Krooninen sairaus

tiivistelmä

Säteilytys ja DNA: ta vaurioittavien kemoterapeuttisten aineiden käytetään yleisesti syöpälääkkeiden hoitoja. Sen jälkeen DNA-vaurioita FOXM1 proteiinin tasot ovat usein koholla. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet selvittämään mahdollista roolia FOXM1 vuonna ohjelmoidun solukuoleman aiheuttama DNA-vaurioita. Ihmisen syöpäsolut jälkeen FOXM1 tukahduttaminen alistettiin doksorubisiinille tai γ-säteilytys hoito. Tuloksemme osoittavat, että FOXM1 downregulation vakaa tai ohimenevä Knockdown käyttäen RNAi tai käsittelemällä proteasomiestäjät että tavoite FOXM1 voimakkaasti herkistyneet ihmisen syöpäsoluja eri alkuperää DNA-vaurioita aiheuttama apoptoosin. Olemme osoittaneet, että FOXM1 estää aktivointi pro-apoptoottisten JNK ja säätelee positiivisesti anti-apoptoottisten Bcl-2, mikä viittaa siihen, että JNK: n aktivaatiota ja Bcl-2 säätely alaspäin voisi välittää herkkyyden DNA-vaurioittava aine-indusoidun apoptoosin jälkeen kohdistaminen FOXM1. Koska FOXM1 ilmentyy laajalti ihmisen syövissä, meidän tiedot tukevat edelleen se, että se on voimassa kohde kombinatorisista syöpähoidon.

Citation: Halasi M, Gartel AL (2012) tukahduttaminen FOXM1 herkistää ihmisen syöpäsolujen solukuolema DNA-vauriot. PLoS ONE 7 (2): e31761. doi: 10,1371 /journal.pone.0031761

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 14 syyskuu 2011; Hyväksytty: 18 tammikuu 2012; Julkaistu: 29 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Halasi, Gartel. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH) myöntää 1RO1CA1294414 ja 1R21CA134615 Dr. Gartel. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

γ-säteilytys ja DNA: ta vaurioittavien kemoterapeuttisten on keskeinen rooli syövän hoitoon, koska niillä on kyky indusoida DNA: n kahden juosteen katkoksia johtaa syöpäsolun kuoleman [1]. Koska syöpäsolut muuttuvat usein resistenttejä DNA: ta vaurioittavien aineiden, on tärkeää määrittää mekanismeja lääkeresistenssideterminantit. Useat tutkimukset ovat raportoineet, että vastauksena IR, etoposidi, daunorubisiini tai doksorubisiini hoidon FOXM1 proteiinin taso nousee annoksesta riippuvalla tavalla [2] – [4]. FOXM1 pidetään päällikön säätelijä solusyklin [5], [6], ohjaamalla geenien ilmentymistä, jotka ovat ratkaisevia G1 /S- ja G2 /M-etenemisen [7]. FOXM1 on ilmentyy runsaana monenlaisia ​​ihmisen syövissä [8] – [11], mikä viittaa siihen, että kohdistaminen FOXM1 voisi olla terapeuttinen strategia ihmisen maligniteettien [12], [13]. FOXM1 on liitetty DNA-vaurioita vastaus koulutusjakso, esimerkiksi DNA: n korjaukseen geenejä, XRCC1 ja BRCA2 tunnistettiin suoraan transkription kohteina FOXM1 [2]. Lisäksi asema FOXM1 vasteena DNA-vaurion on tutkittu yhteydessä ihmisen syöpäsoluja villityypin p53 [2], [11], [14], [15]. Kuitenkin, tuumorisuppressori p53: n havaittiin olevan negatiivinen säätelijä FOXM1 ja DNA-vaurion voimakkaasti säädelty tason FOXM1 puuttuessa p53 [3], [4]. Näin ollen, olemme hypoteesi, että DNA: ta vaurioittavien kemoterapeuttisten aineiden ei välttämättä ole yhtä tehokas puuttuessa p53, koska ne vakauttaa FOXM1-proteiinin taso, joka johtaa suojaa DNA-vaurion indusoiman apoptoosin. Koska FOXM1 on potentiaalisesti onkogeenisia transkriptiotekijä, ja se on myös osallisena invaasio ja angiogeneesi [16] – [24], kasvainten hoidossa, joissa p53 on mutatoitu tai inaktivoitu DNA: ta vaurioittavien aineiden voisi olla haitallista potilaille. Ryhmämme raportoitu aiemmin, että suppressio FOXM1 mukaan tiatsoli antibiootteja [25] – [28] ja proteasomiestäjät [29] korreloi aste apoptoosin viittaa siihen, että FOXM1 voi toimia mahdollisena estäjä apoptoosin [25] – [27]. Lisäksi on osoitettu, äskettäin, että rintasyövän solujen kohonneita FOXM1 tuli herkkä Herceptin paklitakseli [30] ja sisplatiinin [11]. Näin ollen, on selvää, että FOXM1 voi estää indusoiman apoptoosin eri syöpälääkkeiden.

c-Jun N-terminaalinen kinaasien (JNK: t; tunnetaan myös stressin aktivoimien proteiinikinaasien, SAPKs) vastata erilaisiin solunulkoisen ärsykkeisiin ja ympäristön korostaa [31]. JNK signalointireitin säätelee monia solun toiminnoissa, kuten lisääntymistä, eloonjääntiä, apoptoosin ja erilaistumisen [32]. FOXM1 on osoitettu transkriptionaalisesti aktivoida JNK1 ohjata solusyklin etenemisen ja invaasiota [18]. Kuitenkin tulos JNK aktivaation määritetään kesto JNK signaling [33], [34]. Lyhytaikainen JNK aktivointi liittyy leviämisen, kun taas jatkuva aktivointi JNK johtaa yleensä apoptoosin [33], [34]. B-solulymfooma 2 (Bcl-2) on antiapoptoottista jäsen Bcl-2-perheen [35], [36]. Bcl-2 on keskeinen rooli luontaisen apoptoottisen reitin toimii valvojana mitokondrioiden estämällä Bax aktivaation [35], [37]. Pakko yli-ilmentymisen Bcl-2 useissa viljellyissä solulinjoissa siirrettävä vastustuskyky kemoterapia-aineiden ja säteilytys [35].

Tässä tutkimuksessa tutkimme onko FOXM1 on rooli solukuoleman aiheuttama DNA-vaurioita ihmisen kasvainten solulinjat kanssa mutantti p53. Osoitamme, että pysyvän tai väliaikaisen knockdovvn FOXM1 käyttäen RNAi herkkyys kasvaa eri ihmisen syöpäsolujen DNA: ta vaurioittavien aineiden kuten doksorubisiinin käsittelyä ja γ-säteilytys. Lisäksi osoitamme, että yhdistelmä proteasomiestäjät estävien FOXM1 kanssa DNA: ta vaurioittavien aineiden indusoi erittäin vankka apoptoosin. Tulosten perusteella näyttää, että JNK aktivointi ja Bcl-2 downregulation voi selittää lisääntyneen solukuoleman jälkeen tukahduttaminen FOXM1 yhdistettynä DNA-vaurioita.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, kemialliset yhdisteet ja hoitoja

MIA PaCa-2 haiman (ATCC), Hep3B maksa (ATCC), HCT 116 ja HCT 116 shp53 paksusuolen [38] ihmisen syövän solulinjoja kasvatettiin DMEM-alustassa (Invitrogen). MDA-MB-231 (ATCC) rinta- ihmisen syövän solulinjaa kasvatettiin RPMI-alustassa (Invitrogen). Media oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (GIBCO), ja soluja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Stabiilit solulinjat (Fig. 1), käyttäen ATCC saatua vanhempien solut syntyvät transduktio ohjaus ja FOXM1 shRNA lentivirus- partikkeleita (Sigma), minkä jälkeen valinta puromysiini (Sigma). Doksorubisiini (Fisher Scientific), tiostreptonille (Sigma), bortetsomibi (VELCADE) (Millenium Pharmaceuticals) ja JNK estäjä SP600125 (A. G. Scientific) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (Fisher Scientific). Säteilytys suoritettiin käyttäen

137Caesium γ-lähde (JL Shepherd malli 6810, JL Shepherd, San Fernando, CA) annoksella 8 ja 10 Gy.

(A) HCT 116 p53 taitavia ja puutteellinen ihmisen paksusuolen syövän soluja FOXM1 knockdown hoidettiin doksorubisiinilla (doxo) esitetyllä tavalla. Immunoblottaus varten FOXM1, p53, irrotettiin kaspaasi-3, PARP ja β-aktiini kuin latauskontrollina suoritettiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen. (B) MIA PaCa-2 vektori ohjaus ja FOXM1 pudotus haimasyövän soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet doksorubisiinia. Kaksikymmentäneljä tuntia käsittelyn jälkeen solulysaatit immunoblotattiin ja FOXM1, pilkottiin kaspaasi-3, PARP ja β-aktiini kuin lastaus ohjaus. (C) MDA-MB-231 vektori-ohjaus ja FOXM1 pudotus rintasyövän soluja käsiteltiin doksorubisiini kuten on osoitettu. Immunoblottianalyysi suoritettiin FOXM1, halkaistut kaspaasi-3 ja β-aktiini kuin latauskontrollina 48 tuntia käsittelyn jälkeen. (D) Hep3B vektori ohjaus ja FOXM1 pudotus maksasyövän solut käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina doksorubisiinin. Solulysaatit immunoblotattiin varten FOXM1, halkaistut kaspaasi-3 ja β-aktiini kuin latauskontrollina 24 tuntia käsittelyn jälkeen. (E) haimasyöpä solujen MIA PaCa-2 transfektoitiin ohjaus ja FOXM1 siRNA 48 tuntia, ja sitten käsiteltiin kuten on esitetty. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun hoidon immunoblottaus suoritettiin FOXM1, pilkottiin kaspaasi-3 ja β-aktiini-vasta-aineita. (F) Rintasyöpä MDA-MB-231 transfektoitiin ohjaus ja FOXM1 siRNA 48 tuntia, sitten käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina doksorubisiinin. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia käsittelyn jälkeen solulysaatit immunoblotattiin ja FOXM1, pilkottiin kaspaasi-3 ja β-aktiini kuin lastaus ohjaus.

immunoblot-analyysi

Käsitellyt solut otettiin talteen ja käsiteltiin immunoblottauksella kuvatulla ref. [27] vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä FOXM1 (kanin polyklonaalinen vasta-aine vastaan ​​FOXM1 on kuvattu aiemmin [45]), p53 (Santa Cruz), pilkottiin kaspaasi-3 (Cell signalointi), PARP-1/2 (Santa Cruz), Total ja fosfo-SAPK /JNK (Cell signalointi), Bcl-2 (Santa Cruz), Bcl-xL: n (Cell signalointi) ja β-aktiini (Sigma). Kvantifiointi tehtiin Image J ohjelmisto (NIH). Suhteellinen proteiinin tasot normalisoitiin vastaavaan aktiinin tasot.

Transfektio ja siRNA

Ohjaus (AACAGUCGCGUUUGCGACUGGUU) pieniä häiritseviä RNA: n (siRNA) ja siRNA spesifinen FOXM1 (GGACCACUUUCCCUACUUUUU) syntetisoitiin Sigma. 50 nM siRNA-dupleksit transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaan valmistajan suositusten. Soluja käsiteltiin kuten 48 tuntia transfektion jälkeen.

Yhteensä RNA ja Quantitative reaaliaikaisen (qRT) -PCR

Jos haluat purkaa koko RNA solut kerättiin TRIzol reagenssia (Invitrogen). cDNA syntetisoitiin käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR ajettiin ABI 7900 HT (Applied Biosystems) kone. Seuraavia alukkeita käytettiin: ihmisen Bcl-2 (Sense, 5′-TGG GAT GCC TTT GTG GAA CT-3 ’; antisense 5′-GAG ACA GCC AGG AGA AAT CAA AC-3′) [46] ja ihmisen syklofiliinin (Sense, 5’-GCA GAC AAG GTC CCA AAG ACA G-3 ’Antisense, 5′-CAC CCT GAC ACA TAA ACC CTG G-3’) [25].

Virtaussytometria – propidiumjodidia värjäys

Soluja käsiteltiin kuten ja korjattu trypsinaatiolla. Sitten solut pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin jääkylmällä 95% etanolilla. Kiinnityksen jälkeen solut värjättiin propidiumjodidilla (50 ug /ml) (Invitrogen) PBS /RNAasi /Triton X-100: ssa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja analysoitiin virtaussytometrialla.

Colony muodostava määritys

1 x 10

5 solua maljattiin 100 mm ruokia kaksoiskappaleet ja käsiteltiin kuten 24 tuntia. Pesäkkeet annettiin muodostua 10 päivän ajan, ja sitten solut värjättiin Crystal violetti.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin Microsoft Excel käyttäen Student

t

testi (kaksisuuntainen).

P

arvoja 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset ja keskustelu

knockdovvn FOXM1 herkistää ihmisen syöpäsolujen DNA: ta vaurioittavien aineiden

Ensinnäkin, isogeeninen HCT 116 p53 taitavia ja puutteellinen ihmisen paksusuolen syövän soluja FOXM1 pudotus käsiteltiin eri pitoisuuksilla doksorubisiinin (syyli) ja solukuolemaa arvioitiin immunoblot-merkkiaineista apoptoosin lukien pilkottiin kaspaasi-3 ja PARP (Fig. 1A ). Knockdovvn FOXM1 herkempiä koolonkarsinoomasoluissa doksorubisiinille välittämää apoptoosia riippumatta p53 tila. p53 taitavia solut FOXM1 Knockdown kävi vahvempia apoptoosin verrattuna niiden p53 puutteellista kollegansa. Tämä havainto voidaan selittää läsnä p53-riippuvaisten apoptoottisten signalointia p53-taitavia soluja, mutta ei p53-vajaiden solujen seuraavat DNA-vaurioita.

Noin 50% ihmisen kasvaimissa satamaan mutantti tai inaktivoitu p53; Näin ollen p53-riippuvaisen apoptoottisen reitin ei voida hyödyntää hävittämiseksi syöpäsolujen seuraavista syöpähoidon [39]. Tutkia mahdollista roolia FOXM1 DNA-vaurioita aiheuttama apoptoosin solulinjoissa mutantti p53, jotka ovat yleensä vastustuskykyisempiä kemoterapiaa kuin syöpäsolun linjat villityypin p53, MIA PaCa-2 vektorisäädön ja FOXM1 pudotus ihmisen haimasyövän solulinjoja kätkeminen mutantti p53 käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla doksorubisiinin ja immunoblottaus suoritettiin FOXM1, pilkottiin kaspaasi-3 ja PARP (Fig. 1 B). Mukaisesti aiemmissa tutkimuksissa [2] – [4], [11], [14], [40], myös havaittu, että seuraavat DNA-vaurioita FOXM1 proteiinin taso on koholla. Mutta mikä tärkeintä, olemme havainneet, että ei ole FOXM1 herkistynyt syöpäsolujen solukuolemaan indusoiman doksorubisiinin (Fig. 1 B), kuten havaitaan katkaisun kaspaasi-3 ja PARP. Voit varmistaa, että tämä ilmiö ei ole solulinjassa erityisiä, MDA-MB-231 ihmisen rinta (p53-mutantti) (Fig. 1 C) ja Hep3B ihmisen maksan (p53-nolla) (Fig. 1 D) vektorisäätö ja FOXM1 knockdown syöpäsolujen olivat käsiteltiin eri pitoisuuksilla doksorubisiinin. Western blot-analyysi katkaistun kaspaasi-3 osoitti, että pudotus on FOXM1 myös herkistynyt rinta- ja maksan syöpäsolujen dok-: n indusoiman apoptoosin.

Lisäksi testasimme ohimenevä knockdovvn FOXM1 johtaa lisääntyneeseen apoptoosiin seuraavat DNA-vaurioita. Saavuttaakseen riittävän ohimenevä knockdovvn FOXM1 käytimme pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) vastaan ​​FOXM1. MIA PaCa-2 haiman (Fig. 1 E) ja MDA-MB-231 rinta- (Fig. 1 F) ohjaus ja FOXM1 pudotus syövän soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla doksorubisiinin. Olemme havainneet, että solujen ohimenevän FOXM1 pudotus oli alttiimpi apoptoosia DNA-vaurioita, kuten havaittiin immunoblottauksella on katkaistun kaspaasi-3, mikä tukee ajatusta, että FOXM1 voi olla rooli DNA-vaurion indusoiman apoptoosin.

jotta voitaisiin vahvistaa tätä, MIA PaCa-2 ja MDA-MB-231 vektorisäädön ja FOXM1 pudotus solut altistaa ionisoivalle säteilylle. γ-säteilytys indusoi myös vankka apoptoosia havaita pilkkomalla kaspaasi-3: FOXM1 pudotus-soluissa (kuvio. 2A, B). Lisäksi voitaisiin arvioida määrällisesti asteen solukuoleman aiheuttama γ-säteilytys MIA PaCa-2 ja MDA-MB-231 vektorisäädön ja FOXM1 pudotus solut y-säteilytettiin erilaisilla annoksilla, korjattu ja värjättiin propidiumjodidilla. Apoptoosin laajuuden mitattiin virtaussytometrialla (Fig. 2C, D). Sekä haiman ja rintojen FOXM1 pudotus solut osoittivat merkittävää kasvua solukuoleman hoidon jälkeen verrattuna säteilytetty valvonnan kanssa. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että tukahduttaa FOXM1 ihmisen syöpäsoluissa voisi tehdä niistä alttiimpia solukuolema DNA-vahingoittavat aineet.

(A) MIA PaCa-2-ohjaus ja FOXM1 knockdown haimasyövän soluja γ- säteilytetty 8 ja 10 Gy. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia säteilytyksen jälkeen solut kerättiin ja immunoblottaus suoritettiin vasta-aineiden kanssa FOXM1 ja pilkottiin kaspaasi-3. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus. (B) MDA-MB-231-ohjaus ja FOXM1 pudotus rintasyövän solut altistettiin y-säteilytys, jossa on valittu annoksilla. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia säteilytyksen jälkeen solut kerättiin ja immunoblottaus suoritettiin FOXM1, pilkottiin kaspaasi-3 ja β-aktiini kuin lastaus ohjaus. (C-D) aste solukuolemaa arvioitiin virtaussytometrialla seuraavasti propidiumjodidivärjäys in MIA PaCa-2 haiman ja MDA-MB-231 rinta- ohjaus ja FOXM1 pudotus syöpäsoluja, vastaavasti, 48 tunnin jälkeen, γ-säteilytyksen. Kaavio osoittaa määrällisesti prosentteina apoptoottisten solujen verrattuna vektorisäätö käsittelemätön soluja, ± SD edustavan kolmena kappaleena (C) tai kopioida (D) koe.

Hoito proteasomiestäjät herkistää ihmisen syöpäsoluja indusoimaa apoptoosia DNA-vaurioita

Ryhmämme on raportoitu aikaisemmin, että tiatsoli antibiootit tiostreptonille ja Siomycin a ovat tehokkaita estäjiä FOXM1 [25] – [28] ja toimivat proteasomiestäjät [29]. Lisäksi olemme osoittaneet, että tunnettujen proteasomiestäjät kuten bortetsomibi (VELCADE) ja MG132 myös kohdentaa FOXM1 [29]. Downregulation FOXM1 on yksi keino, jolla proteasomiestäjät voi aiheuttaa solukuoleman in vitro ja in vivo [27], [29], [41], mutta on tietenkin useita mahdollisia FOXM1-riippumattomien mekanismien proteasomeja estäjän aiheuttama solukuoleman että emme keskustele tässä tutkimuksessa. Testata FOXM1 /proteasomiestäjät yhdessä DNA: ta vaurioittavien aineiden, MIA PaCa-2 haimasyöpä solulinja käsiteltiin yhdistelmällä doksorubisiinin ja bortetsomibi (Bor) (Fig. 3A) tai tiostreptonille (Thio) (Fig. 3B), vastaavasti . Olemme havainneet, että inhibiittorit FOXM1, tiostreptonia ja bortetsomibilla tukahdutetaan FOXM1 ilmaisu (tuloksia ei ole esitetty) [27], [29] ja yhdistelmänä doksorubisiinin kanssa osoitti vahvempaa pilkkominen kaspaasi-3 tai PARP verrattuna hoitoihin huumeita yksittäisinä aineina. Lisäksi MIA PaCa-2 haimasyövän soluja y-säteilytettiin yhdessä hoitoon tiostreptonia tai bortetsomibia (Fig. 3C). Western blot analyysi katkaistun kaspaasi-3 osoitti, että MIA PaCa-2 solut olivat herkempiä yhdistelmä γ-säteilytyksen ja tiostreptonia tai bortetsomibilla, vastaavasti, kuin yksittäisiä lääkehoitoa.

(A) haiman syöpäsoluissa MIA PaCa-2 hoidettiin konsentraatiot doksorubisiinin ja bortetsomibi (Bor) yksin tai yhdessä. 24 tuntia käsittelyn jälkeen solulysaatit analysoitiin immunoblottauksella katkaistun kaspaasi-3, PARP ja β-aktiini-vasta-aineita. (B) MIA PaCa-2 haimasyövän soluja käsiteltiin doksorubisiinin ja tiostreptonia (Thio) yksinään tai yhdessä osoitettujen konsentraatioiden 24 tunnin ajan. Immunoblottaus suoritettiin spesifisiä vasta-aineita lohkaistaan ​​kaspaasi-3 ja β-aktiini kuin lastaus ohjaus. (C) Haimasyöpä solulinjaa MIA PaCa-2 altistettiin y-säteilytys ja käsitellään yhdessä tiostreptonille tai bortetsomibilla 24 tuntia. Immunoblottaus suoritettiin katkaistun kaspaasi-3 ja β-aktiini kuin lastaus ohjaus. (D) MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen käsiteltiin doksorubisiinia yhdessä tiostreptonia tai bortetsomibihoitoon kuten 24 tuntia. Solulysaatit analysoitiin immunoblottaamalla vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä lohkaistaan ​​kaspaasi-3 ja β-aktiini kuin lastaus ohjaus. (E) Hep3B maksasyövän soluja käsiteltiin doksorubisiinin ja tiostreptonia yksin tai yhdessä kuten 24 tuntia. Immunoblottaus suoritettiin spesifisiä vasta-aineita lohkaistaan ​​kaspaasi-3 ja β-aktiini kuin lastaus ohjaus. (F) Rintasyöpä MDA-MB-231 alistettiin y-säteilytys ja käsitellään yhdessä tiostreptonille tai bortetsomibilla 24 tuntia. Immunoblot-analyysi suoritettiin katkaistun kaspaasi-3 ja β-aktiini-vasta-aineita. (G-H) 1 x 10

5 MIA PaCa-2 (G) tai MDA-MB-231 (H) ihmisen syövän solut levytettiin ja käsiteltiin kuten 24 tuntia. 10 päivää käsittelyn jälkeen solut värjättiin kristallivioletilla ja edustavat levyt on esitetty. Kaavio esittää määrällisesti ± SD päällekkäisiä kokeita (*,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001).

varmistamiseksi edelleen tätä vaikutusta, MDA-MB-231 rinta- ja Hep3B maksasyövän soluja käsiteltiin doksorubisiini (Fig. 3d, E) tai säteilytettyjä (Fig. 3F) yhdessä tiostreptonille tai bortetsomibin, vastaavasti. Analyysi pilkkoa kaspaasi-3: n ekspressio Western blot osoitti, että yhdistelmä-DNA: ta vaurioittavien aineiden kanssa FOXM1 /proteasomiestäjät lisännyt apoptoosia rintasyövän ja maksasyöpä soluja verrattuna hoitoon lääkkeitä yksinään. Koska käsittely DNA: ta vaurioittavien aineiden kanssa FOXM1 /proteasomiestäjät indusoi tällaisia ​​merkitty apoptoosia, niiden vaikutus yhdistelmän tutkittiin myös pitkän aikavälin selviytymisen suorittamalla klonogeeniset määrityksen. MIA PaCa-2, ja MDA-MB-231 ihmisen syövän soluja käsiteltiin γ-säteilytyksen kanssa tiostreptonia tai bortetsomibi ja pesäkkeitä muodostava kyky arvioitiin 10 päivää myöhemmin (Fig. 3G-H). Olemme havainneet, että yhdistelmä γ-säteilytys ja FOXM1 /proteasomiestäjät inhiboi merkittävästi pesäkkeiden muodostumista, jotka aiheuttavat paljon vähemmän pesäkkeiden lukumäärä verrattuna yksittäisiin lääkehoitoa. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että yhdistelmä yleisesti käytetty DNA: ta vaurioittavien kemoterapeuttisten aineiden ja FOXM1 /proteasomiestäjät voidaan pitää hoitostrategiaa parantamiseksi hoitovasteen eri syöpähoitojen.

Herkkyys DNA- vahinkoja suppression jälkeen FOXM1 osittain johtuvan JNK aktivointi ja Bcl-2: downregulation

on kiehtova, että FOXM1, tunnettu säädin solusyklin, voivat estää DNA-vaurion indusoiman apoptoosin. Selventämiseksi mahdollista oleva mekanismi meidän kääntyi JNK signalointireitin, koska se on liitetty vastata erilaisiin ärsykkeisiin, kuten erilaisia ​​apoptoottisia ärsykkeille [32]. On raportoitu, että γ-säteilytys johtaa JNK aktivointi, joka välittää säteilyn indusoiman apoptoosin [33], [42] – [44]. Vaikutuksen määrittämiseksi DNA-vaurioita aktivointi JNK: n läsnä tai poissa ollessa FOXM1, MIA PaCa-2 vektori ohjaus ja FOXM1 pudotus haimasyövän soluja γ-säteilytettyjä ja immunoblotattiin ja fosfo-SAPK /JNK (Fig. 4A) . Havaitsimme, että FOXM1-pudotus-solujen induktion seuraavan solu- kuoleman γ-säteilytys, johon liittyy kohonnut fosforylaatio JNK, viittaa siihen, että FOXM1 voi estää JNK: n aktivaatiota, kun läsnä on DNA-vaurioita. Jotta mahdollisen roolin tutkimiseksi JNK aktivaation indusoiman apoptoosin DNA-vaurioita FOXM1 pudotus soluissa, MIA PaCa-2 haiman ja MDA-MB-231 rinta- FOXM1 pudotus syövän solut y-säteilytetään, kun läsnä on erityisiä JNK-inhibiittori , SP600125 (Fig. 4B-E). Western blot analyysi katkaistun kaspaasi-3 osoitti, että apoptoosin induktio säteilytyksen heikennettiin käsittelemällä JNK-inhibiittori, viittaa siihen, että JNK aktivaatio on osittain vastuussa ohjelmoidun solukuoleman seuraavat DNA-vaurioita.

(A) MIA PaCa-2-ohjaus ja FOXM1 knockdown haimasyövän soluja y-säteilytettiin ilmoitetun annoksilla. Seitsemänkymmentä-kaksi tuntia säteilytyksen jälkeen solut kerättiin ja immunoblottaus suoritettiin spesifisillä vasta-aineilla Phospho /Total-SAPK /JNK ja halkaistut kaspaasi-3. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus. (B) MIA PaCa-2 FOXM1 pudotus haimasyövän soluja esi-inkuboitiin 1 tunnin ajan 10 uM JNK-inhibiittori, SP600125 ja sitten oli y-säteilytettiin kuten on osoitettu. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia säteilytyksen jälkeen solut kerättiin ja immunoblottaus suoritettiin pilkottiin kaspaasi-3 ja β-aktiini kuin lastaus ohjaus. (C) Käyrät keskiarvoja ± SEM neljästä itsenäisestä kokeesta. (D) MDA-MB-231 FOXM1 pudotus rintasyövän soluja esi-inkuboitiin 1 tunnin ajan 10 uM JNK-inhibiittori, SP600125 ja sitten alistettiin y-säteilytys, jossa on valittu annoksilla. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia säteilytyksen jälkeen solut kerättiin ja immunoblottaus suoritettiin katkaistun kaspaasi-3 ja β-aktiini-vasta-aineita. (E) Käyrät keskiarvoja ± SEM kahden erillisen kokeen. (F) Haiman MIA PaCa-2-ohjaus ja FOXM1 knockdown syöpäsolut altistettiin ionisoivaa säteilyä, jossa on valittu annoksilla. Kolmekymmentä-kuusi tuntia säteilytyksen jälkeen solut kerättiin ja immunoblottaus suoritettiin spesifisillä vasta-aineilla Bcl-2 ja Bcl-x L. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus. (G) Breast MDA-MB-231-ohjaus ja FOXM1 pudotus syövän soluja y-säteilytettiin kuten on osoitettu. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia säteilytyksen jälkeen solut kerättiin ja immunoblottaus suoritettiin Bcl-2. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus. (H) MIA PaCa-2-ohjaus ja FOXM1 knockdown haimasyövän solut kerättiin RNA. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin Bcl-2 ja syklofiliinin alukkeita. Kuvaaja osoittaa keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (I) purkaa RNA: MDA-MB-231-ohjaus ja FOXM1 pudotus rintasyövän solut kerättiin. Käyttämällä Bcl-2 ja cyclophlin alukkeita qRT-PCR suoritettiin. Kuvaaja osoittaa keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

tarkasteltiin myös ylimääräisiä mekanismeja, jotka saattavat olla mukana herkistyminen DNA-vaurioita puuttuessa FOXM1. Bcl-2-perheen proteiinien on yksi tärkeimmistä säätelijöitä apoptoosin [35] – [37]. Bcl-2 tunnetaan parhaiten ehkäistä apoptoosin viranomais- mitokondrion kalvon eheys [35] – [37]. Bcl-2: n havaittiin myös resistenssin kemoterapeuttisten aineiden ja säteilytys erilaisissa solulinjoissa [35]. Immunoblot-analyysi Bcl-2 ja Bcl-x L ilmentymisen jälkeen γ-säteilytyksen paljasti, että Bcl-2: ta säädeltiin vuonna FOXM1 pudotus haima- ja rintasyöpä solut (Fig. 4F, G), kun taas Bcl-x L-proteiini pysyi muuttumattomana (kuvio. 4F ). Sen tutkimiseksi, onko Bcl-2 on transkription kohteena FOXM1, Bcl-2: n mRNA-ekspressio kvantitatiivisen reaaliaikaisen (qRT) -PCR vektorisäädön ja FOXM1 pudotus haima- ja rintasyöpä soluja. FOXM1 Knockdown johti 30-40% vähennys Bcl-2 mRNA: n ilmentymisen (Fig. 4H, I), mikä viittaa siihen, että FOXM1 kopiointia up-regulation Bcl-2. Tulevaisuuden kokeita sen selvittämiseksi, ovatko Bcl-2 on välittömänä kohteena FOXM1. Nämä tiedot viittaavat siihen, että suppressio FOXM1 voi herkistää ihmisen syöpäsolujen DNA-vaurion välityksellä Bcl-2: downregulation.

Yhteenvetona osoitettiin, että FOXM1 tukahduttaminen pysyvän tai väliaikaisen taintumisen käyttäen RNAi (kuvio. 1, 2 ) tai käsittelemällä FOXM1 /proteasomiestäjät (Fig. 3) herkistää ihmisen syöpäsoluja eri alkuperää indusoiman apoptoosin DNA: ta vaurioittavien aineiden, mukaan lukien doksorubisiini ja γ-säteilytys. Vaikutus endogeenisen FOXM1 Knockdown ihmisen syöpäsoluissa apoptoosiin doksorubisiinin jälkeen ja γ-säteilytys hoito ei ole koskaan aikaisemmin tutkittu. JNK aktivointi ja Bcl-2: downregulation seurauksena FOXM1 pudotus voi selittää vastus FOXM1 taitava solujen apoptoosin seuraavat DNA-vaurioita. Kaiken kaikkiaan meidän havainnot mukaisesti aikaisempien raporttien [11], [14] vahvistavat, että kohdistaminen FOXM1 yhdessä DNA: ta vaurioittavien lääkkeiden tai γ-säteilytys saattaa olla arvokas terapeuttinen lähestymistapa vastaan ​​erityyppisiä ihmisen syövän. Koska osa FOXM1 /proteasomiestäjät kuten bortetsomibi ovat jo kliinisessä käytännössä Tässä esitetyt tiedot viittaavat myös siihen, että hallinto yleisesti käytettyjen DNA: ta vaurioittavien kemoterapeuttisten aineiden kanssa FOXM1 /proteasomiestäjät tai muiden mahdollisten FOXM1 estäjien pitäisi olla perusteltua vakavasti parantamiseksi hoitotulokseen.

Kiitokset

Haluamme kiittää tohtori Veronique Nogueira (University of Illinois at Chicago) hänen apua suorittamiseksi virtaussytometrianalyysin mittauksiin. Kiitämme myös Dr. Jessica J. Gierut (Harvard Medical School) lukemiseksi käsikirjoituksen ja hänen arvokkaasta kommentteja.