Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset todisteet viittaavat Myc – monipuolinen bHLHZip transkriptiotekijän vapautettiin useimmissa ihmisen syöpien – ensisijaisesti kohteena terapiassa. Miten kohdistaa Myc on vähemmän selvä, kun otetaan huomioon sen osallistuminen erilaisiin keskeisiä toimintoja terveissä soluissa. Kirjoittajat raportoivat toiminnan mekanismi Myc häiritsevän molekyyli, jota kutsutaan nimellä Omomyc, joka osoitti hämmästyttävää terapeuttista tehoa siirtogeenisen hiiren syöpä mallit

in vivo

. Omomyc toiminta on erilainen kuin se, joka voidaan saavuttaa geenin knockout tai RNA-interferenssi, lähestymistavat on suunniteltu estämään kaikki toiminnot geenin tuotteen. Tämä molekyyli – sen sijaan – näyttää aiheuttavan reunasta tietyn häiriön, joka tuhoaa jonkin verran proteiinia vuorovaikutuksesta Myc solmun ja pitää muut ehjä, ja tuloksena muokkaavat Myc transcriptome. Omomyc valikoivasti kohdistettu Myc proteiini-vuorovaikutuksia: se sitoutuu c- ja N-Myc, Max ja Miz-1, mutta ei sitoudu Mad tai valita HLH proteiineja. Erityisesti se estää Myc sitoutumisen promoottori E-laatikot ja transaktivaation kohdegeenien säilyttäen Miz-1 riippuu sitoutumisesta promoottoreita ja transrepression. Tähän liittyy laaja epigeneettisellä muutokset kuten vähentynyt asetylaatio ja lisääntynyt metylaation H3 lysiinin 9. läsnäollessa Omomyc, Myc interactome kanavoidaan sortoa ja sen toiminta näyttää siirtyä pro-kasvaimia synnyttävän kasvaimeen ehkäisevästä yksi. Koska ylimääräinen terapeuttinen vaikutus Omomyc eläinmalleissa, nämä tiedot viittaavat siihen, että onnistuneesti kohdistaminen Myc syövän hoitoa on ehkä samantapainen kaksinkertainen toimintaa, jotta estetään Myc /Max sitoutumalla E-laatikot ja, samaan aikaan, pitää tukahduttaa geenit joka olisi tukahdutettu Myc.

Citation: Savino M, Annibali D, Carucci N, Favuzzi E, Cole MD, Evan GI, et al. (2011) Action mekanismi Myc Inhibitor kutsutaan Omomyc voi antaa vihjeitä Kuinka Target Myc Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (7): e22284. doi: 10,1371 /journal.pone.0022284

Editor: Laszlo Tora, Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology, Ranska

vastaanotettu: 02 marraskuu 2010; Hyväksytty: 23 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 21 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Savino et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusapurahoja peräisin AIRC, ASI, MIUR ja Fondazione Guido Berlucchi (SN), Bear välttämättömyystarvikkeita Pediatric Syöpäsäätiön avustus (LS), joka on CNR lyhyellä aikavälillä liikkuvuuden apurahan (SN) ja CNR – Sapienza University PhD apurahoja (MS, DA). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

myc transkription regulaattorit – c-, N- ja L-myc – ovat perus, heliksi-silmukka-heliksi, leusiinivetoketjun (bHLHZip) proteiineja, jotka sitoutuvat erilaisia ​​genomista sivustoilta joko indusoida tai tukahduttaa transkription geenejä tärkeää solujen kasvun, aineenvaihdunnan ja erilaistumista [1] – [4]. Nämä tekijät – erityisesti c-Myc ja N-Myc – on vapautettu useimmissa ihmisen syövissä. Tämä on yleensä ei johdu

Myc

geenimutaatio mutta tulokset ylävirtaan vaikuttavia mutaatioita muiden onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla. Myc toiminta näyttää näin tarvitaan kehittämiseen ja ylläpitoon enemmistön kasvainten, vaikka alulle muista syistä. Kasvaimissa aiheuttama Myc säätelyyn ylöspäin siirtogeenisiä hiiriä, vaikka lyhyt Myc de-aktivointi laukaisee kasvainregressio yhdessä kasvuun pidätys, erilaistumista ja romahdus kasvaimen verisuoniston [5]. Myc toimii hyvin toisiinsa interactome verkko ja mahdollinen strategia kohdistaminen Myc onkogeenisten toiminto on hallitseva interferenssi Myc-proteiinin vuorovaikutusta. Tässä suhteessa, Myc oligomerointi verkkotunnuksen – bHLHZip alue – on osoittautunut kykenee vallitsevasti inhiboimaan Myc muuttamassa kykyä rotan alkion fibroblastisoluissa [6], [7]. Tämä domain välittää suora vuorovaikutus Max ja sekvenssin spesifinen sitoutuminen tiettyihin konsensussekvenssit – E laatikot – in edistäjiä aktivoitujen kohdegeenien. BHLHZip domain on mukana myös vuorovaikutusta muiden kumppaneiden – kuten Miz-1 – jotka välittävät transkription repressio Myc [4], [8]. Häiritä Myc proteiini-proteiini vuorovaikutusten, kehitimme hallitseva negatiivinen molekyylin tuomalla neljä valitaan mutaatioista bHLHZip alueella ihmisen c-Myc. Tuloksena 90 aminohappoa miniprotein – kutsutaan Omomyc sen kyky muodostaa homodimeerejä – kykenee estämään C-Myc /Max yhdistys, vaikuttamaan transkription aktivaatio c-Myc, ja parantaa c-Myc riippuvaista apoptoosia kudosviljelysoluissa [9 ], [10]. Sen osoitettiin estää c-Myc indusoiman papillomatosis

in vivo

vaikuttamatta kudoksen homeostaasin [11] viittaa siihen, jonka kapasiteetti on kohdistettu tuumorisolujen vahingoittamatta normaalia kudosta.

huolimatta levinnyt rooli ihmisten syöpä, Myc kohdannut merkittävää epäilyä terapeuttisena kohteena, koska sen vaatimus lisääntymistä ja ylläpitoon aikuisten kantasolujen osastoihin epäilivät myrkyllisyyttä Myc eston terveiden kudosten [12], [13]. Osittain ansiosta työskennellä Omomyc potentiaalia Myc terapeuttisena kohteena on nyt vakiintunut. Paljon epäilyjä selektiivisyys kasvaimia on hälventää tutkimukset osoittavat, että ohimenevästi estävä Myc ihon, suolen epiteelin ja muissa kudoksissa ei dramaattisesti muuta kudosta homeostaasin [11], [14], [15]. Tehoa ja turvallisuutta Myc kohdistaminen

à la Omomyc

on lopullisesti osoitettu reversiibeli ilmentymistä Omomyc transgeenisissä malleissa [16], [17]. Systeeminen ilmaus Omomyc heikennettyjä leviämisen nopeasti jakautuvat kudoksiin, mutta tämä oli hyvin siedetty; kudos homeostaasin pidettiin, ei apoptoosia havaittiin normaaleissa kudoksissa, ja kaikki haittavaikutukset olivat nopeasti päinvastaiseksi seuraavat Omomyc poisto. Ras-odotuksiin keuhkotuumoreita, vaikutus Omomyc oli vaikuttava. Hiiret jatkuvasti ilmentävät Omomyc onnistuneet kehittämään keuhkojen adenokarsinooma. Hiirillä, jotka olivat aiemmin kehittynyt pitkälle edennyt syöpä, induktio Omomyc laukeaa kasvainregressio joka oli mukana vähentynyt proliferaatio ja lisääntynyt apoptoosin kasvainkudoksen [16]. Vastaava syövänvastainen vaikutus löydettiin apinan virus 40 (SV40) -indusoituun haiman saarekesolujen kasvaimeen malli [17], rintasyövässä (G. Evan, henkilökohtainen tiedonanto) ja gliooma (valmisteilla). Joten, manipuloimalla Myc funktio samalla tavalla Omomyc voisi olla potentiaalia tehokas syövän vastaisen strategian eri kasvainten tyyppejä.

Koska silmiinpistävää ominaisuuksia tämän molekyylin, se on erittäin tärkeä selvittämiseksi sen vaikutusmekanismia. Omomyc biologiset vaikutukset ovat yksinkertaisesti tuloksia

tout tuomioistuin

Myc toiminto ablaatio, koska se esiintyy Myc-geeniä tai mRNA aihiot? On selvää, selittää huomattavat ominaisuudet Omomyc on tärkeää ymmärtää, ovatko ne ilmenevät valikoivaa kohdentamista Myc interactome ja siitä, miten ne vaikuttavat Myc aktivoitu ja tukahdutettu tavoitteet. Näitä kysymyksiä käsitellään myös tässä työssä.

tulokset osoittavat, että Omomyc ei aiheuta maailmanlaajuinen esto Myc funktio vaan toimii reuna-erityisiä häiritseekin Myc interactome, kanavoimalla aktiivisuutta transrepression. Tämä voi olla avain menestykseen kuin syöpälääke.

Tulokset

Omomyc valikoivasti kohdistettu Myc interactome

suora fyysinen vuorovaikutus bHLHZip proteiini Max on ratkaisevaa Myc toiminto : Myc /Max kompleksi sitoo DNA – tunnustaa E-box – ja toimii transkriptioaktivaattorina [18]. Omomyc pystyy homodimerize, muodostaa heterodimeerejä C-Myc ja Max proteiineja, ja häiritä c-Myc /Max kompleksin muodostumisen ja sitoutumalla E-box-in vitro [9], [10]. Paremmin osoite Omomyc valikoivuus tutkimme sen kykyä sitoa N-Myc – joka jakaa merkittävä toiminnallinen redundanssi c-Myc ja on tärkeä rooli kasvainten muodostumista hermostossa -, Mad – puhtaasti liittyvä bHLHZip tekijä dimerisoituu Max, sitoo E-laatikot ja toimii transkription repressori [4] -, Hepr ja ID1 – kaksi HLH proteiineja edustaa suuri perhe transkription sääntelyviranomaisten osallisina kehitysprosessien [19]. Arvioida kykyä sitoa N-Myc suoritimme immuunisaostuksissa 293T-soluissa ektooppisesti ilmentävät Omomyc fuusioitu estrogeenireseptori ER ™ – Omomer [10] – ja FLAG-leimattua C- tai N-Myc. Olemme havainneet, että Omomyc sitoutunut N-Myc samalla tavalla c-Myc (kuvio 1A), kanssa virtuaalisen identiteetin bHLHZip domeenin aminohapposekvenssit Myc proteiinit. Arvioida sitoutumisen Max, Mad ja kaksi HLH proteiinit hepr (E proteiini) ja ID1 suoritimme avattavasta määrityksiä GST-sidottu Max, Mad, Hepr ja ID1 otteisiin 293T-solujen ektooppisesti ilmentävät FLAG-merkitty Omomyc. Kun taas sitoutuminen Max vahvat kuin aiemmin raportoitu [9], Omomyc sitoutuminen Mad oli tuskin näkyvä ja sitoutuminen Heb ja ID1 oli havaittavissa (kuvio 1 B). Heikko signaali GST-Mad avattavasta johtuu todennäköisesti erittäin korkeita FLAG-Omomyc ilmentymistä transfektoiduissa soluissa ja ne eivät edusta fysiologisen vuorovaikutuksen kahden proteiinin. Yhteenvetona, olemme huomanneet, että Omomyc sitoutumisspesifisyys Max ja Mad proteiinit oli sama kuin Myc. Samoin Myc, Omomyc ei näytä vuorovaikutuksessa HLH proteiinien ja siksi ei toimi häiritsemällä HLH proteiini verkkoja ratkaiseva erilaistumisen valvontaa [20] – [22]. Sitten kysyi sää Omomyc vuorovaikutuksessa Hypoksia indusoituvat kerroin 1-alfa (Hif-1α) on proteiini, joka toimii isäntä transkription säätelijä sopeutumisen hypoksia, on keskeinen rooli kasvaimen angiogeneesiä ja osoittaa huomattavaa vuorovaikutus Myc sääntelyssä useiden glykolyyttisistä geeneistä [23] – [25]. HIF-1α sisältää bHLH verkkotunnuksen ja antagonisoi Myc sitoutumalla Max [24]. Tutkia Omomyc sitoutumisen Hif-1α suoritimme immuunisaostuksissa 293T-soluissa ektooppisesti ilmentävät FLAG-leimattua Omomyc yhdessä Hif-1α. Löysimme (Fig. 1 C), joka Omomyc ei sitoudu Hif-1α, kun taas Max ei raportoitu. Kaiken kaikkiaan nämä kokeet osoittavat selvästi, että Omomyc on Myc-Max-Mad-verkon erityinen ja – tässä verkossa – valikoivasti vaikuttaa Myc /Max dimerisaatio, tarvitaan Myc sitoutumisen E-laatikot ja transaktivaation suuri määrä geenejä.

) Omomyc sitoo c-Myc ja N-Myc. Immunoblottaus (WB), FLAG ja ER-vasta-aineita – kuten – ja immunosaostukset suoritettiin FLAG-vasta-293T-solut transfektoitiin FLAG-c-Myc tai FLAG-N-Myc ilmentävillä vektoreilla yhdessä Omomer ilmentävällä vektorilla. B) Omomyc sitoo Max muttei Mad ja kahden edustavan HLH proteiineja. Immunoblottauksella (WB) FLAG-vasta-aineita GST avattava määritykset suoritettiin GST, GST-MAX, GST-MAD, GST-ID1 ja GST-HEB (10 ìg kumpaakin) 293T-solut transfektoitu FLAG-Omomyc ilmentävällä vektorilla. 293T-soluissa, jotka on transfektoitu ID2 tai FLAG-13i [65] ilmentävillä vektoreilla käytettiin positiivisena kontrollina GST-HEB: n ja GST-ID1, vastaavasti. Otteita ilmentävien bakteerien His-MAX käytettiin positiivisina kontrolleina GST-MAX ja GST-MAD. C) Omomyc ei sitoudu Hif-1α. Immunoblottauksella (WB) kanssa Hif-1α, Max ja FLAG-vasta-aineita – kuten – of immuunisaostuksissa suoritetaan FLAG vasta-293T-solut transfektoitu Hif-1α, Max ja FLAG-Omomyc ilmentävillä vektoreilla. D) Omomyc sitoutuu Miz-1. Immunoblottauksella (WB) ja Miz-1 ja ER-vasta-aineita – kuten – of immuunisaostuksissa suoritetaan Miz-1 vasta-aineiden vaikutusta 293T-solut kotransfektoitiin Miz-1 ja Omomer ilmentävillä vektoreilla.

Keskeistä Myc toiminta on transrepression lukuisten geenien kasvun säätelyssä, erilaistumiseen ja tuumorisuppressiogeeneksi [4]. Tämä toiminta ei näytä sotkea suoraan Myc sitoutumalla E-laatikoita. Myc rekrytoimista promoottorit tukahdutettua geenien vain välillisesti, kun vuorovaikutus proteiineja, jotka suoraan sitoutuvat tällaiset promoottorit. Tunnetuin niistä on Miz-1, sinkkisormipolypeptidiin osallistuva proteiini Myc riippuvainen tukahduttaminen solukierron estäjiä – P15-INK4b (Sykliinistä riippuvaisen kinaasin 4 estäjä B) ja p21 (CDKN1: sykliiniriippuvaisen estäjä 1) – ja in Myc riippuvaista apoptoosia vastauksena kasvutekijän peruuttamisesta [26] – [29]. Oletettavasti monimutkaisissa Max, Myc yhteystiedot Miz-1 N-pään alueen kautta aminohappo sivustoja D394 ja S405 [28], jotka sijaitsevat HLH alueella. Koska nämä sivustot eivät mutatoituneet Omomyc, me arveltu, että Omomyc säilytetään kyky sitoa Miz-1. Testasimme tätä mahdollisuutta kautta immunosaostus 293T-soluissa ektooppisesti ilmentävät Omomer ja Miz-1. Kuva 1D osoittaa, että Omomyc suoraan vuorovaikutuksessa Miz-1. Endogeeninen Miz-1: n raportoitiin kerääntyä solujen sytoplasmassa, jossa pieni murto-osa tumaan; Myc yliekspressio laukaisee tumaansiirtymiseen of Miz-1 ja sitomisen diskreetti subnuclear pesäkkeitä [30]. Vuorovaikutuksen tutkimiseksi ja solunsisäisen lokalisaation Omomyc, Omomyc /Miz-1 ja Omomyc /c-Myc-komplekseja, me 293T-solut FLAG-leimattua Omomyc tai c-Myc ekspressoivien plasmidien yhdessä ilmentävien plasmidien korvamerkittöminä Miz-1 ja C-Myc, ja havaitaan proteiinin lokalisointi immunofluoresenssilla anti FLAG, c-Myc, ja Miz-1-vasta-aineita (kuvio 2). Transfektoiduissa soluissa yhden ekspressioplasmideilla, Miz-1 oli enimmäkseen (noin 90%) sijaitsi sytoplasmassa, kuten aiemmin on raportoitu [30], Myc oli läsnä ainoastaan ​​tumassa, kuten odotettua, ja Omomyc oli pitkälti tumassa (noin 85% ), jossa pieni osa sytoplasmassa (kuvio 2). Omomyc puuttuu tumalokalisaatiosignaalin Myc proteiineja: se voi tulla ydin sen pienen koon tai kun dimerointi endogeenisten Myc tai Max. Kun kotransfektoitiin, useimmat Myc proteiinit yhteistyössä paikallistaa Omomyc tumassa; murto-osa Omomyc pysyi sytoplasmassa – assosioitumattomaan Myc – todennäköisesti johtuen korkeamman ilmentymisen. Ektooppinen Myc ilmaisu laukaisi tumaansiirtymiseen ja Miz-1 (noin 40%) ja muodostuu erillisistä subnuclear pesäkkeitä, kuten aiemmin on raportoitu [30]. Miz-1 on osittain siirretty tumaan, kun läsnä on yli-ilmentynyt Omomyc sekä (noin 35%). Endogeeninen Miz-1 -, joka on läsnä pieninä määrinä soluissa [30] – oletettavasti pääasiassa tumaan, kun läsnä on yli-ilmentynyt Myc tai Omomyc.

A) Immunofluoresenssi mikrovalokuvia 293T-solut transfektoitiin Miz -1, c-Myc, FLAG-c-Myc ja FLAG-Omomyc ekspressoivien plasmidien – kuten edellä paneelit – ja värjättiin vasta-aineiden FLAG (vihreä), Miz-1 (punainen) ja c-Myc (punainen), kuten sisällä paneelit. Ytimet samojen kenttien värjättiin sinisellä DAPI (4,6-diamino-2-fenyyli). B) määrän määritys esitetyissä kokeissa A), joka perustuu tarkasteluun 15 mikroskopia kentän ja vähintään kolme biologista rinnakkaisnäytettä.

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että häiriön Myc interactome mukaan Omomyc tuloksia ei vain estyminen Myc sitoutumisen Max – joka tarvitaan E-box sitova ja transaktivaation – mutta myös vuorovaikutuksesta Omomyc kanssa Miz-1, joka on Myc sitovan kumppanin mukana transrepression.

Omomyc vaikuttaa transkription vaste fibroblastien seerumin stimulointi

Myc-proteiinit kykenevät sitoutumaan 10-20% genomisen lokuksen ja ekspression modu- satoja tuhansia geenejä. Omomyc osoitettiin heikentää transaktivaation Myc aktivoitua kohdegeenin

cad

vuonna RAT1 fibroblasteja eikä vaikuta downregulation Myc tukahdutettu tavoite

gadd45

[10]. Saada käsityksen laajaa geenien ilmentymisen muutoksia vaikutteita Omomyc, olemme analysoineet transkription vastaus seerumin stimulointi RAT1 fibroblastien vakaasti infektoidaan Omomer tuottavat tai tyhjän retrovirus (RAT1-Omomer ja RAT1-ohjaus soluissa, vastaavasti, kuten on kuvattu [ ,,,0],10]). c-Myc tiedetään vaimentua seerumin nälkään ja voimakkaasti indusoi seerumin lisäksi – yhdessä useiden muiden välittömän varhaisen geenejä – huipussaan jälkeen 1-2 h; c-Myc induktio on rooli solusyklin re-entry [31] – [33]. Sen lisäksi solujen lisääntymistä, seerumin vaste fibroblastien integroi muiden prosessien – e. g. haavan paranemista [34] – ja seerumin geenien sisältävät geenejä, jotka säätelevät Myc sekä geenit, jotka eivät ole. Solut seerumin puutteessa ennen seerumin stimulaatiota ja mRNA: n ekspressio analysoitiin aikaan seerumin uudelleen lisäksi (aika 0) ja 90 ’jälkeen – ajanhetkeen, jossa Myc induktio on maksimaalinen – niin, että induktio on suora Myc tavoite olisi läheisesti seurata ilmaus Myc. mRNA-ekspressiota analysoitiin kautta oligonukleotidin array sisältää koettimia noin 7000 täyspitkät sekvenssit ja 1000 EST (expressed sequence tags) klustereita. Tiedot ovat saatavilla GEO tietokannassa seuraavat hakunumero: GSE25039. Suhteelliset mRNA ilmaisu arvot (kertamuutoksia) laskettiin ottamalla viitteeksi RAT1-ohjaus soluissa hetkellä 0; vain geenit osoittavat kertamuutos vähintään +3 (voimistunut geenejä) tai -3 (vaimentua geenit) otettiin huomioon. Tuolloin seerumin stimulointi, Omomer ilmentävät ja hallita RAT1 soluilla lähes identtinen geeniekspressioprofiili (kuva 3, ylhäällä). Klo 90 min seerumin induktioon 111 sekvenssit voimistunut ja 96 vaimentua in RAT1-ohjaus soluissa. Silmiinpistävän, korostunut downregulation löytyi RAT1-Omomer solut: koska monet 516 geenin sekvenssit vaimentua ja 143 voimistunut (taulukko S1). Kaiken kokonaismäärä sekvenssit, joiden ekspressio oli ylös- tai vaimentua, kun läsnä on Omomyc jälkeen 90 min seerumin stimulointi oli 8,2% koettimista on jono. Niistä sekvenssit vaimentua, kun läsnä on Omomyc, 475 edustaa geenejä, joiden tiedetään olevan GeneID (geenin tunniste) ja 41 muuta transkriptoidaan alueilla. Selvittää geenien vaimentua läsnäollessa Omomyc myös validoitu Myc tavoitteet vertasimme niitä joukko geenejä lueteltu Myc Cancer Gene tietokanta (www.myccancergene.org), kokoelma Myc reagoivien geenien tunnistettu riippumattomien tutkimusten avulla erilaisia ​​tekniikoita [35]. 115 (24%) ja 475 geenien vaimentua läsnäollessa Omomyc lueteltiin Myc kohdegeenin tietokannassa: 45 listattiin voimistunut ja 35 kuten vaimentua mukaan Myc, kun taas ylös tai alas säätely loput 35 geenit oli tuntematon. Huomauttaa suora Myc luettelon kohteet geenien vaimentua läsnäollessa Omomyc, listan risteytettiin näitä kahdesta tutkimuksesta, jotka käytetään ChIP analyysiä määrittämään genomin laaja promoottori käyttöasteen Myc alkion kantasoluja (ES-solut) [36], [37]. 31,5%: n geenien vaimentua läsnäollessa Omomyc oli promoottoreita, jotka ilmoitettiin välittömästi sidottuja Myc ES-soluissa (P-arvo: 1,3 × 10

-24) verrattuna 19%: sen puuttuessa (P- arvo: 3 x 10

-2). Kaikkiaan 44,4%: n Omomyc vaimentua geenit osoittautui olevan aito Myc tavoitteiden mukaan joko Myc kohdegeenien tietokannasta tai listaus Myc sidottu promoottorit ES-soluissa (Venn-kaavio: kuvio 4A). Geenit yhteinen kaikille kolme ryhmää ovat ryhmittyneet yhteen suuntaan kuviossa 4B. Tällainen suuri – vaikkakin puutteellinen – päällekkäisyys geenejä, joiden downregulation oli liittyy Omomer aktivaation RAT1 fibroblasteissa ja validoitu Myc tavoitteet on erittäin merkittävä. Tämä päällekkäisyys on epätäydellinen on yhdenmukainen muiden analyysien ilmaisu- ja laskennallisesti saatu geeni sarjaa [38], [39], ja se saattaa johtua osittain muita vaikutuksia seerumin. Kuva 3 (keskellä) esittää luokittelu toimintakategorioihin perustuu GO (Gene ontologia) ehdot. Kuten raportoitu liittyviä geenejä c-Myc toimintaa [36], [40], [41], geenit vaikuttavat Omomyc jakautuvat useisiin toiminnallisiin luokkiin, joissa kasvu, aineenvaihdunta, solu signalointireittejä, solusyklin etenemistä, ja apoptoosin. Erityisesti, geenien vaimentua, kun läsnä on Omomyc rikastuneet luokkiin – nukleotidi- ja nukleiinihapon aineenvaihduntaan – jotka ovat yliedustettuina tavoitteet voimistuvan c-Myc [36], [40] – [42], joka tukee käsitettä Omomyc estäjänä Myc välitteisen transaktivaation (kuva 3, alhaalla). Tavoitteet tiedetään voimistuvan Myc ja todettu vaimentua mukaan Omomyc sisältää geenejä, jotka koodaavat proteiineja, jotka osallistuvat suoraan kääntämisen ja ribosomin kokoonpano – kuten käännöksen aloittamista tekijä Eif3s9, käännöksen elongaatiotekijän Eef1a1, ja ribosomaalinen proteiini L3 ja S4 – samoin koska geenit koodaavat metabolisia entsyymejä – isositraattidehydrogenaasin 2, laktaattidehydrogenaasin B ja fosfoglyseraattikinaasia 1 -, proteiinit, jotka osallistuvat solusyklin etenemisen – anafaasia edistävän kompleksin alayksikön Anapc5, sykliini B1 ja sykliini D1 -, ​​ATPaasi /DNA helikaasin TIP49 (Ruvbl1) ja rakenteellinen chromatin proteiinin HMGB1. HMGB1 on tärkeä rooli kromatiinin remodeling ja on välittäjänä tulehduksen, joiden yli-ilmentyminen liittyy monien kasvainten tyyppiä [43]. TIP49 on tärkeä Myc kofaktori, mukana Myc transkription ja onkogeenisten toiminnot [44]. Useita geenejä havaittiin vaimentua mukaan Omomyc ja sen tiedetään olevan Myc tukahdutettu tavoitteet koodaavat proteiineja, jotka liittyvät signalointireittien, soluadheesiota ja transkription – kuten Akt1 erbB2, c-Jun ja fibroblastikasvutekijäreseptori FGFR1 – kun

Mxi1

koodaa proteiinia, joka on vuorovaikutuksessa Max ja säätelee negatiivisesti Myc-toiminto.

Mxi1

on tukahdutettu Myc [45], mutta aktivoidaan Hif-1α [46], [47]. Viat tämä geeni on raportoitu eturauhasen syöpä ja osajoukko glioblastoomat [48], [49].

Omomyc edistää downregulation lukuisia geenejä. Top. Monia muitakin geenejä vaimentua vuonna RAT1 soluissa, jotka ilmentävät Omomer (Omomer) kuin soluissa, jotka eivät (Control) 90 ’seuraavissa seerumin stimulointi RAT1 fibroblastien läsnäollessa tamoksifeenin. Määrä voimistunut geenejä oli samanlainen. RAT1-ohjaus soluissa hetkellä 0 otettiin viitteenä. Lähi. Jakelu eri Biological Process luokissa – perustuvat Gene ontologia luokittelu – geenien vaimentua 90 ’seuraava seerumin stimulaation Omomer ja valvontaa soluja. Pohja. Liittyvien geenien nukleotidi- ja nukleiinihapon aineenvaihduntaan ovat kaikkein merkittävästi yliedustettuna – laskemana Panther ohjelmisto – joukossa geenien vaimentua, kun läsnä on Omomyc (Omomer solujen läsnä ollessa tamoksifeenin).

A) Venn-kaavio, joka havainnollistaa päällekkäisyys geenien vaimentua jonka Omomyc esillä olevassa tutkimuksessa, luetelluista geeneistä kuten Myc tavoitteet Myc kohdegeenin tietokanta (www.myccancergene.org), ja geenit, on raportoitu olevan suoraan sitoutua c-Myc ES soluihin [29], [38]. Sisällä Myc kohdegeenin tietokantaan ja ES-solujen aineistoja, vain geenit, jotka oli luotain Affymetrix U34A array otettiin huomioon. B) Päällekkäiset, bona fide Myc kohdegeenien poimittiin meidän aineisto ja ryhmitelty yksi ulottuvuus. C) Suhteellinen ilmentymistaso (kertaluokkamuutos) – mitattuna Real Time PCR 90 min seuraavissa seerumin stimulaation läsnä ollessa tai poissa ollessa 4-OHT – on

CCND1

,

Eif3s9

,

PGK1-

,

Akt1

,

ErbB2

,

Gadd45a

,

Mxi1

mRNA villityypin (vasemmalla) ja Myc nolla (oikealla) RAT1 solut, jotka ilmentävät tamoksifeenin indusoituva Omomyc (Omomer).

CCND1

,

Eif3s9

,

PGK1-

edustavat Myc aktivoitu tavoitteet;

Akt1

,

ErbB2

,

Gadd45a

,

Mxi1

edustavat Myc tukahdutettu tavoitteita. Expression aikaan seerumin lisäys (aika 0) otettiin referenssinä laskettaessa kertaluokkamuutos.

edelleen vahvistaa havaintomme, suoritimme Real Time PCR-määrityksissä villityypin ja Myc null RAT1 fibroblasteja ilmentävät tamoksifeeni indusoituva Omomyc (kuvio 4C). Vertasimme – 0 ja 90 min seerumin stimulointi – ilmentymisen tasoja valitse näytteen geenien, joihin seerumin stimulointi, joiden tiedetään olevan joko tukahdutettu –

Gadd45a

,

Mxi1

,

ErbB2

,

Akt1

– tai aktivoitu –

PGK1-

,

Eif3s9

,

CCND1

– by Myc [40], [45 ], [50]. Nämä geenit, kuten mikä tahansa geeni, eivät sulje pois Myc tavoitteita, ja muut transkriptiotekijät moduloitu tai seerumin voivat edistää niiden sääntelyä. Huomasimme, että ekspressiotasot tukahdutettu tavoitteiden

Gadd45a

,

Mxi1

,

ErbB2

ja

Akt1

villityypin RAT1 solut eivät muuttuneet tai jopa repressoidun läsnäollessa Omomyc taas säätelyä aktivoitua tavoitteiden

PGK1-

,

Eif3s9

ja

CCND1

oli vaarantunut (kuvio 4C, vasemmalla). Vuonna Myc null soluja, huomasimme, että Omomyc ei vaikuttanut merkitsevästi ilmaus tukahdutettu eikä heikentänyt säätelyä aktivoitua tavoitteiden (kuvio 4C, oikealla). Siksi vaikutus Omomyc transkriptioon Myc aktivoitu tavoitteiden näyttää vaativan jonkin verran toimintaa Myc.

Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että Omomyc ei globaalisti estävät Myc funktio transkription säätely kohdegeenien ja viittaavat siihen, että valikoivasti häiritsee Myc transcriptome vaikeuttaen Myc välittämää transaktivaatiota ja säilöntä Myc välittämän tukahduttaminen.

Omomyc differentiaalisesti vaikuttaa transaktivaatio ja tukahduttaminen vaikuttamalla Myc sitoutumaan kohde-geenin promoottorit

liittyvien mekanismien ymmärtämiseksi geenisäätelyn by Omomyc, teimme lusiferaasireportteri- ja kromatiinin immunosaos- (ChIP) määritykset kaksi geeniä, jotka koodaavat nucleolar proteiinia nukleoliinin ja sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittorin p21, vastaavasti, jotka edustavat todellisia ja kohdistu suoraa Myc aktivaation ja tukahduttamisen [51], [52]. c-Myc pystyy aktivoimaan

nukleoliinin

transkriptio kahdella erittäin konservoitunut E-laatikot introni 1 [51]. Testata kykyä Omomyc estää Myc-välitteisen transkription aktivaation, teimme toimittaja määrityksissä 293T-soluissa, jotka oli transfektoitu lusiferaasireportteriplasmidi pNucL14 [51] -, joka sisältää hiiren

nukleoliinin

promoottorin, eksonin 1, intronin 1 ja ensimmäinen 8 nt: n eksonin 2 – yhdessä erilaisten yhdistelmien FLAG-c-Myc ja Omomyc ekspressioplasmidien (kuvio 5A). Olemme havainneet, että Omomyc inhiboi Myc aktivaatio lusiferaasireportterigeenin annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas se ei vaikuta sen perusaktiivisuutta. Voit testata, onko estyminen

nukleoliinin

transaktivaatiota Omomyc johtui vähentämiseen promoottorin sitova, mittasimme määrä Myc sitoutuneen

nukleoliinin

promoottorin 293T-solut transfektoitu

nukleoliinin

reportteri, FLAG-c-Myc ja Omomyc ilmentävien plasmidien. Talteenotto

nukleoliinin

DNA saostetaan samanaikaisesti Myc kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR: llä, käyttäen alukkeita sijaitsee noin kaksi E-laatikot

nukleoliinin

introni 1. Olemme havainneet, että Omomyc aiheutti 40%: n vähennys määrän promoottorin sitoutuneen Myc (kuvio 5B, vasemmalla). Lisäksi kilpailevat Myc /Max yhdistys, Omomyc kykenee muodostamaan homodimeerejä sekä Omomyc /Max dimeerejä: vain jälkimmäinen sitoa E-laatikot

in vitro

korkea hyötysuhde [9]. Siksi Omomyc saattaa vaikuttaa Myc sitoutumalla DNA kahdella concurring mekanismien: inhibitio Myc /Max dimerisaation sekä suora kilpailu E-box sitova. Arvioida jälkimmäinen, mittasimme määrä Omomyc sitoutuneen

nukleoliinin

promoottorin transfektoiduissa soluissa c-Myc ja FLAG-Omomyc ekspressoivien plasmidien (kuvio 5B, oikealla). Huomasimme, että Omomyc oli nimenomaan rekrytoitiin E-box sisältävän alueen intronin 1 ja että se kilpaili c-Myc: n kanssa sitoutumisesta tälle alueelle. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että Omomyc voi vaikuttaa transaktivaatio sitomalla Myc komplekseissa kykene sitoutumaan E-laatikot sekä toimimalla – oletettavasti yhdessä Max – kuten kilpaileva estäjä Myc /Max komplekseja E-Box sitova.

A) Lusiferaasiaktiivisuutta hiiren

nukleoliinin

promoottori reportteriplasmidilla – pNucL14 – transfektoiduissa 293T-soluissa yhdessä FLAG-c-Myc ja Omomyc ilmentävillä vektoreilla. Data normalisoitiin transfektoimalla PRL-TK Renilla lusiferaasi. Pohjapinta aktiivisuus toimittaja asetettiin arvoon 100. B) kvantitatiivinen ChIP määritystä Myc ja Omomyc sitoutumaan

nukleoliinin

promoottorialue (Ncl; harmaat palkit). Vasen: FLAG-c-Myc sitova 293T-soluissa, jotka oli transfektoitu

nukleoliinin

toimittaja pNucL14 yhdessä FLAG-c-Myc ja Omomyc ilmentävien plasmidien. Oikealla: FLAG-Omomyc sitova 293T-soluissa, jotka oli transfektoitu

nukleoliinin

reportteri yhdessä FLAG-Omomyc ja c-Myc ilmentävien plasmidien. Alueella on

lusiferaasia

koodaussekvenssin (Luc; mustat palkit) käytettiin kontrollina. Pylväät edustavat prosentuaalinen osuus DNA immunosaostettiin, kun tausta on vähennetty. ChIP arvot ilmaistaan% panos DNA.

tutkia, miten Omomyc voivat toimia tukemaan Myc välittämää tukahduttaminen, teimme määritykset ihmisen

p21

promoottori – nimenomaan sekvenssi käsitti välillä -194 ja +16 alkaen transkription aloituskohdasta – johon Myc värvää sinkkisormen proteiini Miz-1 [27], [52]. Teimme toimittaja määrityksissä ja havaittiin, että lusiferaasin ilmentymistä ohjaavat täyspitkän ihmisen

p21

promoottori – p21Cip1-Luc [53] – estyi c-Myc, ja että Omomyc oli synerginen c-Myc (kuvio 6A ). Mielenkiintoista – jopa ilman yhtäaikaa transfektoidun c-Myc – Omomyc provosoi

p21

promoottori tukahduttaminen tasolle samanlaisia ​​kuin aiheuttaman c-Myc. Siksi Omomyc pystyy tukemaan

p21

promoottori tukahduttaminen sekä läsnä ja poissa ollessa yli-ilmaisivat c-Myc. Sen tutkimiseksi, onko tämä liittyi lisääntyneeseen promoottorin sitovia, suoritimme ChlP määritykset 293T-solut, jotka oli transfektoitu p21 reportteri yhdessä FLAG-Myc ja kasvavan määrän Omomyc plasmidin. Havaitsimme, että Omomyc selvästi lisääntynyt c-Myc sitoutumisesta -194-+16 alueelle (kuvio 6B, ylhäällä). Mielenkiintoista on, että vastavuoroisesti määritystä soluihin transfektoitiin FLAG-Omomyc ja yhä enemmän c-Myc-plasmidi osoitti, että Omomyc kykeni vuorovaikutuksessa saman

p21

promoottorialue (kuvio 6B, alhaalla). Tällöin Myc yliekspressio ei kilpaile Omomyc sitovia.