Krooninen sairaus

tiivistelmä

Prosessi solutransformaatioon liittyy tarkkaa molekyylitason muutoksia, jotka moduloidaan kautta muuttunut epigeneettiset, transkriptio Translaationjälkeiset ja proteiini säätelyverkkojen. Siten tunnistukseen liittyvä proteiini muutokset voidaan antaa käsityksen suurten säätelyreittejä aktivoituvat taudin etenemistä. Esillä olevassa proteiinin ilmentymisen profilointi lähestymistapa, olemme määritelleet ero sarjaa proteiinien kaksiulotteisen geelielektroforeesin näyttö on vakavien munasarjojen adenokarsinooma etenemisen malli. Toiminnoille luokittelun proteiinien yksinomaan liittyy ennalta transformoidut solut tunnistetaan neljä soluprosesseissa joista RXR-γ tiedetään moduloida solujen erilaistumista ja apoptoosia. Meillä on siis probed toiminnallista merkitystä RXR-γ ilmaisun ja signalointi näiden kahden reitin aikana syövän etenemiseen. RXR-γ ilmentyminen havaittiin moduloimaan solujen erilaistumista ja apoptoosia vakaan tilan pre-transformoitujen solujen. Mielenkiintoista, retinoidi hoito todettiin tehostaa RXR-γ ilmentyminen transformoiduissa soluissa ja herkistää niitä kohti apoptoosin

in vitro

, ja myös vähentää kasvua ksenograftien peräisin transformoiduista soluista. Meidän havainnot korostavat, että menetys RXR-γ tasot näyttää tarjoavan mekanistisen etuja transformoituja soluja kohti hankinta vastustuskyky apoptoosin tuntomerkki syövän, kun taas tehokas retinoidi hoito voidaan esittää toteuttamiskelpoisen lähestymistavan herkistymistä kasvainsolujen apoptoosin induktion kautta RXR- γ ilme.

Citation: Kalra RS, Bapat SA (2013) Expression Proteomiikka ennustaa menetys RXR-γ aikana eteneminen epiteelin munasarjasyöpä. PLoS ONE 8 (8): e70398. doi: 10,1371 /journal.pone.0070398

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 helmikuu 2013; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 06 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Kalra, Bapat. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Department of Biotechnology, Intian hallitus, New Delhi KTT [Grant no. BT /PR7186 /MED /14/965/2006]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nykyaikainen näkemys tumorigeneesin on, että muunnos tulokset monivaiheinen prosessi, johon geneettinen, epigeneettiset, solu- ja kudos- liittyvät muutokset [1], [2], [3]. Nämä vaikutukset muutoksia useiden sääntely- ja toiminnallisia verkostoja solussa, jotka johtavat asteittaiseen hankintaan valmiuksia omavaraisuuden kasvun signaaleja, sieto anti-kasvun signaaleja, rajoittamaton replikatiivisia potentiaali, kiertäminen apoptoottiset signaalit, kudosten ja metastaasit, ja jatkuva angiogeneesi [4]. Enemmän viime aikoina, energia-aineenvaihduntaa uudelleenohjelmointi ja kiertää immuunijärjestelmän tuhoutuminen ovat saaneet ylimääräisenä tunnusmerkkejä transformaatio [5].

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on tunnustettu viidenneksi yleisin syöpä ja korkein syöpään liittyvän kuolemista nainen [6], [7]. Rajoituksena EOC tutkimuksissa on puute tunnistamisen pre-neoplastisia vaurioita, jotka johtavat nopeaan ja aggressiivinen etäpesäke, jossa vaiheessa tauti on useimmin diagnosoitu. Tämä on edelleen monimutkaisempi viimeaikaisten havaintojen viittaavat siihen, että korkea-asteen EOC olevan peräisin munanjohtimeen epiteelin, toisin kuin klassisen lausunnon munasarjojen pinnan epiteeli ollessa solun alkuperästä [8], [9]. Vaikkakin nykyiset Proteome analyysit tarjoavat dynaamisen ja tehokas lähde tunnistaminen tuumorisuppressorien, onkogeenien, syövän diagnostiikassa ja terapeuttisia [10], [11], [12], [13], laajennettu käsitys monivaiheisen muutoksen tapahtumista EOC vis-suhteessa muuttunut molekyyli ilmaisuja keskuudessa muunnetaan ja ennalta transformoitujen solujen vielä ratkaisematta.

Tämä tutkimus perustuu proteomic profilointiin olevan

in vitro

mallissa vakavien munasarjan adenokarsinooma ( SeOvCa) perustettiin aiemmin meidän lab [14]. Lyhyesti, meillä oli perustanut useita yksisoluiset klooni peräisin kulttuureihin pahanlaatuiset vesivatsat Grade IV serous munasarjan adenokarsinooma potilaalle. Yhdeksäntoista näistä tehtiin spontaani kuolemattomaksi ja perustettiin jatkuvina linjat. A4 klooni oli yksi näistä klooneista. Alkuperäisessä kohtia, se nähtiin hitaasti pyöräily ja ei-tuumorigeenisiä; Kuitenkin noin passage 20-25 siihen muuttuu aggressiivisesti tuumorigeenisia klooni metastasoitunutta ominaisuuksia. Nämä tiedot viittaavat siihen, että varhainen A4 soluja, vaikka puuttuu tumorigenecity oli jo hankkinut joitakin ominaisuuksia muutosprosessia. Siksi me viitataan näihin olevan ennalta muunneta (A4-P), kun taas transformoidut solut on johdettu A4-P-soluja kutsutaan kuin A4-T. Tämä antoi meille sopiva etenemisen malli kaksi toiminnallisesti erillisiä solun, jotka on johdettu yksittäinen klooni on kasvain. Proteomia profiilit Tämän A4 etenemisen malli ratkaistaan ​​2-ulottuvuuden geelielektroforeesi (2DE) ja sen jälkeen MS (MALDI-TOF /TOF) johti johtaminen tietyn proteiinin ryhmään niiden yksinomainen ja differentiaalikaavojen kuvioita.

luonnehdinta toiminnallisten verkostojen määritelty tällaisia ​​proteiineja esiin selvän käsityksen muuttunut solujen toiminnallisuuden ja suuria reittejä mukana munasarjojen solutransformaatio. Näiden, RXR-γ moduloidun solujen erilaistumisen ja apoptoosin olivat yksinomaan ennalta transformoidut solut. Modulaatio retinolia aineenvaihdunta on ehdotettu yhdessä EOC eteneminen [15], [16], jossa on alentuneet CRBP1 (cellular retinolia sitova proteiini-1) pidetään ratkaisevana askeleena etenemistä muutosprosessi [17]. Kuitenkin tarkka merkitystä RXR-γ signalointi edelleen suurelta osin tuntemattomia. Päätimme sen toiminnallinen rooli transformoituneiden solujen meidän etenemisen mallin kautta induktion ilmaisun käsittelemällä selektiivisten retinoidien lukien 9

cis

retinoiinihappo (CRA), Adapalane (ADA) ja 4 – [(E) – 2- (5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametyyli-2-naftalenyyli) -1-propenyyli] bentsoehappo (TTNPB). Tällainen modulaatio solujen erilaistumisen ja apoptoosin RXR-γ in SeOvCa ulottuu lisäksi nykyisen ymmärryksemme solutransformaatioon.

Tulokset

Vertaileva proteiinin ilmentymisen analyysi A4-P ja A4-T epiteelin munasarjasyöpä etenemisen malli

toiminnallisesti eri A4-P ja A4-T epiteelin munasarjasyövän soluilla selvä fenotyypin, entisen ollessa kara-muotoinen, kun taas jälkimmäinen näyttävät epiteelin kaltainen morfologia (Fig. 1A). 2-DE geelit valmistettiin käyttäen proteomiin näytteitä A4-P ja A4-T-solut. Kaksi teknistä sarjaa 2-DE analyyttinen geelit valmistettiin kustakin fenotyyppi kussakin kokeessa, joka suoritettiin kolmena kappaleena (yhteensä 6 toistoa) ja hopea-värjättiin. Skannattuja kuvia käsiteltiin käyttäen PDQuest ja proteiinien ero ilme oli selityksin. Keskimäärin 400-500 ero proteiini täplät näin rajatut. Lisäykset paikkoja johti johtamista proteiinin sarjaa perustuen niiden ekspressiokuvioita jokaisessa solutyypissä. Kohti tunnistaminen ero proteiinin ilmentymisen, valitut proteiinitäplien hajotettiin ja massaspektrit syntyi MS /MS-analyysit. GPS Explorer ohjelmistot (v.3.6) käytettiin esittämään yhdistetyn MS ja MS /MS tietoja MALDI-TOF /TOF kohteeseen Mascot vastaan ​​SwissProt tietokantaan. Kaikkien proteiinien näin analysoitu, kohtuullinen järjestyksessä kattavuus, alhainen indeksi massan virheet ja korkea luottamusväli (CI ≥95%) saatiin.

. Morfologiset erot A4 ennalta muunneta (A4-P) ja A4 muunneta (A4-T) soluja (Bar 100μ). B, analyyttinen putki; Alempi paneeli-edustaja geeli kuvat osoittavat yksinomaan ilmaistaan ​​proteiinien A4-P-soluissa (vasen – EEx) ja A4-T-soluja (oikealla – lex). C, Venn kaavio, jossa proteiinit luokiteltu kaikki 4 alaryhmien. D.I.-ii, Pie, joka esittää molekyylitason toiminnallisuus ja reitit liittyvät tunnistettu A4-P ja A4-T proteiineja vastaavasti. E, kvantitatiivinen proteiinin ilmentymistä vimentiinista, sytokeratiinivasta-8 ja sytokeratiinivasta-18; Esitetyt tiedot edustavat 3 eri kokeesta kuvataan keskiarvona ± SEM *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0.00.

johtaminen proteiinin ryhmien perusteella ilmentymiskuvio

MS /MS-pohjainen proteiini tunnistaminen johti johtaminen kahteen ryhmään eri tavalla ekspressoituneiden proteiinien (Fig. 1 B).

ryhmä I

koostuvat proteiineista, jotka laadullisesti (yksinomaan) joko A4-P tai A4-T (kutsutaan kuin EEx ja lex proteiineja vastaavasti), kun taas

ryhmä II

sisältää proteiineja ilmaistu kvantitatiivisesti eri tasoilla (vähintään kaksi-kertainen ero ilmentymisen kahden solutyyppien). Kumpikin ryhmä jaettiin edelleen kahteen alaryhmään perustuen niiden ilmaisuja vastaavissa solutyypeissä. Lisäykset laadullisia ja määrällisiä ilmauksia suoritettiin kussakin Replikoitumattoman sarjan A4-P ja A4-T-solut. Kaikkiaan 10 ja 34

I ryhmän

proteiineja ja, 31 ja 48

Ryhmän II

proteiinit havaittiin ilmaistaan ​​A4-P ja A4-T-soluissa (kuvio. 1C; Taulukko S1). Taulukot 1 2 luetellaan tunnistettu

I ryhmän

ja

ryhmä II

proteiinien tiettyyn paikalla numerot, molekyyli- ja toiminnan kuvaus sekä yksityiskohdat ottelun peptidien, proteiinien pisteet, sekvenssi kattavuus (%) ja suhteellinen ilmaisun fold-muutos.

luokittelu toiminnallisia polkuja raportoitujen ontologiat ja ilme validointi

Gene ontologia analyysit määritettiin lisää erillisiä molekyyli- toiminnot ja reitit liittyvät tunnistettuihin proteiinin profiileja kaksi solutyyppejä (Fig. 1D.i). Siten useat solua sääteleviä mekanismeja kuten proteiinibiosynteesin, solun tukirangan organisaatioon, signaalitransduktion, apoptoosin säätelyyn ja proteiinien hajoamista suurelta osin rikastuneet ja vaikutti toimivuutta A4-P-soluissa. Näitä ehdotettiin olevan ylikuulumista muiden reittien kuten proteiinien ja energia-aineenvaihduntaan, RNA aineenvaihdunta, solun erilaistumisen ja redox reaktioita.

Käänteisesti toiminnallinen ryhmittely proteiinien A4-T-solut koostui reittejä liittyvä klassisen tunnusmerkkejä syöpäsolujen

eli

. resistenssin apoptoosia, energia-aineenvaihduntaan, solujen lisääntymisen, angiogeneesin ja invaasion ja etäpesäkkeitä (Fig. 1D.ii). Siten molekyylit osallistuvat liittyy proteiinien biosynteesiä, taitto ja kuljettaa hallita dynaamista proteiinien aineenvaihduntaan transformoiduissa soluissa kohti yhteen sen proliferatiivisen toiminnan.

Towards vahvistaa tasoilla joitakin tunnistetuista proteiineista, niiden ilmaisuja todensi välillä A4-P ja A4-T-solujen kautta immunoblottauksella (Fig. 1 E, Fig. 2A, B, C, D). SeOvCa on ainutlaatuinen, että muutos on ekspressioon liittyviä epiteelin markkerit [21]. Parannettu vimentiinista ilmentyminen A4-P-solujen viittaavat mesenkymaaliset taas kohonneet sytokeratiinivasta 8 ja 18 A4-T-solut korreloivat epiteelin ominaisuuksia vastaavasti (Kuva. 1 E), lisäksi on yhdenmukaiset niiden solun muotoon ja vallalla hypoteesi.

kvantitatiivinen validointi ilmaisun ja taita muutos joidenkin proteiinien tunnistettiin molemmissa ryhmissä; Ryhmä I proteiineja, A, yksinomaan ilmaistuna A4-P ja B, A4-T-solujen osalta; kun taas D, ryhmä-II proteiinien määrällisesti säädellään ylöspäin A4-P-soluissa ja E, A4-T. E. Suhteellinen ilmentyminen RXR-γ ja β-aktiini on CRA, ADA tai TTNPB retinoidien käsiteltiin A4-P (P) ja A4-T (T-solut) validoitu immunoblottauksella. F. kvantitointi suhteellisen RXR-γ ilmentymisen A4-P ja A4-T-solut. Tilastollinen analyysi osoittaa testin merkitystä (* -Säätimet A4-P ja retinoidit käsiteltyjä soluja; $ – ohjaus A4-P ja retinoidit käsiteltyjä soluja) kantavassa esitetyt tiedot ovat edustavat kolmea erillistä koetta ja kuvattu keskiarvona ± SEM *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001.

toiminnallinen luonnehdinta RXR-y yksinomainen ryhmä I proteiini

Ten I ryhmän proteiinit ilmennettiin yksinomaan A4-P-solujen (EEx proteiineja). Kirjallisuus-pohjainen toiminnallinen huomautusta johtanut niiden categorizat ioni neljään toiminnalliseen ryhmään

eli.

solujen erilaistumista ja apoptoosia –

RXR-γ, PRDX4;

Solulisääntyminen

– GNA11, PIBF-1, ANXA5, katepsiini D (CTSD);

Mitosis ja sytokineesiin

– KLH9;

Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) B – TPM1, ANXA5.

Vaikka kaikki edellä mainitut toiminnot ovat merkityksellisiä muutosprosessi, keskityimme tutkitaan toimivuutta solujen erilaistumisen ja apoptoosin että on kriittinen ylläpitämisessä kudoksen homeostaasiin ja tunnettuja säänneltävä RXR-γ transkriptionaalisella tasolla dimeroivalla retinoiinihappohoidon tai retinoiinihappo X-reseptorit (RAR tai RXR vastaavasti) tai muu salliva heterodimeerin kumppanien kuten PPAR-γ [22], [23 ], [24]. Olemme siis päättäneet tutkia roolia RXR-γ meidän epiteelin munasarjasyövän etenemisen malli.

RXR-γ vuorovaikutus tumareseptoreja ja modulaatio solujen erilaistumisen A4-P-solujen upon retinoidien hoito

Retinoid hoito tehostetun RXR-γ tasot A4-P-soluissa; ja mielenkiintoisesti, jatkettiin merkittävää ilmentymistä A4-T-solujen samoin (Fig. 2E, F). CRA ja ADA yksilöllistä kohonnut RXR-γ tasot molemmissa solutyypeissä, vaikka tämä induktio oli vähemmän tehokas yhdessä TTNPB. Kohti validointi RXR-γ vuorovaikutus muiden tumareseptorien, samanaikainen immunosaostus ja immunoblottauksella vahvisti vuorovaikutukset PPAR-γ, RAR-γ, RXR-α ja RAR-α pre-transformoiduissa soluissa (Fig. 3A, B). Arviointi RXR-γ osallistumista solujen erilaistumista saavutettiin profilointi epiteeli- markkereita E-kadheriinin (E-cad), sytokeratiinivasta 18 (CK-18) ja Mucin-1 (Muc-1) on geenien ilmentyminen ja proteiinin tasot, vakaassa tilassa ja altistuminen luonnon

eli

. CRA ja synteettiset retinoidien (ADA ja TTNPB) (Fig. 3C). Vakaassa tilassa, pienempi ilmentyminen E-Cad havaittiin A4-P-soluissa. Expression of E-Cad entisestään kanssa CRA ja myös ADA; CRA annettiin yksinään tai yhdessä ADA ja TTNPB. Tasot E-Cad, CK18 ja Muc-1 olivat endogeenisesti suurempi A4-T-solut. Synteettinen retinoidi ADA yksin tai yhdessä CRA yliaktiivista CK18 ilmentymistä sekä solutyypeissä. Vaikka erityinen rooli TTNPB solujen erilaistumista ei tunneta, TTNPB hoito aiheutti pieniä ylösajon Differentiaatiomarkkerien. Kaikki kolme markkereita kehitettiin vastauksena retinoidien altistus A4-P-solujen siten vahvistaen osallistumista RXR-γ modulaatioon solujen erilaistumista. Retinoid kohtelu A4-T-solut johti induktioon RXR-γ ilman merkittävää tasojen muutokset näiden epiteelisolujen erilaistumisen markkeri-geenin ilmentymisen ja proteiinin tasot (kuviot. 3D, 3E).

. Co-immunosaostus (Co-IP) kanssa RXR-γ näyttää eluoitiin immunokompleksivälitteiset hopeavärjäyksellä. B. validointi RXR-γ osoittaa vuorovaikutus Co-IP RXR-γ kanssa PPAR-γ, RAR-γ, RXR-α ja RAR-α A4-P-solujen validoitu immunoblottauksella. C. Expression profilointi CK-18, Muc-1 ja E-kadheriinin at transkription (Tr) ja proteiini (Pr) suoritetaan semikvantitatiivinen RT-PCR ja immunoblottaus vuonna CRA, ADA tai TTNPB retinoidien käsitelty A4-P (P) ja A4-T (T-solut). D. kvantitointi mRNA ilmentymisen E-Cad, CK18 ja MUC1 epiteelin Differentiaatiomarkkerien A4-P (P, viiva) ja A4-T-solujen (T; katkoviiva) päälle retinoidien käsittely validoitu RT-PCR. E. kvantitointi proteiinin ilmentymistä E-Cad, CK18 ja MUC1 päättäjien A4-P (P, viiva) ja A4-T-solujen (T; katkoviiva) päälle retinoidien käsittely validoitu immunoblottauksella. Esitetyt tiedot edustavat kolmea erillistä koetta kuvataan keskiarvona ± SEM *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001.

Retinoid aiheuttama RXR-γ tasot herkistää transformoituja soluja kohtaan apoptoosin kautta sisäisellä reitillä

Role of RXR-γ välittämisessä apoptoosin reagointia luonnon- ja synteettisten retinoidien arvioitiin (kuvio . 4A). Vakaassa tilassa, apoptoosin oli merkitsevästi pienempi A4-T-solut verrattuna A4-P-soluissa osoittaa hankinta vastustuskykyä apoptoosin aikana muutosprosessin. Apoptoosi parannettu molemmissa solutyypeissä altistumisesta CRA ja ADA – joko yksinään tai yhdessä (4B). Vaikka TTNPB itsessään ei onnistunut indusoimaan solukuolemaa, yhdessä ADA ja CRA se herkistyneet A4-T-solujen apoptoosin. Retinoidi aktivaatioon RXR-γ ekspressiota havaittiin myös korreloivan suoraan korkeamman apoptoosin (Fig. 2E, F). Olemme profiloitu ilmentymistä transkriptiotekijä Snail (joka antagonisoi p53-välitteinen pro-selviytymisen signalointi aktiivisella tukahduttaminen pro-apoptoottiset PUMA /BBC3, ATM ja PTEN in munasarjasyöpäsoluja stressiä; [19]) ja arvioida vaikutuksia RXR-γ johti apoptoosin sitä. Caspase 9, merkki luontaisten apoptoosireittiä, upregulated aikana RXR-γ ja PPAR-γ induktio ja Bcl-2 merkkiaineina apoptoosin [25]. Snail ja Bcl-2: n ilmentymisen vähenivät, kun taas merkittävästi kohonnut ilmentyminen RXR-γ, PPAR-γ ja kaspaasi 9 näkyivät on retinoidi hoito (Fig. 4C, 4D, 4E). Ilmentymistä näiden molekyylien tehostettiin kombinatorisen retinoidi hoitoon. Olemme edelleen probed vaikutukset retinoidien solusyklin profiileja (Fig. S1A, 1B). Kuten odotettua, vakaan tilan A4-T-solut omaavat korkeammat S G2 /M populaatiot kuin A4-P-soluissa osoittaa aktiivista lisääntymistä. CRA hoito parantaa apoptoosin yhdessä G2 /M pidätys A4-P-solujen taas ADA ja TTNPB johtavan vain G2 /M pidätykseen. Vuonna kombinatorisista hoitoja, CRA ADA tai läsnä kaikkien kolmen retinoidit indusoi G1 /S pidätys transformoiduissa soluissa.

. Anneksiini V-FITC koetulokset osoittavat apoptoosin A4-P ja A4-T-solujen eri retinoidien hoito-; missä minä. joilla ei ole retinoidi hoitoa, ii. käsitelty CRA, iii. ADA ja iv. sekä ottaa vaihtoehtoinen hoito toisen synteettisen retinoidi so TTNPB. B. Tilastollinen analyysi apoptoosimäärityksessä osoittaa merkittävää apoptoosia keskuudessa solutyyppejä erilaista retinoidi hoito. C. Expression analyysit RXR-γ, PPAR-γ, Bcl-2, kaspaasi 9 ja etanan klo transkription (Tr.) Ja proteiini taso (Pr.) Kautta RT-PCR ja immunoblottaus vastaavasti. D. kvantitointi mRNA ilmaisun, i. ilmentyminen RXR-γ, PPAR-γ, Caspase 9, Bcl-2 ja etanan päälle retinoidien hoidon A4-P soluissa, kun taas, ii. osoittaa niiden tasot A4-T-solujen validointi kautta RT-PCR. E. kvantitointi proteiinin ilmentymisen, i. ilmauksia RXR-γ, PPAR-γ, Caspase 9, Bcl-2 ja etanan A4-P soluissa, kun taas, ii. osoittaa niiden tasot A4-T-solujen upon retinoidien hoidon validoitu immunoblottauksella.

In vivo retinoidi hoito vähentää huomattavasti ksenograftin kasvun NOD-SCID-hiirissä kautta RXR-γ välittämää herkistymistä transformoituneiden solujen kohti apoptoosin

laajennettiin edelleen edellä uudelleen herkistää RXR-γ tasot A4-T-solujen vaikutuksia saadaan

in vitro

kokeelliseen kasvaimiin (Fig. 5A). Kasvaimen tilavuus (kuviot. 5B, 5C) kussakin hoidon vaiheessa yhdessä keskimääräisen kasvaimen tilavuuden ja painon 7th viikolla (kuviot. S1C, S1D) osoitti merkittävää vähenemistä retinoidien käsiteltyjen hiirten kasvainten vs. ne DMSO käsiteltyihin kontrolleihin. Kaiken kombinatorinen retinoidi hoito oli tehokkainta. Selvästi voimistunut RXR-γ ilmaisuja retinoidi-käsitellyt tuumorit vahvasti siihen herkistyminen transformoituneiden A4 solujen apoptoosin. Yhdistetyt vaikutus retinoidien havaittiin olevan kaikkein vaarallisin kasvaimen kasvua jatkettiin RXR-γ-välitteisen apoptoosin kasvainsoluissa

in vivo

. RXR-γ tasot havaittiin merkitsevästi korkeampi kaikissa 5 sarjaa myös viestintävirasto, CRA TTNPB, ADA, ADA TTNPB ja CRA, ADA TTNPB; verrattuna DMSO ajoneuvon hallinnan. Tämä on lopullinen korrelaatio RXR-γ stimulaatio ja apoptoosin induktio näissä soluissa

in vitro

(Fig.5D).

. Kokeellinen menettely havainnollistaa retinoidien hoito-ohjelman NOD-SCID-hiirissä. Hiiret havaittiin jopa 3 viikkoa ennen kasvaimen koon kasvaessa 25-30 mm

3, hoito DMSO, CRA, CRA + TTNPB, ADA, ADA + TTNBP ja CRA + ADA + TTNBP alkoivat 4

th viikko ja eteni Jopa 7

th viikko. B. graafinen esitys, joka esittää tuumorin tilavuutta ohjaus ja retinoidien käsitellyistä NOD-SCID-hiirissä eri ajankohtina. C. Vertaileva kasvain koot ohjaus ja retinoidien käsitelty kasvaimia. D. kvantitatiivinen ilmentyminen RXR-γ hallinnassa ja retinoidien käsitellyt tuumorit validoitu immunoblottauksella. Esitetyt tiedot edustavat kolmea erillistä koetta (n = 6

in vivo

koetta) ja kuvattu keskiarvona ± SEM *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001.

keskustelu

olemassaolo useita histologisia alatyyppejä, jotka korreloivat eri solu (t) -of-alkuperää munasarjasyöpä [26] on edelleen este perustaminen edustajan etenemisen mallien tässä sairaudessa. Tämä on toisin kuin muiden pahanlaatuisten kasvainten, kuten eturauhassyövän, joissa tällaisia ​​malleja on käytetty kahden viime vuosikymmenen aikana selvittämisessä molekyylitason mekanismeja taudin [1], [27], [28], [29]. Esillä olevassa tutkimuksessa, yksityiskohtainen yksinomainen ja ero proteiini profilointi etenemistä mallin aikaisemmin perustettuun meidän lab aikaan uusia oivalluksia muuttunut molekyyli kuvioita aikana SeOvCa etenemisen. A4-P-solujen Replikoitumattoman kuolemattomia edustavat preneoplasti- vaiheessa, kun A4-T-solujen aggressiivista ja metastaattinen ominaisuudet edustavat muutosta ja taudin etenemiseen.

data vahvistaa, että kaksi toimintatilaa mallin liittyy erottuva proteiiniprofiilit. Ryhmän sisällä proteiinien yksinoikeudella A4-P-soluissa, luonnehdinta rooli RXR-γ paljasti herkkyyttä ennalta transformoitujen solujen apoptoosiin ja erilaistumiseen kuten aiemmin on kuvattu [30]. Vaarannu RXR-γ tasot ovat myös raportoitu useissa maligniteetteja mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [31]; jossa se myös on raportoitu, että epigeneettisellä vaiennettu RXR-γ korreloi vähentynyt eloonjäämisaste potilaiden [32]. Meidän pre-transformoitujen solujen, RXR-γ yhteistyötä PPAR-γ, RAR-γ, RAR-α ja RXR-α muodostamaan toiminnallisen heterodimeerisen komplekseja, joissa RXR-γ kanssa PPAR-γ koordinoi solujen apoptoosin kautta sisäisen reaktiotien vahvisti kohonnut Caspase-9 tasoa. Lisäksi havaitsimme, että RXRγ aktivaatio transformoiduissa soluissa uudelleen herkistää ne apoptoosin synergistisen vaikutuksen agonistien, jotka välittävät sytotoksisten vaikutusten

in vitro

sekä kokeellisissa kasvaimissa (Fig. 6). Tämä on tärkeä tunnistaminen, joka kohdistuu retinoidi-hoidoissa. Tässä tutkimuksessa olemme luonnehti pleotropic luonnetta RXR-γ signalointi meidän SeOvCa-etenemisen malli järjestelmä. Menetys RXR-γ tasoille helpottaa mekanistisiin etuja transformoituja soluja kohtaan hankinta vastustuskykyä apoptoosin; Näin ollen, retinoidi-herkistyneet kasvainsoluja upregulate RXR-γ tasot johtavat merkittäviin solukuolemaan.

. RXR-γ modulaatiota vakaassa tilassa ennalta transformoiduissa soluissa; retinoidien hoito parantaa RXR-γ tasoilla ja skaalata apoptoosin (kun RXR-γ vuorovaikutus PPAR-γ) ja ilmaus epiteelisolujen erilaistumisen markkereita (upon RXR-γ vuorovaikutuksia RAR-γ, RXR-α ja RAR-α). B. Puutos RXR-γ tarjoavat hyötyjä resistenssin apoptoosia transformoitujen solujen; retinoidi hoito indusoi RXR-γ tasot herkistää näiden solujen kohti merkittävää apoptoosin.

Tämä proteomiikka lähestymistapa on ensimmäinen huomioon muutokset SeOvCa jotka heijastavat eri transformaatio liittyviä toiminnallisia polkuja. On merkittävää, RXR-γ signalointi voisi olla potentiaalinen gateway estämään taudin etenemistä. Selittämisessä RXR-γ signalointi ulottuu nykyajan lähestymistapoja solujen transformaation SeOvCa jotka voidaan nyt hyödyntää edelleen kehittämiseen ja arviointiin sekä uusien hoitomuotojen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki eläin työ suoritettiin National Center for Cell Science (NCC) Institutional animal eettisen komitean (IAEC) hyväksyminen kokeita väärennöskeskukset Experimental animal House (EAH) Facility, ja suoritettiin kohti normeja, lakeja ja politiikkaa säädetty komitea.

Soluviljely, hoidot ja transfektiot

johtaminen A4 etenemisen malli pre-muunnetaan ja transformoidut SeOvCa soluja (A4-P ja A4-T-solut) on kuvattu aiemmin [14], [18]. Retinoidi (RXR-γ ligandi) käsittely suoritettiin käyttäen joko luonnollisia retinoidi

eli

. 9

Cis

Retinoiinihappo (CRA; 10 uM) tai synteettisiä retinoidien Adapalene (ADA, 2 uM, RAR-agonistia) tai 4 – [(E) -2- (5,6,7,8 tetrahydro – 5,5,8,8-tetrametyyli – 2 naftalenyyli) – 1 propenyyli] bentsoehappo Arotinoid happo (TTBPB, 10 uM, RXR ja RAR agonisti) 48 h.

Näytteiden valmistelu, 2-ulotteinen geelielektroforeesilla ( 2DE) ja kuva-analyysit

Solusakat (10

7) A4-P ja A4-T suspendoitiin 500 ul ml urean hajotuspuskuria, joka sisälsi 8 ​​M ureaa, 2 M Tiourea, 100 mM DTT , 2% CHAPS ja 0,2% amfolyyttejä proteaasi-estäjän cocktail (Amersham USB suuntaviiva). Solu-uutetta annettiin sekoitetaan vähintään 15 minuutin ajan ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa oikean proteiinin- solublisation. Proteiini-näytteet sentrifugoitiin (110,000g 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa), ja suspensio kerättiin. Proteiinipitoisuus arvioitiin 2DE kvant Kit (GE Healthcare) 480 nm (Bekman Coulter). Valmistetut näytteet ajettiin ensimmäinen ulottuvuus (pl) ja sen jälkeen toisen ulottuvuuden denaturoivissa SDS-PAGE (Mw). Kaikkiaan 350 ug kokosoluproteiinikuviot lysaatti tehtiin 18 cm immobilisoidun pH-gradientin (IPG) liuska (pH 4-7) ja nesteytyksestä yön yli. Kolmivaiheista IEF jännite ohjelma on laadittu nauhat Protean IEF solu (Bio-Rad): 50 V 20 min, 10000 V 2 tuntia minuuttia ja 10,000 V 45000 V-hr. Liuskoja vähentää edelleen inkuboimalla tasapainotuspuskurilla /vähennys-puskuria (6 M urea, 0,375 M Tris pH 8,8, 2% SDS, 20% glyseroli, 2% (w /v) DTT (Sigma)), ja sitten alkyloida samalla puskurilla, mutta joka sisälsi 2,5% (w /v) jodiasetamidia (Sigma) sen sijaan, että DTT. Toinen ulottuvuus suoritettiin ajamalla IPG nauhat 1,0 mm paksu 10% – (w /v) – SDS-PAGE. Geelit värjättiin massaspektrometrialla yhteensopiva modifioitu Coomassie-sinistä (Pierce, Thermo Fisher) ja hopeavärjäyksellä. Image Acquisition proteiinia geeliä suoritettiin käyttäen Määrä One® ohjelmistoja VersaDocTM järjestelmän (Bio-Rad Laboratories, USA) yhtä parametrien arvoista. Kuva-analyysi ja paikalla havaitseminen suoritettiin PDQuest 2-DE-analyysi-ohjelmisto kehittyneempi versio 8.0 (Bio-Rad). Sillä määrällisiä ja laadullisia spot vertailu poikki molemmat geelit, ottelu-sarjaa (Master sarja) kuuden rinnakkaisnäytettä A4-P ja A4-T 2DE-geelit valmistettiin ja analysoitiin. Ohjelmisto helpottaa merkintä kunkin ja yksittäisen paikan, ainutlaatuinen identiteetit toimitettiin jokaiselle proteiinitäplien rinnakkaisten geeliä. Analyysi joukko proteiineja on laadittu tunnistamaan paikkoja, jotka ovat merkittävästi erilaisia. Analyysin perusteella tehtiin perustuen tunnistetaan proteiineja huomasi ainutlaatuinen A4-P ja A4-T ja yhteisiä paikkoja keskuudessa kaksi rinnakkaista ryhmää, jossa on 2,0-kertaisesti määrän vaihtelu kynnys. Kaikkiaan arvio sovitetun ja verraton paikkoja oli valmis lopulliseen kuvia ja ero proteiinit tunnistettiin-kahden solutyyppejä edustaja geelejä.

In-geeli ruoansulatusta ja proteiinin tunnistaminen käyttäen MALDI-TOF /TOF

proteiini paikkoja 2DE osoittaa differentiaalikaavojen ja täyttävät tilastotietojen perusteella valittiin ja irrotettiin in-geeliä ruuansulatuksen ja edelleen MS analyysejä. Spot leikkaaminen suoritettiin manuaalisesti avulla steriilin terävä spot leikkuri. Lyhyesti, geelipalat väri poistettiin 25 mM ammoniumbikarbonaattia, myöhemmin kuivattu kanssa 02:01 seos, 50 mM ammoniumbikarbonaattia: 100% asetonitriiliä (ACN) ja toistettiin 3 kertaa 5 minuuttia. Geelipalat pelkistettiin 10 mM DTT: n kanssa 60 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Jäähdytyksen jälkeen geelipalat inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa 50 mM jodietikkahappoa. Pesun ja dehydratoimalla geelipaloista 25 mM ammoniumbikarbonaattia ja ACN 10 minuuttia, ne kuivattiin vakuumissa ja tryptisen digestion suoritettiin 50 mM ammoniumbikarbonaattia, joka sisälsi 20 ug /ml modifioitu proteomic luokka trypsiiniä (Sigma-Aldrich) mukaisesti valmistajan ohjeiden ja pidettiin jäissä 30 min. Lisäksi 25 mM ammoniumbikarbonaattia lisättiin ja digestio jatkettiin yön yli 37 ° C: ssa. Uutetaan peptidit olivat täysin kuivataan speedvac ja suspendoidaan uudelleen 10 ui 20% ammoniumbikarbonaattiliuosta ja 1% muurahaishappoa.

Kun käsittelyn kautta Zip-Tip pipetinkärjet (Millipore, USA), peptidi seoksia liuotettiin kanssa matriisiliuoksen. Käytetty matriisi MALDI analyysi oli a-syaani-4-hydroksikanelihappo (Sigma) 20 mg /ml 50% asetonitriili, 0,1% trifluorietikkahappoa. Yhtä suuret tilavuudet peptidin ja matriisin liuosta sekoitettiin, ja 1 ui saatua liuosta täpliksi ruostumattomasta teräksestä MALDI näyte levy. Spectra of pilkottu peptidien hankittiin 4800 MALDI-TOF /TOF massaspektrometrillä (AB Sciex, Framingham, MA) liittyy 4000-sarja explorer (versio 3.5.3). Tuotettu massaspektrit rekisteröitiin heijastin tilassa sisällä massa-alue 800-4000 Da käyttäen Nd: YAG 355nm laser. Kiihdytysjännite ja louhinta jännite asetettiin 20 kV ja 18 kV vastaavasti. Kuusi pistekalibroinnin instrumentin suoritettiin peptidistandardista Kit (AB Sciex). Kaikki MS-spektrit saatiin kertyminen 900 laukausta. MS /MS-spektrit saatiin yhteensä kertymistä 1500 laser laukausta ja törmäys energiaa 1 kV. Vuoden loppuun MS kyselyn skannaa, data prosessoitiin luodakseen luettelon lähtöaineiden ionien haussa MS /MS. Yhdistetty MS ja MS /MS huippu luetteloita tutkittiin käyttämällä GPS

TM Explorer ohjelmistoversio 3.6 (AB Sciex). Proteiini tunnistus suoritettiin MS /MS-ioni-haun MASCOT (versio 2.1) (https://www.martixscience.com) hakukone vastaan ​​SwissProt tietokantaan.