Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sarsaparilla, joka tunnetaan myös nimellä

Smilax Glabra

Rhizome (SGR), oli osoitettu moduloivan immuniteetti, suojaavat maksavaurio, verensokerin alentamiseksi ja tukahduttaa syöpään. Kuitenkin sen vaikutuksia syöpäsolujen tarttuvuus, muuttoliike ja invaasio olivat epäselviä. Tässä tutkimuksessa, huomasimme, että supernatantti vesiliukoisten ote SGR (SW) voisi edistää tarttumista, estävät muuttoliike ja hyökkäys HepG2, MDA-MB-231 ja T24-solujen

in vitro

, samoin kuten tukahduttaa etäpesäke MDA-MB-231-solujen

in vivo

. Tulokset F-aktiini ja vinkuliini dual värjäys osoitti parannetun fokaalisen adheesion SW-käsitellyissä soluissa. Microarray-analyysi osoitti tukahduttaminen TGF-β1 signalointi SW hoito, joka varmistettiin reaaliaikaisen RT-PCR TGF-β1 liittyvien geenien ja immuno- TGFBR1 proteiinia. SW osoitettiin myös antagonisoida TGF-β1-edistänyt solumigraation. Yhdessä tutkimuksemme paljastanut uuden antitumor funktio Sarsaparilla torjuttaessa invasiivisuus osajoukon syöpäsolujen estämällä TGF-β1 signalointi.

Citation: Hän T, Zhao C, Feng J, Wang L, Qu L, Fang K, et ai. (2015) Sarsaparilla (

Smilax Glabra

Rhizome) Pura Estää Migration ja Invasion syöpäsolujen estämällä TGF-β1 Pathway. PLoS ONE 10 (3): e0118287. doi: 10,1371 /journal.pone.0118287

Academic Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Etelä-Korea

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 12 tammikuu 2015; Julkaistu 5 maaliskuuta 2015

Copyright: © 2015 Hän et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Microarray data on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (tulonumero. GSE58201), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58201.

Rahoitus : Rahoitusta saatiin National Basic Research Program of China (2010CB529303, 2013CB910504), https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sarsaparilla, joka tunnetaan myös nimellä

Smilax Glabra

Rhizome (SGR), on luonnollinen ravintolisä laajalti elintarvike- päätöksenteossa ja terveydenhuollon, joka perustuu sen valmiudet detoxicating, clearing lämpö ja lievittää kosteus [1,2]. Jotkut SGR sisältäviä juomia, elintarvikkeita ja ravintolisät ovat ostettavissa Kaakkois-Aasiassa ja Pohjois-Amerikassa. Potilaat, joilla ihottuma, kuppa tai kihdin Kaakkois-Aasiassa ovat hyötyneet hoitoon SGR sisältävien kasviperäisten seoksia varten on pitkä historia [3,4]. Tällä hetkellä on olemassa myös kasvava tieteellisten tietojen raportoi sen terapeuttisen potentiaalin nivelreuman [5], tulehdus [6], maksavaurio [1], hyperinsulinemia [7] ja syöpä [8].

toiminnot of SGR ovat pääasiassa jaettu neljään osa, eli immuunivastetta sääteleviä, maksa ja suojaava, kasvaimia tuhoavaa ja muut. On immunomodulatorinen näkökohdassa vesiuute SGR kohdistaa merkittävä inhibitio pikryylikloridia (PCI) – tai lampaan punasoluja (SRBC) aiheuttama viivästyneen yliherkkyyden (DTH) [6,9]. SGR ensisijaisesti vaikuttaa solujen immuunivasteeseen (CIR), Efektorivaihe DTH sijaan humoraalisen immuunivasteen (HIR) voi siten antaa SGR ylivoimainen etu muihin immunosuppressoreilla hoidossa CIR-välitteisten tulehdussairauksien kuten hepatiitin ja nivelreuman [6,9 ]. Astilbin, yksi bioaktiivisten yhdisteiden eristetyn SGR, voi muuttaa

in vivo

sytokiinien profiileja lymfosyyttien ja tukahduttaa siirtyminen aktivoitujen T-solujen, mikä lievittää ketusyliherkkyyteen ja DTH [10,11]. On maksa- suojaava näkökohta, Astilbin helpottaa apoptoosia maksan infiltroivien T-lymfosyyttien ja estää soluväliaineen tarttumista pernasolujen minimoimiseksi maksavaurio [12,13]. Lisäksi se voisi parantaa maksan toimintaa käänteisessä transaminaasiarvo, alentamalla TNF-α ja vähentämällä maksatoksisuuden nonparenchymal solujen [12,14]. Taxifolin, toinen yhdiste eristettiin SGR, todettiin muuttaa rasva-aineenvaihduntaan lievittää maksan taakkaa [15,16]. Toiminta SGR myös muita biologisia toimintoja, kuten tukahduttaa Helicobacter pylori -bakteerin [17], alentaa veren glukoosin [2] ja vähentää aktiivisuutta HIV-1-integraasin [18]. Kaikki nämä löydökset viittaavat siihen monitoiminen potentiaalia SGR.

On syövän vastaisen näkökohdan, suun kautta kasviperäistä kaavan sisältävä SGR todettiin ulottaa kipua lievittävää kestävän ajan, parantaa potilaiden elämänlaatua ja pidentää pitkä- termi potilaiden selviytymiseen maksakarsinoomaa [19]. Toinen SGR sisältävä injektio havaittiin vähenevän kasvaimen kasvun suhteellisen suurina annoksina hiirillä malleissa [20]. Otteita SGR havaittiin edistää apoptoosin paksu- ja peräsuolisyövän HT-29, ihmisen maksan syöpä HepG2 ja HepG3 solut [8,21]. On olemassa myös useita vihjeitä osoittaa mahdollisia rooleja SGR säätelyssä soluadheesion ja muuttoliike. Astilbin voi estää tarttumista pernasolujen soluväliaineen maksan loukkaantunut hiirimalleissa [14], ja estää solujen välistä adheesiota välillä ihmisen Jurkat-T-solujen ja ECV-304-soluja [13]. Lisäksi 5-O-caffeoylshikimic happo, taxifolin ja astilbin alkaen SGR esti migraation ja adheesion makrofagien [22]. Kuitenkin suora rooli SGR uutteen syöpäsolun invasiivisuus on epäselvä ja mekanistinen perusta puuttuu. Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme vaikutuksia supernatantin vesiliukoisten uute SGR (SW) on tarttuvuus, muuttoliike ja hyökkäys kolme syöpäsolun riviä, ja tutki mahdollinen mekanismi.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

eläinten tutkimus hyväksyi Biomedical eettisen lautakunnan Pekingin yliopisto Cancer Hospital Instituutti ja suoritetava perustettu institutionaalisten eläinten hyvinvoinnin suuntaviivat yhtäpitävä Yhdysvaltain suuntaviivojen (NIH julkaisu # 85-23, tarkistettu vuonna 1985).

Materiaalit

matrigeelin hankittiin BD Biosciences (San Jose, CA). Vasta-aineita vinkuliini ja TGFBRI ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ja Bioworld (Peking, Kiina) vastaavasti. TGF-β1 oli Sigma-Aldrich.

valmistaminen SGR ote

SGR saatiin Ben Cao Fang Yuan Pharmaceutical Co. (Peking, Kiina). Menettelyt valmistelua supernatantin vesiliukoisten ote SGR (SW) on kuvattu aiemmin [23]. Saanto prosenttiosuus SW oli 7,27% (g /g). Liuotin valmistamiseksi SW (kantaliuos) oli 3% DMSO: ta PBS: ssä, ja DMSO työliuoksessa SW oli pienempi kuin 0,15% (v /v).

Soluviljely

HepG2, MDA-MB-231 ja T24-solut saatiin ATCC: ltä (Rockville, MD) ja viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Kaikki reagenssit kulttuurin saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA).

Soluadheesioanalyysi

Solut istutettiin 6 cm: n maljoihin ja viljellään RPMI 1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS ). Matrigel oli laimennettu 1: 100 seerumittomalla RPMI 1640 väliaineessa ja lisättiin 96-kuoppaiselle levylle, jotta päällystämiseen yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin trypsiinillä ja otettiin talteen seerumittomassa väliaineessa, johon oli lisätty ilmoitettu annoksilla SW. Sen jälkeen, kun lääkeaine-esikäsittely 15 min ajan (ja T24-solut) tai 30 min (MDA-MB-231 ja HepG2-soluissa), Sitten solususpensio täydennetty 0,5% FBS: ää, ennen kuin se ympättiin matrigeeliä esipäällystetty 96-kuoppalevyille tiheys 2 x 10

4 kuoppaa kohden, ja annettiin kiinnittyä 2 h. Poistamisen jälkeen tarttumattomat solut PBS, kiinnittyneet solut valokuvattiin kanssa CloneSelect Imager-järjestelmän (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Yhdeksän mikroskooppikentäs- kunkin hyvin sattumanvaraisesti kiinni ja solut laskettiin käyttäen Image Pro Plus ohjelmisto.

TranswellTM muuttoliike /invaasiomääritys

migraatiokokeessa, soluja ympättiin 10 cm ruokia. Seuraavana päivänä solut otettiin talteen seerumittomassa väliaineessa ja jaettuna kolmeen yhtä suureen osaan. Sen jälkeen kun kukin osa on täydennetty ilmoitetuilla annoksilla SW, puoli solususpensiota lisättiin ylempään kaivoon transwell-insertin (Corning Inc, Corning, NY) tiheydellä 1 x 10

4 (T24 ja HepG2-soluissa ) tai 5 x 10

3 (MDA-MB-231 solua) kuoppaa kohti. Alempi hyvin lisättiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: ia, kuten kemotaktinen attractors. Jäljellä oleva puoli solususpensiota kylvettiin sitten 96-kuoppalevyille elinkelpoisuuden määrityksessä. 12 tunnin kuluttua n inkuboinnin, solut, jotka ovat tunkeutuneet alapuolen transwell kalvo värjättiin kristallivioletilla ja valokuvattiin mikroskoopin alla. 14 mikroskooppikentäs- olivat satunnaisesti kiinni ja laskettiin. Vaikutuksen arvioimiseksi TGF-β1 on solumigraatio, solut nälässä RPMI 1640, joka sisälsi 0,5% FBS: ää 24 tunnin ajan ja kerättiin sitten trypsinoimalla. Solususpensiota jakautuu neljään yhtä suureen osaan ja kukin osa on täydennetty liuottimella, 5 ng /ml TGF-β1, 1,5 ug /ul SW tai SW ja TGF-β1. Kun on lisätty puolet lääkeainetta sisältävän solususpensiota ylempään kaivoon transwell-insertin, jäljellä solususpensiota lisättiin 96-kuoppaisille levyille. Molemmat levyjä inkuboitiin 12 tuntia. Transvvell- levyjä käytettiin migraatiokokeessa ja 96-kuoppaisille levyille solunelinkykyisyysmääritys. Sillä invaasiomääritys, kerros Matrigel (1: 4 laimennos seerumivapaassa väliaineessa) oli ennalta päällystetty ylempään kaivoon transwell-insertin ennen solujen lisäämistä, ja soluja inkuboitiin 36 tunnin ajan, ennen kuin kristalliviolettia värjäystä. Loput menettelyt olivat samat kuin migraatiokokeessa.

Solun haavan paranemista määritys

Kaksi rinnakkaista vedettiin takana puolella 12-kuoppaisilla levyillä tussilla ennen solun kylvö. Seuraavana päivänä elatusaine poistettiin ja korvattiin 0,5% FBS /RPMI 1640-väliaine. 24 tuntia myöhemmin, suora haava viiva, joka oli kohtisuorassa näitä samansuuntaisesti vedettiin poikki kiinnitetty solukerros pipetinkärjet. Siksi haava kuilu kaksi rinnakkaista oli merkitty. Poistamisen jälkeen kelluva solut PBS: llä, osoitti annosta SW lisättiin kuhunkin kuoppaan. Kuvia otettiin merkittyjen kuilu välein 6-8 tunnin kunnes haava umpeen. Haava aukot digitaalisesti kvantitoitiin käyttäen Image Pro Plus ohjelmisto.

Eläinmallijärjestelmiä

7 8 viikon ikäisiä Balb /c-nude-hiiriin (Vital River Laboratories, Peking, Kiina) olivat pistetään häntälaskimoon 1 x 10

6 MDA-MB-231-soluja. Seuraavana päivänä hiiret (n = 8 kussakin ryhmässä) annettiin suun kautta hallinnoitava 72,7 mg SW (valmistettu PBS: ään, on yhtä suuri kuin 1 g SGR) tai PBS: ää per päivä. Kahden viikon kuluttua hiiriä pidettiin toiset 3 viikkoa ennen uhrataan keuhkojen ja maksan kokoelma. Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 ja kertamuutosta kynnyksen 1.5 tunnistettiin olevan tilastollisesti merkittäviä muutoksia. Kegg, GO ja Gene Kortit (https://www.genecards.org/) käytettiin valitsemaan pois geenien liittyi soluadheesion, muuttoliike ja hyökkäystä. Seuraavaksi nämä geenit laitettiin STRING tietokantaan signalointireittiin etsimistä. Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin tulosten validointiin microarray ja suoritettiin valmistajan ohjeiden (SYBR, TOYOBO). Ekspressiotasot kaikkien geenien normalisoitiin läpi

GAPDH

geenin ja 2

-ΔΔCT menetelmää käytettiin laskettaessa suhteessa geenin ilmentymisen. Alukkeet reaaliaikaisen RT-PCR (

TGFBR1

, eteenpäin, 5′-CCTGGGATTTATAGCAGCAGAC-3 ’, kääntää, 5′-TGACACCAACCAGAGCTGAG-3’;

NTS

, eteenpäin, 5 ’ -ATTAGTAAAGCACATGTTCC-3 ’, kääntää, 5′-CTCCCAGTGTTGAAAAGCCC-3’;

ID1

, eteenpäin, 5′-GAGCTGAACTCGGAATCCGAAG-3 ’, kääntää, 5′-GATCGTCCGCAGGAACGCATGC-3’;

ID2

, eteenpäin, 5′-TCAGCCTGCATCACCAGAGA-3 ’, kääntää, 5′-CTGCAAGGACAGGATGCTGATA-3’;

ID3

, eteenpäin, 5′-CTGAGCTTGCTGGACGACA-3 ’, kääntää, 5′-ATGTAGTCGATGACGCGCTGTA-3’) syntetisoitiin GenePharma (Shanghai, Kiina).

tilastollinen

Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). Kaksisuuntainen t-testiä ja ANOVA käytettiin määrittämään merkitystä erot eri koeryhmään.

Tulokset

SW parantaa soluadheesiota

testaamiseksi vaikutuksen SW syöpäsolujen kykyä sitoutua soluväliaineen, teimme soluadheesioanalyysissä käyttämällä hepatoomasolulinjaan HepG2 (Fig. 1A), rintasyövän solulinjan MDA-MB-231 (Fig. 1 B) ja virtsarakon syövän solulinja T24 (kuvio. 1C). Havaittiin, että adheesio HepG2-solujen matrigeeliä lisättiin 0,7 ug /ul SW (Fig. 1A), kun taas vaikutus saman pitoisuuden SW tarttumiseen MDA-MB-231-soluja oli vähäinen (Fig. 1 B) . Päinvastoin, kasvu adheesio oli selvempää T24-soluissa ja korkein tarttumista saavutettiin niinkin alhainen kuin 0,07 ug /ul SW (Fig. 1 C).

Vasen paneeli: HepG2 (A), MDA-MB-231 (B) ja T24-solujen (C) kanssa, esikäsiteltiin ilmoitetuilla annoksilla SW 15 tai 30 minuuttia ennen kylvö suoraan Matrigel-päällystettyihin kuoppiin, ja 2 tuntia myöhemmin, noudatetaan solut laskettiin poistamisen jälkeen kelluva solut PBS: llä. Kuvat ovat näkyivät. Mittakaava, 200 um. Oikea paneelit: kvantifiointi tietojen vasemmassa reunassa, näkyy olivat komposiitti tulokset kolmesta itsenäisesti kokeiluja kolmena kappaleena. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD.

SW estää syöpäsolun muuttoliike

Seuraavaksi suoritetaan

in vitro

tyhjästä määritys. Soluja esi-inkuboitiin 0,5% FBS: ia 24 tuntia ennen käyttöönottoa tyhjästä jotta estetään vaikutus FBS soluproliferaatioon. Haavanparantamislaite seurattiin säännöllisesti kunnes se suljettu. Havaitsimme, että SW johti hidastumisesta muuttoliikkeen HepG2, MDA-MB-231 ja T24-soluissa (kuvio. 2A, B ja C), MDA-MB-231-solujen osoittaa ilmeisin estävä vaikutus (Fig. 2B ). Huomasimme, että se vaatii eri aika eri solulinjojen haavojen parantumiseen. Lisäksi saman pitoisuuden SW näytteillä erillisten esto haavan paranemiseen eri solulinjoissa. Tämä voi selittyä solu linage spesifisyyttä muuttoliikettä. Ottaen huomioon karheus ja subjektiivisuus tyhjästä määrityksen, myös käytetty siirtokuoppaan migraatiokokeessa. Solut, jotka onnistuivat tunkeutua mikro-reiät pohjan kalvo SW-hoidetussa ryhmässä oli selvästi vähemmän kuin verrokkiryhmässä (Fig. 3A, B ja C, vasen ja keskimmäinen paneeli), joilla on vain vähän vaikutusta solujen elinkelpoisuuden (Fig. 3A, B ja C, oikea paneeli). Nämä tulokset viittasivat estovaikutuksen SW syöpään solujen vaeltamiseen.

In vitro

naarmu määritystä käytettiin vaikutuksen arvioimiseksi SW siirtyvien HepG2 (A), MDA-MB -231 (B) ja T24-solujen (C). Kuvat ovat näkyivät vasemmassa paneelissa; kvantifiointi tietojen vasen paneeli näkyy oikeassa paneelissa, esitetään olivat komposiitti tulokset kolmesta itsenäisesti kokeiluja kolmena rinnakkaista näytettä. Siirtyminen indeksi kuvaa muuttoliikkeen nopeus suhteessa kontrolliryhmään. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD.

HepG2 (A), T24 (B) ja MDA-MB-231 (C) solut ympättiin Transvvell- insertin läsnä ollessa ilmoitettu annoksia SW 12 tuntia. Solut pohjan saavuttamista puolella transwell kalvon värjättiin ja edustavat kuvat olivat esillä ylemmässä paneelissa. Mittakaava, 200 um. Tiedot vasemman paneelin kvantitoitiin ja keskellä näkyy paneelissa, ja solujen elinkyky näkyi soluun yhtymäkohta kurssi oikeassa paneelissa. Näkyy olivat komposiitti tulokset kahdesta itsenäisesti kokeiluja. Pylväät, keskiarvo; baaria, SD; NS, ei tilastollisesti merkitsevä.

SW estää syöpäsolujen invaasiota

in vitro

ja etäpesäkkeiden

in vivo

Testasimme myös vaikutusta SW syöpäsoluinvaasiota. Silti käytimme samoja siirtokuoppaan laite plus lastaus kerros Matrigel pohjan päälle kalvo. Kuten odotettua, SW hoito esti kaikki kolme solulinjat tunkeutuvat koko matrigeeliä päästä alapuolen pohjan kalvon (Fig. 4A, yläpaneeli ja vasen alapaneeli). Lisäksi 36 h altistus ilmoitetaan annosten SW kohdistuvan merkityksettömiä Solujen proliferaation estyminen (Fig. 4A, alempi oikea paneeli). Edelleen vaikutuksen arvioimiseksi SW etäpesäkkeitä

in vivo

, MDA-MB-231 metastasoitunut hiirten mallilla. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, suun kautta SW 2 viikkoa merkittävästi vähensi keuhkojen metastaasipesäkkeiden. Ei maksa metastaasipesäkkeiden havaittiin molemmissa ryhmissä (S1 kuvio.).

(A) Transwell kammiot esipinnoitettiin 60 ui matrigeeliä laimennus (1: 4 seerumivapaassa väliaineessa) ennen kylvö soluja. Soluja inkuboitiin ilmoitetuilla annoksilla SW 36 tuntia ennen värjäystä. Kuvat ovat näkyivät yläpaneeli. Mittakaava, 200 um. Data kulkeutumista ja solujen elinkelpoisuus kvantitoitiin ja esitetty vastaavasti alemman levyn, näytetään olivat komposiitti tulokset kahdesta itsenäisesti kokeiluja kolmena kappaleena. Pylväät, keskiarvo; baaria, SD; NS, ei ole tilastollisesti merkitsevä. (B) Vasen paneeli: edustaja kuvaa H 10 MDA-MB-231 syövän solut tunnistettiin metastaasipesäkkeiden. Suurennos, 4 × (ylempi) ja 20 x (alempi). Oikea paneeli: kvantifiointi keuhko metastaasipesäkkeiden PBS: llä ja SW-käsiteltyihin hiiriin (n = 8 kussakin ryhmässä). Pylväät, keskiarvo; baareja, SD.

SW lisää fokaalisen adheesion

Kerrottiin, että määrä ja koko paikallisia tarttumista oli kääntäen verrannollinen muuttonopeus [24]. Tämän teimme kaksi fluoresenssivärjäys F-aktiini ja vinkuliini vaikutuksen arvioimiseksi, jos mikään, SGR on fokaalisen adheesion [20,24,25]. Altistuksen jälkeen SW: ssa 0,5 tuntia, HepG2 ja T24-solujen alkoi esiintyä voimakkaampi vinkuliinin signaalin pääasiassa solun ympärille kehän, näytetään fascicle kaltainen tai spot-muotoon (Fig. 5A). Vastaavasti suuri stressi kuidut poikki solun elin menetettiin, F-aktiini kuituja vähitellen siirtymässä solun kehälle ja yhteistyötä paikallistamisen siellä vinkuliini samoin. Kvantitoimme alueet ja fluoresoiva intensiteetti tarttuvuuden sivustoja. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, tarttuvuus alueen solua kohti koholla 0,5 tuntia ja saavutti tasanteen 1 h SW-käsiteltyjen HepG2-soluissa, kun se on jo saavuttanut huippunsa 0,5 tunnin kuluttua SW hoidon T24-soluissa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin intensiteetti kvantifiointi (Fig. 5C).

(A) HepG2 ja T24-soluja käsiteltiin SW (3,5 ug /ul) ja osoitetun kertaa ja sitten immuno-värjättiin F-aktiini (FITC -falloidiini) ja vinkuliini (punainen). Tumat vastavärjättiin mukaan DAPI (sininen). Kuvat ovat näkyivät. Mittakaava, 100 pm. (B) alue tarttuvuus sivustoja solua kohden (jossa F-aktiini ja vinkuliini yhdistyivät). Näkyy olivat komposiitti tulokset kahdesta itsenäisesti kokeiluja (n = 50 solua). Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. (C) fluoresenssin intensiteetti vinkuliini tarttuvuus laastaria solua kohti. Näkyy olivat komposiitti tulokset kahdesta itsenäisesti kokeiluja (n = 50 solua). Pylväät, keskiarvo; baareja, SD.

SW antagonisoivat TGF-β1 aiheuttama ylössäätöä liittyvien geenien invasiivisuus

Saat syvempää ymmärrystä mahdollinen mekanismi taustalla kaikki nämä tulokset, teimme geeniekspressiovektoria mikrosiruanalyysi SW-käsiteltyjen HepG2-soluissa. Löysimme oli 118 geenejä on yli 1,5-kertainen ekspression muutos soluissa käsitelty SW, jotkut niistä liittyy solun liikkuvuus, aineenvaihduntaa, ja oksidatiivisen stressin (Fig. 6A). Seuraavaksi analysoimme osajoukko liittyvien geenien solujen invasiivisuus käyttämällä STRING tietokantaa. Kuten on esitetty kuviossa. 6B, useimmat näistä 12 geenit suoraan tai epäsuorasti säätelee TGF-β1 polku, mikä osoittaa, että TGF-β1 reitin saattaa olla mukana SW-säännelty fenotyyppejä. Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin arvioitiin ekspressiotasoja 5 geenien, eli

TGFBR1

,

NTS

,

ID1

,

ID2

, ja

ID3

HepG2 ja T24 soluja käsiteltiin TGF-β1 tai ilman SW. SW yksin alentuneet

NTS

,

ID1

,

ID2

, ja

ID3

HepG2-soluissa ja

TGFBR1

,

NTS

,

ID1

, ja

ID2

in T24-soluissa. Toisaalta, TGF-β1 merkittävästi kohonnut mRNA-tasot näiden geenien molemmissa solulinjoissa (Fig. 6C), mikä vahvistaa, että nämä geenit ovat alavirtaan TGF-β1 signalointia. Kuitenkin suurin osa TGF-β1 aiheuttama lisäys geenien ilmentyminen oli torjua samanaikainen hoito SW, paitsi

ID1

HepG2-soluissa (kuvio. 6C). Lisäksi havaitsimme säädelty proteiini tasoilla TGFBR1 TGF-β1-käsiteltyjen HepG2 ja T24-solujen, joka purettiin SW (Fig. 6D). Edelleen vahvistavat estävää vaikutusta SW on TGF-β1 signalointi, arvioimme vaikutus SW on TGF-β1 muuttoliikkeelle. Kuten on esitetty kuviossa. 7, TGF-β1-edistänyt muuttoliike oli merkittävästi kumottu SW HepG2, MDA-MB-231 ja T24 soluja, kun taas solujen elinkelpoisuus oli vaikuttanut SW (Fig. 7A, B ja C).

(A ) lämpö kartta funktionaalisten rikastaminen differentialy ilmaisi geenien HepG2 siru tuloksen. Cluster 3.0 ja TreeView ohjelmistoa käytettiin muodostaen lämpöä, kartan. Red: ylössäätöä versus tarkoittaa; vihreä: alassäätöä versus tarkoittaa. (B) Sääntely verkko joukossa liittyvistä geeneistä tarttuvuus, muuttoliikettä ja invaasiota in (A) käyttäen STRING tietokantaa. (C) Reaaliaikainen RT-PCR todentaminen geenien HepG2 ja T24 soluja käsiteltiin TGF-β1 tai ilman SW. Näkyy olivat komposiitti tulokset kolmesta itsenäisesti kokeiluja kolmena kappaleena. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. (D) vaikutus SW on TGF-β1 aiheuttama säätely ylöspäin TGFBR1 arvioitiin immunoblottauksella. Esitetty olivat edustavia tuloksia 3 erilliselle kokeelle.

HepG2 (A), MDA-MB-231 (B) ja T24 (C) solut ympättiin Transwell-irto läsnä TGF-β1 plus SW. 12 tuntia myöhemmin, solut värjättiin ja kuvassa. Kuvat ovat näkyivät vasemmassa paneelissa. Mittakaava, 100 pm. Aineisto muuttoliikkeen kvantitoitiin ja keskellä näkyy paneelissa. Solun elinkelpoisuus näkyi soluun yhtymäkohta kurssi oikeassa paneelissa. Näkyy oli yhdistetty tulokset kahdesta itsenäisesti kokeiluja kolmena kappaleena. Pylväät, keskiarvo; baaria, SD; NS, ei ole tilastollisesti merkitsevä.

Keskustelu

SGR, joka tunnetaan myös nimellä Sarsaparilla, on ilmoitettu osoittavan syöpälääkkeiden mahdollisia [8,21]. Useita SGR sisältäviä kasviperäisiä kaavoja käytetään Kaakkois-Aasiassa oli varmuudella estää syövän

in vitro

ja

in vivo

[20,26]. Suurin osa aiemmista tutkimuksista keskittyi estävää vaikutusta SGR on syöpäsolujen kasvua, ja vain muutama arvioitiin sen vaikutus invasiivisuus syöpäsoluja. SGR sisältävä kasviperäisten kaava todettiin tukahduttaa keuhkosyövän etäpesäke [27]. Yhdisteet eristettiin SGR, eli 5-O-caffeoylshikimic happo, taxifolin ja astilbin, osoitettiin olevan inhibitorinen vaikutus adheesiota ja /tai migraatiota immuunijärjestelmän soluihin [22]. Aiemmissa tutkimuksessa löysimme solujen kasvun estäminen SGR oli suhteellisen pitkäaikainen vaikutus ( 24 h) alla suuria annoksia [21]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme, ensimmäistä kertaa, on raportoitu estävän vaikutuksen SGR uutteen invasiivisuus kolmen syöpäsoluja, todennäköisesti läpi tukahduttaminen TGF-β1 kautta. On syytä mainita, että kaikki

in vitro

kokeet suoritettiin pienillä annoksilla SW lyhyen aikavälin minimoida bias johtui SW aiheuttama kasvun estäminen.

Focal tartunta on perusrakenne moduliyksikköön soluadheesion, mahdolliset muutokset sen rakenteessa tai koostumuksessa saattavat vaikuttaa tartuntalujuus solujen koko [24,25]. Muodostuminen fokaalisen adheesion menee läpi useita vaiheita, kuten orastava tarttuvuus, polttoväli monimutkainen ja sitten fokaalisen adheesion [25]. Koko ja kypsyys paikallisia tarttumista raportoitiin olevan käänteisesti verrannollisia solujen vaeltamiseen nopeudella [24]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme asteittainen siirtyminen tarttumista laastareita solusta kehon solujen reuna-alueen SW-käsiteltyjen HepG2 ja T24-solujen, vahvempi vinkuliini signaali ja suurempi tarttuvuus koko solun cortex. Tämä ilmiö oli, ainakin osittain, koska tilaa ja paikka- suunnatun siirtymä tarttuvuusongelmat proteiineja, erityisesti T24-soluissa. Mielenkiintoista, SW aiheuttama suuri ja vakaa reuna-kiinnikkeistä muistuttivat fokaalisen adheesion kinaasi (FAK) vajausta soluihin [25,28]. Lisäksi soluja, joista puuttuu joko tyrosiinifosfataasien kuten SHP-2 tai Src kinaaseja myös näytteillä samanlainen tarttuvuus kuvio [24,29]. Siksi arvonalentuminen FAK-Src-reitin voi välittää tämän SW aiheuttama vaikutus, joka vaatii lisätutkimuksia.

Siru tuloksista osoitti tukahduttaminen TGF-β1 signalointi SW-käsitellyissä soluissa. Geenit myös

HMOX1

[30,31],

PSAT1

[32],

TGFBR1

[33],

EDNRA

[34,35],

NTS

[36,37],

ID1

[38,39],

ID2

[40,41] ja

ID3

[42,43 ], kaikki liittyvät soluadheesion, muuttoliike ja invaasio, oli joko suoraan tai epäsuorasti säätelee TGF-β1 signalointireittiin. Inaktivointi TGFBR1 n kinaasidomeenin voisi estää TGF-β1 signalointi etenemästä alas [33]. Samaan aikaan kumota TGF-β1 signalointi käyttäen vallitsevaa negatiivista TGFBR voisi estää epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) kytkin

in vivo

[44], mikä viittaa siihen, että tukahduttaminen TGFBR voisi tarjota toteuttamiskelpoisia keinoja tukahduttaa TGF-β1 signalointi . Esillä olevassa tutkimuksessa, TGF-β1 aiheuttama TGFBR1 heikensi SW. Lisäksi SW kumottu TGF-β1 aiheuttaman vauhtia muuttoliike, mikä vahvistaa estävä vaikutus SW on TGF-β1-reitin.

On syytä mainita, että TGF-β1 signalointi havaittiin lisäävän soluadheesion ja edistää fokaalisen adheesion [45], siis SW aiheuttama soluadheesiota ja polttovälin tarttuvuus voi tukeutua erillisiä järjestelmiä. Tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että SW-esti syöpäsolun invasiivisuudesta voisi olla integroitu vaikutuksia useiden signalointi tapahtumia. Muita reittejä myös ennustettu vaikuttavan SW mikrosiruanalyysi, kuten aineenvaihdunta ja oksidatiivisen stressin. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat panosta vapautetuilla aineenvaihduntaa ja oksidatiivisen stressin syöpäsolu invasiivisuus [46,47]. Olipa SW voisivat hyödyntää näitä reittejä säännellä syöpäsolu invasiivisuus ansaitsevat lisätutkimuksia.

Yhdessä löysimme SGR voitaisiin edistää soluadheesiota mahdollisesti lisäämällä koko ja vahvuus paikallisia tarttumista, ja estävät muuttoliike ja hyökkäys HepG2, MDA -MB-231 ja T24 soluja. Tukahduttaminen TGF-β1 signalointi osittain myötävaikuttaa SW aiheuttamaa kulkeutumistestis-. Vaikka nämä tulokset saatiin osajoukko syöpäsolun linjat, uuden syövän vastaisen toiminta SGR voi antaa mahdollisen molekyylitason perustan sen tulevan kliiniseen käyttöön syövän hoidossa.

tukeminen Information

S1 Kuva. Ei metastaasipesäkkeiden havaittu maksasta hiirillä.

Edustaja kuvaa H & E värjättyä maksakudoksissa PBS: llä ja SW-käsitellyssä ryhmässä. Parafinoidut maksat leikattiin 30 mm: n välein ja ˃10 MDA-MB-231 syövän solut tunnistettiin metastaasipesäkkeiden. Mittakaava, 200 mm, suurennus, × 10.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0118287.s001

(TIF) B