Krooninen sairaus

tiivistelmä

hematogenous etäpesäke aiheuttaa suurimman syöpään liittyvien kuolemien, mutta mekanismi on edelleen epäselvä. Kiertävä kasvainsolujen (CTC) veressä voi soveltaa erilaisia ​​väyliä ylittämään veri endoteelin esteen ja luoda metastasoitunut kapealla. Useissa tutkimuksissa on osoitettu, että eturauhassyöpä (PCA) solu-jaon ja liikkuvan mikrovaskulaarisen endoteelin kautta E-selektiini /E-selektiinin ligandivuorovaikutuksia alle hiertoleikkausvirtaus teoreettisesti edistää ekstravasaatio ja edistää etäpesäkkeiden. Kuitenkin ei tiedetä, CTC PCA potilaista vuorovaikutuksessa E-selektiinin ilmentyy endoteelin, aloittaa reitin kasvainten etäpesäkkeitä. Kirjoittajat raportoivat, että CTC peräisin PCa potilailla esiintyi vuorovaikutusta E-selektiinin ja E-selektiinin ilmentävien endoteelisolujen. Tutkia E-selektiinin välittämän vuorovaikutukset PCa solulinjojen ja CTC peräisin metastaattinen PCa potilailla, käytimme fluoresoivasti leimattua anti-eturauhasen kalvon (PSMA) monoklonaalinen vasta-aine J591-488, joka sisäistetään seuraavat solupintasitomis-. Käytimme mikromittakaavaisen virtaus, joka koostuu E-selektiinin päällystetty mikroputkille ja ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) on yhdensuuntainen levyn virtauskammion simuloimalla verisuonten endoteelin. Havaitsimme, että J591-488 ei merkittävästi muuttanut liikkuvan käyttäytyminen PCa solujen leikkausjännityksissä alle 3 dyn /cm

2. CTC saatu 31 PCa potilaan näytteet osoittivat, että CTC lieka ja vakaasti vuorovaikutuksessa E-selektiinin ja E-selektiinin ilmentävien HUVEC fysiologisissa leikkausjännitys. Mielenkiintoista, otetuista näytteistä aikana sairauden etenemiseen oli merkittävästi enemmän CTC /E-selektiini vuorovaikutukset kuin näytteitä aikoina hoitovaste (

p

= 0,016). Analyysi ilmaus sialyyli Lewis X (SLE

x) potilaan näytteet osoittivat, että pieni joukko, joka sisältää 1,9-18,8% of CTC hallussaan korkean SLE

x ilme. Lisäksi E-selektiini-välitteisen vuorovaikutukset eturauhasen CTC ja HUVEC oli vähentynyt, kun läsnä oli anti-E-selektiinin neutraloiva vasta-aine. CTC-endoteelisolujen vuorovaikutusta aikaan uudenlainen tietoa mahdollisten liima mekanismeja eturauhasen CTC keinona aloittaa etäpesäkkeitä.

Citation: Gakhar G, Navarro VN, Jurish M, Lee GY, Tagawa ST, Akhtar NH, et ai . (2013) Circulating syöpäsolujen eturauhassyöpäpotilaalla Vuorovaikutuksessa E-Selectin fysiologisissa verenkiertoa. PLoS ONE 8 (12): e85143. doi: 10,1371 /journal.pone.0085143

Editor: Kjetil Tasken, University of Oslo, Norja

vastaanotettu: 27 elokuu 2013; Hyväksytty: 23 marraskuu 2013; Julkaistu: 27 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Gakhar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat postdoctoral koulutusta palkinnon puolustusministeriön-Eturauhassyöpä tutkimusohjelma (W81XWH-12-1-0124, G. Gakhar); U54CA143876 National Cancer Institute (ja D. M. nanus ja M.R. King); David Koch Foundation ja Robert Dow Foundation (ja N. H. Bander); National Science Foundation Graduate Research Fellowship (Y. Geng); USA: sta NIH (R01 CA137020-01, P. Giannakakou); Charles H. Leach, II Foundation, ja Robert H. McCooey Urogenitaalinen Oncology Research Fund; alkaen Clinical Translational Science Center, National Center for edistäminen Translational Sciences (UL1-TR000457-06, että PJ Christos). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat konflikteja. NHB on keksijä patenteista liittyy J591-vasta tässä tutkimuksessa käytetyt (Katso Tiedosto attachment- Bander_J591Patent). Nämä patentit on määritetty Cornell. Tohtori Bander on konsultti ja pitää oman pääoman BZL Biologics, yritys johon patentit lisensoitu CRF lisätutkimusta ja kehittämistä. MS on keksijä seuraaviin patentti, joka kattaa käytön E4ORF1 endoteelisolujen (endoteelisoluissa ilmennä adenoviruksen E4ORF1 ja menetelmät niiden käyttämiseksi, US-patentti # 8465732). Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

kehitys etäpesäkkeitä on arveltu aloittaa samankaltaisten mekanismien välityksellä käyttämä leukosyyttien tarttumisen ja transmigraatio veren kautta endoteelin [1]. Valkosolujen rekrytointi Cascade endoteeliin tulehduksen aikana käsittää peräkkäiset vaiheet kuten kiinniottamiseksi, liikkuva, tarttuvuus, ja lopulta transmigraatio. Alkuperäinen vaihe tethering ja liikkuvan tapahtuu dynaamisten ja ohimeneviä vuorovaikutukset selektiineiksi ilmaisema endoteelisolujen (EC) ja niiden ligandien läsnä valkosoluissa aikana veren virtaus aiheuttaa jatkuvaa jarrutetaan ja muodostumista reseptori-ligandi joukkovelkakirjoja. Tämä sykli johtaa ominaisuuden liikkuvan käyttäytymistä leukosyyttien [2]. Ihmisillä E-selektiini on osoitettu olevan ensisijaisesti vastuussa selektiinin välittämän liikkuva ja jaon [3].

Useat tutkimukset käyttäen kasvainsolulinjoja ja hiiri malleja viittaavat siihen, että endoteelin (E) -selectin on mukana kasvaimen soluadheesiota, muuttoliikettä ja kehitystä etäpesäkkeiden [4,5].

In vivo

hiiren mallit ovat osoittaneet, että E-selektiinin edistää etäpesäkkeiden [6] ja ohjaa etäpesäkkeitä maksaan [7]. Simetidiini, joka estää induktion E-selektiinin ekspressiota, merkittävästi vähentynyt maksan etäpesäkkeiden HT-29 paksusuolen syövän soluista kateenkorvattomissa hiirimallissa vaikuttamatta primaarikasvaimen [8]. Lisäksi E- ja P-selektiini hiirissä injektoitiin HT-29-kasvainsolut osoitti merkittävää väheneminen keuhkojen etäpesäkkeiden verrattuna villityypin hiirissä [9].

välinen yhteys E-selektiinin ja etäpesäkkeiden johtanut moniin tutkimuksiin luonteenomaiset selektiiniligandeille kasvainten solujen pinnalla. Selektiiniligandeille ovat spesifisiä glykoproteiineja, jotka tulevat toimintakunnossa, kun translaation jälkeiset muutokseen, glykosyylitransferaasit ja sulfotransferaasien. Läsnäolo sialyyli-Lewis X (SLE

x) ja sialyyli-Lewis a kappale (SLE

a), hiilihydraatti epitoopit selektiiniligandeille [10,11] usein liittyy syövän etenemiseen ja huonon ennusteen [12,13 ]. Tutkimukset viittaavat myös siihen, että tropismi Eturauhassyövän solujen luuta johtuu välistä vuorovaikutusta E-selektiinin ilmentyy luuytimen endoteelisolujen (EC) ja E-selektiiniligandeille läsnä PCa soluihin [14].

todisteita siitä roolista E-selektiinin ja sen ligandien tuumorimetastaasissa tehtyihin tutkimuksiin käyttäen tuumorisolulinjoja, mutta ei ole koskaan todettu verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC), jotka ovat peräisin potilaista. Raportoimme tästä käyttäen

ex vivo

ehtoja, jotka CTC eristetty miesten kastraation kestävät eturauhassyöpä (CRPC) osoitettava fyysinen vuorovaikutus, pääasiassa tethering ja hyvä pysyvyys, jossa E-selektiini pinnoille ja E-selektiinin ilmentävät EC aikana fysiologisia verenkiertoa. Lisäksi CTC /E-selektiini vuorovaikutukset osoitti merkittävää korrelaatiota kliinisen vasteen potilaiden hoitoa. Nämä yhteisvaikutukset ovat vähentyneet, kun läsnä oli anti-E-selektiinin neutraloiva vasta-aine. Lisäksi löysimme vaihteleva ilmentyminen SLE

x CTC, mikä viittaa siihen, että todennäköisesti kaikki CTC osaltaan etäpesäkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

PC3, C4-2, LNCaP, MDA PCa 2b (MDA), ja KGI solut ovat peräisin ATCC (Manassas, VA, USA ). PCa solulinjat PC3, C4-2, ja LNCaP pidettiin RPMI, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, ja MDA PCa 2b (MDA) pidettiin F-12K-alusta täydennettynä 20% naudan sikiön seerumia (FBS), 10 ng /ml EGF, 0,005 /ml insuliini, 100 pg /ml hydrokortisonia, 25 ng /ml koleratoksiinin, 45 nM seleenihapoke, ja 0,005 mM fosfoetanolamiinia. KG1 solut (akuutti myelooinen leukemiasolulinjan), IMDM-alusta täydennettynä 20% FBS.

Etiikka ja ohjausjärjestelmästä ja Patient näytekokoelmalla

Alle Weill Cornell Medical College Institutional Review Board (IRB) hyväksytyn protokollan, 31 perifeerisen veren näytettä otettiin potilaista, joilla CRPC ja 10 perifeerisen veren näytteet otettiin terveiltä luovuttajilta seuraavan kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Verta otettiin joko Ficoll-Paque putkiin (7,5 ml verta kunkin) tai BD-Vacutainer putkiin (2,7 ml verta kunkin; Becton-Dickinson), joka sisälsi 2,3% natriumsitraattia antikoagulanttina. De-tunnistettu kliinistä tietoa saatiin. Määritys kasvain tila (kliininen eteneminen tai kliininen vaste) määritettiin 2 itsenäistä kliinikot tavallisilla kriteerit.

Pinta Merkinnät anti-PSMA monoklonaalista vasta J591

MDA solut trypsinoitiin, sentrifugoitiin, ja inkuboitiin Hankin tasapainotettuun suolaliuokseen (HBSS) /10 mM HEPES /2 mM CaCl

2 /0,5% ihmisen seerumin albumiinia (puskuri I). Monoklonaalinen vasta-aine J591 [15], joka tunnistaa ulkoisen toimialueen eturauhasen kalvoantigeeni (PSMA) konjugoituna Alexa fluor-488 (J591-488) lisättiin MDA ja PC3-solut (yksin ja solujen teräviä terveillä veressä) 20 ug /ml 30 min ajan huoneenlämpötilassa on rotaattori, sentrifugoitiin 1500 rpm: llä 5 minuutin ajan, ja pelletti suspendoitiin uudelleen RPMI-elatusaineeseen. Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) eristettiin normaaleista terveitä verestä Ficoll tiheys perustuva sentrifugointi samalla käsitelty, ja asetettiin BD solu-tak (BD Biosciences, San Jose, CA) päällystetyt peitinlasit mukaan Sytospin. PBMC: t kiinnitetään käyttäen 2%: ista formaldehydiä (Tousimis, Rockville, MD) ja värjättiin hiiren anti-CD45-vasta-ainetta (1: 200, Clone 2D1, BD Pharmingen, San Jose, CA), pestiin PBS: llä ja inkuboitiin vuohen anti-hiiri-Alexa fluori (AF) -594 sekundaarista vasta-ainetta, pestiin ja vastavärjättiin DAPI.

rikastaminen CTC anti-CD45 immunomagneettihelmidepleetio helmi ehtyminen

rikastamiseksi CTC, PBMC: t eristetään perifeerisestä verestä Ficoll tiheys -pohjainen sentrifugoimalla alistettiin negatiivisen valinnan leukosyyttejä käyttäen anti-CD45 immunomagneettisia helmiä (Life Technologies, Grand Island, NY). PBMC pestiin kahdesti 2% RPMI /4 mM MgCl

2/1 mM CaCl

2 puskuria (puskuri II) ja inkuboitiin esipesty anti-CD45 immunomagneettisia helmiä 1 ml: aan puskuria I 20 min pyörittäjässä. Inkuboinnin jälkeen 35 ml: aan puskuria I lisättiin ja soluja pidettiin magneetilla 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Soluja sentrifugoitiin 400 g: ssa 12 minuutin ajan ja anti-PSMA J591-488 vasta-ainetta lisättiin 40 min, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen puskuriin I ja liikkuvan määritykset suoritettiin. Immunovärjäämistä kokeiden jälkeen anti-CD45 immunomagneettihelmidepleetio ehtyminen, solut suspensoitiin 500 ui 2% RPMI ja Cytospin positiivisesti varautuneita objektilaseille (Thermo Scientific, Asheville, NC). Leikkeitä säilytettiin -20 ° C: ssa myöhempää immunovärjäystä.

Flow-Based Microtube määritys

Lyhyesti, steriilit 50 cm pituus 300 um ”D” microrenathane putket (Braintree Scientific, MA) oli inkuboitiin 10 mg /ml proteiinia G liuosta 1,5 h, jonka jälkeen 2 tunnin inkuboinnin 10 ug /ml ihmisen rekombinantti-IgG E-selektiini [16] (R 2) Rolling /jako CTC (ts tethering viittaa CTC jotka kiinnittyvät pintaan, sitten irrottaa alle viidessä sekunnissa ja kiinnitä uudelleen); ja 3) Tarttumattomat CTC (CTC joka ei rullaa /lieka tai kiinni pintaan).

Immunofluoresoivat värjäys solunpintamarkkereiden

jälkeen rikastamista PBMC PCA potilaista, eristettyjä soluja kiinnitettiin lasilevyille cytospin, kiinnitettiin 2% formaldehydillä (Tousimis, Rockville, MD) 20 minuutin ajan, ja pestiin 3 x PBS: llä. Solut blokattiin 2% BSA: ssa 1 h, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla rotan anti-SLE

x (01:10, HECA-452, BD Pharmingen, San Jose, CA) tai kaniinin polyklonaalista anti-CXCR4 (1: 100, Novus Biologicals, Littleton, CO) mAb: itä 1 h, ja inkuboitiin toissijaisen Abs (vuohen anti-rotta AF594 ja vuohen anti-kani Dylight 405) 1 tunti, inkuboitiin AF-488 ja AF-647 konjugoitua ensisijainen vasta-aineita anti-PSMA (humanisoitu) ja anti-EpCAM (hiiri, klooni 9C4, BD Biosciences), vastaavasti, ja joka on asennettu coverslide tuoreeltaan valmistetun Mowiol (Calbiochem, Billerica, MA). Kaikki inkuboinnit suoritettiin huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen 3X pesu PBS: llä plus 0,5% BSA: ta. Sillä immunofluoresenssivärjäyksellä, MDA, PC3, KG1cells ja PBMC: t on saatu normaaleilta terveiltä luovuttajilta käytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina eri proteiineja. Ohjaus solut ympättiin BD Cell-Tak päällystetty peitelaseja ja käsitellään samalla tavoin kuin potilaan näytteitä. Kvantifiointi SLE

x ilmaisua Tiedot saatiin käyttämällä Metamorph

TM ohjelmisto (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA) ja mittaamalla fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) kuvapistettä kohden [20]. Taustaintensiteetin, määritettiin valitsemalla alue puuttuu CTC, vähennettiin näistä arvoista kullekin kuvalle. Näitä mittauksia Z-pinoja hankitun kuvien käytettiin ottanut LSM 700 Zeiss Observer.Z1 (Carl Zeiss, Microimaging Inc, Thornwood, NY).

Western blot ja immunofluorescene E-selektiinin ilmentyminen HUVEC

sekä 1 ° ja E4ORF1 HUVEC stimuloitiin IL-1β 4 h. Sen jälkeen kun IL-1β stimulaation, sekä stimuloimattomissa ja stimuloituja soluja pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä. Solut suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (150 mM NaCl, 10 mM Tris HCI, pH = 7,5, 5 mM EDTA), joka sisälsi proteaasi-inhibiittori Cocktail tabletti (1 tabletti /10 ml lyysipuskuria, Roche). Proteiinipitoisuudet solulysaattia määritettiin Bradfordin menetelmällä. Solulysaattia laimennettiin vähentää 6X näytepuskuriin (12% paino /tilavuus SDS: ää, 0,06% w /v bromifenolisinistä, 47% v /v glyseroli, 0,5 M Tris, pH = 6,8, tilavuudeksi 10 ml: aan tislattua vettä) ja erotettiin 10% SDS-PAGE-geelissä. Erotetut proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvolle (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) ja blokattiin 5% maitoa, 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kalvo leikattiin ja inkuboitiin sitten hiiren anti-E-selektiini (1: 500, 68-5H11, BD Pharmingen, San Jose, CA) ja hiiren anti-β-Actin (1: 10000, Sigma Aldrich), yön yli 4 ° C. Immunoreaktiivisuus visualisoida LI-COR Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences). Immunofluoresenssitutkimuksia, sekä 1 ° ja E4ORF1 HUVEC stimuloitiin IL-1β: ssa 4 h ja molemmat stimuloimattoman ja IL-1β-stimuloidun HUVEC kiinnitettiin, läpäiseviksi 0,1% Triton-X 100, ja immuno- värjättiin hiiren anti-E-selektiini monoklonaalinen vasta-aine (2,5 ug /ml, 68-5H11, BD Pharmingen, San Jose, CA) yli yön 4 ° C: ssa. HUVEC-solut värjättiin Alexa fluor vuohen anti-hiiri 488 nm vasta-ainetta (1: 500, Molecular Probes) 1 h huoneen lämpötilassa. HUVEC pestiin ja vastavärjättiin DAPI.

Tilastollinen analyysi

Tarkempi tilasto esittelyyn histogrammien keskiarvo + keskihajonta (SD). Keinot verrattiin kahden otoksen t-testi sopivilla varianssi laskin. Rasiakuvaajien tehtiin ja ei-parametrinen Wilcoxonin-summa suoritettiin vertaamaan jakaumat (eli mediaani, vaihteluväli) ryhmien välillä. Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin syöpäsolulinjoilla. Fisherin tarkka testi suoritettiin välisen suhteen arvioimiseksi potilaan CTC /E-selektiinin vuorovaikutus tilan ja kliinisen etenemisen tila. P-arvo

0,05

pidettiin tilastollisesti merkitsevä kaikissa analyyseissä. Kaikki analyysit suoritettiin STATA versio 10.0 (StataCorp, College Station, TX).

Tulokset

leimaaminen eturauhaskasvainsoluissa anti-PSMA J591-488 vasta-

tutkimuksessa CTC eristetty potilailta, joilla CRPC, otimme etuna se, että 90% PCa soluista ilmentävät PSMA pinnallaan [21,22], ja käytetään mAbJ591-488, joka tunnistaa ulkoisen verkkotunnus PSMA ja nopeasti sisäistää seuraavat sitoutuminen solun pintaan PSMA, tunnistaa PCa CTC [15,23] .. MDA soluja, jotka ilmentävät PSMA ja PC-3-soluja (PSMA negatiivinen kontrolli) lisättiin erikseen normaalin terveen verta, ja seosta inkuboitiin mAbJ591- 488. Inkuboinnin jälkeen PBMC-kerros, joka sisältää syövän solut kerättiin. Kuten odotettua (kuvio 1A), MDA solut, jotka ilmentävät PSMA sisäistetään mAbJ591-488 ja helposti nähtävissä fluoresenssimikroskopialla, kun taas mAbJ591-488 ei sitoudu PC3-solut (kuvio 1 B). Veri lisäystasot kokeiluja MDA ja PC3 tehtiin kuusi kertaa eri terveitä luovuttajan verta. Ei PSMA ekspressiota havaittiin ympäröivän leukosyyttejä, jotka tunnistettiin immunovärjäyksellä anti-CD45-vasta-ainetta (kuvio 1 C). PSMA-ilmentyminen on myös ei havaittu PC3-soluissa sekoitettu verta (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että mAbJ591-488 voidaan spesifisesti leimata PCa soluja ja voidaan siten käyttää merkitsemään PCa CTC.

Cancer solut maljattiin joko yksinään (A, B) tai läsnä ollessa terveestä luovuttajasta peräisin PBMC: t (C ). Solut leimattiin J591-488 vasta-aineella (vihreä) huoneenlämpötilassa, sitten kiinteä ja immunovärjättiin CD45 (punainen) ja DAPI (sininen). A) MDA solut ovat positiivisia PSMA ilmaisua. B) PC3-solut ovat negatiivisia ja siksi puuttuu PSMA ilmaisua. C) Oikea alakuviossa esittää erityinen ilmaisu PSMA mukaan MDA solut samalla verisoluja ilmentävät CD45. PBMC eristetään normaaleilta terveiltä luovuttajilta sekoitettiin MDA soluja ja käsiteltiin kuten A, B PSMA-positiivisten MDA syöpäsolut ovat selkeästi ja nimenomaisesti kuvattu (valkoinen nuoli) joukossa CD45-ilmentävien leukosyyttien (nuolenpäät) yhdistelmä.

Green = PSMA, punainen = CD45, ja sininen = DAPI

.

E-selektiini-riippuvainen adheesio leimaamattoman ja anti-PSMA J591-488 leimattuja eturauhaskasvainsoluissa

aikana tulehdusvastetta, leukosyyttien kiinni verisuonen endoteelin väliset vuorovaikutukset adheesion molekyylien läsnä luminaalipuolella verisuonten endoteelin ja täydentäviä ligandien läsnä valkosoluissa. Nämä yhteisvaikutukset johtavat ohimenevä, dynaaminen tarttuvuus (liukuva) solujen verisuonen seinämään [2]. Liikkuvan havaitaan koska jatkuva jarrutetaan ja muodostumista reseptori-ligandi-sidoksia takapäässä solu- ja etureunan solun, vastaavasti. Sen tutkimiseksi, E-selektiini-riippuvaista vuorovaikutusta esiintyy eturauhasen CTC, ensin käytetty MDA, PC3, LNCaP ja C4-2 PCa solulinjojen arvioida niiden liikkuvan käyttäytyminen läsnäollessa E-selektiinin päällystetty microtube pintoja. Neljästä PCa solulinjoissa tutkittu, me vain havaita vankka liikkuvan käyttäytymistä MDA soluissa (tuloksia ei esitetä) Kuten aiemmissa tutkimuksissa [24,25].

Monoklonaalinen vasta J591 sisäistetään seuraavat solupintasitomis- viittaa siihen, että PCa CTC voidaan merkitä

ex vivo

ja tutkittu CTC-endoteelin vuorovaikutusta. Kuitenkin sulkea pois mahdollisuutta, että J591-488 sitova ja sisäistämisen muuttuu liikkuvan käyttäytyminen, me merkitty MDA soluja J591-488 ja verrataan liikkuvan käyttäytyminen leimaamattoman MDA soluilla leikkausjännityksissä vaihtelevat 0,5-8 dyn /cm

2 . Keskimääräinen kierimisnopeutta leimaamatonta ja J591-488-leimatun MDA-soluja 0,5 dyn /cm

2 oli 5,27 + 1,28 um /s ja 5,23 + 1,85 um /s (kuvio 2, p = 0,88, NS). Teimme tarkkailla pieni, mutta tilastollisesti merkitsevä ero keskimääräisessä liikkuvan nopeudet leimaamatonta versus J591-488 leimattu MDA solut 3 (7,04 + 1,15 vs. 6,33 + 1,22 mikrometriä /s,

p 0,005

) ja 8 ( 17.81 + 3.51 vs 14,38 + 1,83 mikrometriä /s,

p 0,0005

) dyn /cm

2 leikkausjännitys. Siksi perustuu meidän tuloksia ja aikaisempien tutkimusten, me kokeita 0,6 dyn /cm

2, joka on laajalti käytössä fysiologinen leikkausjännitys mittaamaan liikkuvan käytös [17]. Lisäksi on osoitettu, että kasvainsolujen roll ja lieka alemmilla leikkausjännityksissä (

3 dyn /cm

2) [26]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että CTC voidaan leimata J591-488 ja että fluoresoiva merkinnöistä CTC ei vaikuta liikkuvan käyttäytymiseen alemmilla leikkausjännityksissä. Huomattavaa on, että emme havaitse mitään liikkuvaa toimintaa joko ilman E-selektiinin milloin tahansa leikkausjännitys tutkittu tai läsnä ihmisen yhdistelmä-L-selektiini-proteiinia (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että E-selektiinin vaaditaan liikkuvan käyttäytymistä. Videoita S1 ja S2 näyttää liikkuvan käyttäytymistä leimaamattoman ja J591-488-leimattuja MDA solujen

.

MDA solut leimattiin mAb J591-488 varten PSMA. Sen jälkeen merkintöjä, 10

6 J591-488 leimattuja MDA soluja perfusoitiin 0,5, 1, 3, 5, ja 8 dyne /cm

2 leikkausjännitys. Samoin merkitsemätön MDA solut myös perfusoitiin kautta E-selektiinin päällystetty mikroputkea. Kymmenen videoita otettiin eri pituudet microtube kunkin leikkausjännitys. Rolling nopeus mitattiin sekä leimaamatonta anti-PSMA J591-488 leimattuja MDA soluja. Kuvio ei osoita merkittävää eroa liikkuvan nopeuden välillä leimaamatonta ja anti-PSMA J591-488 leimattu MDA solujen leikkausjännitys vaihtelevat 0,5-1 dyn /cm

2. Keskimääräinen Liikkuvan nopeudet 0,5 dyn /cm

2 olivat 5.27+ 1,38 ja 5,23 + 1,85 mikrometriä /s tunnisteettomien ja J591-488 merkitty MDA soluja, tässä järjestyksessä. Suuremmilla leikkausjännitysten, merkitsevä ero havaittiin näiden kahden MDA soluja. Histogrammi esittää tulokset kolmesta eri kokeesta yhdistetään. UNL = merkitsemätön MDA soluja, Lab = J591-488 leimattuja MDA soluja. Tiedot esitetään keskiarvona + SD.

E-selektiinin välittämän vuorovaikutuksen CTC peräisin eturauhassyöpäpotilaalla

Seuraava ratkaistava, onko CTC peräisin PCa potilaat vuorovaikutuksessa E- selektiinin samanlainen MDA PCa soluihin. PBMC: t ~ 6 ml (5,4-7,5) kokoveri saatiin 17 yksittäisten potilaiden (27 verinäytettä), joilla on metastaattinen PCa, ja inkuboitiin mAb: J591-488. Seuraava merkintä, 21 näytettä tehtiin anti-CD45 ehtyminen; kun taas 6 näytettä, ei anti-CD45 ehtyminen suoritettiin. Ensin juoksi kuuden potilaan näytteitä ilman anti-CD45 ehtyminen. Myöhemmin ei saastuta valkosoluja, jotka voi mahdollisesti pienentää mahdollisuutta CTC vuorovaikutuksessa pintaan, käytimme anti-CD45 ehtyminen rikastamiseksi CTC väestölle. Takaisinsaamisaste tätä tekniikkaa oli 60-70% käyttäen PSMA ilmentäviä PCa soluja (tuloksia ei ole esitetty). Jokainen potilas näyte perfusoitiin yli E-selektiini-pinnoitettu microtube pinnat 0,6 dyn /cm

2 muodostetaan seinän leikkausnopeudella 60

-s, joka on alueella fysiologisten seinän leikkausnopeutta postkapillaarilaskimopopulaation [27 ]. Eturauhassyövän CTC merkitty mAb J591-488 todettiin 23 näytettä, ja mediaani määrä CTC havaita käyttämällä offline videoanalyysi oli yhdeksän (vaihteluväli 0-270) (taulukko 1). Yhdeksän 23 (39,1%) ja 10/23 (43,5%) potilaan näytteessä oli liikkuvan /tethering ja vakaa tarttuvuus, vastaavasti. E-selektiinin välittämän vuorovaikutuksia havaittu eturauhasessa CTC koostui enimmäkseen tethering ja vakaa tarttuvuus harvoja CTC näytetään liikkuvan käyttäytymistä. Kun arvioimme kliinistä aikaan näytteen keräämistä ja käsittelyä, totesimme, että CTC näytteistä kokeneiden potilaiden kliininen vaste oli huomattavasti vähemmän todennäköisesti E-selektiinin välittämän vuorovaikutukset verrattuna CTC kliinisesti etenee potilaista (taulukko 1; 0,0 % vs. 61,9%, tässä järjestyksessä,

p

= 0,016). Anti-CD45 ehtyminen ei ollut vaikutusta E-selektiini-riippuvainen vuorovaikutus CTC (taulukko 1, näyte 1, 13, 17, 21, 22, 25); vaikka emme voi täysin sulkea pois mahdollisuutta, että jotkut CTC menetettiin anti-CD45 ehtyminen prosessi. Video S3 esittää videon yhden potilaan näytettä osoittaa vuorovaikutuksen CTC E-selektiini. Nämä tulokset tarjoavat suoran todisteet eturauhasen CTC ilmentävät PSMA vuorovaikutuksessa E-selektiinin ja viittaavat siihen, että eturauhasen CTC hallussaan E-selektiiniligandin (t) (ESLs) niiden solujen pinnalla.

Patient No.

Näyte

Rolling ja jako

Stable Adhesion

Yhteensä

sairauskertomus klo näytekokoelmatodistuksesta

kliininen vaste aikaan näytteenotosta

1 * 13329Bone ja LN etäpesäkkeitä seuraavat etenemistä dosetakselin ja tutkitun hoidon hetkellä ketokonatsoli /hydrocortisoneProgression121310Bone ja LN etäpesäkkeitä seuraavat etenemistä dosetakselin ja tutkitun hoidon hetkellä ketokonatsoli /hydrocortisoneProgression132814270Bone ja LN etäpesäkkeitä seuraava edennyt hormonihoitoa, dosetakseli, ja tutkitun hoidon parhaillaan abirateronin /prednisoneProgression140072Bone ja LN etäpesäkkeitä seuraavat etenemistä dosetakselin ja abirateronin parhaillaan karboplatiini /paclitaxelResponding150012Bone ja LN etäpesäkkeitä seuraavat etenemistä dosetakselin ja abirateronin parhaillaan karboplatiini /paclitaxelResponding26009Bone ja LN etäpesäkkeitä aiemmin hoidettu hormonihoidon ja doketakselin tutkimuslääkkeiden therapyProgression27004Bone ja LN etäpesäkkeitä käsiteltiin aiemmin hormonaalisia terapia ja doketakseli tutkimuslääkkeiden therapyProgression38035Bone etäpesäkkeitä seuraavat monirivisille hormonaalista therapyProgression39009Bone etäpesäkkeiden seuraavat monirivisille hormonihoito on docetaxelResponding410012Bone, LN, maksan ja keuhkojen etäpesäkkeet aiemmin hoidettu dosetakselilla ja abirateronin parhaillaan karboplatiini /paclitaxelProgression511009LN etäpesäkkeitä progressioehtoisen hormonaalisia therapyProgression512001LN etäpesäkkeitä kanssa progressiota hormonihoito ja doketakselin parhaillaan abirateronin /prednisoneResponding6 * 13400166bone etäpesäkkeitä progressioehtoisen dosetakselin ja tutkimuslääkkeiden therapiesProgression614036bone etäpesäkkeitä etenemiseen dosetakselin, tutkimuslääkkeiden hoitoja, ja abirateroneProgression7152141bone, LN, paksusuolen ja virtsarakon etäpesäkkeitä seuraavat hormonaalista tutkimuslääkkeiden therapyProgression716002bone, LN, paksusuolen ja virtsarakon etäpesäkkeitä seuraavat hormonaalista tutkimuslääkkeiden terapiassa nykyisin docetaxelResponding8 * 17023bones etäpesäkkeet aiemmin hoidettu monirivisille hormonaalista therapyProgression818000bones etäpesäkkeitä aiemmin hoidettu useita rivejä hormonihoito, nykyisin docetaxelResponding919000bone etäpesäkkeitä etenee alkuperäisen hormonaalista therapyProgression10202153LN ja maksametastaaseista aiemmin hoidettu dosetakselilla parhaillaan abirateroneProgression11 * 219228bone etäpesäkkeet aiemmin hoidettu dosetakselilla, ketokonatsoli, ja tutkimuslääkkeiden therapyProgression12 * 22102LN etäpesäkkeitä aiemmin hoidettu tutkitun hoidon ja dosetakseli, tällä hetkellä enzalutamideProgression1323000bone ja LN etäpesäkkeitä on leuprolide ja bicalutamideProgression14240020bone ja keuhkojen etäpesäkkeet aiemmin hoidettu hormonaalisia therapyProgression15 * 250010bone, LN, virtsarakko- ja keuhkojen etäpesäkkeet aiemmin hoidettu tutkitun hoidon ja docetaxelProgression1626000bone ja LN etäpesäkkeitä aiemmin hoidettu tutkitun hoidon ja docetaxelProgression17271022LN ja virtsarakon etäpesäkkeitä aiemmin treatd ketokonatsolin, dosetakseli, tutkimukselliset terapia, nykyisin cabazitaxelProgressionTable 1. vuorovaikutus CTC johdettu metastaattisen PCa potilaista ja E-selektiinin kuorrutettu microtube pintoja.

LN = imusolmuke; Yhteensä tarkoitetaan kaikkia J591-leimattua CTC;

tukeminen Information

Kuva S1.