Krooninen sairaus

tiivistelmä

Wilmsin tuumorisuppressorigeeniä (WT1) on tunnistettu onkogeenin monia pahanlaatuisten sairauksien, kuten leukemian, rintasyövän, mesoteliooma ja keuhkosyöpä. Kuitenkin rooli WT1 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) syövän synnyn jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa vertasimme WT1 mRNA tasot NSCLC kudoksiin pariksi vastaavien viereisten kudosten ja tunnistettu huomattavasti korkeampi ilmaisun NSCLC yksilöitä. Solujen lisääntyminen kolme NSCLC solulinjojen korreloi positiivisesti WT1 ilme; Lisäksi nämä yhdistykset havaittiin molemmissa solulinjoissa ja vierassiirrännänmallissa hiirimallissa. Lisäksi olemme osoittaneet, että säätely ylöspäin sykliini D1 ja fosforyloidun retinoblastoomaproteiiniin (p-pRb) oli mekaanisesti liittyy WT1 nopeuttaa solujen S-vaiheessa. Johtopäätöksenä havaintomme osoitti, että WT1 on onkogeeni ja edistää NSCLC solujen lisääntymistä jopa sääteleviä sykliini D1 ja p-pRb ilme.

Citation: Xu C, Wu C, Xia Y, Zhong Z, Liu X , Xu J, et al. (2013) WT1 Edistää soluproliferaation ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Cell Lines kautta Up-sääntely sykliini D1 ja p-pRb In vitro ja in vivo. PLoS ONE 8 (8): e68837. doi: 10,1371 /journal.pone.0068837

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 joulukuu 2012; Hyväksytty 4. kesäkuuta 2013 Julkaistu: 01 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Natural Science Foundation of China [81170158] (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on edelleen merkittävä kansanterveydellinen ongelma sekä miehiä että naisia, se on tällä hetkellä syöpä tyyppi, jolla on korkein kuolleisuus kaikkialla maailmassa. Ilmaantuvuus on kasvanut nopeasti, koska laaja tupakoinnin [1] – [3], ja Kiinassa on ollut 26,9% kasvu miehillä ja 38,4% naisilla viiden viime vuoden aikana [4]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) sisältää useita histologisia alaryhmiä, adenokarsinooma, levyepiteelisyöpä ja suuri karsinooma, jotka koostuvat 80-85% koko esiintymistä, kun taas loput tapaukset sisältävät sitä selkeämmin joukko pieniä keuhkosyöpä ( SCLC) [2], [5] – [7]. Tässä tutkimuksessa keskitymme roolista WT1 kehittämisessä ja syövän syntymistä NSCLC.

Wilmsin kasvain geenin (WT1), joka sijaitsee osoitteessa 11p13q, koodaa 52-54 kDa proteiini, joka sisältää neljä sinkkiä sormi transkriptiotekijöitä ja tunnistettiin ensin kasvainsuppressorigeenin in nefroblastooma tai Wilmsin kasvain, pediatrinen munuaissyövän [8], [9]. Yliekspressio Tämän geenin havaittiin myös useita leukemiat ja kiinteät tuumorit, kuten rinta- syöpä, keuhkosyöpä ja mesoteliooma, ja se hypoteesi, että tämä geeni on suuri onkogeenisen rooli [10], [11]. Oji Y et ai ehdotti, että WT1 on tärkeä rooli kasvun normaalien keuhkojen soluja; yli-ilmentyminen WT1 häiritsevät kasvua ja erilaistumista normaalien keuhkojen solut ja mukaan havaintonsa, aiheuttaa keuhkosyöpää [11]. WT1 on osoitettu olevan rooli säätelyssä soluproliferaation ja apoptoosin monissa biologisissa ja patologisia mekanismeja. Viime aikoina on tutkittu mahdollisena kohteena immunoterapian useita syöpätyyppejä, mukaan lukien NSCLC ja mesoteliooma [12].

Signal muuntimet ja aktivaattoreita transkription 3 (STAT3) on raportoitu olevan yli-ilmentynyt useissa ihmisen maligniteetit ja aktivoituvat erilaisten sytokiinien ja kasvutekijöiden aikana syövän kehittymisen ja etenemisen [13], [14]. On osoitettu, että STAT3 edistää syöpäsolujen lisääntymistä kautta ylös-säätely geenejä, jotka koodaavat apoptoosin estäjät, kuten Mcl-1: n ja Bcl-xL: n ja solun lukiertosäätelijöistä kuten sykliinit D1 /D2 ja c-Myc [13] – [17 ]. Mielenkiintoista Rong ym osoittivat todisteita siitä WT1enhanced transkriptionaalista aktiivisuutta fosforyloidun STAT3 (p-STAT3) johtaa synergistiseen säätely ylöspäin alavirran geenien kuten sykliini D1 ja Bcl-x L, hiiren fibroblasteissa, melanooma ja maksan soluihin sekä ihmisen alkion munuaisen soluihin [18]. Kuitenkin, WT1 ei ole aiemmin raportoitu keuhkosyövän solulinjoissa.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin tunnistamaan ilmentymistä WT1 proteiinin NSCLC yksilöitä verrattuna viereisiin kudoksiin, tutkia leviämisen mainostaisi WT1 in vitro ja in vivo ja tunnistaa sen suhdetta p-STAT3 transkription aktivaation.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

NSCLC ja vastaavien viereisten kudosten mukana tässä tutkimuksessa saatiin 85 peräkkäisen potilailla, joilla oli de novo sairauden ja kirurgisista resektion. He olivat mukana välillä joulukuu 2010 ja huhtikuun 2011 ensimmäinen Affiliated sairaala Nanjing Medical University (Nanjing, Kiina). Oikea diagnoosi arvioitiin kokenut patologi ja lavastus NSCLC jonka kliininen onkologi mukaan International Association for Study of Lung Cancer (IASLC) seitsemäs TNM-luokitus. Vieruskudos sijaitsi 3 cm reunasta kasvainkudoksen.

RT-PCR

RNA saatiin snap-pakastetut kudokset ja NSCLC solulinjoissa käyttämällä Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA) menetelmän jälkeen, valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA pitoisuuksia ja ominaisuuksia tutkittiin Beckman Coulter DU800 spektrofotometriä (Beckman, Brea, CA, USA). cDNA syntetisoitiin kanssa Primescript ™ RT reagenssipakkaus (TaKaRa, Japani). 12 ui kokonais-RNA sekoitettiin 8 ui Primescript-puskuria ja 20 ui DEPC-käsiteltyä vettä inkuboitiin 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan, 85 ° C: ssa 5 s ja varastoitiin 4 ° C: ssa käyttöön asti.

qRT -PCR

ABI Prism7500 Sequence Detector System (ABI, USA) käytettiin määrittämään suhteellinen taso mRNA kasvainkudoksissa ja viereisten kudosten. Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) analyysi WT1 ja β-aktiini suoritettiin SYBR® Esiseos ExTaq ™ (TaKaRa, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR suoritettiin käyttäen 10 ui 2 x esisekoite-puskuria, 0,5 pl kutakin 5 ’ja 3’ aluke, ja 1 ui näytteitä tai tislattua vettä lopputilavuuteen 20 ui. Jokainen injektiopullo denaturoitiin 95 ° C: ssa 1 min. denaturoitu 95 ° C 15 sekuntia, lämpökäsiteltiin 60 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja laajennettiin 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan käyttäen seuraavia alukkeita: WT1 forward-aluke, 5’GCTATTCGCAATCAGGGTTACAG3 ”; WT1 reverse-aluke, 5’TGGGATCCTCATGCTTGAATG3 ”. β-aktiini eteenpäin pohjamaali, 5’CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT3 ’; p-aktiini käänteinen aluke: 5’ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA3 ’; lopussa jatkovaiheessa fluoresenssidetektiojärjestel- suoritettiin. Syrjiä tiettyjä epäspesifiseltä cDNA tuotteista, sulamis- käyrä saatiin lopussa kunkin aikavälillä.

Cell Culture

A549, H1299, H1650 ja 293T solulinjat (ATCC) käytettiin varten Tämä tutkimus. A549, H1299 ja H1650 viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), kun taas 293T viljeltiin DMEM korkea glukoosi väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia. Kaikki soluja pidettiin kosteutetussa 37 ° C inkubaattorissa 5% CO

2.

lentivirustartunnat Production ja transduktio

WT1A (-17aa-KTS isoformi) geeni syntetisoitiin (hankittu Genscript, Piscataway, NJ), jossa rajoittava ruoansulatusta käyttäen Mlul ja subkloonattiin pLV-GFP-plasmidi (lahja D. Beicheng Sun, University of Nanjing Medical University, Kiina), ja nimettiin pLV-GFP-WT1. Tuottamaan plasmidi ilmentävät WT1-shRNA, kaksijuosteiset oligonukleotidit kloonattiin pLL3.7 vektoriin (lahja D. Yun Chen, University of Nanjing Medical University, Kiina) ja nimettiin pLL3.7-WT1-shRNA. Sekvenssit WT1-shRNA käyttää, ovat aac TCAGGGTTACAGCACGGTC ttcaagaga GACCGTGCTGTAACCCTGA tttttt c. Isot kirjaimet edustavat WT1 tietyssä järjestyksessä ja pienet kirjaimet ovat hiusneula sekvenssit. Rekombinantti lentivirus tuotettiin 293T-soluihin käyttäen kalsiumfosfaattisaostusta. A549, H1299, H1650 transfektoitiin lentiviruksen avulla polybreenin (8 ug /ml). Edustaja kuvaa villityypin ja transfektoidut solut on esitetty kuvassa S1.

Western-blotting-määritys

Proteiinit uutettiin viljellyistä soluista ja hiirillä kudoksia, kvantitoitiin käyttäen proteiinimääritys (BCA-menetelmällä, Beyotime, Kiina). Proteiinit fraktioitiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin PVDF-membraanille, estetään 4% kuivamaitoa huoneen lämpötilassa 1 tunti ja immunovärjättiin primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli käyttäen anti-WT1 (1:1000, 6F-H2, Millipore, USA), anti-STAT3 /p-STAT3 (1:2000, Cell Signalling Technology, Beverly, MA, USA), anti-sykliini D1 (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, USA), anti-p -pRb (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-caspase3 (1:3000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Bcl-2L (1:1000, Abcam, Cambridge, MA , USA) ja anti-GAPDH (1:1000, Kangchen, Kiina). Tulokset visualisoitiin kautta kemiluminesenssiosoitusta järjestelmä (Pierce ECL Alustan Western blot tunnistusjärjestelmä, Thermo, Pittsburgh, PA, USA) ja altistuvat Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Pitoisuus

solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (6,0 x 10

3 solua /kuoppa). Solujen elinkelpoisuus arvioitiin CCK-8 määritys (Beyotime Biotekniikan instituutti, Kiina). Absorbanssi jokaisen luettiin spektrofotometrillä (Thermo, Pittsburgh, PA, USA) 450 nm: ssä (A450). Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta suoritettiin viitenä.

Virtaussytometrinen analyysi

Virtaussytometrinen analyysi tehtiin havaitsemaan apoptoosia ja solusyklin tilan. Solut otettiin talteen, pestiin kahdesti ja suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan PBS: ää, joka sisälsi 3 ui anneksiini V: n ja 3 ui PI (KeyGen, Kiina) mukaan valmistajan suosituksen. Apoptoosi tiedonkeruu ja analyysi suoritettiin jonka virtaussytometrialla laitos (BD Biosciences, San Jose, CA).

Solusyklianalyysiä arvioitiin DNA sisällön havaittiin käyttäen virtaussytometrillä laitos (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Jälkeen kerättiin trypsiinikäsittelyllä, solut suspendoitiin 70% etanolilla ja pidettiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Suodatettiin verkon läpi, ja DNA-pitoisuus värjättyä ytimien analysoitiin. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa takaa tuloksia facticity.

tuumorigeenisyystesti nude-hiirissä

vaikutusten tutkiminen WT1 kasvaimen kasvua in vivo, loimme ksenograftimallia 4-viikko- ikäiset Balb /c

nu /nu-hiirissä. Meillä työskentelee 90 Balb /c

nu /nu-hiiriä (hankittiin mallista eläin tutkimuskeskuksen Nanjing University Kiinassa) tässä tutkimuksessa ja jakaa ne 5 ryhmään satunnaisesti (n = 6 ryhmää kohden) kutakin solulinjaa (A549 /H1299 /H1650). Kaikki solut tripsinized ja suspendoitiin uudelleen 100 ul: lla PBS: ää (joka sisälsi 50 ui Matrigel), vastaavasti, ja ihon alle injektoidaan axilla kunkin paljaan hiiren (5 x 10

6 solua per hiiri). Viikon kuluttua injektion, kasvaimet mitat mitattiin 4 päivän välein ja yhden kuukauden jälkeen kaikki hiiret tapettiin ja kasvaimet saatiin (kuva S2). Tilavuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: tilavuus = pituus x leveys

2 x 0,5.

immunohistokemia

Kudokset fiksattiin 4% paraformaldehydillä ja leikataan parafiiniblokkiin 5 pm paksuuteen. Sen jälkeen vahanpoisto ksyleenillä ja nesteytys asteittaisella sarja etanolia, kalvot kuumennettiin autoklaavissa kolmen minuutin ajan käyttäen sitraatti- puskuria (pH 6,0), ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen WT1 (1:100, 6F-H2, Millipore, USA), p-STAT3 (1:400, Cell Signalling Technology, Beverly, MA, USA), sykliini D1 (01:50, Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, USA) ja p-pRb (1:100, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 4 ° C: ssa yön yli. Estää seerumia tai vasta-aine, laimennus puskuriin valmistettiin Negatiiviset kontrollit. Primaaristen vasta-aineiden käytössä olivat samat kuin Western blot-analyysi. Kuvat ovat microcope (Nikon Eclipse 50i) ja ohjelmistot NIS-elementit v4.0. Keskiarvot integroitujen optinen tiheys (IOD) saatiin viideltä satunnaisesti näkökenttään objektilasia kohti käyttäen Image-Pro Plus ohjelmisto (v5.0). Jokainen tietoja ilmennyt kolme kertaa vähintään.

Tilastollinen analyysi

Tiedot esitettiin keskiarvona ± SD perustuu kolmeen erillään kokeita. Studentin t-testi, ANOVA ja kaksipuolinen Fisherin tarkkaa testiä käytettiin arvioimaan tilastollinen merkitys erojen kaikki asiaankuuluvat kokeet. Arvo P 0,05 pidettiin tilastollista merkittävyyttä, ja P 0,001 katsottiin erittäin merkittävä. Kaikki tilastolliset analyysit analysoitiin SPSS-ohjelman v17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).

Tulokset

1. WT1 mRNA-tasojen oli yli-ilmentynyt NSCLC näytteet

tutkittu 85 paria NSCLC ja vastaavien viereisten näytteiden avulla immunohistokemia ja reaaliaikainen PCR. Kliiniset ominaisuudet potilaiden on esitetty taulukossa S1. WT1 ilmentyminen kasvaimissa oli merkittävästi suurempi verrattuna viereisiin kudoksiin. Edustavia kuvia esitetään kuviossa 1A. Tilastollinen analyysi IOD arvojen 85 liukuu värjättiin WT1 on esitetty histogrammissa kuviossa 1B (* p 0,05). Kuten on esitetty kuviossa 1C, mRNA taso WT1 on yliekspressoituvat merkittävästi NSCLC yksilöt (** p 0,001). Lisäksi meidän havaintojen mukaan WT1 mRNA taso oli yhteydessä sekä kasvaimen ja normaalissa ja kasvaimen vaiheesta, katso taulukko S1 (** p 0,001). Yhdessä nämä tulokset ovat yhdenmukaiset aiempien tulosten kanssa osoittaa, että korkeampi ilmentyminen WT1 liittyy NSCLC.

, immunohistokemiallinen värjäys WT1 kasvaimen (vasemmalla) ja viereisen (oikealla) yksilöitä. B, keskimääräinen arvo integroitu optinen tiheys (IOD) arvioitiin analysoimalla viiteen näkökenttään objektilasia kohti ja tallennettu histogrammin. C, reaaliaikainen PCR-analyysi WT1 mRNA tasolla kasvain ja viereisten kudosten suhteessa P-aktiini. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD.

* P 0,05,

** P 0,001.

2. WT1 Expression edistänyt elinkelpoisuus NSCLC solulinjojen in vitro

Jos haluat löytää WT1-shRNA joka voisi tehokkaasti alas-säätelemään WT1 in NSCLC solulinjoissa, kolme ehdokasta WT1-shRNA (taulukko S2) syntetisoitiin ja testattiin Western-blot-analyysi ja reaaliaikaisella PCR: llä. Olemme havainneet, että WT1-shRNA3repressed ilmentymistä WT1 A549 /H1299 /H1650 mahdollisimman tehokkaasti (kuvio 2A). Sitten, havaitsimme ilmaus WT1 kaikissa solulinjoissa vahvistaa lentivirus Western-blot-analyysillä ja reaaliaikaisella PCR: llä. Huomasimme, että ilmaus WT1 A549 /H1299 /H1650 transdusoitiin pLL3.7-WT1-shRNA oli paljon pienempi kuin valvonnan; samanaikaisesti, ilmaus WT1 A549 /H1299 /H1650 transdusoitiin pLV-GFP-WT1 oli paljon suurempi verrattuna kontrolleihin. Olemme myös havainneet, että kahden vektorin (pLL3.7-WT1 ja pLV-GFP) ei ollut vaikutusta ilmentymiseen WT1 (kuvio 2A ja kuvio S3). Seuraavaksi teimme CCK-8 määrityksen testaamiseksi elinkelpoisuuden; tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen WT1 tehostetun solujen elinkelpoisuuden, kun taas alas-säätely WT1 näytteillä päinvastainen vaikutus ja ero oli yhä ilmeisemmäksi ajan (kuvio 2B). Siksi nämä havainnot osoittivat, että WT1 edistetään NSCLC solujen elinkelpoisuus in vitro.

WT1 ilmaus NSCLC villityypin soluissa ja NSCLC-solut transfektoitiin lentivirukselle sisältävän pLL3.7 (GFP1), pLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) ja pLV-GFP-WT1 (WT1) western-blot. B, elinkelpoisuus NSCLC-solujen arvioitiin CCK-8-määritys: yliekspressio WT1 edistää solujen elinkelpoisuuden esto WT1 ilmentymisen vähentää vaikutusta. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD.

* P 0,05,

** P 0,001.

3. WT1 Expression Nopeutettu S-vaihe syöttö Cell Cycle jopa sääteleviä sykliini D1 ja p-pRb Protein

tutkimiseksi mekanismi, jonka WT1 edistänyt NSCLC solujen lisääntymistä, tutkimme vaikutuksia WT1 ilmaisua solusyklin kautta virtaussytometrianalyysin. Tulokset osoittivat, että prosenttiosuus S-vaihe WT1 yliekspressio ryhmässä oli korkeampi kontrolliin verrattuna, kun taas WT1 knockdown ryhmässä oli alhaisempi (kuvio 3A 0,05,

** P 0,001.

Jotta edelleen selvittämiseksi mekanismi, havaitsimme ilmaus sykliini D1 ja p-pRb koska tämä toiminta on tarpeen solusyklin G1 /S siirtyminen Western-blot. Kuten kuviossa 3D, sykliini D1 ja p-pRb proteiinia sekä lisääntynyt WT1 yli-ilmentävät solut ja vähennetään WT1 alassäädetty soluissa. Perustuen WT1, parannettu transkriptionaalista aktiivisuutta p-STAT3, ja muut havainnot Rong et ai, havaitsimme aktiivisuutta STAT3 ja p-STAT3 (S727 ja Y705) ja totesi, että fosforylaatio sekä S727 ja Y705 yliekspressoitui kaikissa solulinjoissa . Tähän mennessä ei ole raportteja, jotka ovat tutkineet, onko WT1 liittyy fosforylaatiota STAT3. Lisäksi meillä on myös havaittu apoptoosin ja ei löytänyt mitään vaikutusta WT1 (kuvio 3C 3D). Yhdessä meidän havainnot viittaavat, että WT1 kiihdyttää S-vaihe tulo solukierron jopa sääteleviä sykliini D1 ja p-pRb proteiinin ilmentymisen.

4. WT1 Expression edistänyt kasvua tuumoriksenograftien in vivo

Voit selvittää WT1 vaikuttaa NSCLC etenemistä in vivo, perustimme ksenografti kasvain malli käyttäen Balb /c

nu /nu hiirille. Hiiret injektoidaan subku- vakaasti pLV-GFP-WT1 ja pLL3.7-WT1-shRNA tartunnan A549 /H1299 /H1650 solujen yhteen toimipaikkaan, vastaavasti tyhjällä plasmidilla ja villityypin WT1 verrokkeina. Kuten on esitetty kuviossa 4A, olemme havainneet, että ei ollut merkittäviä eroja villityypin soluja ja soluja transdusoitiin pLV-GFP: n ja pLL3.7-GFP; Tämä osoitti, että kasvaimen kasvu käyrän soluissa transdusoitiin pLV-GFP-WT1 oli merkittävästi lisääntynyt verrattuna kontrolli, kun kasvaimen kasvukäyrä soluissa transdusoitiin pLL3.7-WT1-shRNA oli merkittävästi inhiboitu. Tuumorikudoksista saatu nude-hiirten esiteltiin kirkkaassa valossa (kuva 4B vasemmalla) ja in vivo fluoresenssi kuvan (kuva 4B oikealla). Merkittävä kasvu kasvaimen tilavuuden havaittiin, kun solut transdusoitiin pLV-GFP-WT1 verrattuna villityypin soluissa; sen sijaan, kasvaimen soluja transdusoitu pLL3.7-WT1-shRNA oli merkittävästi vähentynyt. Lisäksi olemme havainneet ilmentymistä WT1 proteiinin kasvaimiin saatu nude-hiiriin Western-blot-analyysi. Olemme havainneet, että se ei ole muuttunut verrattuna soluihin in vitro (kuvio 2A oikealla ja kuva 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että WT1 edistää kasvua ihonalaisen implantin kasvaimen in vivo.

, Kasvaimen tilavuus Balb /c

nu /nu nude-hiirissä 31 vuorokauden kuluessa NSCLC-solujen injektion. B, kasvain kudosten saatu nude-hiirten esitetty kirkas valo (vasemmalla) ja in vivo fluoresenssi kuvan järjestelmään. C, WT1 ilmentyminen kasvaimen kudoksissa nude-hiiriin Western-blotting-analyysi. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD.

* P 0,05,

** P 0,001.

5. WT1 Vaikuttavat Expression sykliini D1 ja p-pRb in vivo

In vivo, me edelleen validoitu meidän in vitro tulokset, joissa WT1 kiihtyi S-vaihe tulo solukierron jopa sääteleviä sykliini D1 ja p-pRb . Tutkimme ilmaisua STAT3, p-STAT3 (S727), sykliini D1 ja p-pRb kasvaimissa saatu nude-hiirissä kautta immunohistokemiallinen värjäys ja Western-blot-analyysi. Kuten kuvioissa 5A ja 5B, sykliini D1 ja p-pRb kohoamiseen vuonna WT1 yliekspressoivat kudoksissa verrattuna WT1 alassäädetty kudoksiin. Samaan aikaan, p-STAT3 (S727) on yli-ilmentyy molemmissa kudoksissa. Tilastollinen analyysi IOD arvojen tuumorikudosten on esitetty histogrammissa (kuvio 5A, p 0,05). Lopullisesti, nämä tulokset osoittavat, että WT1 edistää kasvua kasvaimen in vivo ja myös riippuu säätely ylöspäin ilmentymisen sykliini D1 ja p-pRb.

, immunohistokemiallinen värjäys WT1, p-STAT3 (S727) , sykliini D1 ja p-pRb in WT1 yli-ilmentynyt (WT1) kasvain kudosten ja WT1 alassäädetty (WT1-shRNA) tuumorikudoksia in vivo. Keskimääräinen arvo integroitu optinen tiheys (IOD) saatiin kuten edellä on kuvattu, osoitti, että ilmentyminen sykliini D1 ja p-pRb oli merkittävästi sääteli. B, Western-blotting-analyysi ilmentymisen WT1, STAT3, p-STAT3 (S727 ja Y705), sykliini-D1, p-pRb on osoitettu kasvaimia. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD.

* P 0,05.

6. WT1 Expression Vaikuttavat Expression sykliini D1 ja p-pRb NSCLC näytteet

Arvioimme lisäksi korrelaatio WT1 ilmaisun ja taso sykliini D1 ja p-pRb 85 parafiiniin ihmisen NSCLC kudosta dioja. Kaksi tapausta eri WT1 ekspressiotasot esitetään kuviossa 6: 1 tapaus (voimakas positiivinen) ja 2 tapaus (heikko positiivinen). Taso sykliini D1 ja p-pRb oli säädellään ylöspäin Case1 verrattuna 2 tapaus. Kuten odotettua, p-STAT3 (S727) oli vahvasti värjättiin sekä Case1 ja 2 tapaus. Tämä tulos tukee hypoteesia, että WT1 voi lisätä ilmentymistä sykliini D1 ja p-pRb ja säätelevät solusyklin.

immunohistokemiallinen värjäys WT1, p-STAT3 (S727), sykliini D1 ja p-pRb in WT1 yli-ilmentyminen (Case 1) kasvain kudosten ja WT1 heikkoa ilmentymistä (tapaus 2) kasvaimen kudoksiin in vivo. Keskimääräinen arvo integroitu optinen tiheys (IOD) saatiin kuten edellä on kuvattu, osoitti, että ilmentyminen sykliini D1 ja p-pRb oli merkittävästi sääteli. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD.

* P 0,05.

Keskustelu

Viimeisten vuosikymmenten, vaikka tutkimukset ovat tutkineet roolia WT1 NSCLC, sen toiminta ei ole täysin selvitetty. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ilmaus WT1-geenin ja proteiinin NSCLC yksilöitä oli selvästi säädelty verrattuna viereisten kudosten WT1 edistänyt leviämisen NSCLC-solujen in vitro ja in vivo, ja WT1 ilme vaikuttaa tasoon sykliini D1 ja p-pRb joka kiihtyi soluproliferaatiota NSCLC soluissa ja kliinisissä näytteissä. Kun kaikki havainnot yhdessä, me arveltu, että WT1 mahdollisesti näyttelee onkogeenisessä rooli syövän synnyn ja etenemisen NSCLC.

WT1 tunnistettiin alun perin kasvainsuppressorigeenin vuonna Wilmsin kasvain, ja sen jälkeen havaittiin yliekspressoituvan erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [19]. Kuitenkin suhde ilmaisun ja syövän syntymistä WT1 NSCLC edelleen kiistanalainen. Oji et al. ehdotti, että WT1 voi häiritä kasvua ja erilaistumista normaalien keuhkojen soluihin ja edistää kasvaimen synnyssä keuhkosyöpään [11]. Hiljattain Hayashi S ym kertoi, että alhainen WT1-geenin ilmentyminen NSCLC kasvaimissa oli negatiivinen prognoosi- merkki ja liittyi myös imusolmuke etäpesäke [20]. Lisäksi on osoitettu, että WT1 menetys indusoi vanhenemista ja vähentynyt proliferaatio keuhkosyövän soluja alavirtaan onkogeenisten KRAS signaloinnin [21] .STAT3 konstitutiivisesti aktivoitu monissa ihmisen kasvaimissa, kuten eturauhas-, keuhko-, aivo-, rinta- ja haimasyövän [13], [15], [22], [23]. Loppupään geenejä, mukaan lukien sykliini D1, c-myc, ja Bcl-x L ja STAT3, ovat potentiaalisesti ajan säädellään fosforyloidun STST3. Sykliini D1 on solusyklin säädin, joka edistää solujen G1-vaiheesta S-vaiheeseen, ja fosforyloi pRb proteiini [24], joka on ydin- fosfoproteiini, joka säätelee solujen kasvua G1-vaiheessa. Hypophosphorylated pRb on S780 vapauttaa sitten E2F alkaen estävää monimutkainen ja mahdollistaa se edistää transkriptiota tarpeen eteneminen myöhään G1-vaiheen ja S-vaiheen [24] – [26]. On raportoitu, että sykliini D1 ja sykliini-riippui-kinaasin 4 (CDK4) fosforyloitu pRb ja että pRb menettänyt kykynsä sitoutua E2F [27]. Niinpä kun sykliini D1 ajan säädellään STAT3 se voi fosforyloida pRb ja edistää solujen kasvua vapauttamalla E2F.

Rong ym on raportoitu, että toiminta WT1 kuin tuumorisuppressorin tai onkogeeni oli pääasiallisesti riippuvainen toimintaa of STAT3. Niinpä kun STAT3 oli aktivoitu, WT1 toimi tuumorisuppressorina, mutta kun STST3 oli toimintakyvyttömäksi, WT1 toimi kuin onkoproteiinia [18]. He ehdottivat myös, että WT1 ja STAT3 synergistisesti edistää solujen lisääntymistä jopa säätelevä geenejä, kuten sykliini D1 ja Bcl-xL. Näiden tulosten perusteella, me arveltu, että WT1 voi toimia onkogeenin NSCLC.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että WT1 yliekspressoitui NSCLC kudoksissa verrattuna viereisten kudosten. WT1 näytteillä vaikutusta proliferaatioon NSCLC-solujen in vitro ja in vivo: yliekspressio WT1 edistää solujen kasvua taas alassäätöä inhiboivat NSCLC-solujen. Olemme myös havainneet ilmaus STST3 in NSCLC yksilöiden ja soluja, linjassa Fernandes ym joka löysi STST3 yliekspressoituvat keuhkosyövän kudoksissa [23]. Tuloksemme osoittivat, että WT1 nopeutettu S-vaiheen solujen merkintä; Näin ollen, arvioimme solusyklin säätelygeenien kuten sykliini D1 ja p-pRb ja olemme havainneet, että ilmaus sykliini D1 ja p-pRb on todellakin säädellään ylöspäin, kuten on esitetty kuviossa 3D. Ottaen huomioon tuloksemme ja aiempia havaintoja Rong et al, huomasimme, että WT1 ja STAT3 synergistisesti kasvun edistämiseksi NSCLC solujen ajan säätelemällä solukierron sääntelyviranomaisten sykliini D1 ja p-pRb. Lisäksi olemme havainneet, että WT1 ilmentyminen liittyi sekä imusolmuke etäpesäke ja kasvaimen vaiheessa. Tämä tulos osoittaa, että WT1: n ilmentyminen olla merkitystä syövän leviämisen ja etäpesäkkeiden. Epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) pidetään keskeisenä prosessi etäpesäke syöpä ja levittäminen syöpäsolujen primaarikasvaimen ja siirtymistä eri sivustoja kehon [28]. Mielenkiintoista, WT1 saattaisi ajaa EMT kautta EMT liittyviä tavoitteita, kuten Snail, Slug ja E-kadheriinin [29] – [31]. Tämä edellyttää lisätutkimuksia määrittää toiminta WT1 kasvaimen invaasion ja metastaasin.

Yllättäen emme löytäneet että WT1 ollut vaikutusta apoptoosiin NSCLC-solujen mukaan virtaussytometrillä määritys ja myös Western -blot määritys; tämä eroaa Rong Y et al havainnot, jotka osoittivat WT1 lisääntynyt ilmentyminen Bcl-x L [18]. On myös raportoitu, että WT1: tä vaaditaan apoptoosin estämiseen rintasyövän ja rhabdoid syövän vähentämällä Bcl-2: n mRNA ja proteiini tasoilla [32], [33]; kuitenkin muita raportteja osoitti, että WT1 säätelee negatiivisesti Bcl-2 promoottorin eturauhasen solulinjassa [34]. Vincent S et ai. ilmoitti, että he eivät havaitse mitään eroa vastauksena WT1 ehtyminen NSCLC solulinjoissa [21], joka oli mukaisesti havaintomme. Syynä näihin eroihin on edelleen tuntematon, mutta edelleen selventämiseksi, miksi WT1 ja STAT3 synergistisesti edistää tasoa sykliini D1 mutta ei vaikuta tasoon Bcl-2L NSCLC, on perusteltua. Viime aikoina identifioitu transkription WT1 co-tekijät, kuten BASP1 (brain happo-liukoista proteiinia 1) ja WTIP (WT1 vuorovaikutuksessa proteiini) saattaa osallistua näihin eroihin WT1-välitteisen transkription säätelyyn kohdegeenien, kuten Bcl-2L [35] – [37].

Johtopäätöksenä tässä tutkimuksessa, löysimme merkittävästi korkeampi WT1 ekspressiotaso NSCLC yksilöitä verrattuna viereiseen ei-syöpä kudoksiin, osoitimme leviämisen mainostaisi WT1 in vitro ja in vivo ja tunnistimme sen onkogeeninen rooli NSCLC kautta monistamisen transkriptionaalista aktiivisuutta p-STAT3 että up-regulation alavirran geenien, kuten sykliini D1 ja hypo-fosforyloituu retinoblastoomaproteiinia (p-pRb). Siten WT1 mahdollisesti toimia terapeuttisena kohteena hoitoon NSCLC.

tukeminen Information

Kuva S1.

kuva NSCLC Villityypin solut ja muut transfektoitu lentiviruksen kirkkaassa valossa (ylempi) ja vihreä valo (alempi). NSCLC villityypin soluista viitataan kontrollina; solut transdusoitu pLL3.7 ja pLV-GFP nimitystä GFP1 ja GFP2; solut transdusoitu pLL3.7-WT1-shRNA viitataan kuten WT1-shRNA ja transdusoitiin pLV-GFP-WT1 nimitystä WT1 kuvassa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0068837.s001

(TIF)

Kuva S2.

Kasvaimet saatu paljaisiin hiiriin. Kasvaimet saatu nude-hiirissä ovat kaikki esitetty tässä kuviossa. On huomattava, että me vain havaittu 4 kasvaimista H1299-WT1-shRNA ryhmä ja 5 kasvainten H1650-WT1-shRNA ryhmä pistetään sivuston.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0068837.s002

( TIF)

Kuva S3.

WT1 mRNA ilmentymä NSCLC soluja. WT1 ilmentyminen NSCLC villityypin soluissa ja NSCLC-solut transfektoitiin lentiviruksen sisältävät pLL3.7 (GFP1), pLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) ja pLV-GFP-WT1 (WT1) Real-time PCR. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. * P 0,05.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0068837.s003

(TIF) B Taulukko S1.

suhde WT1 ilmaisun ja kliinis piirteitä NSCLC.

doi: 10,1371 /journal.pone.0068837.s004

(DOC) B Taulukko S2.

sekvenssi WT1-shRNA.

doi: 10,1371 /journal.pone.0068837.s005

(DOC) B

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää kaikkia ihmisiä, jotka vapaaehtoisesti tutkimukseen osallistui ja D. Beicheng Sun ja D. Yun Chen (University of Nanjing Medical University, Nanjing, Kiina) niiden plasmidien.