Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain yksilöt ovat usein säilyneet formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kudosblokeista, yleisin kliininen lähde DNA sekvensoinnilla. Tässä arvioimme vaikutus ennalta sekvensointi parametrien ohjata oikea otoksen valinta kohdegeenin sekvensointi. Tiedot 113 FFPE keuhkosyövän näytteet kerättiin, ja kohdegeenin sekvensointi suoritettiin. Kirjastoa konstruoitiin käyttäen muokattuja antureista ja olivat pariksi-end sekvensoitiin seuraavan sukupolven sekvensointialustamme. PCR-pohjainen laadunvalvonta (QC) määritys käyttää määrittämään DNA laatua, ja suhde oli tuotettu verrattuna kontrolli-DNA. Havaitsimme, että FFPE varastointiaika, PCR /QC-suhde, ja DNA panos kirjastossa valmistelussa merkittävästi korreloi suurin parametrien sekvensointi tehokkuuden lukien kattavuutta, yhdenmukaistaminen korko, insertin koko ja lukea laatu. Yhdistetty pisteet käyttäen kolmea parametrit syntyi ja osoittautui erittäin tarkka ennustaa sekvensointi mittareita. Osoitimme myös laaja lukea count vaihtelu genomin, jolla on huonompi kattavuus harvaan GC sisällön kuten

KRAS

. Näyte laatu ja GC-pitoisuus oli riippumattomia vaikutuksia sekvensointi syvyyttä, ja pahiten havaittiin harvaan GC sisällön näytteitä huonolaatuista. Tuloksemme vahvistavat, että FFPE näytteet ovat luotettava lähde kohdennettuja geenisekvensseihin syövän, edellyttäen riittävä näyte laadunvalvontaa käytetään. Tissue laatu olisi rutiininomaisesti arvioitava preanalyyttiset tekijät, ja sekvensointi syvyys voidaan rajoittaa genomialuetta alhaisen GC sisällön jos optimaalisella näytteiden hyödynnetään.

Citation: Araujo LH, Timmers C, Shilo K, Zhao W Zhang J, Yu L, et ai. (2015) vaikutus preanalyyttiset muuttujat syöväntutkimuslaitos Kohdennettu Gene Sequencing Tehokkuus. PLoS ONE 10 (11): e0143092. doi: 10,1371 /journal.pone.0143092

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 04 syyskuu 2015; Hyväksytty: 26 syyskuu 2015; Julkaistu 25 marraskuuta 2015

Copyright: © 2015 Araujo ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: LHA tukee Conquer Cancer Foundation of ASCO pitkäaikaista International Fellowship (Life) ja Landon Perustusten AACR uudistaja palkinnon International Collaboration in Cancer Research. Tämä työ on rahoittanut NIH /NCI 1RC1 CA146260-01, NCI R01CA60691, NCI R01CA87895, NCI P30CA022453 ja Ohio State Cancer Center Support Grant (CCSG), NCI CA16058. T.G.N ja C.J.M. työskentelee GenomOncology. Tämä rahoittaja tuettiin muodossa palkkojen tekijöille (T.G.N ja C.J.M), mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet tekijän maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: T.G.N ja C.J.M. työskentelee GenomOncology. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Viime vuosikymmenen, ymmärtämään paremmin syövän biologian ja tunnistaminen somaattisten mutaatioiden syöpä ovat johtaneet uuden aikakauden yksilöllisiä onkologian. [1] Landmark esimerkkejä mukana löytö mutaatioita proto-onkogeenien c-

KIT

ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet (GIST), [2] epidermaalisen kasvutekijän reseptori (

EGFR

) keuhkojen adenokarsinooman, [3] ja v-Raf hiiren sarkooma viruksen onkogeenin homologi B1 (

BRAF

) melanoomissa. [4] Kasvaimet kätkeminen nämä mutaatiot aikaan erinomaisia ​​herkkyys tietyille kinaasi inhibiittorit kohdistuvat vastaaviin aktivoituvien reittien.

Nämä kasvaimia synnyttävän mutaatiot määritellään usein syövän kuljettajien koska ne tarjoavat valikoivaa etua soluun klooni, välttämättömiä kasvaimen käynnistämiseen ja ylläpitoon. [5] klinikalle, ne voivat toimivat sormenjälkiä, joiden avulla kliinikot alatyypin syöpiä, jotka muutoin läsnä samanlainen histologinen kuvioita. [6-9] Vaikka mutaatiostatuksesta profilointi on tullut hyödyllinen väline räätälöintiin paremmin kohdennettuja hoitoja, kohtaavat uusia haasteita myös usein tarve saada optimaalinen Tuumorinäytteet ylimääräisiä geneettisen testauksen. [10-12] Lisäksi useat testit voidaan suositella hoitopaikassa, jossa lukuisia Hakijan mutaatioita on arvioitava. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), muutoksia ainakin 10 esikasvaintekijät on ehdotettu mahdollisesti ”druggable”, jossa mutaatio taajuudet vaihtelevat 1%: sta 25%

MAP2K1

ja

KRAS

vastaavasti mukaan tutkitussa populaatiossa. [13] paras algoritmi testaukseen, mukaan lukien peräkkäinen vs. multiplex arvioida tällaisten muutosten on vielä Kiistanalaista.

Vaikka Sangerin sekvensointia on perinteisesti käytetty havaitsemiseksi toistuvien pistemutaatioiden syövän, uusien tekniikoiden ansiosta kattavampi analyysi geneettisten häiriöiden. Tässä skenaariossa seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) alustat-tunnetaan myös massiivisesti rinnakkaisen sekvensointilaatuinen tarjoavat monenlaisia ​​mahdollisuuksia luonnehtia syövän genomin. [14-16] Esimerkiksi saatavuudesta hybridisaatio-kaapata tekniikoita tarjoaa korkean -throughput ja kustannustehokasta strategiaa arvioida satoja geenejä samanaikaisesti. [16-19] Lyhyenä menetelmiin tarkastelun, genomista DNA: ta (gDNA) puhdistetaan tuumorinäytteistä ja leikattiin joko sonikoimalla tai restriktioentsyymejä miljoonien pieniä palasia (kymmeniä tai satoja nukleotidia pitkä). Nämä fragmentit hybridisoidaan sitten mukautetun koetin joukon, joka sisältää syötit, jotka ovat spesifisiä mielenkiinnon kohteena olevia geenejä, ja vahvistetaan tuottaa sekvensointi kirjasto. Ainutlaatuinen viivakoodi liitetään kunkin kirjaston-vastaavat jokaista näytteen, joka mahdollistaa useiden näytteiden keskittää yhteen sekvensointia. Useat kaupalliset DNA kuvankaappausteknologiat ovat tällä hetkellä saatavilla, ja monet laitokset ovat suunnitelleet ja toteutettu räätälöityjä kohdennettuja paneelit genotyypittämiseksi syöpänäytteissä. [10, 20, 21]

Kliininen kasvaimen yksilöt ovat usein säilyneet formaliinilla kiinnitetyt parafinoidut (FFPE) kudos lohkojen biorepositories, ja tämä on helpoimmin saatavilla lähde saamiseksi gDNA sekä kliinisissä ja tutkimukseen asetukset. [22-24] kuitenkin useat vaiheet FFPE käsittelyn tiedetään aiheuttavan DNA-vaurioita, jotka suoraan vaikuttavat DNA laadun ja riittävyyden sekvensointia. Esimerkiksi formaliinilla kiinnitys voi johtaa erilaisten siltojen kahden aminohapon, kaksi nukleiinihappoa, tai välillä aminohappo ja nukleiini- happo-emäs. [25-27] Nämä kemialliset muutokset voivat hämmentää molekyylitestin estämällä entsymaattista manipuloinnin DNA: ta. Formaliini kiinnitys saattaa myös aiheuttaa nukleotidin hapettumista ja deaminoinnilla, jälkimmäisen ollessa liittyvät kehittämiseen keinotekoista nukleotidin siirtymät (enimmäkseen C T CpG dinukleotideissä) joukossa näytteitä tallennetaan FFPE. [23, 28] Lopuksi metyleeni silloitukset aiheuttama formaliini voi johtaa DNA pirstoutuminen, mikä rajoittaa DNA pituus sekvensointiin. Lisäksi formaliinin kiinnittymisestä kudosvalmistuksen, parafiinivalu, ja arkistointiteknologioita

sinänsä

voivat kaikki lopulta osansa näytteissä laatua. [29] Lisäksi FFPE lohkot saadaan usein pienistä koepaloja, ja alhainen kudos määrä voi olla ylimääräinen rajoitus sekvensointia. Jotta voitaisiin arvioida laadun gDNA uutettu FFPE näytteistä, PCR-pohjainen laadunvalvonta (QC) määritykset ovat suositeltavia. [30-33] Muita muuttujia, jotka todennäköisesti vaikuttavat lopulliseen sekvensoinnin tuloksiin sisältyvät määrä DNA käytettiin hyväksi kirjaston valmistelu, sekvensointi syvyyttä, ja kohdealueella kohteisiin (GC sisällön ja sekvenssihomologia).

Tässä arvioimme yksilön ja vaikutuksia yhdessä ennalta sekvensointi parametrit kohdegeenin sekvensointi tehokkuutta. Tätä varten käytimme täysin selityksin vedostulostus ominaista tietoa monenlaisia ​​preanalyyttiset muuttujia, jotka oli genotyyppi varten räätälöidyn geeni paneeliin käytetään kaupallisesti saatavilla kohdegeenin sekvensointi lähestymistapa-Agilent Haloplex Target Enrichment System (Agilent Technologies ). Tämä alusta eroaa muista hybridisaatio-kaapata tekniikoita, että allas restriktioentsyymejä käytetään sulattamaan näyte-DNA (toisin kuin sonikoimalla), ja koettimet on suunniteltu homologia vain päihin kohdennettujen DNA-restriktiofragmenttien. [34] myöhemmin universaali aluketta käytettiin monistamaan kaapattu alueilla ja luo tiheä samanlaisia ​​lukee muistuttava osumaa in amplikoni-pohjaisia ​​alustoja (S1 Kuva). Tästä syystä jotkut sekvensointi tietoja, kuten päällekkäisyys nopeudella ja ainutlaatuinen lukee kvantifiointiin eivät koske tätä tekniikkaa. Olemme myös vahvisti luku- syvyyden vaihtelu genomissa, paljastaa ongelmalliset alueet perustuvat GC sisällön, ja määritettiin niiden vaikutus parametrit variantti calling. Nämä tiedot voivat olla erittäin informatiivinen ohjata kliininen ja tutkimusyhteisön riittävän valinnassa kliinisistä näytteistä kohdennettujen geenisekvensseihin ja oikeaa tulkintaa sekvensoinnin tulosten funktiona näytteen laatu ja sekvensointi yhdenmukaisuutta.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

tutkittu aineisto käsitti 113 keuhkojen kasvain näytteet resektoitiin potilailta James Cancer sairaalan /Ohio State University (OSU, Columbus, OH) välillä 1988 ja 2011. Kaikki näytteet arkistoidaan FFPE kasvainkudospalasta, ja valittiin perustuen kudokseen saatavuuden. Sata ja kymmenen näytettä olivat ensisijainen NSCLC (60 adenokarsinoomat, 31 okasolukarsinoomia, 10 adenosquamous ja 9 muut histologinen alatyyppi), kun taas 3 näytteet olivat pään ja kaulan alueen syövät (kaikki okasolusyöpää) metastasizing keuhkoihin (taulukko A S1 File). Kukin näyte yksilöllinen, tunnistamattomia koodi ja päivämäärä leikkaus tarkasteli ja selityksin arvioida kasvainblokki säilytysajan. Institutionaalinen Review Board hyväksyi tämän hankkeen, ja luopua tarvetta suostuu.

Tissue käsittely

resektoitiin joissa on edustava kasvainkudoksen valittiin NGS testaus. Lisätä kasvain sisältöä, patologi (K.S.) merkitty H 0,01 kaikissa tapauksissa), ja keskimääräinen pohjan laatu (

r

= -0,188, p = 0,046), ja positiivisesti korreloi off-tavoitetason (

r

= 0,285, p 0,01), yhteensopiva parempia tuloksia, jos uudempia näytteitä on valittu. Laatukriteeristöä suhde korreloi lisätä koko (

r

= 0,601, p 0,01), ja merkityksettömän korreloivat kohdistaa kattavuus (

r

= 0,183, p = 0,058), linjaus rate (

r

= 0,169, p = 0,08), ja pohja laatu (

r

= 0,162, p = 0,094). DNA tulo korreloi kokonaismäärään lukee (

r

= 0,548), keskimääräinen Kattavuustavoite (

r

= 0,549), linjaus rate (

r

= 0,449), tarkoittaa pohja laatu (r = 0,477), ja off-tavoitteesta (

r

= -0,336, p 0,01 kaikissa tapauksissa), mutta ei lisätä koko (

r

= 0,081, p = 0,395). Nämä tiedot viittaavat siihen, että parempi QC suhde ja korkeamman DNA panos kirjastossa valmiste voi ennustaa suurempi sekvensointi tehokkuutta.

kolme preanalyyttiset muuttujat (FFPE varastointiaika, PCR /QC-suhde, ja DNA panos kirjastossa valmisteilla) merkittävästi korreloi kaikkein jälkeinen sekvensointi parametrit (A). Ennalta analyyttisten muuttujien luokiteltiin alle tai yli mediaaniarvojen havainnollistamaan vaikutusta insertin koon (B) sekä lukea laadusta /Phred pisteet (C). Lyhenteet: FFPE, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu kudokseen lohkot; PCR /QC, PCR-pohjainen laadunvalvonta.

yhdistetty vaikutus preanalyyttiset muuttujien

yhdistetty vaikutus preanalyyttiset muuttujia arvioitiin koulutus aineisto 33 genomista alueet, joilla mediaani kattavuutta 267 (vaihteluväli 43-464). FFPE säilytysaika negatiivisesti korreloi kattavuutta (

r

= -0,558, p 0,01; kuvio 2A), kun taas QC suhde ja DNA panos korreloivat positiivisesti (

r

= 0,37 ja 0,47, vastaavasti; p 0,01 molemmissa, kuviossa 2B ja 2C). Käyttämällä Monimuuttuja-analyysissä, osoitimme, että jokainen näistä muuttujista oli vielä merkittävästi korreloi sekvensointi suorituskyvyn (taulukko E S1 File). Jotta tuottaa ainutlaatuisen lukeman, jonka näyte laatu tässä kohortissa, yhdistimme kaikki kolme muuttujaa yhdistetyksi pisteet, kuten on kuvattu menetelmissä. Kuten odotettua, yhdistetty pisteytys korreloi voimakkaasti kattavuutta koulutukseen aineisto (

r

= 0,751; p 0,01; Kuva 2D). Vahvista sen tarkkuus, vertasimme sen keskimääräinen tavoite kattavuus kaikissa tutkituissa genomialuetta (riippumatta aiheuttama harha kopioluku muutokset) sekä luetun syvyyteen emäkset kätkeminen usein ituradan tai somaattiset yhden nukleotidin vaihtelut (SNV), joka sijaitsee geeneissä ei käytetty koulutuksessa aineisto. Siellä oli vahva positiivinen korrelaatio yhdistetyn pisteet ja syvyys kattavuus kaikissa näissä tapauksissa. Lisäksi olemme osoittaneet vahvaa korrelaatiota yhdistetyn pisteet ja 20x, 50x ja 100x tavoitteen perustakuuaika (

r

= 0,779, 0,790 ja 0,792, vastaavasti; p 0,01), sekä muut sekvensointi tehokkuuden parametrit (taulukko 2 ja kuvio 3A).

FFPE säilytysaika (A), PCR /QC-suhde (B), ja DNA-tulo (C) on verrannollinen sekvensointi kattavuutta. Yhdistetty pistemäärä (D) on rakennettu näiden kolmen parametrit, ja se korreloi sekvensointi syvyyteen. Lyhenteet: FFPE, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu kudokseen lohkot; PCR /QC, PCR-pohjainen laadunvalvonta.

yhdistetyn pisteet vahvasti korreloi jälkeiseen sekvensointi parametrit (A). Korrelaatio 50x kattavuutta käytetään määrittelemään preanalyyttiset kynnyksiä, jotka voisivat ennustaa sekvensointi tehokkuutta, ja havainnollistetaan tasoitus käyriä (B).

vieressä pyrittiin määrittämään preanalyyttiset cut-off-arvo, joka voisi ennustaa riittävän sekvensoinnin tulokset. Tämän vuoksi meidän piirretty ennalta sekvensointi muuttujat (mukaan lukien yhdistetyn pisteet) vastaan ​​50x kattavuuden meidän aineisto, ja määritellään 90% 50x peitto muuttujana suotuisia tuloksia. Tämän analyysin, joka on FFPE varastointiaika 8,6 vuotta, PCR /QC-suhde oli 0,22, DNA-tuloon 960 ng, tai yhdistetty pisteet 266 kynnysarvojen liittyy sekvensointi tehokkuutta (kuvio 3B).

alhainen kattavuutta oli ominaista harvaan GC-pitoisuus

lisäksi näytteen laatu, arvioimme vaikutus pohjan koostumusta sekvensointi syvyyttä. Arvioida kattavuutta tasaisuus, arvioimme keskimääräinen normalisoitu kattavuus poikki genomialuetta virittämä suunniteltu antureista. Osoitimme laaja vaihtelevuus, ja totesi, että huono kattavuus oli merkitsevästi yhteydessä alueiden esittää alemman GC-pitoisuus (kuvio 4A). Paras kattavuus havaittiin alueilla, joilla on 0,5-0,7 GC sisällön suhteet, joissa huomattavaa heikkenemistä alle 0,4 (p 0,01). Sen jälkeen me ositettu näytteiden mukaan perustason laatu (mitattuna ennalta sekvensointi yhdistetty pistemäärä), ja arvioidaan uudelleen GC sisällön vaikutus. Erityisesti harvaan GC-pitoisuus (alle 0,4) oli huonompi kattavuus kaikissa ositteessa, joiden lausutaan pienempi kattavuus näytteiden huono pre-sekvensointi laatu (kuvio 4B).

Normalized kattavuutta esittelee laaja vaihtelu genomin, jossa on huonompi kattavuus havaittu alueilla, joilla on alhaisempi GC-pitoisuus (A). GC-pitoisuus vaikutus oli additiivinen näyte laatu ennustaa kattavuutta, sillä hoidon jälkeen kerrostamiselintä näytteen laatu käyttäen yhdistetyn pisteet (B). Lyhenteet: St. Dev., Keskihajonta. Obs: ** osoittaa merkitsevyyden p 0,01.

vaikutus kattavuuden vaihtelevuutta geeni kuormittajat

Koska sekvensointi mittareita ovat viime kädessä korvike optimaalisen variantin soittaa, me kuulusteltiin jos näyte laatu ja GC-pitoisuus olisi vaikutusta kohde kattavuus hotspot asemissa

KRAS

ja

EGFR

. Kuten taulukosta 3, nämä geenit ovat esimerkkejä äärimmäisiin kattavuuden spektrin havaittu tässä. Vaikka hotspot tehtävissä

EGFR

esitteli ihanteellinen GC-pitoisuus (0,51-0,55) ja optimaalinen kattavuus,

KRAS

osoitti pienempi GC-pitoisuus (0,33-,36) ja dramaattisesti huonompi kattavuus. Mediaani määrä lukee

KRAS

kodonissa 12 oli vain 51 (vaihteluväli 3-183), sekä 20x ja 50x Kattavuustavoite olivat 87,9% ja 51,4%, tässä järjestyksessä. Toisaalta, kaikki

EGFR

hotspot kannanottoja tyydyttävä kattavuus (taulukko 3). Kuten NGS variantti soittamalla putkilinjat usein suodattimia tukikohtia minimaalinen kattavuuden (esim. 20x tai 50x), toistuvat

KRAS

mutaatioita voidaan helposti hukata alhaisen kattavuuden. Itse asiassa 12 ulos 22

KRAS

mutantti tapauksia todettiin joukossa näytteitä 50 lukee tai vähemmän, ja 3 tapausta havaittiin alle 20 lukee (taulukko F S1 File), jotka kaikki vahvistivat visuaalinen lukea tarkastus. Huono kattavuus näitä sivustoja voisi myös heikentää herkkyyttä havaita matalan alleelifrekvensseiltään mutaatioita. Käyttämällä pienin yhdistetty pisteet kynnystä 266, lukumäärän mediaani lukee

KRAS

kodonissa 12 oli 72,5 (vaihteluväli 18-183), ja 20x ja 50x kattavuus oli 98,2% ja 80,4%. Tuoreiden raporttien, havaitsimme negatiivinen korrelaatio PCR /QC suhteen ja dinukleotidi CpG TPG siirtymät (

r

= -0,186, p = 0,049). Samanlaisia ​​korrelaatioita ei havaittu muita preanalyyttiset muuttujia tai muita dinukleotidi muutoksia.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että kliiniset FFPE näytteet ovat luotettava lähde DNA kohdegeenin sekvensointi syövän, edellyttäen riittävä näyte laadunvalvontaa käytetään. Olemme osoittaneet, että kolme preanalyyttiset muuttujat-FFPE varastointiaika, PCR /QC-suhde, ja DNA panos kirjastossa valmistelussa-merkittävästi korreloi suurin parametrien sekvensointi tehokkuutta. Yhteenlaskettu tarkastelu näistä ominaisuuksista voi olla erityisen hyödyllistä määritellä näytteen riittävyyden sekvensointiin, mikä osoitetaan yhdistetyssä malli niistä johdetut, joka korreloi yhdistelmätilaan tehokkuutta. Osoitimme myös merkittävän vaihtelun kattavuutta genomin sisällä, riippuu GC-pitoisuus suhde. Genomialuetta pienemmällä GC-pitoisuus esitettiin huonompi kattavuutta, ja tämä vaikutus oli additiivinen näyte laatua.

On osoitettu, että NGS tietoja FFPE näytteistä on pienempi kirjasto inserttikoot ja peiton vaihtelevuutta. [23] tässä menimme vielä osoitettava, että FFPE varastointiaika, PCR /QC-suhde, ja DNA syöttö voivat kaikki ennustaa sekvensointi laatu tässä ryhmässä. Esimerkiksi FFPE säilytysaika (tai kasvain ikä) oli negatiivinen korrelaatio useita post-sekvensointi parametrit, kuten kattavuutta, insertin koko ja pohja laatu. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa havaintojen Hedegaard et al, [12] jotka myös osoittivat parempia tuloksia, kun viime aikoina on saatu FFPE näytteitä käytettiin. Tässä mielessä useat tekijät voivat vaikuttaa kielteisesti tuloksiin vanhemmilla näytteistä, mukaan lukien ei-standardoituja menetelmiä käytetty aiemmin kasvaimen kiinnittäminen, käsittely, upottamisen, sekä varastointiaika

sinänsä

. Toisaalta, Schweiger et al [39] ei löytänyt vaikutusta kasvaimen iän sekvensointi syvyyttä kuitenkin, että tutkimus oli rajoitettu hyvin pieneen otokseen (vain 7 FFPE näytettä). Vaikka vanhemmat kasvaimet voivat olla poikkeus kliinisessä ympäristössä, patologit joutua käyttämään antiikin FFPE näytteitä erityisiä tutkimusasetelmissa. Jotkut mahdollisia skenaarioita sisältävät Retrospektiivinen analyysi ainutlaatuinen näytteiden hankitun kliinisissä tutkimuksissa, tutkimus harvinaisten sairauksien ja kun kudospankki näytteet ovat ainoa käytettävissä oleva lähde. Jos vanhemmat näytteet on mukana, se voi olla tärkeää valita niille parempaa DNA laatu (käyttäen arvioita DNA pirstoutuminen). Kun vaihtoehtoiset lähteet eivät ole vaihtoehto, lisäämällä DNA tulo tai sekvensointi syvyys voi auttaa voittamaan luontaisista rajoituksista liittyvät kauemmin näytteen varastointi ja vanhemmat käsittelyn menetelmiä.

Erilaisia ​​menetelmiä on raportoitu arvioida laadun gDNA johdettu kliinisissä FFPE näytteitä. Näitä ovat tarkastaa A260 /280-suhde käyttäen Nanodrop spektrofotometriä (suhde 1,8 tai suurempi viittaa kohtuullinen puhtaus), estimoidun kaksijuosteisen DNA: n määrä, jakamalla Qubit

® DNA arvioon Nanodrop (suhteet 0,4 tai enemmän ovat ihanteellisia) , juokseva alikvootti gDNA agaroosigeelissä tai TapeStation (fragmentteja 200 bp tai vähemmän osoittaa huonoa laatua), tai käyttämällä PCR-lähestymistapaa. [30-33] tässä tutkimuksessa käytimme vakioprotokolla valmistajan suositteleman , joka perustuu PCR-monistuksen genomialueiden erikokoisia. [35] Alhainen laatu DNA tuottaa vähemmän runsas amplikoneja jäljitellen odotetut tulokset aikana tavoite rikastamiseen. Tällainen analyysi itsenäisesti korreloi kattavuutta, joissa suurempi osuus antaa parhaan kattavuus. Tämä PCR-pohjainen testi on suhteellisen yksinkertaista, halpaa, käyttää pieni määrä DNA: ta käyttäen ja ovat siten helposti soveltaa useimmissa laboratorioissa.

DNA tulo kirjaston valmistamiseksi on tärkeä ennustaja sekvensointi menestystä. [21 ] Sillä alustan käytetään nykyisessä tutkimuksessa, valmistaja suosittelee vähintään 225 ng gDNA (arvioitu fluoresenssimenetelmiä kuten PicoGreen

® tai Qubit

®), jota voidaan korottaa siinä tapauksessa huonolaatuisia DNA . Tuloksemme osoittavat, että DNA panos oli korreloi sekvensointi syvyyteen, linjaus korko, pohja laatu ja off-tavoitteesta. Vielä tärkeämpää on, DNA panos oli korvattavissa muilla valmiiksi sekvensointia parametrit (kasvain ikä, PCR /QC) ennustaa sekvensointi syvyyteen. Se tarkoittaa, että suurempia DNA panos voi usein kompensoida heikkolaatuisten DNA, kun taas laadukkaan DNA voitaisiin käyttää huomattavasti pienemmällä teholla, mikä näkyy yhdistetyn pisteet Tässä esitetty analyysi.

syntyy ainutlaatuinen pisteet, joka huomioi tiedot kolmesta preanalyyttiset muuttujia, jotka osoittivat riippumaton vaikutus sekvensointi syvyyttä. Lisäksi olemme spekuloitu mahdollisia raja-arvot kullekin näistä muuttujista, jotka voivat auttaa määrittelemään kudoksen riittävyys sekvensointia. Vaikka se voi olla houkuttelevaa harkita näitä arvoja rutiini sekvensointi laboratorioiden, joitakin rajoituksia on keskusteltava. Esimerkiksi se on vielä epävarmaa, jos tämä arviointi voitaisiin soveltaa muita asetuksia, varsinkin jos erillistä QC tai NGS määrityksiä käytetään.