Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA ovat endogeenisia lyhytketjuisia nukleotidin RNA: ita, jotka säätelevät geenien toiminnan suoraan sitoutumisesta kohde- mRNA: iden. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutuksia mikroRNA-206 (miR-206) on mahasyövän. miR-206 oli ensimmäinen vahvistettiin vaimentua mahasyövän yksilöitä. Toisaalta, ylössäätely c-Met: vahvistettiin kudosnäytteistä ihmisen mahasyövän, jossa sen taso korreloi käänteisesti miR-206 ilmentymistä. Esittely miR-206 esti solujen lisääntymistä indusoimalla G1 solusyklin pysähtymiseen, sekä muuttoliike ja invaasiota. Lisäksi tärkeitä proliferaation ja /tai muuttoliikkeeseen liittyvät molekyylit, kuten c-Met: n, CDK4, p-Rb, p-Akt ja p-ERK varmistettiin vaimentua Western blot -analyysillä. Kohdistaminen c-Met myös vaikuttanut suoraan AGS solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion.

In vivo

, miR-206 ilmentäviä tuumorisoluja myös näkyvissä kasvun viivästyminen verrattuna ennallaan syöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat, että miR-206 tukahdutetaan c-Met: ilmentymistä mahasyövän ja voisi toimia tehokkaana tuumorisuppressori c-Met: yli-ilmentävät kasvaimet. Esto miR-206 toiminto voitaisiin edistää poikkeavan solun proliferaatio ja migraatio, joka johtaa mahalaukun syövän kehitystä.

Citation: Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) MicroRNA-206: Tehokas esto mahasyövän Progression läpi c-Met Pathway. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10,1371 /journal.pone.0128751

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu 4 helmikuuta 2015 Hyväksytty: 01 toukokuu 2015; Julkaistu: 17 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Zheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki osittain National Natural Science Foundation of China Grant 81100671 (DY), Zhejiangin maakunnan Natural Science Foundation of China Grant Y2110609 ( DY), ja Wenzhou Science Teknologia Bureau Grant Y20080096 (DY). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman maailmassa [1]. Sen sairastuvuus ja kuolleisuus on erityisen korostunut Aasian maissa johtuu monista seikoista [1]. Koska sen muoto liittyy usein pitkälle edennyt tauti, on kiireellinen tarve kehitys sen havaitseminen ja lopulta sen johtamisesta. Tällä hetkellä ymmärtäminen MikroRNA (miRNA) vaikuttamista mahasyövän muodostuminen tapahtuvat nopeasti.

Koska ensimmäinen kuvaus miRNA vuonna sukkulamato

C

.

elegans

jo vuonna 1993, että niillä on vaikutusta pienet ei-koodaavat RNA: t on ylittänyt useita oksia molekyylibiologian [2]. MiRNA ovat erittäin kudosspesifisiä biomarkkereita kanssa mahdollisesti muuttuu ja muuttaa asukas kudos. Koska yli-ilmentymisen ja ali-ilmentyminen on molemmat liittynyt kasvaimen kehittymisen [3], roolissaan onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille ovat molemmat vakiintunut [4, 5]. Viime vuosien, niiden vaikutus kehitykseen ja havaitsemiseen kiinteiden elinten kasvainten kuten mahasyövän onkin vähitellen selvitetty. On olemassa jo useita miRNA yksilöity mahasyövän antiapoptoottinen mekanismi kuten miR-21 ja miR-148a [6, 7]. Muita reittejä vaikutteita miRNA kuuluvat solusyklin etenemisen koostuu miR-222/221, miR-106b /93/25 ja miR-24 [6, 7].

Yksi muita lupaavia uusia miRNA kiinteiden organ kasvaimia sisältää miR-206 [8]. Tämä erityisesti miRNA kuuluu ryhmään ”myomiRs”, joka on mukana luuston lihasten kehittämiseen [9]. Kun on yhdistetty lukuisiin muihin sairauksiin, kuten sydänsairaus, krooninen ahtauttava keuhkosairaus ja Alzheimerin tauti, sen rooli syövän synnyssä sai valvontaa viime aikoina, kuten rabdomyosarkooma, keuhkosyöpä, kolorektaalisyöpä, schwannooma, ja mahasyövän [8, 9]. Vaikka kohonnut muutaman syöpätyyppien kuten munasarjojen ja Waldenströmin makroglobulinemia, miR-206 on enimmäkseen vaimentaa kiinteiden elinten kasvaimet [9]. miR-206 on aiemmin osoitettu estävän mahalaukun syövän proliferaatiota osittain estämällä sykliini D2 [10]. Tässä tutkimuksessa keskityimme roolista miR-206 mahasyövän oncogenesis läpi c-Met-reitin, joka on perinteisesti ollut vaikutusvaltainen signalointi koulutusjakson oncogenesis erilaisissa kasvaimissa [11]. c-Met on ennustettu ja osoitettu olevan kohdegeenin useita miRNA lukien miR-206 [9, 12].

Tulokset

Suppression of miR-206 lisännyt c-Met: ilmaisu mahasyövän

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi suoritettiin ekspression havaitsemiseksi miR-206 40 mahasyövän näytteet ja normaaleissa kudoksissa. miR-206 tasolle useimmissa kudosnäytteistä mahakasvaimen (34/40) havaittiin olevan huomattavasti pienempi kuin normaaleissa kudoksissa (kuvio 1A). miR-206-ekspressio kääntäen verrannollinen tason c-Met: havaittu kasvaimen näytteistä (kuvio 1B). Useimmat kasvain näytteet, joissa vähentynyt miR-206 ilmaisua, osoitti korkea prosenttiosuus ( 50%) c-Met värjäystä. Toisaalta, kasvaimet, joilla on normaali ilmentyminen miR-206 oli hyvin heikko tai negatiivinen c-Met ilmentymistä.

(A) Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi osoittaa ekspressiota miR-206 normaaleissa kudoksissa (asetettu 1 ) ja suhteellinen määrä miR-206 kasvaimissa, kuten kertainen pieneneminen. N: normaali kudoksia; T: kasvaimia. U6 snRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) miR-206 ilmentyminen soluissa korreloi käänteisesti c-Met. Edustaja immunohistokemiallinen värjäytyminen kolme mahakasvaimen yksilöitä ja niiden viereisten normaaleissa kudoksissa esiteltiin. Näyte nro 2, 6, ja 23 ovat samat kuin reaaliaikainen RT-PCR. Kasvainsolujen 50% positiivista värjäytymistä katsottiin olevan vahva c-Met ilme.

miR-206 aiheuttama G1 pidätyksen ja estivät solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion AGS mahalaukun syöpäsolujen

Koska miR -206 ilmentyminen väheni mahasyövän yksilöitä, etsimme onko käyttöönoton miR-206 ollut biologista vaikutusta AGS soluihin. AGS transfektoitu miR-206-molekyylin estivät solujen kasvua verrattuna negatiiviseen kontrolliin, joka perustuu MTS-määritys (kuvio 2A). FACS-analyysi soluista osoitti G1 solusyklin pysähtymiseen (S1 Kuva). Pesäkkeiden määrä oli pienennetään myös transfektio miR-206 (S2 kuvassa).

(A) MTS-solujen lisääntymisen määritys suoritettiin päivänä 3 esitetyllä tavalla. (B) AGS solut arvioitu TranswellTM ja Matrigel määrityksissä. Solujen lukumäärä, jotka olivat vaeltaneet kautta viljelyinsertistä huokoset (vasemmalla) tai olivat tunkeutuneet kautta matrigeelin insertin huokoset (oikealla) kvantifioitiin laskemalla viiden itsenäisen näkökentän. *: Erot solumigraation tai invaasion välillä miR-206 ja negatiivisen kontrollin transfektoidut solut olivat merkittäviä,

P

0.01.

miR-206 voi estää maahanmuutto- ja invaasion AGS-soluissa (kuvio 2B ja S3 kuvassa). Dramaattinen vähentäminen siirtymistä alakammioissa havaittiin miR-206 transfektoiduissa AGS soluja (86 ± 15 vs. 165 ± 16 AGS soluissa,

P

0,01, n = 3). Lisäksi solut, jotka on transfektoitu miR-206 osoitti, että HGF-indusoitua invasiivisuus on myös merkittävästi haittasi seuraavat miR-206 transfektiota (57 ± 12 vs. 116 ± 14 AGS-soluissa,

P

0,01, n = 3).

miR-206 vaimentua c-Met ilmaisun ja muut solusykliä liittyviä proteiineja

Olemme aiemmin tunnistettu c-Met välittömänä kohteena miR-206 [9]. Western blot-analyysi vahvisti, että c-Met ilmentyminen väheni miR-206 transfektion AGS soluissa (kuvio 3). Samalla kohdunulkoinen miR-206 myös alassäädetty ilmaisun CDK4, p-Rb, p-Akt ja p-ERK.

miR-206 myös downregulates ilmaus p-Akt ja p-ERK1 /2, mutta eivät koko Akt tai ERK1 /2.

alassäätely c-Met esti mahasyövässä solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion

Seuraavaksi c-Met erityinen siRNA käytettiin ensimmäisen laskevan ekspression c-Met: in AGS-soluissa (S4 kuvassa). MTS-määritykset suoritettiin havaita solujen lisääntymistä. AGS transfektoiduissa soluissa c-Met siRNA oli vähentynyt solujen kasvua verrattuna negatiiviseen kontrolliin soluja (kuvio 4A, 25.10 ± 3,81%: n lasku). Sekä HGF aiheuttaman muuttoliikkeen ja invaasion pieneni, kun verrataan c-Met siRNA transfektoidut solut negatiivisen kontrollin transfektoitujen solujen. Kuten kuviossa 4B ja S5 kuvassa, vähenee muuttoliikkeen (88 ± 10 vs. 155 ± 15, P 0,01, n = 3) ja invaasiota (72 ± 7 vs. 126 ± 12, P 0,01, n = 3) olivat molemmat tilastollisesti merkitseviä.

(A) MTS-solujen lisääntymisen määritys suoritettiin päivänä 3 transfektion jälkeen. (B) vaikutus c-Met siRNA on AGS soluihin kvantitoitiin käyttäen kulttuurin tai Matrigeliä inserttejä.

käyttöönotto miR-206 tukahdutti kasvaimen kasvun

in vivo

tutkimme seuraavaksi, jos yli-ilmentymisen miR-206 voi tukahduttaa kasvaimen kasvua

in vivo

. Sen jälkeen, kun 8 viikkoa, keskiarvoistetut kasvaintilavuudet olivat merkittävästi alhaisemmat infektoitujen solujen lentivirus ilmentävät miR-206, verrattuna kontrolli (kuvio 5).

(A) edustaja valokuvia nude-hiirten 8 viikkoa siirrostuksen jälkeen. (B) Keskimääräinen kasvainten tilavuuden välillä oli tilastollisesti merkitsevä. *: N = 5 kussakin,

P

0.01.

Keskustelu

Mahasyöpää säilyttänyt merkittävän terveydenhuollon taakka maailmanlaajuisesti huolimatta vuoden tutkimuksen [1]. WHO: n mukaan, mahasyövän edelleen yksi alkuun syövän etiologies jolla on korkea kuolleisuuden [1]. Kuten muidenkin kiinteiden elinten kasvaimia, on yhä selvempää, että ymmärrettäisiin paremmin kasvain oncogenesis on tarpeen parantaa ennustetta näillä potilailla. Koska esiintyy Aasian maissa, tietoja syntymässä roolista miRNA kehitykseen tai tukahduttaminen mahasyövistä [6].

miRNA ovat kaksi toimintoa suhteen mahasyövän kehittäminen [6, 13]. Jotkut miRNA ovat tuumorisuppressoreilla ja toiset ovat oncomiRs [6]. Ueda et ai. löytyi 22 miRNA voimistunut ja 13 vaimentua plasmassa potilailla, joilla on mahalaukun syöpä [13]. Tavoitteet, jotka ovat tutkimuksen kohteena tapauksessa mahasyövän kuuluu sääntelyviranomaisten p16 kautta miR-24, ja p21 kautta miR-222/221 ja miR-106b /93/25 [6]. Toiset, kuten miR-21, voidaan yläreguloituja jopa 92% mahasyövän kudosnäytteiden [14]. Ehdokkaat tunnistettu mahasyövän palvelee tuumorisuppressoreilla kuuluvat miR-181B, miR-101 ja miR-486 [6]. Esimerkiksi miR-101 ajatellaan kohdistaa EZH2, Cox-2, Mcl-1 ja Fos [15]. miR-486 ajatellaan vaikuttavan OLFM4, mahdollisesti vaikuttaa apoptoosia alavirtaan [16].

Kun on todettu, että suurin osa miRNA toimivat tuumorisuppressorien, tutkimme c-Met-reitin mahasyövän. Tutkiessani c-Met koulutusjakson rhadbomyosarcoma, löysimme tärkeä tämä polku sarkooma [9]. c-Met: tiedetään väärin säädellystä mahasyövän [11, 17-19]. MET proto-onkogeenin koodaa proteiinia, joka tunnetaan nimellä hepatosyyttikasvutekijän (HGF) -reseptorin, jolla on tyrosiinikinaasiaktiivisuutta [18]. Olemme yleensä löytää se ilmaista vain kantasoluista, mutta myös nähneet sen säätelyhäiriötä kasvaimen synnyssä [18]. Tässä tutkimuksessa pystyimme vahvistamaan, että c-Met on merkittävästi osallisena mahasyövän ja sen rooli miR-206 tavoite on keskeinen kasvaimen synnyssä.

solusyklin etenemisen on väärin säädellystä mahasyövän. Aiempien raporttien sykliini D2 on kohonnut mahasyövän kun miR-206 vaikuttaa [10]. miR-206: n on osoitettu olevan tehokas prognostinen markkeri [10]. Sen downregulation liittyy lyhyempi kokonaiselossaolo. Palauttaminen miR-206 johtaa G0 /G1 solusyklin pysähtymiseen, vahvistaa rooliaan tuumorisuppressorina. Työmme osoitti myös solusyklin säätelyhäiriötä CDK4 ja fosforyloidun-Rb vaikuttamaan. CDK4 on jäsenenä sykliini riippuvaisen kinaasin perheen ser /thr proteiinikinaasi aktiivisuutta. Se johtaa G1 vaiheeseen etenemistä. Lisäksi, kinaasia johtaa fosforylaatioon Rb, joka on tuumorisuppressori osallistuu solusyklin etenemisen.

Vaikka samanlaisia ​​havaintoja on vahvistettu mahalaukun, munasarjan ja rintasyöpiä, rooli miR-206 näyttää olla päinvastainen vaikutus paksusuolen syöpä [6, 20]. Käänteinen korrelaatio välillä todettiin miR-206 ja Klf4 paneelissa ihmisen paksusuolen syövistä [20]. Klf4, joka on onkogeeninen ominaisuuksia muiden syöpien, kuten rinta-, iho- ja keuhkojen, toimii tuumorisuppressori paksusuolensyöpä [20]. Sen promoottori on hyper-metyloitu kohonneita miR-206 johtaa downregulation Klf4 [20]. Nämä havainnot osoittavat, että miR-206 ei välttämättä toimi samalla tavalla kaikissa epiteelisolujen, mikä tekee tyhjäksi yhden koon lähestymistapaa kemoterapeuttisten.

Tässä tutkimuksessa tunnistimme mekanismin säätelyyn c-Met geeniekspression kautta miR-206 mahasyövän. c-Met: n yliekspressio seuraavat miR-206 downregulation näyttää olevan yhteinen etiologia patogeneesissä mahasyövän useimmissa tutkituista tässä tutkimuksessa. Yhteenvetona, olemme osoittaneet, että miR-206 negatiivisesti moduloi c-Met: signalointireitin osallistuvat solujen proliferaatio ja migraatio. Tutkimuksemme toivottavasti on merkittäviä kliinisiä seurauksia hoidossa mahasyövän. miR-206 on ehdokkaana molemmat immunohistokemiallista havaitsemista pieniä kasvaimia ja mahdollinen tavoite biologisen terapeuttisten.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen mahalaukun syövän solulinja, AGS, ostettu ATCC: ltä (Manassas, VA), kasvatettiin Hamin F-12-elatusaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone, Logan, UT).

Ethics lausuma

tutkimus toteutettiin tiukasti suositusten mukaisesti ja hyväksynnän Wenzhoun Medical University Animal Care ja Käytä komitea (Luvan numero: WZMCOPT-043011). Neljäkymmentä mahakasvaimen yksilöitä ja normaalin luovuttajan mahalaukun kudokset saatiin toisesta sidoksissa sairaalan Wenzhoun Medical University (Wenzhou, Kiina). Näytteiden kerääminen on hyväksynyt Wenzhou Medical University Ethics tutkimusta ihmiseen kohdistuvan, ja kirjallinen suostumus saatiin jokaisessa tapauksessa. Kaikki kokeet suoritettiin noudattaen Helsingin julistuksen ja kansallisen lainsäädännön mukaisesti.

kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä RNA eristettiin ihmisen mahakasvaimen näytteitä ja normaalit kontrollit kanssa Trizol reagenssia (Invitrogen). 10 ng kokonais-RNA: ta käytettiin cDNA-synteesin, jonka Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), ja miR-206 ekspressiotaso kvantitoitiin Taqman MicroRNA Assay (Applied Biosystems). Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

immunohistokemiallinen värjäys c-Met

Jaksot formaliinilla kiinnitetyt parafinoidut ihmisen mahakasvaimen yksilöt (5 um) tehtiin ja sitten de-paraffinized ksyleenillä ja etanolilla. Objektilasit käsiteltiin 0,3% vetyperoksidia ja sitten niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: c-Met-vasta-aineen 1: 300 laimennus (CST, Beverly, MA). Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin käyttäen EnVision HRP /DAB tunnistusjärjestelmä (Dako, Glostrup, Tanska).

Soluproliferaatiomääritys

AGS solut maljattiin 2000 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ( Costar, High Wycombe, UK) kunkin transfektion. Transfektiot suoritettiin reagenssilla (Lipofectamine RNAiMAX; Invitrogen), kolmena rinnakkaisena. Kunkin hyvin, 50 nM miR-206 jäljittelee molekyyli (Ambion, Austin, TX) tai negatiivinen kontrolli (Ambion) transfektio käytettiin. 72 tunnin viljelyn, soluproliferaatiota arvioitiin MTS-määritys (CellTiter 96 Aqueous, Promega, Madison, WI).

TranswellTM muuttoliike määrityksissä

24 tuntia transfektion, AGS solut kerättiin trypsinisaatiolla ja pestiin kerran D-Hanks liuos (Invitrogen). Mitata solumigraation tai invaasio, 8-um huokoskoko kulttuurin tai matrigeelin insertit (TranswellTM; Costar) pantiin kuoppiin 24-kuoppaviljelylevyillä. Alemmassa kammiossa, 400 ui F-12, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 20 ng /ml HGF lisättiin. Sitten 5×10

4 solut lisättiin ylempään kammioon. 20 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut, jotka olivat vaeltaneet huokosten läpi värjättiin kristallivioletilla ja havaittiin mikroskoopilla (Zeiss, Oberkochen, Saksa) käyttäen 20X objektiivin.

Western blot-analyysi

AGS-soluja (1×10

5) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä kasvatettiin F-12: ssa 24 tuntia ennen transfektiota. 72 tuntia transfektion jälkeen solut pestiin kylmällä PBS: llä ja altistettiin lyysipuskuria (35 mM Tris-Cl [pH 6,8], 20 g /l natriumdodekyylisulfaattia [SDS], 100 mM ditiotreitoli). Proteiini lysaatit (20 ug kutakin) erotettiin käyttäen 8% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, sitten elektro-siirretään nitroselluloosalle suodattimen läpi. Membraanit blokattiin puskurilla, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa PBS: ssä, jossa oli 0,05% Tween-20: ssa 2 tunnin ajan ja inkuboitiin yön yli vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun toinen pesu PBS: llä, joka sisälsi 0,05% Tween-20, kalvoja inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita (Millipore, Darmstadt, Saksa) ja kehitettiin parannettu kemiluminesenssidetektiolla (Pierce, Rockford, IL). GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Vasta-aineet CDK4, p-Rb, ERK, Akt, p-ERK, p-Akt, c-Met, ja GAPDH olivat Cell Signaling Technology (Beverly, MA).

siRNA määrityksissä

c-Met-spesifinen siRNA (Ambion) ja negatiivinen kontrolli siRNA (Ambion) käytettiin säätelevät vaimentaen c-Met: ilmentymisen AGS-soluissa. 50 nM c-Met-spesifinen siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA transfektoitiin AGS solut Lipofectamine RNAiMAX. MTS-määritys suoritettiin 72 tuntia transfektion jälkeen, kun Transwell ja Matrigel määritykset suoritettiin 24 tuntia transfektion jälkeen, kuten edellä on kuvattu.

In vivo

kasvaimen kasvun määrityksessä

pre-microRNA ilmentämiskonstruktiot lenti-miR-206 ja pCDH-CMV-MCS-EF 1-copGFP kontrollivektorille ostettiin System Biosciences (Mountain View, CA). AGS-solut infektoitiin lentivirus ilmentävät miR-206 tai negatiivinen kontrolli. Nainen nude-hiiriin, 6 viikon iässä, ympättiin AGS soluja (8×10

6) ilmentävät miR-206 tai negatiivisia kontrolleja niiden kyljet, ja sitten tapettiin 8 viikon kuluttua. Kasvaimen koko mitattiin ja tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: (

L

x

W

2) x 0,5, (

L

, pituus;

W

, leveys), menetelmän mukaisesti aiemmin raportoitu [21]. Kaikki tutkimukset ja menettelyt hyväksynyt Wenzhou Medical University Animal Care ja käyttö komitea.

Tilastollinen

Kaikki tiedot näytettiin keskiarvona ± SEM. Tulokset on esitetty on ilmaistu keskiarvona ± SEM saatujen tulosten kolmena rinnakkaisena yhdessä kokeessa. Tulokset edustavat ne, jotka saatiin kolmessa erillisessä kokeessa. Erot kokeellista ryhmien ja kontrolliryhmien analysoitiin käyttäen Studentin

t

-testi. Tilastollinen merkittävyys hyväksytty

P

0.05.

tukeminen Information

S1 Kuva. FACS-analyysi AGS transfektoitujen solujen miR-206.

AGS solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen miR-206 tai NC, värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrialla. Kymmenentuhatta solua arvioitiin kunkin näytteen. Kaikkein edustavia tuloksia kolmessa riippumattomassa kokeessa on kuvattu.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0128751.s001

(TIF)

S2 kuviossa. Pesäkemuodostusta.

AGS transfektoitujen solujen miR-206 tai NC ympättiin alhainen tiheys. Jälkeen 7 päivää, pesäkemuodostusta määritettiin värjäämällä kristallivioletilla. Tyypilliset tulokset kolmessa riippumattomassa kokeessa on esitetty.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0128751.s002

(TIF)

S3 kuviossa. Vaikutukset miR-206 AGS solut arvioitu TranswellTM ja matrigeelin määrityksissä.

Solujen määrän, jotka olivat vaeltaneet kautta viljelyinsertistä huokoset (ylöspäin) tai olivat tunkeutuneet kautta matrigeelin insertin huokoset (alas) valokuvattiin käyttäen 20X mikroskoopin tavoite.

doi: 10,1371 /journal.pone.0128751.s003

(TIF)

S4 Fig. Downregulation c-Met: siRNA.

Western blot -analyysi suoritettiin vahvistamaan tukahduttaminen c-Met: ekspression jälkeen lipofektamiinia transfektion AGS-solujen joko c-Met: siRNA tai negatiivinen kontrolli (NC).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0128751.s004

(TIF)

S5 Fig. Vaikutukset c-Met siRNA on AGS solut arvioitu TranswellTM ja matrigeelin määrityksissä.

Solujen määrän, jotka olivat vaeltaneet kautta viljelyinsertistä huokoset (ylöspäin) tai olivat tunkeutuneet kautta matrigeelin insertin huokoset (alas) valokuvattiin käyttäen 20X mikroskoopin tavoite.

doi: 10,1371 /journal.pone.0128751.s005

(TIF) B