Krooninen sairaus

tiivistelmä

Resistance sisplatiiniin kemoterapiaan on suurin syy hoidon epäonnistumisesta pitkälle virtsarakon syöpä (BC) potilasta. On yhä enemmän todisteita siitä, että MikroRNA osallistuvat kehittymistä ja etenemistä BC. Kuitenkin vähän tiedetään toiminta MikroRNA ennustaa vaikutus adjuvanttihoitoa BC selviytymisen ja säännellä vastaus sisplatiinia. Tämän kysymyksen, käytimme RT-qPCR arvioida kliinistä merkitystä miR-203 ilmentymisen 108 kudoksissa BC saaneilla potilailla sisplatiini-kemoterapiaa liitännäishoitona, ja suorittaa in vitro tutkimukset tutkia kemoterapeuttisen herkkyyttä sisplatiiniin miR-203 yliekspressoivia BC solut. Löysimme miR-203-tasot olivat huomattavasti matalammat BC etenemisen ryhmässä kuin ei edennyt ryhmä (

P

0,001). ROC-käyrä analyysi kuvitettu miR-203 voisi merkittävästi erottaa eteni potilaiden niistä ei ollut edennyt (

P

0,001), jolloin saatiin ala ROC käyrän 0,839 (95% CI, 0,756-0,903). Lisäksi alhainen miR-203 ilmaisu korreloi lyhentää ilman taudin etenemistä (PFS) ja kokonaiselossaoloaika (OS) BC potilaiden, ja oli itsenäinen ennustetekijä. Yli-ilmentymisen miR-203 5637 ja T24 BC solut voitaisiin vähentää solujen elävyyttä, parantaa sisplatiini sytotoksisuutta, ja edistää apoptoosia. Western blotting ja lusiferaasireportterista määritys osoitti Bcl-w ja Surviviinispesifisiä oli suoria alavirtaan kohteina miR-203. Myös vastakkainen vaikutus välillä miR-203 ja Bcl-w tai surviviinia ilmentymisen BC kudoksissa (r = -0,781, -0,740, sekä

P

0,001). Lopuksi vähentynyt miR-203 ennustaa etenemistä ja huono ennuste BC potilaiden sisplatiinia kemoterapian aikana miR-203 yliekspressio voi parantaa sisplatiini herkistymistä apoptoosin edistämiseksi kautta suoraan kohdistaminen Bcl-w ja surviviinin.

Citation: Zhang X Zhang Y, Liu X, Fang A, Li P, Li Z, et al. (2015) MicroRNA-203 Onko Prognostiset indikaattorin Virtsarakon syövän ja parantaa Kemosensitiivisyys sisplatiiniin kautta Apoptoosi Targeting Bcl-w ja surviviinin. PLoS ONE 10 (11): e0143441. doi: 10,1371 /journal.pone.0143441

Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, FRANCE

vastaanotettu: 30 heinäkuu 2015; Hyväksytty 4 marraskuuta 2015 Julkaistu: 23 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) CW (nro 81271916) ; National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) ja XZ (nro 81301506); Natural Science Foundation of Shandong (https://www.sdnsf.gov.cn/portal/) ja XZ (ZR2013HQ063); ja tohtoriohjelma korkeakoulutuksesta of China (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm) ja XZ (nro 20130131120067).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Worldwide, virtsarakon syöpä (BC) on toiseksi yleisin maligniteetti virtsateiden, noin 386300 uutta tapausta ja 150200 kuolemantapausta vuosittain [1 ]. Koska useimmat paikallisesti edennyt BC potilaat kokevat uusiutumisen jälkeen radikaali cystectomy [2], adjuvanttihoitoa yleensä muotoon pyrkimyksenä viivyttää toistuminen ja pidentää elinaikaa. Tällä hetkellä, sisplatiini on yksi tärkeimmistä kemoterapialääkkeet BC yhdistelmänä hoito, kuten MVAC (metotreksaatti, vinblastiini, doksorubisiini, sisplatiini) ja GC (gemsitabiini ja sisplatiini). Kuitenkin vain 50% lihasten invasiivisia BC potilaat ovat reagoineet sisplatiini kemoterapiaan [3]. Vielä pahempaa, jotkut potilaat vain kärsiä myrkyllisyys saavuttamatta kemoterapeuttisen hyötyä. Siksi on olemassa kiireellinen tarve ennustaa, adjuvanttihoitoa BC selviytyminen ja ymmärtää mekanismit, jotka estävät vastaus kemoterapiaa.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet kestävyys sisplatiinihoitoon voisi välittyä MikroRNA (miRNA) [ ,,,0],4, 5]. miRNA ovat luokan ei-koodaavan sääntelyyn RNA: t, joka koostuu noin 22 nukleotidia, jotka toimivat ensisijaisesti säätelevät vaimentaen kohde-mRNA: iden sitoutumalla spesifisesti 3′-transloimaton alue (3′-UTR), ja sen jälkeen edistää hajoaminen ja /tai estämään translaatio [6, 7]. Useita julkaisuja ovat dokumentoineet miRNA voi toimia tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien osallisena kasvainten muodostumista, huolto, ja etäpesäkkeitä, ja ovat mahdollisia biomarkkereita syövän diagnosointiin, hoitotulokseen ja ennusteen [8-10]. Näistä miR-203 toimii yleensä tuumorisuppressorina, ja on säädellä vähentävästi erilaatuisia ihmisen maligniteettien lukien BC [11]. Äskettäin miR-203 ilmaisu on yhdistetty resistenssin kehittymistä vastaan ​​kemoterapian moniin syöpiin. Esimerkiksi miR-203-tasot laskivat hankittu kemoterapiaa huumeiden rintasyövän soluja [12]. Yliekspressio miR-203 parantaa syövän vastaista vaikutusta paklitakselin koolonkarsinoomasoluissa kautta solun uudiskasvun estämiseksi, joka edistää apoptoosia ja syöttämällä [13]. Sen sijaan Zhou et al [14] löydetty eksogeeninen ilmaus miR-203 aiheuttama resistenssi oksaliplatiinille peräsuolen syöpäsoluja. Tähän asti ei ole juurikaan tiedossa mahdollisesta roolista miR-203 sisplatiini- BC kemoterapiaa ja tarvitaan lisätutkimusta.

Tässä tutkimuksessa miR-203 tutkittiin kliinisesti resektoitiin kudoksissa BC hoidettiin radikaali cystectomy ja sisplatiini-kemoterapiaa liitännäishoitona, ja yhdistyksen välillä miR-203 ja ennusteen analysoitiin. Lisäksi mekanismeista rooli miR-203 chemoresistance BC tutkittiin. Löysimme alhainen ilmentyminen miR-203 korreloi etenemistä ja huono selviytyminen BC saaneilla potilailla sisplatiini-kemoterapiaa liitännäishoitona. Lisäksi palauttaminen miR-203 ilmentyminen voi lisätä herkkyyttä sisplatiinin BC soluissa edistämällä solujen apoptoosia kohdistamalla Bcl-w (tunnetaan myös nimellä BCL2L2) ja surviviinin (tunnetaan myös nimellä BIRC5), joka osoitti, miR-203 saattaa olla joitakin mahdollinen arvo ennusteessa ennustaminen ja terapeuttinen käyttö.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaiden ja kudosnäytteiden

tutkimus hyväksynyt eettinen komitea Qilu sairaalan Shandongin yliopistossa, ja kirjallinen ilmoitti luvan kunkin potilaan saatiin myös. Alustavassa tutkimuksessa oli mukana yhteensä 149 BC hoidetuista potilaista radikaali cystectomy ja sisplatiini-kemoterapiaa liitännäishoitona Qilu sairaalan, Shandongin yliopistossa huhtikuusta 2007 ja maaliskuussa 2010. Kaikki potilaat olivat histologisesti vahvistetuilla lokalisoitu siirtymäkauden cell carcinoma, järjestetään niin PT3A-4a /N + ja M0 mukaan 2010 AJCC /TNM luokittelu. Standardi kemoterapiakäytäntöä (MVAC tai GC) annettiin välillä 3-10 viikkoa jälkeen täydellinen resektio, enintään 6 jaksoa, ellei etenemiseen tai kestämättömien haittavaikutusten ilmestyi. Näistä 25 sai sädehoitoa, BCG hoito tai neoadjuvanttikemoterapian, ja 16 jätettiin pois epätäydellisestä resektio. Tutkintavankeuteen 108 potilasta seurattiin kystoskopia neljännesvuosittain ensimmäisen 2 vuotta, sitten puolivuosittain 5 vuotta, ja sen jälkeen vuosittain vasta tammikuussa 2015. eteneminen määriteltiin Paikallista toistuminen, kaukainen etäpesäke tai kuoleman takia BC. Progression elinaika (PFS) laskettiin, kun leikkaus kuluessa ensimmäisestä etenemiseen ja Kokonaiselossaoloaika (OS) laskettiin, kun leikkaus kuolinpäivä. Potilaat, jotka eivät yllä tapahtuma sensuroitiin tutkimuksen lopussa. Kaikki kudokset olivat snap-jäädytetty ja vahvistanut patologinen analyysi, ja varastoidaan -80 ° C: ssa, kunnes RNA.

Solulinjat ja kulttuuri

Ihmisen BC solulinjoja (5637 ja T24) ja HEK 293T-solulinja hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), ja ylläpidettiin RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ympäristössä, joka on 5% CO

2 ilmassa.

transfektio

Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) käytettiin asennuspalveli- 203 jäljittelee /miRNA jäljittelee negatiivinen kont- mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. miR-203 jäljittelee (Dharmacon, Lafayette, CO, USA) oli kaksijuosteinen RNA oligonukleotidien suunniteltu jäljittelemään endogeenisen, kypsä miR-203. miRNA jäljittelee negatiivinen kontrolli (Dharmacon) perustui cel-miR-67, kypsän sekvenssin: UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA, ja oli samanlainen malli ja muutoksia miR-203 matkii.

RNA ja RT-qPCR

Kokonais-RNA eristettiin kudoksista tavallisilla TRIzolia menetelmää (Invitrogen, Carlsbad, CA) seuraten valmistajan protokollaa, ja mitataan NanoDrop spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). RT-qPCR suoritettiin ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Detection of miR-203 suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Bcl-w ja surviviinia mRNA: iden määrän, RNA käänteistranskriboitiin käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), sitten 10-kertaisesti laimennettua cDNA: ta monistettiin Virta SYBR Green PCR Master Mix ( Applied Biosystems). Suhteellinen ilmentymistaso miR-203: n ja Bcl-w: n ja surviviinin mRNA: t laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmän avulla normalisoidaan viite geenien U6 snRNA ja GAPDH-mRNA: n, vastaavasti.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elävyys kvantitoitiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Diojindo Laboratories, Kumamoto, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. -Soluja (5 x 10

3 solua /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena 24 transfektion jälkeen, ja inkuboitiin 0, 5, 10, 15, 20, 25 ja 30 uM sisplatiinin 100 ui viljelyalustaa toiseen 24h. Sitten, WST-8-substraattia lisättiin 37 ° C: ssa 2 tuntia, ja absorbanssi luettiin spektrofotometrillä 450 nm.

Virtaussytometria apoptoosin määritystä

Virtaussytometrianalyysi apoptoosin analysoitiin käyttämällä anneksiini V-FITC /PI -värjäyspakkausta (BestBio, Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut (1 x 10

4 solua /kuoppa) stimuloitiin 5 uM sisplatiinin 48 tuntia ja sitten kerättiin. Kun oli pesty 3 kertaa kylmällä PBS: llä, solut suspendoitiin uudelleen sitomispuskuriin seurasi värjäys anneksiini V-FITC: llä 15 min ja PI 5 min pimeässä. 1 x 10

4 solut arvioitiin FACS Calibur virtaussytometrillä (BD, Bedford, MA, USA). Kaikki kokeet tehtiin kolminkertaisina.

TUNEL-määrityksessä

Solut (1 x 10

4 solua /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena transfektion jälkeen, ja inkuboitiin 5 uM sisplatiinin 100 ui viljelyalustaa 24. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 min ajan, sitten se neutraloitiin 2 mg /ml glysiini 5 min, läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 10 min, ja lopuksi leimattu fluoreseiini-12-dUTP käyttämällä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia. Lokalisoitu vihreän fluoresenssin apoptoottisten solujen (fluoreseiini-12-dUTP) havaittiin fluoresenssimikroskopialla.

Western blotting -analyysi

Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, solut hajotettiin jääkylmässä radioimmunosaostuskoe (RIPA) puskurissa 30 minuutin ajan, ja proteiinikonsentraatio määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä reagenssia (Bio-Rad, CA, USA). Kolmekymmentä ug proteiinia näytteet ladattiin ja erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja (Millipore, Bedford, MA, USA). Membraanit blokattiin ensin 5% rasvatonta rasvaton maito 2 tunnin ajan, sitten inkuboitiin anti-Bcl-w (1: 1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-Surviviini (1: 1000; Abcam, Cambridge, Massachusetts, USA), tai anti-β-aktiini-kanin monoklonaalista vasta-ainetta (1: 1000, Cell Signaling Technology) yön yli 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin HRP-leimattua sekundaarista vasta-ainetta (1: 5000, Cell Signaling Technology) 1 h huoneen lämpötilassa. Lopuksi bändit visualisoitiin käyttäen kemiluminesenssidetektiolla (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) FluorChem E Kemiluminesenssiin Western Blot Imaging System (Cell Biosciences, Santa Clara, CA, USA).

lusiferaasireporttiterilla määritys

pmiR-MIETINTÖ

TM vektorit (RiboBio, Guangzhou, Kiina) rakennettiin villityypin (WT) tai mutantti (MUT) 3′-UTR Bcl-w ja surviviinia ja kaikki sekvenssit olivat väliin hRluc ja hLuc geenin. HEK293T-soluja (1 x 10

4 solua /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille ja ko-transfektoitiin miR-203 /negatiivinen kontrolli miRNA ja WT-surviviinin 3′-UTR vektori /Mut surviviinin 3′-UTR vektori tai WT-Bcl-w: 3′-UTR vektori /Mut Bcl-w 3′-UTR-vektorin kanssa käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja analysoitiin käyttäen Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). Kukin määritys suoritettiin kolmena kappaleena.

Tilastollinen analyysi

miR-203 ilmentymistä kudosnäytteistä määritettiin ei-normaali jakauma käyttäen Kolmogorov-Smirnov testi. Näin ollen, Mann-Whitneyn U-testiä tai Kruskal-Wallisin testiä käytetään arvioimaan merkitystä miR-203 ryhmien välisiä eroja. Vastaanotin toimii (ROC) käyrä suoritettiin arvioimaan syrjintää voima miR-203 erotteleva eteni potilaiden niistä ei ollut edennyt, ja optimaalinen kynnysarvon määritys perustuu Youdenin indeksi (herkkyys + spesifisyys-1) [16]. Survival konstruoitiin Kaplan-Meier menetelmällä, ja verrattiin log-rank-testi. Cox mallia käytettiin tunnistamiseksi riippumattomien tekijöiden PFS ja OS. Studentin t-testi suoritettiin sen määrittämiseksi, merkitys tietojen elinkelpoisuuden määrityksessä, apoptoosimäärityksessä ja lusiferaasireportterigeenin määritys. Suhde miR-203 ja kohdegeenin ilmentyminen tutustuu Spearman korrelaatio. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS Statistics 17.0 for Windows (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Tulokset

Potilasominaisuudet

mediaani-ikä on 108 BC potilailla, jotka saivat sisplatiinia kemoterapiaa liitännäishoitona oli 62 (vaihteluväli 42-81) vuotta ja mediaani seuranta-aika oli 51,5 (vaihteluväli 6-65) kuukautta. Seuranta-aikana, 45 potilasta osoitti etenemistä, joista 32 tapauksessa oli Paikallista toistuminen, 11 tapausta osoitti etäinen etäpesäke, ja 39 kuoli lopulta BC. Yksityiskohtaisesti lähtötilanteen ominaisuudet potilaista on esitetty taulukossa 1.

alennetulla miR-203 ilmentyminen liittyi taudin etenemiseen

miR-203 tasot olivat merkittävästi vähentyneet etenemistä ryhmässä verrattuna ei edennyt ryhmä (

P

0,001; Kuva 1A ja S1 File). ROC käyrät analysoi kuvitettu miR-203 tuotti ala ROC-käyrän (AUC) arvo 0,839 (95% CI, 0,756-,903) erottamisessa potilailla, joilla eteneminen näistä ei ollut edennyt, mikä oli tarkempi kuin arvailla (

P

0,001; Kuva 1B). Ei kuitenkaan ole merkittäviä esiintynyt eroja miR-203 tasoilla ja ikä, sukupuoli, luokka, T vaiheessa imusolmukestatuksesta, ja solunsalpaajahoitoa (kaikki

P

0,05, taulukko 2).

(A) miR-203 tasot havaittiin RT-qPCR menetelmällä ja normalisoidaan U6-RNA 108 tapauksissa virtsarakon syöpään kudoksiin. Tasot miR-203 etenemisessä ryhmässä olivat merkittävästi alhaisemmat kuin ei edennyt ryhmä (

P

0,001, U-testi). (B) ROC-käyrän erottaa sairastavien potilaiden etenemistä niistä ei ollut edennyt käyttävät miR-203, jonka pinta-ala alle ROC-käyrän arvo 0,839 (95% CI, +0,756-+0,903). (C, D) Kaplan-Meier PFS ja OS käyrät perustuvat miR-203 ilmentymistä virtsarakon syöpäpotilailla. Optimaalinen raja-arvo (0,345) lasketaan ROC-analyysiä käytettiin luokitella potilaita korkean ja matalan miR-203 ilmaisua ryhmissä. Alhainen ilmentyminen miR-203 korreloi merkitsevästi lyhentää PFS tai OS (molemmat

P

0,001, log-rank-testi).

miR-203 ennustaa ennuste BC potilaille kemoterapian jälkeen

Perustuu optimaalinen raja-arvo (0,345) lasketaan ROC-analyysi BC etenemisen jälkeen kemoterapiaa, 79 potilasta, joiden miR-203 tasot olivat yli 0,345 luokiteltiin korkea miR-203 ilmaisu ryhmä , loput 29 tapausta luokiteltiin alhainen miR-203 ilmaisun ryhmä. Kaplan-Meier selviytymisen käyrä osoitti alhainen ilmentyminen miR-203 korreloi merkitsevästi lyhentää PFS ja OS (Sekä

P

0,001; Kuva 1C ja 1 D).

Univariate Cox Regressioanalyysistä paljasti merkittäviä assosiaatioita miR-203, T vaiheessa imusolmukestatuksesta ja PFS (kaikki

P

0,05, taulukko 3), sekä miR-203, T vaiheessa ja OS (kaikki

P

0,05, taulukko 3). Jättäessään edellä merkittäviä tekijöitä otetaan Coxin monimuuttuja malliin, miR-203, T-luokkaa ja imusolmukestatuksesta osoittanut riippumaton ennusteen arvioinnissa PFS (kaikki

P

0,05, taulukko 3), ja miR-203, T vaihe osoitti riippumaton ennusteen arvioinnissa OS (kaikki

P

0,05, taulukko 3).

yli-ilmentyminen miR-203 tehostetun sisplatiinin herkistyminen BC soluissa

Tutkitaan vaikutuksen miR-203 sisplatiinilla kemosensi- BC soluissa, pitoisuudesta riippuvainen käyrät 5637 ja T24 BC solulinjat transfektoidaan miR-203 matkii ja negatiivisen kontrollin piirrettiin. Kuten on esitetty kuviossa 2A, 24 tuntia transfektion jälkeen, MIR-203 ekspressiotasot 5637 ja T24-solujen, jotka oli transfektoitu miR-203 jäljittelee olivat 5297 ja 8089 kertaa suurempi kuin transfektoitiin negatiivisen kontrollin (

P

0,001). Cell elinkykyä miR-203-yliekspressoivassa 5637 ja T24-soluja vähentynyt voimakkaasti verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu negatiivinen kontrolli, jonka pitoisuus gradientti 5, 10, 15, 20, 25 ja 30 uM: ssa 24 tuntia (kaikki

P

0,05, kuvio 2B ja 2C). Puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC50) arvot kanssa sisplatiinia 5637 ja T24 solut olivat 11,1 (95% IC 9,7-12,5) uM ja 14,3 (95% IC 12,7-16,1) uM, tässä järjestyksessä. Yli-ilmentymisen miR-203 vähensi IC 50-arvot 8,3 (95% IC 6,9-9,6) uM ja 9,0 (95% IC 7,6-10,4) uM, tässä järjestyksessä. Lisäksi vaikutukset miR-203 gemsitabiinin ja sisplatiinin yhdistelmän näytettiin S2 File.

(A) miR-203 ekspressiotasot 5637 ja T24-solujen, jotka oli transfektoitu miR-203 jäljittelee /negatiivisena kontrollina. miR-203 tasot olivat huomattavasti transfektoiduissa soluissa miR-203 jäljittelee verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu negatiivinen kontrolli (*

P

0,001, t-testi, n = 6). (B, C) pitoisuus riippuva käyrät 5637 ja T24 solulinjat transfektoidaan miR-203 matkii ja negatiivinen kontrolli klo 24. Cell elinkykyä miR-203-yli-ilmentävät solut vähentynyt voimakkaasti verrattuna negatiiviseen kontrolliin, jossa soluja 5, 10, 15, 20, 25 ja 30 uM sisplatiinia (kaikki

P

0,05, t-testi). (D) Virtaussytometria-analyysi apoptoosin kautta kaksinkertaisen solujen värjäys anneksiini V FITC ja propidiumjodidilla (PI). (E) kvantifiointi analyysi apoptoosin kuviossa 2B. Yli-ilmentymisen miR-203 merkittävästi täydennetty apoptoosin 5637 ja T24 solulinjoissa (*

P

0,01, t-testi, n = 6). (F) TUNEL määritys osoitti 5637 ja T24 solulinjat transfektoidaan miR-203 matkii osoitti kohonneet DNA pilkkominen verrattuna normaaliin ohjaus (40 x). Solut värjättiin DAPI ja altistettiin TUNEL-määritys DNA: n detektoimiseksi ja apoptoottisten solujen.

Sitten suoritimme virtaussytometria-analyysi määrittää apoptoosin kautta kaksinkertainen solujen värjäys anneksiini V: FITC ja propidiumjodidilla ( PI). Tulokset osoittivat yli-ilmentymisen miR-203 merkittävästi täydennetty apoptoosia sekä BC solulinjoissa (sekä

P

0,05, kuvio 2D ja 2E). Sen varmistamiseksi, että apoptoosin lisääntyminen johtui aktivointi edellä mainitun apoptoosireittiä, mittasimme DNA: n fragmentoituminen TUNEL-määritys ja vahvisti, että solut, jotka on transfektoitu miR-203 osoitti kohonneet DNA katkaisun (kuvio 2F).

Bcl-w ja Surviviinispesifisiä oli suoria alavirtaan kohteina miR-203

Bcl-w ja Surviviinispesifisiä ennustettiin mahdollisina kohdistu suoraa miR-203 kaksi suurta tavoitetta ennustus ohjelmia, TargetScan 5,1 (http: //www.targetscan.org/) ja Miranda (https://www.microrna.org/). Lisäksi Bcl-w ja Surviviinispesifisiä pelataan tärkeä rooli BC kehittämiseen, ja niiden downregulation liittyi suurempi herkkyys sisplatiinin indusoiman apoptoosin [17-20]. Ennustettu miR-203 kohdistaminen sivustoja 3’UTR alueilla Bcl-w: (tunnetaan myös nimellä BCL2L2) ja surviviinin (tunnetaan myös nimellä BIRC5) on esitetty kuviossa 3A. Dual-toimittaja lusiferaasianalyysissä käytettiin vahvistamaan, 3’UTR Bcl-w ja Surviviinispesifisiä mRNA: t olivat kohdesivustoissa miR-203. Rakensimme lusiferaasireportteri- vektori, joka koodaa villityypin 3′-sekvenssin, Bcl-w-mRNA: n tai surviviinin mRNA, mukaan lukien ennustettu miR-203 kohdekohtia, ja vastaava mutantti-reportterivektoria. Kuten on esitetty kuviossa 3B, miR-203 esti merkittävästi luminesenssin intensiteetti WT-Bcl-w: 3′-UTR vektori ja WT-surviviinin 3′-UTR-vektoriin (molemmat

P

0,01), kun taas mutaation sitoutumiskohdan estetty lasku lusiferaasin aktiivisuuden, mikä osoittaa, oli olemassa suora vuorovaikutus miR-203 ja 3’UTR Bcl-w-mRNA: n tai surviviinin mRNA.

(A) kuva ennustetun miR-203 kohdistaminen sivustoja 3’UTR alueilla Bcl-w ja surviviinin. (B) Dual-Lusiferaasiaktiivisuutta määritys suoritettiin HEK293T soluissa kotransfektoitiin ohjaus /miR-203 ja pmiR-SELVITYS vektoreita villiin /mutantti 3′-UTR Bcl-w (yllä) ja Surviviinispesifisiä (alla). *

P

0,01, t-testi, n = 6 (C) Western-blotit osoittavat downregulation Bcl-w ja Surviviinispesifisiä proteiineja transfektion jälkeen miR-203 jäljittelee in 5637 ja T24 solulinjoissa. β-aktiini käytettiin kontrollina. (D) RT-qPCR osoittaa downregulation Bcl-w ja Surviviinispesifisiä mRNA: iden transfektion jälkeen miR-203 jäljittelee in 5637 ja T24 solulinjoissa. *

P

0,01, t-testi, n = 6 (E) Spearmanin korrelaatio analyysi osoittaa vastakkainen vaikutus välillä miR-203 ja Bcl-w-mRNA tai surviviini mRNA ilmentymistä virtsarakon syövän kudoksissa (r = -0,781, -0,740, sekä

P

0,001).

edelleen vahvistamaan suhdetta BC, transfektoimme 5637 ja T24 solulinjoissa miR-203 jäljittelee tai negatiivinen kontrolli, ja analysoitiin mRNA ja proteiini ilmentymistä Bcl-w tai Surviviinispesifisiä RT-qPCR ja western-blotting määrityksissä. Tulokset osoittivat, että endogeeninen ilmaisuja Bcl-w: n ja surviviinin merkittävästi vähentynyt sekä mRNA: ta ja proteiinia tasot miR-203 transfektoitiin BC-soluja (kuvio 3C ja 3D). Tämän mukaisesti, oli myös vastakkainen vaikutus välillä miR-203 ja Bcl-w tai surviviini mRNA: n ekspression BC kudoksissa (r = -0,781, -0,740, sekä

P

0,001; Kuva 3E ). Yhdessä miR-203 voisi käyttää sen toiminnon suoraan kohdentamalla Bcl-w ja surviviinia geenin BC.

Keskustelu

Leikkauksen jälkeinen sisplatiini-kemoterapian on käytetty laajasti lihaksen invasiivisia tai metastaattinen BC , tuloksena vasteen jopa 70% potilaista [21]. Valitettavasti, koska chemoresistance syöpäsoluja, vaste ei jatkunut yli 50%: ssa tapauksista, jolloin 5 vuoden pysyvyys on 15% [22, 23]. Näin ollen on tärkeää ymmärtää paremmin tekijöitä, jotka määrittävät kemoterapiaa vastausta ja ennustetta. Nordentoft ym [24] ovat löytäneet 15 miRNA vastauksena sisplatiinihoitoon, ja 5 miRNA liittyy elinaika, joista 3 miRNA (miR-886-3p, miR-923, miR-944) katsottiin ennustajina molempien sisplatiinin vasteen ja ennustetta. Aiemmat tutkimukset ovat dokumentoitu vähentynyt ilmentyminen miR-203 liittyi taudin etenemiseen ja huonon ennusteen joidenkin syöpien, kuten ihmisen pään ja kaulan okasolusyöpä [25], gliooma [26], ja ruokatorven adenokarsinooma [27]. Yhdenmukainen Edellä kuvattujen havaintojen perusteella tämä tutkimus määrällisesti miR-203 tasot kohortin BC hoidetuista potilaista radikaali cystectomy ja sisplatiini-kemoterapiaa liitännäishoitona, ja löysi miR-203 väheni merkittävästi potilailla, joilla on etenevä sairaus, vaikka ei liity muita kliinis ominaisuudet. Lisäksi ROC-analyysi osoitti miR-203 oli joitakin diagnostisia valtaa erotteleva potilaalla ei etenemistä. Perustuen optimaalinen raja-arvo miR-203, me luokitellaan kaikki potilaat osaksi korkea ja matala miR-203 ilmaisua ryhmissä. Kaplan-Meier-analyysi osoitti matalan miR-203 ilmaisu ryhmä oli huono PFS ja OS. Coxin monimuuttuja regressioanalyyseissä osoittaneet miR-203 oli itsenäinen ennustetekijä BC potilaille. Siten mi-203 voitaisiin käyttää ennustetta ennustamiseen BC potilaista sisplatiinia kemoterapiaa liitännäishoitona.

Cellular vastustuskykyä sisplatiinin usein osoittaa monitekijäinen luonne, mukaan lukien heikentynyt solunsisäinen huumeiden ottoa, kohonnut DNA vahinkosaneeraus, ja vähentynyt suorituksen apoptoottisen ohjelman [28]. Drayton ym [29] löydetty miR-27a osaltaan sisplatiinin vastus säätelemällä solunsisäisen glutationin. Vinall ym [30] osoitti yhtäaikainen käsittely miR-34a ja sisplatiinin johti dramaattiseen inhibition syöpäsolujen lisääntymistä verrattuna sisplatiinihoidolle yksinään. Kääntäen, sisplatiini aiheuttaa demetylaation MIR-34a promoottori ja lisää miR-34a ilmaisu, edelleen herkistävät BC soluja sisplatiini [31]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että transfektio BC solujen miR-203 jäljittelee herkistyneet solujen sytotoksista aktiivisuutta sisplatiinin. Samaan aikaan, tiedot apoptoosin määrityksiä osoitti, kun lisätään 5 uM sisplatiinin, lisää apoptoosia havaittiin miR-203-yliekspressoivassa virtsarakon syövän solujen, mikä viittaa siihen, että inhibitio BC solujen elinkelpoisuuden voi liittyä ainakin osittain parannettu alttius sisplatiinin aiheuttamaa apoptoosin. Siten yhdistelmä hoito miR-203 matkii ja sisplatiinin voisi parantaa BC potilaiden hoitotuloksia.

Saadaksemme lisää ymmärrystä roolin miR-203 BC kehittämiseen, sen mahdollinen loppupään tavoitteet analysoitiin. Jäsenenä Bcl-2-perheen, Bcl-w voi edistää solujen eloonjäämistä estämällä sisäisen reaktiotien apoptoosin [32]. Chen et al [33] havaittu Bcl-w on yliekspressoitu BC yksilöitä verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa, mikä viittaa se oli tärkeä rooli syövän synnyssä BC. Surviviinispesifisiä, mikä oli keskeinen jäsen estäjä apoptoosin proteiinin (IAP) perhe [34], suoritetaan sen antiapoptoottisten funktio estämällä caspases aktiivisuus kompleksin X-kromosomiin liittyvä estäjä apoptoosin proteiinia (XIAP) [35]. Monikeskustutkimuksessa löytyi Surviviinispesifisiä ilmentyminen liittyi kohonnut riski BC uusiutumisen ja syövän aiheuttamaa kuolleisuutta [36]. Tuloksemme osoittivat, että miR-203 voi suoraan sitoa 3′-UTR sekä Bcl-w ja surviviinia, jolloin alassäädetty ilmentyminen Bcl-w ja Surviviinispesifisiä post-transkription tasolla. Nämä tukevat kliiniset tiedot, josta löysimme miR-203 ilmentyminen oli ja korreloi negatiivisesti Bcl-w ja surviviinia mRNA: iden ilmentymistä BC kudosnäytteistä. Siten miR-203 voidaan pitää mahdollisena terapeuttisena aineena samanaikainen inhibitio antiapoptoottisten tekijöiden Bcl-w ja surviviinin.

Lopuksi todettakoon, että tutkimus osoittaa, että vähentynyt miR-203 voidaan käyttää ennustajana etenemisen ja ennusteen BC potilaista sisplatiinia kemoterapiaan. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-203 voi parantaa sisplatiini herkistymistä apoptoosin edistämiseksi kautta suoraan kohdistaminen Bcl-w ja surviviinin. Muita monikeskustutkimus tutkimuksia tarvitaan vahvistamaan, onko miR-203 voisi olla käyttökelpoinen indikaattorina kemosensitiivisyys sisplatiiniin kemoterapiaan hoito sekä terapeuttisena kohteena BC klinikalla.

tukeminen Information

S1 File . MIR-203 ekspressiotasot NMIBC potilaista, Progression ryhmä 45 tapauksessa ja ei edennyt ryhmä 67 tapausta.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0143441.s001

(XLSX)

S2 tiedosto. Vaikutukset miR-203 gemsitabiinin ja sisplatiiniyhdistelmähoidon.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0143441.s002

(DOCX) B