Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on yksi tappavin ihmisen syövissä, koska sen myöhäinen diagnosointi sekä sen voimakas vastustus tällä hetkellä saatavilla terapeuttisia. Tunnistamaan mekanismeja, miksi PDAC reagoivat huonosti DNA: ta vaurioittavat sytotoksisia kemoterapiaa ja säteily, teimme maailmanlaajuinen kuulusteluun DNA-vaurio vaste PDAC. Huomaamme, että PDAC solut yleensä satama korkeita spontaanin DNA-vaurioita. Esto ei-homologisen End Liittyminen (NHEJ) korjaa joko farmakologisesti tai RNAi johti kertymistä DNA vaurioita, kasvun estyminen, ja lopulta apoptoosin jopa ilman ulkopuolista DNA: ta vaurioittavat aineet. Vastauksena säteilylle, PDAC soluja luottaa NHEJ polku nopeasti korjata DNA kaksinkertainen katkeamisen. Mekanistisesti kun NHEJ estetään olemassa korvaava kasvu homologinen rekombinaatio (HR). Tästä huolimatta säätelyä HR, DNA-vaurioita jatkuu ja solut ovat huomattavasti herkempiä säteilylle. Yhdessä nämä havainnot tukevat sisällyttäminen NHEJ inhibitiosta PDAC hoitomenetelmät, joko yksinään tai yhdessä DNA vahingoittamatta hoitomuotoja, kuten säteilyä.

Citation: Li YH, Wang X, Pan Y, Lee DH, Chowdhury D, Kimmelman AC (2012) esto ei-homologisen End liittyminen korjaus Heikentää Haimasyöpä kasvu ja Parantaa Radiation Response. PLoS ONE 7 (6): e39588. doi: 10,1371 /journal.pone.0039588

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 16 tammikuu 2012; Hyväksytty: 25 toukokuu 2012; Julkaistu: 18 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: ACK on tukee National Cancer Institute Grant R01CA157490, Kimmel Scholar Award, ja AACR-PanCAN Career Development Award. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: ACK on konsultti Forma Therapeutics ja Dainippon Pharma. Hän on saanut tutkimusrahoitusta Karyopharm terapeuttisia liity hankkeen ja saanut puhuva honorarium Pfizer. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) jää neljäs johtava syy syövän kuolleisuus Yhdysvalloissa [1], ja on ominaista voimakas resistenssi kemoterapiaa ja ionisoiva säteily (IR). Tämän vuoksi suurin osa potilaista periksi heidän sairautensa alle vuoden ja uusia terapeuttisia lähestymistapoja tarvitaan selvästi. Genomin epästabiilisuuden on yksi tunnusmerkkejä syövän [2], ja tämän me ja muut ovat osoittaneet, että haimasyöpä näyttää erittäin korkea perimän muutoksia [3]. Lisäksi haiman syövät ovat syvästi resistenttejä DNA vahingoittamatta hoitoja kuten solunsalpaajahoito ja säteily [4]. Kuitenkin biologinen merkitys genomista epävakaus tämän taudin ja miten tämä voi vaikuttaa vaste DNA vahingoittamatta hoitoja on suhteellisen tutkimaton.

kaksijuosteiset tauot (DSB: t), aiheuttama säteily tai muut DNA: ta vaurioittavat aineet, uskotaan kaikkein vaarallinen DNA vaurioita, jotka uhkaavat solujen eloonjäämistä. Vastauksena ionisoivaa säteilyä, DSB havaitsee MRE11-RAD50-Nbs1 kompleksin (MRN kompleksi) ja Ku70 /Ku80 komplekseja, jotka nopeasti aktivoida ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) ja DNA-PK vastaavasti [5]. Aktivointi näiden kinaasien indusoi sarjan solun tapahtumien, kuten fosforylaation solusyklin tarkistuspiste proteiineja ja aloittamisen DNA korjauksen. Histone H2AX tärkeä substraatti ATM ja DNA-PK, fosforyloituu seriinin 139 (kutsutaan γH2AX), joka muodostaa pesäkkeitä on DSB sivustojen liittyy muita korjaus- tekijöiden [6].

Kaksi suurta väyliä olemassa korjata DSB -homologous rekombinaatio (HR) ja ei-homologisen end-liittymällä (NHEJ) [7], [8]. HR-suunnattu korjaus vaatii homologisen kromosomin tai sisarkromatiinin mallina korjata DNA hifi, ja siksi se esiintyy lähinnä S- ja G2- vaiheiden solusyklin kun malli on käytettävissä. Toisin kuin HR, NHEJ korjaukset DSB ligatoimalla kaksi DNA-päät seuraavat DNA end käsittelyä. Lopussa käsittely usein johtaa menetykseen nukleotidien ja tekee NHEJ virhealtista [9]. NHEJ on aktiivinen koko solusyklin. Siksi solusyklin vaiheessa ja luonne DNA päät ovat kahden tekijöitä korjaus valintoja HR ja NHEJ [7], [10]. Lisäksi DNA-PK-aktiivisuutta itse on liitetty inhibitioon HR [11], [12]. Tärkeää on, syöpäsolut usein osoittavat poikkeavuuksia DNA-vaurioita vastaus ja puutteita DNA: n korjaukseen, joka voi korreloida muuttunut ilmentyminen korjaus proteiineja. Esimerkiksi, korkeampi ilmentyminen NHEJ proteiinien, DNA-PK ja Ku70 /80 on ilmoitettu syöpäsolulinjoissa [13], [14], [15], [16] kuitenkin DNA-vaurioita vasteen ja DNA: n korjautumista PDAC solut edelleen suhteellisen tutkimaton.

Tässä tutkimme tärkeyden DNA: n korjautumista PDAC biologian ja huomaavat PDAC solut satama kohonneet pohjapinta DNA-vaurioita. Esto NHEJ johtaa lisääntyneeseen DNA-vaurioita ja lopulta vähentynyt proliferaatio. Vastauksena NHEJ inhibition, HR ilmentymistä lisätään, mutta solut eivät pysty korjaamaan DNA-vaurioita tehokkaasti vasteena säteilyä. Tämä johtaa lisääntyneeseen säteilyherkkyydestä osoituksena vähentynyt klonogeeniset selviytymistä. Tuloksemme sotkea NHEJ esto mahdollisena terapeuttinen lähestymistapa PDAC.

Tulokset

Basal DNA-vaurioita PDAC

pyrki ymmärtää miksi PDAC ovat syvästi vastustuskykyisiä DNA vahingoittamatta hoitoja, kuten sytotoksisen kemoterapian ja sädehoidon, me sitoutui vaivaa ymmärtää DNA-vaurioita vastaus ja DNA korjaus näissä kasvaimissa. Aloitusvaiheessa, pohjapinta tasoja DNA-vaurioita tutkittiin kokoelma 18 PDAC solulinjojen sekä ei-transformoitu ikuisti ihmisen haimatiehyen solulinja (HDPE) [17] kontrollina. Western blot analyysi γH2AX, laajalti käytetty merkkiaine DNA-vaurioita, erityisesti DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t) [18], [19] tehtiin. Silmiinpistävän, enemmän kuin puolet PDAC solulinjat osoittivat kohonneet γH2AX (kuvio 1A ja 1 B), verrattuna HDPE. Sen varmistamiseksi, että kohonneet γH2AX eivät olleet pelkästään lisääntyneen veren kokonaiskolesterolia histonien, me normalisoitui tasot γH2AX kokonaismäärään H2AX valituissa solulinjoissa (tuloksia ei ole esitetty), ja osoittivat, että nämä rivit edelleen on koholla γH2AX verrattuna HDPE solut. Lisätodisteena koholla DNA-vaurioita PDAC, γH2AX immunofluoresenssilla tehtiin edustavan PDAC solulinjoissa. Nämä analyysit olivat pitkälti yhdenmukaisia ​​western blot tiedot, joissa pesäkkeitä PDAC linjat tyypillisesti korkeampi kuin HDPE (kuvio 1 C ja 1 D). Mitata suoraan DNA-vaurioita, neutraali komeetta määritykset suoritettiin arvioimaan määrä double-säikeen katkoksia perusolosuhteissa. Jälleen sopusoinnussa γH2AX data, neljä viidestä PDAC solulinjoista määritettiin osoittanut tilastollisesti suurempi hännän hetkiä kuin että HDPE (kuvio 1 E), mikä viittaa DSB. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että PDAC soluilla on usein oltava koholla pohjapinta tasoja DNA-vaurioita, jotka voivat johtaa aktivoinnin DNA-vaurion vasteen.

(A) Western blot -analyysi γH2AX on HDPE ja 18 PDAC solulinjat. Näytteitä 8988T ja Panc1 säteilytettiin 4Gy käytettiin positiivisina verrokkeina ja aktiini toimi latauskontrollina. Kokeet tehtiin vähintään kolme kertaa. (B) kvantitointi γH2AX ilmaisun densitometrisesti normalisoitiin aktiinin ilmentymistä ja esitetään suhteessa HDPE. Tiedot on esitetty kolmesta itsenäisestä kokeesta, jossa virhe kuvaaviin pylväisiin standardipoikkeamat. (C) immunof- pohjapinta γH2AX pesäkkeitä kolmessa edustaja solulinjoissa (HDPE, 8988T ja LVI). Green: γH2AX; Sininen: DAPI (ydin). Mittakaava on 10 um. Kvantifiointi suoritettiin (D) ja on esitetty prosentteina solujen, joissa on enemmän kuin 5 pesäkkeitä. Kokeet tehtiin kolme kertaa ja keskiarvoja laskettiin. Virhepylväät edustavat keskihajonta kolmesta yksittäisestä kokeesta. (E) Neutraali komeetta analyysi suoritettiin suoraan arvioida DNA kaksinkertainen säikeen katkoksia ja tiedot ilmaistiin takaosan liike (Tail hetki = hännän pituus x% DNA häntää). Kaikkien paneelit, tähdellä osoittavat tilastollisesti merkittävää kasvua verrattuna HDPE t-testillä (p≤0.05).

DNA Repair Pathways vuonna PDAC

Kaksi suurta DNA: n korjaukseen reittejä kaksinkertaisen lohkon murtuma korjaus ovat homologinen rekombinaatio (HR) ja ei-homologisen end liittymällä korjaus. HR korjaus vaatii homologisen kromosomin tai sisarkromatiinin mallina ja pääosin tapahtuu S- tai G2-vaiheen solusyklin tarkasti korjata vaurioitunut DNA [7]. NHEJ kuitenkin korjaukset DNA suoraan ligoimalla DNA-päät päättymisen jälkeen käsittely, joka usein esitetään menetys nukleotidien ja tekee NHEJ virhealtista [9]. Koska kohonnut pohjapinta tasoja DNA-vaurioita PDAC, arvioimme taitoa näiden solujen HR ja NHEJ. Mitata suhteellinen määrä HR, teimme immunofluoresenssilla ja Rad51, kriittinen HR proteiinia, joka sitoutuu yksijuosteisen DNA ulokkeita ja katalysoi prosessi DNA-juosteen vaihdon. Muodostuminen Rad51 pesäkkeitä on herkkä ja spesifinen indikaattori HR [20], [21]. Pohjapinta tasoilla Rad51 pesäkkeitä olivat alhaiset 8988T PDAC soluissa sekä HDPE soluissa (kuvio 2A). Vaikka HDPE solut osoittivat selvän kasvun Rad51 pesäkkeitä kasvavia annoksia säteilyä, 8988T solut osoittivat merkitsevästi pienempi nousu pesäkkeitä jopa 5 Gy säteilyn (kuvio 2A). Koska minimiverotasot HR nähdä tässä PDAC linjaa, me arveltu, että nämä solut voivat luottaa ensisijaisesti NHEJ korjattavaksi. Arvioida NHEJ, käytimme hyvin tunnettu lusiferaasi-pohjainen plasmidi, korjaus määritys [22], [23]. Lyhyesti, leikkaus lusiferaasi-plasmidia (pGL2) transfektoidaan soluihin ja korjaus kautta NHEJ mitataan suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus. Sekä 8988T ja Panc1 PDAC linjat osoittanut hallitsevansa NHEJ kuten on osoitettu kuviossa 2B.

(A) HR vastauksena kasvavia annoksia säteilyä (0, 2, ja 5 Gy) mitattiin Rad51 pesäkkeet muodostumista ja ilmaisi keskimääräisenä pesäkkeitä solua kohden. Pesäkkeitä lisääntyvät HDPE soluissa kasvavia annoksia säteilyä, kun taas vain vähän muuttunut 8988T soluissa. Tiedot ovat kaksi erillistä koetta suoritettiin samanlaiset peitelaseja kanssa virhejanat edustavat standardipoikkeamaa. Tähdellä osoittavat tilastollisesti merkitsevä ero t-testillä (p≤0.05). Kuvat ovat on esitetty alla. (B) NHEJ mitattuna plasmidi lusiferaasin repair -testissä. Normalisoidaan transfektiotehokkuutta ja sitten leikkaamaton lusiferaasi. Sekä Panc1 ja 8988T solujen tuntuvia NHEJ korjaus. Knockdovvn Ku80 merkittävästi vähentynyt NHEJ sisään Panc1 soluissa. Virhepylväät edustavat vakiopoikkeamat kolmen erillisen kokeen.

DNA-PK vaaditaan PDAC kasvun

Kun otetaan huomioon tulokset DSB korjaus määritykset, me seuraavaksi kysytään PDAC soluja luottaa NHEJ normaalille lisääntymistä ja kasvua. Olemme keskittyneet inhibitio DNA-PK, joka koostuu Ku70 /Ku80 heterodimeerinen proteiini ja katalyyttinen alayksikkö, DNAPKcs, ja on välttämätöntä NHEJ [24]. Käyttäen shRNAs, me tukahdutti ilmaus säätelyalayksiköt DNA-PK, Ku70 ja Ku80 in 8988T soluissa. Molemmat shRNAs tuotti vahvaa laskua ilmentymisen Ku70 tai Ku80 in 8988T soluja, jotka havaittiin qRT-PCR: Ku70 ja Ku80 ja Western blot ja Ku70 (kuvio 3A). Ehtyminen Ku70 tai Ku80 estivät merkittävästi ankkurointi riippumaton kasvu 8988T arvioimana softagar määrityksiä sekä lisääntymistä kasvukäyrä määrityksessä (kuvio 3B ja 3C). Tukahduttaminen Ku70 tai Ku80 vähensi myös kasvuvauhti kaksi ylimääräistä PDAC solulinjoista, HupT3 ja BXPC3 (kuvio 3C). Toisin kuin PDAC, ehtyminen Ku70 tai Ku80 on HDPE, MCF7 (rintasyöpä solulinja) tai H460 (a keuhkosyöpä solulinja) osoitti lisää vähäinen vaikutus proliferaatioon (kuvio 3C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että PDAC solut vaativat Ku70, Ku80 kasvua. Analysoida edelleen vaatimus NHEJ ylläpitää PDAC kasvua, farmakologisen DNA-PK-inhibiittorin, NU7026 [25], [26], käytettiin tutkittaessa osallistumista DNA-PK PDAC kasvua. NU7026 hoito vähensi kiinnittymisestä riippumattoman kasvun PDAC solujen, kun taas kasvu H460 ja MCF7 ei ollut vaikutusta edes suurimmat annokset (20 uM) (kuvio 4A). Lisäksi olemme määrittäneet herkkyydet kokoelma PDAC linjat NU7026 määrittämällä IC50 (kuvio 4C). Yli puolet linjat olivat herkkiä DNA-PK-inhibition. NU7026 myös vähentynyt klonogeenisten eloonjäämistä 8988T PDAC soluja (kuvio 4B). Yhdessä tulokset tukevat että PDAC solut luottaa NHEJ DNA korjauksen kasvuun perusolosuhteissa.

(A) tukahduttaminen Ku70 tai Ku80 ilmentymistä 8988T soluissa shRNAs havaita kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR (vasemmalla) ja western blot (oikealla). (B) Ylähavas: edustavat kuvat pehmeä agar pesäkkeiden muodostumista 8988T infektoitujen solujen joko ohjaus shRNA GFP tai kaksi erilaista shRNAs on Ku70 tai Ku80 vastaavasti. Alempi paneeli: kvantitoimiseksi pehmeä agar pesäkkeiden muodostumista 8988T solujen suhteessa shGFP tartunnan soluihin. Tulokset ovat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen ja virhepalkit edustavat standardipoikkeamaa. Kahdella tähdellä osoittavat tilastollista merkittävyyttä:

P

0,01 t-testi (C) kasvukäyrä analyysit suoritettiin arvioimaan vaikutuksen esto NHEJ mukaan Ku70 ja Ku80 knockdown päälle PDAC kasvuun. Huomaa vankka tukahduttaminen kasvun PDAC solulinjoissa (8988T, HupT3, BXPC3) ja vain vaatimattomia vaikutuksia muihin solulinjoihin (MCF7, H460 ja HDPE).

(A) Pehmeä agar määrityksissä 8988T PDAC solujen ja kasvaimen solulinjojen muiden histologialtaan (H460 ja MCF7) kasvavia annoksia DNA-PK-inhibiittorin NU7026 osoittaa annoksesta riippuva inhibitio kiinnittymisestä riippumattoman kasvun PDAC soluissa, mutta vain vähän vaikutuksia muihin solulinjoissa määritettiin. Tähdellä osoittavat tilastollisesti merkitsevä ero t-testillä (p≤0.05). (B) klonogeeninen selviytymistä 8988T käsiteltyjen solujen NU7026 osoittaa vähentynyt klonogeeniset kasvua. (C) IC50 on NU7026 poikki suurempi paneeli PDAC solulinjojen osoittavat enemmistö ovat herkkiä DNA-PK esto. Virhe pylväät edustavat standardipoikkeamat kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) NU7026 hoitoon 8988T solujen aiheuttama DNA-vaurioita ja apoptoosin mitattuna γH2AX ja halkaistut kaspaasi-3 vastaavasti. 8988T-soluja käsiteltiin NU7026 tai DMSO: ta kontrollina yhden päivän tai seitsemän vuorokautta, minkä jälkeen Western blot -analyysillä. Lisääntynyt DNA-vaurioita havaittiin varhaisessa (päivä 1) ajankohta yhä vaurioita ja lopulta apoptoosin nähnyt 7. päivänä (E) HDPE soluja verrattuna osoittavat pieneen kasvuun γH2AX ilme, mutta hyvin pieni lisäys lohkaistaan ​​kaspaasi-3.

Yksi mahdollinen lopputulos, kun vaurioitunut DNA jätetään korjaamatta, että solut lopulta apoptoosiin [27], [28]. Arvioida solun seurauksia DNA-PK-inhibition PDAC soluissa, me katsoimme merkkiaineiden DNA-vaurion ja apoptoosin jälkeen lyhyt (1 päivä) tai pitkäaikaista (7 päivää) hoidon NU7026. Itse asiassa huomasimme, että DNA-PK-inhibition yhden päivän aiheuttanut ylimääräisiä DNA-vaurioita analysoitiin γH2AX. Kuitenkin on seitsemän päivää aikapisteessä, lisääntynyt lohkaista kaspaasi-3 ilmaisu kävi ilmi osoittaa, että apoptoosin saattavat kohota NU7026 käsitellyissä soluissa, mutta ei DMSO käsitelty kontrolli soluja (kuvio 4D). Sen sijaan hoidossa HDPE solujen NU7026 osoittivat lisääntynyttä γH2AX hyvin minimaalinen halkaistut kaspaasi-3 lauseke (kuvio 4E). Siten estämällä NHEJ polku johtaa edelleen kertyminen DSB, tarkistuspiste aktivointi ja lopulta apoptoosin PDAC soluissa.

DSB korjaus PDAC jälkeen IR riippuu DNA-PK

Edelleen tutkia vaste PDAC solujen DNA-vaurioita, mittasimme korjaus kinetiikka kolme PDAC solulinjojen seuraavat IR seuraamalla γH2AX pesäkkeitä 30 min, 2, 6 ja 12 tuntia sen jälkeen, kun IR kliinisesti merkittävää annoksen 2Gy. γH2AX pesäkkeitä korkeimmillaan noin 30 minuutin kuluttua IR. Klo 12 tunnin kuluttua IR määrä γH2AX pesäkkeitä kaikissa kolmessa PDAC solua palasi perustasolle. Olemme lisäksi havainneet, että korjaus kaikkien kolmen PDAC solulinjoissa lievensi merkittävästi inhibitio DNA-PK, joka osoittaa, että korjaus DSB on PDAC soluissa on erittäin riippuvainen NHEJ (kuvio 5A). Mielenkiintoista on, että inhibitio DNA-PK oli vain vähäinen vaikutus korjaus HDPE-soluja (kuvio 5A). Me seuraavaksi tutkitaan, miten HR korjaus vaikutti estämällä NHEJ. Kuten on esitetty aikaisemmin, HR oli alhaisempi 8988T soluissa, vaikka IR verrattuna HDPE. Kuitenkin, HR oli merkittävästi lisääntynyt, kun läsnä on NU7026 in 8988T-soluissa sen jälkeen, kun IR (kuvio 5B). Huolimatta ilmeinen korvaava kasvu HR 8988T soluissa, joissa NHEJ estyy, määrä γH2AX pesäkkeitä edelleen korkea (kuvio 5A), mikä osoittaa, että tämä ei vielä ole riittävä täyden korjaus-.

(A) Korjaus kinetiikassa kolme PDAC solulinjoja (8988T, Panc1 ja BXPC3) mitattiin γH2AX värjäys eri ajankohtina sen jälkeen, kun säteily. Tiedot on esitetty pesäkkeitä numero solua kohti, normalisoitu 30 min ajan- kun pesäkkeitä muodostuminen oli maksimaalinen. Kukin solulinja käsiteltiin NU7026 (20 uM) tai DMSO. Jokaisessa rivi resoluutiota pesäkkeitä oli huomattavasti viivästynyt NU7026 hoitoon. Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin HDPE-soluissa (oikea paneeli). Huomaa, että NU7026 ei vaimenna pesäkkeitä resoluutio näissä soluissa. (B) HR kasvatetaan korvaavana vastauksena NHEJ inhibition PDAC soluissa. Rad51 pesäkkeitä muodostuminen on huomattavasti lisääntynyt, kun DNA-PK-aktiivisuuden inhiboi NU7026. Vasen paneeli: Rad51 pesäkkeitä vihreä ja tumassa sinisellä osoittama DAPI värjäys. Oikea paneeli: kvantitoimiseksi pesäkkeitä solua kohden ilmoitettu olosuhteissa. Tiedot on esitetty kahdesta itsenäisestä kokeesta, joissa virhe kuvaaviin pylväisiin keskihajonnan keskiarvon.

NHEJ esto herkistää PDAC IR-

esto NHEJ lisää DNA-vaurioita mikä alentaa kasvun ja apoptoosin in PDAC soluissa sekä tuloksia pitkittynyt DNA-vaurion läsnäollessa pesäkkeitä sädehoidon. Näin ollen, NHEJ eston voidaan olettaa tehostavat säteilyä. Sekä 8988T ja Panc1 solut osoittivat lisääntynyttä herkkyyttä IR, kun niitä käsiteltiin NU7026, kuten on esitetty vähentynyt klonogeenisten eloonjäämisen (kuvio 6A). Vastaavasti, 8988T ja Panc1 solujen Ku70 tai Ku80 pudotus olivat myös herkkiä IR (kuvio 6B). Yhdenmukainen vähentynyt klonogeenisten solujen eloonjääminen, lisääntynyt osa 8988T soluja pidätettiin G2 /M-vaiheen solusyklin, kun soluja käsiteltiin NU7026 ja IR (71,88% vs. 27,26% säteilytetyssä kontrolli) verrattuna kontrolliin käsiteltiin tai säteilytettyjä soluja (kuvio 6C).

(A) inhibitio DNA-PK NU7026 herkistää säteilylle 8988T ja Panc1. Solut maljattiin 6-kuoppalevyille kolmena kappaleena ja käsiteltiin DMSO: ssa tai NU7026 20 uM seuraavana päivänä. Solut altistettiin IR yön yli tapahtuneen käsittelyn kanssa DMSO: ssa tai NU7026. 9 päivän kuluttua solut kiinnitettiin, värjättiin ja pesäkkeet laskettiin. Elossa fraktio laskettiin käyttäen maljaustehokkuus. (B) tukahduttaminen Ku70 tai Ku80 radiosensitized PDAC solulinjoissa, 8988T ja Panc1. 8988T tai Panc1 solut infektoitiin shKu70 tai shKu80 ja shGFP käytettiin kontrollina. Määritykset suoritettiin, kuten (A). (C) Tyypillinen solusyklin jakautumista 8988T merkityillä hoitoja. 8988T-soluja käsiteltiin NU7026 tai DMSO: ssa kaksi päivää, jota seuraa IR 2Gy ja värjättiin propidiumjodidilla 24 tuntia myöhemmin. Solusyklin analysoitiin virtaussytometrialla. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja on edustava tulos.

Keskustelu

Haiman syövät ovat syvästi kestävät nykyistä hoitomuotoja, mukaan lukien ne, jotka toimivat kautta indusoimalla DNA-vaurioita, kuten erilaisten sytotoksisten chemotherapies ja säteily. Siten ymmärtäminen vastaus näiden kasvainten DNA vaurioita saattaa tarjota avain terapeuttisia oivalluksia. Työmme osoittaa, että haimasyövän solulinjoissa on usein kohonneet pohjapinta DNA-vaurioita ilman eksogeenisten vaurioittavat aineet. Vaikka tarkkaa etiologiaa lisääntyneen tyvi DNA-vaurio ei tiedetä, on houkuttelevaa spekuloida, että jatkuva perimän epävakaisuuden että nämä kasvaimet kestävät [3] voivat olla osittain vastuussa. Esimerkiksi prosessin aikana genomin monistamisen, rikkoutuminen-fuusio-silta sykliä esiintyä, joka johtaa siihen, että muodostuu jatkuva ohimenevää DSB [29]. Nämä ja muut genomista tapahtumia usein nähty PDAC, kuten kromosomitranslokaation, voivat edistää vakaan tilan DNA-vaurioita.

havainnot viittaavat siihen, että NHEJ on merkittävä polku vastaa DSB korjaus haiman syöpäsoluja kuin esto of NHEJ poistetaan nopeaa korjaamista kinetiikka. Yhdessä todisteet ehdottaa skenaario, jossa nämä kasvaimet ovat kehittäneet riippuvuus NHEJ hengissä jatkuvan genomin epästabiilisuuden ja tuloksena DNA-vaurioita, että ensues. Valinta DSB korjaukseen liittyvän reitin ja suhde HR ja NHEJ ovat suuri tieteellinen merkitys ja vaikka tarkkaa molekyylitason esiliinan reitin valinta työstetään pois, on todennäköistä, että ainakin osa korjausta valinnan sanelee solusyklin , HR voi toimia S /G2 /M [7]. Osoitamme, että HR on melko alhainen PDAC soluissa, jopa vastauksena IR. Kuitenkin on olemassa korvaava kasvu HR kun NHEJ estyy, mutta se ei riitä estämään genotoksisia tasoja DNA-vaurioita.

Lisäksi tuloksemme ovat sopusoinnussa myös hiljattain hoitomenetelmät BRCA1 ja 2 mutantti kasvaimet käyttävät PARP-inhibiittorit. Tämä ”synteettinen kuolleisuutta”, jossa kasvaimet yhdellä DNA korjaukseen liittyvä reitti, kuten HR on heikentynyt ovat herkkiä estyminen toisen korjaukseen liittyvän reitin (esim. BER), on saanut paljon huomiota [30], [31], [32]. Mukaisesti käsitteen estämällä DNA korjaukseen reittejä kuin terapeuttinen lähestymistapa, PDAC osoittavat herkkyyttä NHEJ estäjiä. Yksi mahdollinen selitys on, että kohonnut pohjapinta DNA-vaurioita palvelee hukuttaa DSB korjaus tekee niistä alttiita estoon NHEJ tai muuta DNA korjaukseen väyliä.

Lopuksi estyminen NHEJ osoittaa vahvaa synergiaa säteilyä. Tämä ei ole odottamatonta mekanistinen kannalta, mutta se voi olla kliinistä merkitystä, että taudin hoitoon. Vaikka kaukainen tauti on merkittävä kuolinsyy haimasyövän, viimeaikaiset tiedot osoittavat, että jopa 30% PDAC kuolemista johtuvat välittömästi paikallisille etenemistä [33]. Valitettavasti, leikkaus ei ole mahdollista, että suurin osa näistä potilaista, ja ainoat muut käytettävissä paikallista hoitoa, säteilyä, on tehoton useimmissa tapauksissa, myös silloin, kun yhdessä kemoterapian [34]. Siksi lisäämällä herkkyyttä näiden kasvainten säteilylle voi olla muokkaava vaikutus tässä potilasryhmässä. Itse asiassa estäjien kehittymisen DNA korjaukseen proteiineja tapahtuu nopeasti, ja monet ovat siirtymässä klinikalla osina syövän hoidossa [35]. Mekanistinen oivalluksia tunnistettu tässä tutkimuksessa, tarjoavat pakottavia molekyylitason perusteita tutkia kehittää sellaisia ​​aineina haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

ihmisen kasvainsolulinjat saatiin the American Type Culture Collection tai saksalaiseen mikro-organismien ja Cell Cultures. HDPE-solut saatiin M.S. Tsao. [17]. Soluja kasvatettiin joko DMEM tai RPMI, jota oli täydennetty 10%: kosmisen vasikan seerumia, antibiootteja ja glutamiinia. HDPE-soluja viljeltiin keratinosyyttien seerumittomassa (KSF) väliaineessa täydennettynä naudan aivolisäkeuutteella ja epidermaalinen kasvutekijä (Gibco). NU7026 (Sigma) käytettiin 20 uM, ellei toisin mainita.

Reaaliaikainen PCR

RNA eristettiin TRIzol (Invitrogen), DNaasi-käsiteltyjen ja käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen MMLV korkea suorituskyky käänteistranskriptaasi (Epicentri) seuraten valmistajan ohjeita. PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green detektointireagenssia (Applied Biosystems), joka Bio-Rad Chromo4 Thermocyclerissä. PCR-monistus suoritettiin 95 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 55 ° C 15 sekuntia ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Lopuksi sulamiskäyrä on tuotettu 55 ° C: sta 95 ° C: ssa, lukea joka 0,5 ° C. Alukkeet olivat seuraavat: Ku70, eteenpäin 5’AGTCATATTACAAAACCGAGGGC -3 ”ja kääntää 5’CCTTGGAGGCATCAACCAAAAA -3 ’Ku80 eteenpäin 5’CCTTTCTGGTGGGGATCAGTA -3” ja kääntää 5’ACCTGGTTGGATTTTGCTTTCAA -3 ”.

IC50-määritys

Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin laimentamalla toistuvasti NU7026 seuraavana päivänä 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen Cell-ainetiitteri-Glow määritystä (Promega, G7570), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. IC50 laskettiin käyttäen sigmoidal mallia käyttäen BioDataFit 1.

shRNA transfektion

pLKO.1 sisältävien plasmidien shRNA sekvenssin Ku70 ja Ku80 saatiin RNAi Consortium (sekvenssit saatavilla pyynnöstä). Lentivirus sisältävät Ku70, Ku80 ja GFP-ohjaus shRNAs valmistettiin HEK293T pakkaus- soluissa ja käytettiin infektoimaan soluja, kun läsnä oli 8 ug /ml polybreeniä (Sigma H9268). Kun puromysiiniselektion varten 2-3 päivää, solut palautettiin säännöllisesti keski- kokeita varten.

Soluproliferaatiomääritys

infektoimien solujen lentivirus sisältävät shGFP, shKu70 ja shKu80 ympättiin kolmena rinnakkaisena 24- kuoppalevyille 2500-5000 solua kuoppaa kohti. Solut kiinnitettiin 10% formaliinilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla päivänä kuten on osoitettu. Dye uutettiin 10% etikkahapolla ja proliferaatio määritettiin mittaamalla OD 595 nm: ssä. Suhteellinen proliferaatio on laskettu normalisoinnin päivänä 0.

Soft agar määrityksessä

2 ml alustaa, joka sisälsi 1% agaroosia (Nobel Agar, BD 214230) pantiin 6-kuoppalevyillä, kuten pohjakerroksen . 2 ml solususpensiota 5000 soluja alustassa, joka sisälsi 0,5% agaroosia päälle asetetaan jähmettyi pohjakerroksen. Sen jälkeen 9-14 päivää, pesäkkeet värjättiin p-iodonitrotetrazolium violetti (Sigma, 18377), laskettiin ja valokuvataan. Jos tarvitaan, NU7026 lisättiin sekä ylä- ja agar, ennen kuin ne on sijoitettu levyt. 200 ui alustaa, joka sisälsi estäjien lisättiin päälle 3 päivän välein. RNAi-kokeissa soluja siirrostettiin kahden päivän kuluttua transfektiosta.

klonogeeninen -eloonjäämiskoe

Solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 6-kuoppalevyille 100 solua /kuoppa kasvualustaan, käsiteltiin NU7026 seuraavana päivänä, ja säteillään 2, 4 ja 6 Gy. 10-14 vuorokauden inkuboinnin, solut kiinnitettiin 80% metanolia ja värjättiin 0,2% kristalliviolettia ja pesäkkeet laskettiin. Elossa jae laskettiin maljaustehokkuus.

Neutral komeetta määrityksissä

Neutral komeetta määritykset suoritettiin valmistajan ohjeiden (Trevigen). Lyhyesti, solut yhdistettiin matalassa lämpötilassa sulava agaroosia (luettelonro. 4250-050-02), ja kiinnitetään sitten CometSlide (luettelonro. 4250-200-03). Solulyysiksen jälkeen (luettelonro. 4250-050-01) ja purkautumisen DNA, solut elektroforeesi 40 minuutin ajan 21 voltin TBE-puskurissa. Levyjä kiinnitettiin etanolilla, värjätään SYBR otettua kuvaa ja AutoComet koneella (TriTek Corp). Vähäinen sadan satunnaisesti valittuja soluja kustakin näytteestä analysoitiin käyttämällä CometScore ohjelmistoa (https://autocomet.com). DNA-vaurioita määritettiin takaosan liike (tail pituus kerrottuna prosenttiosuus DNA hännän).

Western blot-analyysi

Solut pestiin PBS, laskettiin ja hajotettiin 2 x SDS-latauspuskuria . Western blot -analyysi suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Seuraavia vasta-aineita käytettiin Western: Actin (Sigma, A2066), γH2AX (Millipore, 05-636), Ku-70 vuohi (Santa Cruz, sc-1487), Phospho-Chk1 (S345) (solusignalointia, # 2348) , ja pilkotaan kaspaasi-3 (Asp175) (solusignalointia, # 9664).

immunofluoresenssivärjäyksellä

Solut kasvatetaan coverslip tai 8-kuoppaiset mikroskopia Levyjä kiinnitettiin 20 minuuttia 4% paraformaldehydillä ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100: ssa 3 min. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin yön yli 4 ° hiiren monoklonaalisia vasta-aineita γH2AX (Millipore, 05-636), tai Rad51 (Santa Cruz, sc-8349, H-92), jota seurasi vuohen anti-hiiri-IgG-FITC: tä (Santa Cruz, 1 :300) tai vuohen anti-kani-IgG-FITC (Santa Cruz, 1:300). Cell Kuvat on otettu alla Zeiss mikroskoopilla käyttäen 63x tavoite ja analysoitiin pesäkkeet /tumassa.

In vitro pGL2 plasmidissa -pohjainen NHEJ määritys

pGL2-ohjaus plasmidiin (Promega) oli täysin linearisoitiin restriktioendonukleaasilla HindIII ja linearisoitu DNA uutettiin agaroosigeelistä Gel Extraction-kittiä (Invitrogen). Rengasmainen plasmidi ja linearisoitu DNA Sitten ko-transfektoitiin PRT-RL plasmidin solujen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668). Transfektoidut solut hajotettiin ja lusiferaasiaktiivisuus Dual Luciferase Assay (Promega). Tulikärpäsen signaali normalisoitiin kuin Renila joka toimi transfektion viitteenä. Kaiken NHEJ kapasiteetti on laskettu tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus transfektoitujen solujen HindIII-hajotetun DNA: n suhteen, että koskemattoman plasmidi.

Virtaussytometria määrityksessä

Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille, käsiteltiin kanssa NU7026 seuraavana päivänä 48 tuntia, ja säteilee 2 Gy ja vahvistetaan sen jälkeen 24 tunnin jääkylmällä 70% etanolia PBS: ssä yli yön. Sentrifugoinnin jälkeen pelletit suspendoitiin uudelleen PBS: ään, värjättiin propidiumjodidilla liuosta 30 minuutin ajan ja analysoitiin virtaussytometrialla (BD FACS Calibur) pimeässä.