soluissa voi vähentää tasoja cytoglobin ja sytokromi c: n, mutta ei CYP1B1 ja Cox-2.

normaali HBEC30KT keuhkojen epiteelin (HBEC) ja NSCLC HCC4017 (HCC) soluja viljeltiin ja käsiteltiin kuten on ilmoitettu. Proteiini-uutteet valmistettiin ja tasot hemoproteiinien havaittiin Western-blottauksella. Proteiini taso β-aktiini käytettiin normalisointi. (A) proteiini taso cytoglobin normaaleissa ja NSCLC soluissa. (B) proteiini taso sytokromi c normaaleissa ja NSCLC soluissa. (C) proteiini taso CYP1B1 normaaleissa ja NSCLC soluissa. (D) proteiini taso Cox-2 normaaleissa ja NSCLC soluissa. Tilastoanalyysiin tasot syövän solut pitoisuuksiin verrattuna normaaleissa soluissa, käyttämällä Welch 2 otoksen t-testiä. *, P-arvo 0,05; **, P-arvo 0,005.

alentava vaikutus solunsisäisen hemin tarjontaa näitä proteiineja voidaan myös havaita käyttämällä immunofluoresenssivärjäyksen. Esimerkiksi kuvio 4A osoittaa, että ALAS1 osoitti mitokondrion lokalisaatio, erityisesti silloin, kun sen taso on parannettu käsitellyissä soluissa sukkinyyli asetonilla. Kun taustan fluoresenssi oli alhainen paneelissa SA (kuvio 4A), FITC fluoresenssin selvästi colocalized kanssa fluoresenssin MitoTracker, ja mitokondrioiden kuvio oli paljon selvempi. Kaava paneelissa kukaan ei ole yhtä selvä, todennäköisesti siksi, että taustan fluoresenssin aiheuttama alhaisempi ALAS1 ja taustan vasta-värjäystä. Kuvio 4B osoittaa, että sytokromi c osoitti mitokondrion lokalisaatio, mutta sen taso aleni käsitellyissä soluissa sukkinyyli asetonilla, ja sen mitokondrioiden lokalisointi heikensivät myös. Tulokset epäsuoralla immunofluoresenssilla värjäystä ovat yhdenmukaisia ​​tuloksia Western-blottauksella. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että tehostettu hemin synteesiin ja otto liittyy lisääntynyt tuotanto eri happi-hyödyntäen hemoproteiinien syöpäsoluissa.

NSCLC HCC4017 (HCC) soluja viljeltiin säännöllisesti väliaineessa (ei mitään) tai heme- köyhdytettyä alustaa, joka sisälsi 0,5 mM sukkinyyli asetonia (SA). Solut värjättiin ensin anti-ALAS1 tai anti-sytokromi-c-vasta-aineita, ja sitten FITC-konjugoitua vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta, MitoTracker sekä DAPI. FITC, MitoTracker ja DAPI loisteputki kuvat otettiin kiinni ja näkyvät täällä. Mittakaavapalkki osoittaa 10 pm.

tasot Hemi Biosynteettiset Entsyymi ALAS, Hemi otto proteiinit HCP1 ja HRG1 ja Oxygen-hyödyntämällä hemoproteiineja ovat lisääntyi useissa Human tuumoriksenografteja

Voit selvittää, onko kasvu nopeutta rajoittavaa hemi biosynteettinen entsyymi ALAS, hemin otto proteiineja, ja erilaisia ​​happea hyödyntäen hemoproteiinien esiintyy keuhkotuumoreita, arvioimme tasoa näiden proteiinien viidessä eri ihmisen tuumoriksenografteja (kuva 5). Kuvio 5A esittää, että kaikissa ksenograftikasvaimissa, The ALAS1 ekspressoitiin tasoilla verrattavissa HCC4017 soluissa, mutta huomattavasti suurempi kuin normaalissa HBEC30KT solut (katso kuvio 1 D). Samoin tasot hemin kuljettajat HCP1 (kuvio 5B) ja HRG1 (kuvio 5C) on koholla ksenograftikasvaimissa. Tasot hemin sisältävien, happea sitovia proteiineja cytoglobin (kuvio 5D) ja sytokromi P450 CYP1B1 (kuvio 5E) tehostettiin myös kasvaimia. Nämä tulokset osoittavat, että parannettu hemin synteesi, omaksumisen ja synteesi happea käyttäen hemoproteiinien esiintyä erilaisissa keuhko- solut ja kasvaimia.

Lysaatit ilmoitetusta ihmisen tuumorin ksenografteja valmistettiin, ja tasot ilmoitetaan proteiinien havaittiin Western blottauksella. Proteiini taso β-aktiini käytettiin normalisointi. (A) proteiini taso ALAS1 vuonna HCC4017 soluissa ja erilaisissa ihmisen tuumoriksenografteja. (B) proteiini taso HCP1 vuonna HCC4017 soluissa ja erilaisissa ihmisen tuumoriksenografteja. (C) proteiini taso HRG1 vuonna HCC4017 soluissa ja erilaisissa ihmisen tuumoriksenografteja. (D) proteiini taso cytoglobin vuonna HCC4017 soluissa ja erilaisissa ihmisen tuumoriksenografteja. (E) proteiini taso CYP1B1 vuonna HCC4017 soluissa ja erilaisissa ihmisen tuumoriksenografteja. Tilastoanalyysiin tasot HCC4017 soluissa ja kasvaimia pitoisuuksiin verrattuna normaaleissa soluissa, käyttämällä Welch 2 otoksen t-testiä. *, P-arvo 0,05; **, P-arvo 0,005.

vähentäminen Hemi saatavuus NSCLC Cells Edullisesti vaimentaa hapenkulutus

Lisääntynyt synteesi happea hyödyntäen hemoproteiinien todennäköisesti voivat edistää tehostetun hapenkulutus syöpä solut. Testata tätä ajatusta, tutkimme vaikutus heikentävien Hemi on hapenkulutuksen syövän ja normaali keuhkojen soluja. Olemme havainneet, että hapen kulutus NSCLC-soluihin selektiivisesti vähentää, kun soluja viljeltiin hemi-köyhdytettyä väliaineessa (katso kuvio 6, HD). Sen sijaan, hemin ehtyminen keskipitkällä ei vaikuttanut hapenkulutus normaaleissa soluissa. Esto endogeenisen hemin synteesin sukkinyyli asetonilla (HD + SA, kuva 6) edelleen vähentää hapen kulutusta syöpäsoluissa tasolle samanlainen tasolle käsitellyissä soluissa mitokondrioiden uncoupler CCCP. Sukkinyyli asetoni oli vähäisempi vaikutus normaaleihin soluihin sekä (kuvio 6). Ilmeisesti esto hemioksigenaasi, entsyymi osallistuu hemin hajoamista, jonka Tin protoporfyriini (snpp, kuva 6) ei ensisijaisesti vaikuta syöpäsoluja. Erityisesti, nämä hoidot ovat samat vaikutukset keuhkojen A549-soluja (ei esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että runsaasti tarjontaa hemin on ratkaisevan tärkeää ylläpitää hapenkulutus NSCLC soluissa eli nopeammin kuin normaalit solut. Ne viittaavat vahvasti siihen, että tehostettu hemin synteesiin ja otto tarvitaan lisääntynyt hapenkulutus NSCLC soluissa.

normaali HBEC30KT keuhkoepiteelisolujen (HBEC) ja NSCLC HCC4017 (HCC) soluja viljeltiin ja käsiteltiin normaalissa alustassa (ei mitään) , alustassa, jossa hemin köyhdytettyä (HD), alustassa, jossa hemin tyhjentynyt ja sukkinyyli asetonilla (HD + SA), ja väliaine CCCP. Solut kerättiin ja hapenkulutus hinnat havaittiin ja piirrettiin täällä. Arvot piirretty olivat keskiarvoja vähintään kolmesta kokeesta. Tilastoanalyysiin tasot syövän solut pitoisuuksiin verrattuna normaaleissa soluissa, käyttämällä Welch 2 otoksen t-testiä. *, P-arvo 0,05; **, P-arvo 0,005.

esto Hemi Synthesis ja mitokondrioiden toimintaa voimakkaasti estää NSCLC Cell Proliferation, Colony Formation ja Migration

arvioimiseksi estävä vaikutus hemin synteesin ja mitokondrioiden toimintaan on syöpäsolujen lisääntymistä ja toimintaa, tutkimme keuhkosyöpä kasvuvauhti, pesäkkeiden muodostumisen ja muuttoliike. Kuvio 7A osoittaa, että inhibitio hemin synteesin keskeytti syövän kasvu HCC4017 solujen ankarampi kuin normaali HBEC30KT solut. Samoin mitokondrioiden uncoupler CCCP keskeyttää HCC4017 solujen kasvua voimakkaammin kuin HBEC30KT solujen (kuvio 7A). Sen sijaan, inhibitio hemin hajoamista snpp ei vaikuttavat selektiivisesti HCC4017 solujen lisääntymistä. Samat vaikutukset havaittiin, kun mittasimme HCC4017 pesäkkeiden muodostumista. Kuten kuviossa 7B sekä sukkinyyli asetonia ja CCCP täysin pysähtynyt syöpäsolun pesäkkeiden muodostumista. Lisäksi hemin pitkälti päinvastaiseksi vaikutuksen eston Hemi synteesiä. Kuten odotettua, esto hemin hajoamista Tin protoporfyriini IX (snpp) eivät merkittävästi vaikuttaneet syöpäsolun pesäkkeiden muodostumista. Lisäksi tutkimme estävä vaikutus hemin biosynteesin ja sisäänotos- HCC4017 solujen vaeltamiseen. HCC4017 solumigraation oleellisesti inhiboitui väliaineessa hemin köyhdytettyä ja sukkinyyli asetonilla (kuvio 7C). Lisäksi hemin kääntää eston muuttoliikettä. Olemme myös yrittäneet tutkia vaikutusta kaatamalla hemin biosynteettisiä entsyymien keuhkosyövän soluihin käyttämällä shRNAs joita käytettiin kaataa hemin biosynteesiä HeLa-soluissa [33]. Emme kuitenkaan pystyneet saamaan klooneja, joilla on alhaisempi hemin biosynteesin, todennäköisesti koska HCC4017 solut on lisääntynyt kysyntää korkeampi hemin, alentamalla hemin biosynteesi vähentäisi niiden selviytymistä. Nämä tulokset osoittavat, että esto hemin saatavuudesta ja toiminta merkittävästi vähentää syöpäsolujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumista, ja muuttoliike.

Solut käsiteltiin sukkinyyli asetonia ylläpidetään myös Hemi-köyhdytettyä väliaineessa. (A) vähentäminen Hemi saatavuus tai mitokondrion toiminnan ensisijaisesti vähentää NSCLC syöpäsolun lisääntymistä. % Eläviä soluja laskettiin jakamalla käsiteltyjen solujen määrää käsittelemättömien solujen (ympätty sama määrä soluja). Se osoittaa suhteellisen proliferatiivinen hinnat käsiteltyjen solujen (SA tai snpp) vs. käsittelemättömät solut (Ei mitään). (B) vähentäminen Hemi saatavuus tai mitokondrion toiminnan ensisijaisesti vähentää NSCLC solujen pesäkkeiden muodostumista. (C) vähentäminen Hemi saatavuus ensisijaisesti vähentää NSCLC solujen vaeltamiseen.