Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ihosyöpä on yleisin syöpä maailmassa. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja hankinta syövän kantasoluja (CSCS) kaltaisia ​​ominaisuuksia nousta kriittiset vaiheet etäpesäkkeitä ihmisen ihosyöpiä. Kofeiinihappoa (CAA) kohdistaa antikarsinogeenisia vaikutuksia. Kuitenkin vaikutukset CAA muuttavaa valmiudet sekä CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia ihon syöpäsoluja, ja molekyylitason mekanismien se ei täysin tunneta.

Methods

Pahanlaatuiset HaCaT soluja käsitelty CAA. TranswellTM määritys suoritettiin määrittämään, että CAA vaimennettu muuttavaa valmiudet; Sferoidiviljelmiä muodostumisen määritys suoritettiin sen vahvistamiseksi, että CAA pienensi CSCS kaltainen fenotyyppi; Käsitellyt pahanlaatuisia HaCaT solut molecularly tyypillistä RT-PCR, Western-blotit, Southwestern blot, ja immunosaostus.

Tulokset

CAA hoidetuista pahanlaatuinen ihmisen keratinosyyttien (pahanlaatuinen HaCaT solut), estämällä vaeltavat valmiudet ja CSCS kaltainen fenotyyppi havaittu. CAA sääteli fosforylaatiota p38, ja alassäädetty aktivoitumisen Nukleaaritekijä KB (NF-KB) /etana signaalireitin. Todellakin, p38 laski DNA-sitova aktiivisuus NF-KB: n on promoottori

etana

geenin, joka johti transkription inaktivointi

etana

. Estyminen p38 heikennettyä CAA inhiboivan vaikutuksen muuttavien valmiudet ja CSCS kaltainen fenotyyppi pahanlaatuinen HaCaT soluissa.

Johtopäätökset

CAA vaimentaa vaeltavia valmiudet ja CSCS kaltaiset ominaisuudet pahanlaatuinen ihmisen keratinosyyttien, joissa p38-välitteinen säätely alaspäin NF-KB /etana signaalireitin on mukana.

Citation: Yang Y, Li Y, Wang K, Wang Y, Yin W, Li L (2013) p38 /NF-KB /Snail Pathway osallistuu kofeiinihappoa inhiboivan vaikutuksen Cancer kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia ja vaeltavia Kapasiteetti Pahanlaatuinen Human Keratinosyyttien. PLoS ONE 8 (3): e58915. doi: 10,1371 /journal.pone.0058915

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Amerikan Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 lokakuu 2012; Hyväksytty: 08 helmikuu 2013; Julkaistu: 13 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Natural Science Foundations of China (81072338) ja rahoittama Priority Academic ohjelmasuunnitteluosastolle Jiangsun korkeakouluista (2010). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ihosyöpä on yleisin syöpä maailmassa [1], [2]. Viimeisten kahden vuosikymmenen kuolleisuus ihosyöpä on vakaa, mikä johtuu osittain etäpesäkkeitä [3]. Hoitovaihtoehtoja Metastasoituneessa ihosyöpä kehittyä edelleen useita rajoja. Dakarbatsiinia, tällä hetkellä ainoa Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) hyväksyi kemoterapiaa metastaattisen sairauden, on tähän mennessä johtanut vähän tai ei lainkaan vaikutusta eloonjäämiseen, vaikka arvioidaan yhdessä terapeuttisten monipuolisia toimintamekanismeja [4]. Novel kemoterapeuttiset aineet hoitoon potilailla, joilla levitetään pahanlaatuinen ihosyöpä kiireellisesti.

Luonnollinen hydroksikanelihappomatriisi johdannaisia ​​on raportoitu olevan syövänvastainen, tulehdusta, ja antioksidanttisia ominaisuuksia [5], [6]. Niiden luonnollinen alkuperä ja kaikkialla läsnä esiintyminen ovat herättäneet suurta kiinnostusta käyttää niitä syöpälääkkeiden. Kofeiinihapon (3, 4-dihydroksikanelihappo, CAA) on tärkein ravinnon hydroksikanelihappoa. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että CAA kiinnostavuus syöpää ehkäisevistä vaikutuksista [7]; CAA kykenee suojaavia vaikutuksia UVB-aiheuttamaa ihon vahingoista tukahduttamalla aktivoituminen interleukiini-10 ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK) hiiren ihon [8]; Edelleen, CAA inhiboi Fyn-kinaasin (avainvälittäjä vaaditaan UVB aiheuttama ihosyöpä), joka voi olla mukana tukahduttaminen ihon syövän synnyn [9]. Kuitenkin vaikutukset CAA on metastaattinen kyky ihosyöpä, ja molekyylitason mekanismeista on, ei ole täysin ymmärretty.

epiteeli–mesenkymaalitransitioon (EMT) on kehityksellinen prosessi, jossa epiteelisolut muunnetaan että mesenkyymisolujen alkionkehityksen aikana, kudoksen uudelleen, ja haavan parantumisen [10]. Tällaisissa prosessi, epiteelisolujen hankkia mesenkyymisolun ominaisuuksia, ja näyttää alennetun välistä adheesiota ja lisääntynyt hyökkäys [11]. Aktivointi EMT ohjelmaan on liitetty tärkeänä askeleena etäpesäkkeitä moniin ihmisen kasvaimissa, kuten ihon [10], [12].

käsite ehdotti äskettäin ominaisuuksia selittävät neoplastisen kudosten on olemassaolo itseuudistuvien, kantasolujen kaltaisten solujen kasvaimiin, joita on kutsuttu ”syövän kantasoluja (CSCS)” [13]. CSCS on havaittu monissa ihmisen syövissä, mukaan lukien ihon, rintojen, maksa-, keuhko-, ja niin edelleen [1], [12], [14], [15]. Sisällä kasvain, CSCS, jotka ovat pieni osa neoplastisten solujen, määritellään niiden kyky tuottaa uusia kasvaimia. Tästä syystä niitä on myös kutsuttu ”kasvain aloittamista solujen [13]. Välinen suhde EMT ja CSCS on havaittu, että aikana EMT prosessi, epiteelisolujen hankkia kantasolujen kaltaisia ​​piirteitä ja jotka CSCS omaavat mesenkymaalisten ulkonäkönsä [16]. Tämä yhteys EMT prosessin ja induktio CSCS saattaa selittää, miksi EMT ohjelma indusoi kasvaimen aloittamista ja etenemiseen.

Täällä huomasimme, että CAA heikensi vaeltavia valmiudet ja CSCS vertailukelpoisten kohteiden pahanlaatuinen ihmisen keratinocyte (pahanlaatuinen HaCaT-solut). CAA paransi fosforylaatiota p38, joka esti aktivoitumisen Nukleaaritekijä KB (NF-KB) /etana signaalireitin. P38 poisti CAA inhiboivan vaikutuksen muuttavien valmiudet ja CSCS kaltainen fenotyyppi pahanlaatuinen HaCaT soluissa.

Tulokset

CAA vaimentaa muuttavien kapasiteetti pahanlaatuisten HaCaT solujen

vaikutusten määrittämiseksi CAA muuttavaa potentiaalia pahanlaatuisten HaCaT solujen siirtokuoppaan määritys suoritettiin. Kuten kuviossa 1, pahanlaatuisten HaCaT soluilla korkea muuttavia valmiudet; toisin, CAA vaimenee muuttavia kapasiteetti pahanlaatuisten HaCaT solujen ei-riippuvaisella tavalla. Koska 100,0 uM CAA pienensi muuttavia kykyä pahanlaatuisten HaCaT solujen tehokkaasti, ja koska sillä ei ollut havaittavaa sytotoksisuus (kuvio S1), päätimme tämä pitoisuus lisätutkimuksia varten.

Pahanlaatuiset HaCaT-soluja käsiteltiin 0,0, 50,0 tai 100,0 uM CAA 48 tuntia, vastaavasti. (A) TranswellTM määritys analyysit muuttavien kapasiteetin pahanlaatuisten HaCaT solujen, bar = 125 pm; (B) kvantifiointi siirtokuoppaan solun migraatiokokeessa. Siirtyneet solut värjättiin kristallivioletilla. Tulokset ilmaistiin siirretty solujen määrä per näkökentän (keskiarvo ± SD, n = 5). **

p

0,01 verrattuna 0,0 uM CAA-käsiteltyjen pahanlaatuiset HaCaT solujen ryhmä.

CAA indusoi mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen (MET) pahanlaatuisissa HaCaT soluissa

pahanlaatuisia HaCaT soluja, poikkeama epiteelin karan kaltainen mesenkymaalisten morfologia on osoitus [17]. Koska EMT mahdollistaa solun liikkua ja hyökätä [18], me määritetään sitten vaikutuksia CAA on EMT prosessin pahanlaatuisten HaCaT soluissa. Kuten kuviossa 2A on esitetty, pahanlaatuiset HaCaT-solut näytetään fibroblastin kaltainen mesenkymaaliset ulkonäkö; kuitenkin, sen jälkeen kun nämä solut altistettiin CAA: ssa 48 tuntia, ne osoittivat epiteelin kaltainen morfologia. Estää solun liima kyky liittyy EMT aloittamista [18]. Tässä adheesiomäärityksiä osoitti, että CAA parantaa liima kyky pahanlaatuisten HaCaT-soluja (kuvio 2B). Sitten vaikutukset CAA ilmentymistä koskevat EMT /liimaa markkereita: E-kadheriinin, N-kadheriinin, ja vimentiinistä, määritettiin. Sen jälkeen kun pahanlaatuiset HaCaT-soluja käsiteltiin CAA 48 h, E-kadheriinin oli kasvanut, päinvastoin, N-kadheriinin ja vimentiinin tasot laskivat (kuvio 2C). Siten sekä morfologisia ja molekyylitason muutokset osoittavat, että altistuminen CAA, pahanlaatuiset HaCaT solut läpikäyvät MET.

Pahanlaatuiset HaCaT solut käsiteltiin 0,0 tai 100,0 uM CAA 48 tuntia, vastaavasti. (A) Morfologiset kuvia pahanlaatuisten HaCaT solujen (palkit: yhtenäinen viiva = 500 pm ja katkoviiva = 125 nm); (B) kvantifiointi adheesiomääritystä kuten kuvattu kohdassa

Materiaalit ja menetelmät

. Käytimme tarttuvuus suhde ei-käsiteltyjen pahanlaatuisten HaCaT-soluja määrittää 100%: n tasolla; (C) Western blot -analyysit E-kadheriinin, N-kadheriinin, ja vimentiinin tasolla. Blotteja normalisoitiin käyttämällä GAPDH korjaamaan eroja lastaus proteiinien. **

p

0,01 verrattuna 0,0 uM CAA-käsiteltyjen pahanlaatuiset HaCaT solujen ryhmä.

CAA vähentää CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia pahanlaatuisten HaCaT solujen

induktio EMT on liittynyt hankintaan kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia, kuten ilmaus kantasolujen pinnan markkereita, tarttumaton kasvun ja ilmentymisen muutosten solun pinnan glykoproteiinien [16]. CD34 ja K5 ovat solun pinnalla markkereita ihon kantasoluja [19], [20]. Meidän olevassa tutkimuksessa, pahanlaatuiset HaCaT solut osoittivat kohonnut ilmentyminen

CD34

ja

K5

mRNA: t; kuitenkin, kun pahanlaatuisten HaCaT-solujen CAA 48 tuntia, vähentynyt ilmentyminen sellaisten mRNA: iden havaittiin (kuvio 3A). Muodostaminen pallosia osoittaa kapasiteetin solujen itseuudistumisen ja aloittamaan kasvaimia, jotka ovat ominaisuuksia syövän kantasoluja (CSCS) [21]. Sitten määritetään vaikutuksia CAA muodostumista rakeita pahanlaatuisten HaCaT soluissa. Vuonna tarttumaton astiat, pahanlaatuiset HaCaT solut muodostivat vapaasti kelluva, elinkelpoinen aloilla; kuitenkin, kun pahanlaatuisten HaCaT solujen CAA 48 tuntia, niin ilmiö oli hävinnyt (kuvio 3B ja 3C). Nämä tiedot osoittavat, että CAA vähentää CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia pahanlaatuisten HaCaT-soluja.

Pahanlaatuiset HaCaT-soluja käsiteltiin 0,0 tai 100,0 uM CAA 48 tuntia, vastaavasti. (A) RT-PCR-analyysit

K5

ja

CD34

mRNA-tasoja. Bändit normalisoitiin käyttämällä GAPDH korjaamaan eroja lastaus cDNA; (B) Vapaasti kelluva, kannattava palloja muodostuu pahanlaatuiset HaCaT soluja (bar = 125 nm); (C) Sphere määritysrajan (keskiarvo ± SD, n = 3). **

p

0,01 verrattuna 0,0 uM CAA-käsiteltyjen pahanlaatuiset HaCaT solujen ryhmä.

CAA estää NF-KB /etana signaalireitin p38

Snail, sinkkisormipolypeptidiin transkriptiotekijä , toimii säädin tukahduttaa adheesiomolekyylien ja avustaa karkaamisen syöpäsolujen solukuolemaa aikana EMT [22]. NF-KB, keskeinen välittäjäaine osallistuu pahanlaatuinen muutos HaCaT solujen [17], ylös-säätelee etana ilmaisun ja indusoi EMT [23], [24]. Oletimme, että NF-KB /etana signaalireitin saattaa olla mukana Ilmailulaitoksen inhiboivan vaikutuksen CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia ja muuttavien kapasiteettia pahanlaatuisten HaCaT soluissa. Tässä, kuten on esitetty kuviossa 4A, CAA vähentynyt ilmentyminen fosfo-RelA (osoittaa NF-KB) ja etanat, mikä ehdotti, että CAA estetty NF-KB /etanat signaalireitin.

(A) Pahanlaatuiset HaCaT-soluja käsiteltiin 0,0 tai 100,0 uM CAA: ssa 24 tuntia, vastaavasti. Western blot-analyysit etana, p-p38, ja p-RelA tasoilla. Blotteja normalisoitiin käyttämällä GAPDH korjaamaan eroja lastaus proteiinien; (B) Kun pahanlaatuisten HaCaT-soluja esikäsiteltiin 10,0 uM SB203580 (p38-estäjä) 6 tuntia, ne altistettiin 0,0 tai 100,0 uM CAA: ssa 24 tuntia, vastaavasti. (B, ylhäällä) Solut lysaatit altistettiin immunosaostukselle NF-KB /RelA-vasta-aine, ja immunosaostumat alistettiin Southwestern blotteja sitoutumisen määrittämiseksi NF-KB: n DNA-sekvenssit

etanat

promoottori (5 ’ –

taa

–

GGG-AGT-TGG-CGG

-3 ’); (B, alhaalla) immunopresipitaatit tehtiin Western blot määrittää RelA tasolle, jota käytettiin korjaamaan erot kuormituksen immunosaostumien; (C) pahanlaatuiset HaCaT-soluja käsiteltiin, kuten on kuvattu (B), RT-PCR: llä (ylhäällä) ja Western blot (alhaalla) analyysit etana mRNA: ta ja proteiinia tasolla. Blotteja /bändit normalisoitiin käyttämällä GAPDH korjaamaan eroja lastaus proteiinien /cDNA.

edelleen selvittää vastavirran säädin NF-KB /etanan CAA käsitelty pahanlaatuisten HaCaT soluja olemme tutkineet aktivaation p38 (inhibiittori NF-KB: n ja EMT [25]). Kuten on esitetty kuviossa 4A, CAA parantunut fosforylaatiota p38 (joka osoittaa aktivointi p38). Näiden tietojen perusteella, me arveltu, että pahanlaatuisissa HaCaT soluissa, CAA esti NF-KB /etana signaalireitin p38.

sitten käytetään immunosaostuksella ja Lounais täpläkoe vahvistaa hypoteesia. SB203580 on spesifinen inhibiittori p38, ja käytimme 10,0 uM SB203580 estää CAA-indusoidun aktivaation p38 (kuvio S2). Sen jälkeen kun pahanlaatuiset HaCaT-soluja esikäsiteltiin 10,0 uM SB203580: ssa 6 tuntia, ne altistettiin 0,0 tai 100,0 uM CAA: ssa 24 tuntia, vastaavasti. RelA immunosaostettiin sen spesifisen vasta-aineen, ja immunosaostumat alistettiin sitten Southwestern blotit käyttäen biotiini-leimattu koetin ”

gggagttggc

” (kuva S3) sitoutumisen määrittämiseksi NF-KB: n DNA-sekvenssit

etana

promoottori. Kuten on esitetty kuviossa 4B, CAA vähentynyt sitoutuminen NF-KB: n ja

etana

promoottori pahanlaatuisissa HaCaT-soluissa; kuitenkin, p38 lakkautetaan tätä vaikutusta. Edelleen, tukkeutuminen p38 heikennettyä CAA välittämää vähentynyt ilmentyminen etana mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että pahanlaatuiset HaCaT altistuneiden solujen CAA, p38 vähennä DNA-sitoutumisaktiivisuutta NF-KB: n ja

etana

promoottori, joka johtaa transkription säätely alaspäin etana.

p38 on mukana CAA aiheuttama MET pahanlaatuisten HaCaT solujen

jälkeen määritetään toimintojen p38 in CAA-välitteisen MET pahanlaatuiseen HaCaT soluissa. Sen jälkeen kun pahanlaatuiset HaCaT-soluja esikäsiteltiin 10,0 uM SB203580: ssa 6 tuntia, ne altistettiin 0,0 tai 100,0 uM CAA 48 tuntia, vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa 5. CAA-käsiteltyjen pahanlaatuisten HaCaT-soluja, E-kadheriinin oli kasvanut, mutta N-kadheriinin ja vimentiinin tasot laskivat (kuvio 5A); solun liima kyky oli parantunut (kuvio 5B); ja solut osti epiteelin kaltainen morfologia (kuvio 5C). Kuitenkin p38 poisti ilmiön edellä aiheuttama CAA (kuvio 5A, 5B, ja 5C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että p38 on osallisena CAA aiheuttama MET pahanlaatuisten HaCaT soluja.

Kun pahanlaatuisten HaCaT solut esikäsiteltiin SB203580 (p38-estäjän) 6 tuntia, he olivat altistuneet 0,0 tai 100,0 uM CAA 48 tuntia, vastaavasti. (A) Western blot -analyysit E-kadheriinin, N-kadheriinin, ja vimentiinin tasolla. Blotteja normalisoitiin käyttämällä GAPDH korjaamaan eroja lastaus proteiinien; (B) kvantifiointi adheesiomääritystä kuten kuvattu kohdassa

Materiaalit ja menetelmät

. Käytimme tarttuvuus suhde ei-käsiteltyjen pahanlaatuisten HaCaT-soluja määrittää 100%: n tasolla; (C) Morfologiset kuvia pahanlaatuisten HaCaT solujen (palkit: yhtenäinen viiva = 500 pm ja katkoviiva = 125 pm). **

p

0,01 verrattuna (CAA + SB203580) hoidetun pahanlaatuisten HaCaT solujen ryhmä.

P38 on mukana CAA inhiboivan vaikutuksen CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia pahanlaatuisten HaCaT soluissa

Edelleen, me määritetty vaikutukset p38 on CAA-inhiboivan vaikutuksen CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia in pahanlaatuinen HaCaT soluissa. Soluja käsiteltiin kuten edellä on kuvattu. Kuten kuviossa 6 on esitetty, CAA heikennetty ilmaus

CD34

ja

K5

mRNA: t (kuvio 6A), ja vähensi muodostumista pallosia (kuvio 6B ja 6C). Kuitenkin p38 poisti ilmiön edellä aiheuttama CAA (kuvio 6A, 6B, ja 6C). Nämä tulokset osoittavat, että p38 on osallisena CAA inhiboivan vaikutuksen CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia in pahanlaatuinen HaCaT soluissa.

Kun pahanlaatuisten HaCaT solut esikäsiteltiin SB203580 6 h, he olivat altistuneet 0,0 tai 100,0 uM CAA 48 tuntia, vastaavasti. (A) RT-PCR-analyysit

K5

ja

CD34

mRNA-tasoja. Bändit normalisoitiin käyttämällä GAPDH korjaamaan eroja lastaus cDNA; (B) Vapaasti kelluva, kannattava palloja muodostuu pahanlaatuiset HaCaT soluja (bar = 125 nm); (C) Sphere määritysrajan (keskiarvo ± SD, n = 3). **

p

0,01 verrattuna (CAA + SB203580) hoidetun pahanlaatuisten HaCaT solujen ryhmä.

CAA vaimentaa muuttavien kapasiteetti pahanlaatuisten HaCaT solujen p38

Lopuksi päätimme jos CAA pienensi muuttavien kapasiteetti pahanlaatuisten HaCaT soluihin p38. Pahanlaatuisia HaCaT solut altistettiin CAA (0,0 tai 100,0 uM) läsnä ollessa tai puuttuessa SB203580, kuten on kuvattu kuviossa 6, ja muuttavat mahdollisia pahanlaatuisten HaCaT-solujen määritettiin transwell määrityksellä. Kuten kuviossa 7, CAA vaimenee muuttavia kapasiteetti pahanlaatuisten HaCaT solujen kuitenkin, p38 poistetaan tämän ilmiön. Nämä tiedot viittaavat siihen, että p38 on osallisena CAA inhiboivan vaikutuksen muuttavien kapasiteetin pahanlaatuisten HaCaT soluissa.

Kun pahanlaatuisten HaCaT solut esikäsiteltiin SB203580 6 h, he olivat altistuneet 0,0 tai 100,0 uM CAA 48 h, vastaavasti. (A) TranswellTM määritys analyysit muuttavien kapasiteetin pahanlaatuisten HaCaT solujen, bar = 125 pm; (B) kvantifiointi siirtokuoppaan solun migraatiokokeessa. Siirtyneet solut värjättiin kristallivioletilla. Tulokset ilmaistiin siirretty solujen määrä per näkökentän (keskiarvo ± SD, n = 5). **

p

0,01 verrattuna (CAA + SB203580) hoidetun pahanlaatuisten HaCaT solujen ryhmä.

Keskustelu

CAA on yksi tärkeimmistä aineenvaihduntatuotteiden tuottamien hydrolysointi klorogeenihappoa, suuri fenolisten phytochemical eri elintarvikkeet, kuten kahvi [8]. Koska suuri määrä klorogeenihappoa imeytyy metaboloitumattomana, suurta huomiota on kiinnitetty biologisista vaikutuksista aineenvaihduntatuotteiden kuten CAA arvioidakseen mahdollista

in vivo

vaikutuksia klorogeenihappoa sisältävän ruokavalion [9 ]. Kertyvät viittaavat siihen, että CAA on kyky estää ihosyövän kehittämiseen, esimerkiksi CAA estää ihokasvaimesta edistäminen aiheuttama 12-O-tetradekanoyyliforboli-13-asetaatin hiiren ihon [26]. Kuitenkin vaikutukset CAA muuttavaa kykyä pahanlaatuisten ihosoluja, ja molekyylitason mekanismeista on edelleen epäselvä. Täällä huomasimme, että CAA heikensi vaeltavia valmiudet ja CSCS kaltaiset ominaisuudet pahanlaatuinen ihmisen keratinosyyttien, joissa p38-välitteinen säätely alaspäin NF-KB /etana signaalireitin oli mukana.

EMT viittaa ohjelman normaalin alkionkehityksen jossa menetys epiteelin ominaisuuksia, kuten solujen adheesiota ja ekspression epiteelin markkerin, E-kadheriinin ja hankinta mesenkymaalisten ominaisuuksia, kuten lisääntynyt solun liikkuvuus ja ekspression mesenkymaalisten markkeri, N-kadheriinin ja vimentiinin [ ,,,0],10]. EMT pidetään tärkeänä askeleena kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [27]. Tässä olemme havainneet, että sen jälkeen, kun altistus pahanlaatuisten HaCaT solujen CAA: ssa 48 tuntia, ne osoittivat epiteelin kaltainen morfologia ja parannettu liiman kykyä. Edelleen lisättiin ilmentymisen E-kadheriinin (epiteelin merkki), ja vähentynyt ilmentyminen N-kadheriinin ja vimentiinin (mesenkymaalisten markkereita). Nämä tulokset osoittavat, että altistuminen CAA, pahanlaatuiset HaCaT solut läpikäyvät MET.

hankinta CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia nousta kriittinen vaihe syövän etenemisen [28]. Monet geenit ilmentyvät ihon CSCS, kuten

CD34

,

K5

, ja niin edelleen [19], [20]. Ihon,

CD34

on nimenomaan ilmaistu keratinosyyttien SCS ja

CD34

ilme on avainasemassa ihon syövän synnyn [19];

K5

on merkkiaine erilaistumattoman ihon ScT KO CSCS [20]. Meidän olevassa tutkimuksessa, ilmauksia

CD34

ja

K5

mRNA huomattavasti vähentyneet CAA-käsiteltyjen pahanlaatuisia HaCaT soluja. Lyhytsanomapalvelukeskukset ja CSCS jakaa erilaisia ​​ominaisuuksia, kuten selfrenewal, vaikka se on tyypillisesti väärin säädellystä kasvaimen synnyssä. Monet viljellyt SC tai CSC linjat muodostavat vapaasti kelluva pallomainen klustereita elinkelpoisten solujen sisältävän voittopuolisesti lyhytsanomapalvelukeskukset tai CSCS [21], [29]. Esillä olevassa tutkimuksessa, CAA-käsiteltyjen pahanlaatuiset HaCaT solujen näytteillä heikennettyjä kapasiteetin muodostamiseksi aloilla. Nämä tulokset osoittavat, että pahanlaatuisia HaCaT menetettyjen solujen CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia altistuminen CAA.

Snail, sinkkisormipolypeptidiin transkriptiotekijä, toimii säädin tukahduttaa adheesiomolekyylien ja auttaa paeta syöpäsoluja solukuolemalta aikana EMT [22], [30]. Snail on usein ilmaistu monenlaisia ​​kasvainsolujen, joissa E-kadheriinin ilmentyminen vähenee. Lisäksi tämä käänteinen suhde etana ja E-kadheriinin oli usein havaittu invasiivisia kasvaimia [31]. Myöhemmät tutkimukset vahvistivat painava vaikutus etana

E-kadheriinin

promoottori kautta tietyn sitoutumisen kolme E-laatikkoa

(cacctg) B promoottorialueella klo -178-+92 n

E-kadheriinin

geeni [31]. Lisäksi etana myös on yhdistetty hankintaan CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia [22]. Täällä CAA-käsiteltyjen pahanlaatuiset HaCaT solujen vähentynyt ilmentyminen etana havaittu.

edelleen selvittää vastavirran säätelijä etana CAA käsiteltyjen pahanlaatuisten HaCaT soluja, tutkimme NF-KB. NF-KB on ajateltu aloittaa ja nopeuttaa kasvaimen kehittymisen, ja sen estäminen estää solun muuntaminen aiheuttama kasvain promoottorit [16], [23]; NF-KB aiheuttaa morfologisia muutoksia, solujen vaeltamiseen, etana aktivointi ja tukahduttaminen E-kadheriinin tuotanto [24], [32]. NF-KB sitoutuu

etana

promoottori ja transkription ylössäätelee etana ilmaisun [23]. Täällä CAA-käsiteltyjen pahanlaatuiset HaCaT solujen vähentynyt ilmentyminen p-RelA havaittiin. Edelleen, CAA alassäädetty DNA-sitoutumisaktiivisuutta NF-KB: n ja

etana

promoottori, joka johti transkription inhibitio etana. Nämä tulokset osoittavat, että CAA indusoi inaktivointi NF-KB /etana signaalireitin.

MAPK reittejä välittää signaaleja, jotka johtavat erilaisiin soluvasteita kuten solujen kasvua, erilaistumista, lisääntymistä, apoptoosin, ja stressistä ympäristön ärsykkeiden [33]. Solunulkoinen signaali säännelty kinaasia 1/2 (ERK1 /2) reitin tyypillisesti transdusoi kasvutekijä signaaleja, jotka johtavat solujen erilaistumiseen tai proliferaatioon, kun taas sytokiinien ja stressi signaaleja aktivoi c-Jun-N-terminaalista kinaasien (JNK) ja p38 MAPK polkuja, tuloksena stressin vastausten kasvun pysähtymisen tai apoptoosin [34]. Sen lisäksi, että keskeinen välittäjä on tulehdus- ja stressin vastaus, p38: lla on tärkeä rooli ei-tulehduksellinen prosesseja, kuten solusyklin sääntelyn ja solujen erilaistumista [35]. Kun se on aktivoitu, p38 fosforyloi laaja valikoima substraatteja sytoplasmassa ja tumassa, mikä geenin ilmentymisen säätelemiseksi, solusyklin ja solu- polarisaatio. Tutkimukset roolit MAPK perheiden synnyssä EMT ovat tuottaneet ristiriitaisia ​​tuloksia, koska heterogeenisyys solun malleja ja erilaisia ​​kokeellisia lähestymistapoja käytetään [25], [36]. Edellinen tutkimus osoittaa, että p38 edistää E-kadheriinin ilmentymisen estämällä TGF-β-aktivoitu kinaasi 1 (TAK1) -NF-KB-signaloinnin [25]. Täällä CAA-käsiteltyjen pahanlaatuiset HaCaT solujen p38 vähenee DNA-sitoutumisaktiivisuutta NF-KB: n ja

etana

promoottori, joka johtaa transkription säätely alaspäin etana. P38 /NF-KB /Snail reitin on mukana CAA inhiboivan vaikutuksen CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia ja muuttavien kapasiteettia pahanlaatuinen ihmisen keratinosyyttien (kuva 8).

pahanlaatuisten HaCaT soluja altistetaan CAA, p38 vähentää DNA: ta sitova aktiivisuus NF-KB on

etana

promoottori, joka johtaa transkription säätely alaspäin etana. Tällainen molekyyli prosessi aiheuttaa eston CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia ja muuttavien kapasiteetti pahanlaatuisten HaCaT soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

pahanlaatuisia muuttaneet HaCaT solut aikaisemmin kehittäneet laboratoriossamme [17]. Soluja ylläpidettiin 5% CO

2 37 ° C: ssa RPMI-1640-alustassa (Life Technologies /Gibco, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Life Technologies /Gibco), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Life Technologies /Gibco, Gaithersburg, MD). P38-estäjän, SB203580 ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Kaikki muut käytetyt reagenssit olivat analyyttistä laatua tai ylin luokka käytettävissä.

Transwell määrityksessä

Transwell määritys suoritettiin käyttäen kasvutekijä-vähentää Matrigel-pinnoitettu (8 um huokoskoko, BD, Franklin Lakes, NJ) suodattimet 24-kuoppaisilla levyillä. Lyhyesti, solut trypsinoitiin ja ympättiin ylempään kammioon siirtoaltaat (3 x 10

4 solua /kuoppa) täydentää vapaa 1640-alustassa. Alempi kammioiden siirtoaltaat täytettiin 1640-alustassa, joka sisälsi 100 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF, R immuunikompleksien havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Cell Signaling Technology). Vasta-aineita käytettiin E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinistä, etana, p38, p-p38 (Thr180 /Tyr182), RelA, p-RelA (Ser536, Cell Signaling Technology); Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH, Sigma, St. Louis, MO). Blotit normalisoitiin käyttämällä GAPDH korjaamaan erot kuormituksen proteiineja.

Reverse-transkriptaasia polymeraasiketjureaktiolla (RT-PCR) B

Kokonais-RNA (2 ug) cDNA: ksi käyttäen AMV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA). Alukkeet

CD34

(eteenpäin, 5′-TTGGGCATCACTGGCTATTT-3 ’; taaksepäin, 5′-GGAAGGGTTGGGCGTAAGA-3’),

K5

(eteenpäin, 5′-GAGCAGGGCACCAAGAC-3 ’; käänteinen , 5’-CTCCGCATCAAAGAACATC-3 ’), ja

etana

(eteenpäin, 5’TTCTCCCGAATGTCCCT -3′; taaksepäin, 5′-TCAGCCTTTGTCCTGTAGC -3 ’) käytettiin PCR-monistukseen. PCR-reaktio arvioitiin tarkastamalla PCR-tuotteiden 2% w /v agaroosigeeleillä. Bändit normalisoitiin käyttämällä GAPDH korjaamaan eroja lastaus cDNA

Sferoidiviljelmiä muodostumista

tarttumaton (Costar, USA), Cells (1 x 10

4) oli suspendoitiin määritelty, seerumia, joka koostuu DMEM /F-12 (Gibco), 10 ng /ml ihmisen rekombinantti-fibroblastien kasvutekijä (bFGF, R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Vaikutukset CAA elinkelpoisuudesta pahanlaatuisten HaCaT soluja. Sen jälkeen, kun solut altistettiin 0,0, 50,0, 100,0, tai 200,0 uM CAA 24 ja 48 tuntia, vastaavasti, niiden elinkykyisyyksiä mitattiin käyttämällä solun laskenta kit-8-määrityksessä. Suhteelliset solujen elinkelpoisuus määritettiin vertaamalla solujen kasvun alttiina ei CAA.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0058915.s001

(TIF)

Kuva S2.

vaikutukset SB203580 solun elinkelpoisuuden ja fosforylaatiota p38. (A) vaikutukset SB203580 elinkelpoisuudesta pahanlaatuisten HaCaT soluja. Sen jälkeen, kun solut altistettiin 0,0, 5,0, 10,0, 20,0, tai 40,0 uM SB203580: ssa 24 tuntia, niiden elinkykyisyyksiä mitattiin käyttämällä solun laskenta kit-8-määrityksessä. Suhteelliset solujen elävyyden tulostettiin kanssa käsittelemättömien solujen määrittämiseksi 100% aktiivisuustason. (B) SB203580 esti CAA aiheuttaman fosforylaatiota p38. (

gggynrrrcc

).

doi:10.1371/journal.pone.0058915.s003

(TIF)

Acknowledgments

The