Krooninen sairaus

tiivistelmä

Extracellular matrix metalloproteinase-induktori (EMMPRIN), solukalvon proteiini immunoglobuliinin (Ig) superperheen, on raportoitu edistää syöpäsolujen invaasiota ja etäpesäkkeiden useissa ihmisen syöpäsairauksia. Kuitenkin roolit eri EMMPRIN isoformeja ja niihin liittyvät mekanismit pään ja kaulan alueen syövän etenemisessä ei vielä tunneta. Käyttämällä kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR, huomasimme, että EMMPRIN isoformin 2 (EMMPRIN-2) oli ainoa isoformin, joka oli yli-ilmennetään sekä pään ja kaulan alueen syövän kudoksissa ja solulinjoissa ja että se liittyi pään ja kaulan alueen syöpä etäpesäke. Voit selvittää vaikutukset EMMPRIN-2 pään ja kaulan syövän etenemisessä, transfektoimme pään ja kaulan alueen syöpä solujen kanssa EMMPRIN-2 ekspressiovektoriin ja EMMPRIN-2 siRNA eksogeenisesti moduloida EMMPRIN-2 ilmaisun ja tutki toiminnallista merkitystä EMMPRIN-2 pään ja kaulan syövän eteneminen ja metastaasit. Huomasimme, että EMMPRIN-2 edistänyt pään ja kaulan syöpäsoluinvaasiota, muuttoliike, ja tarttuvuus in vitro ja kasvoivat keuhkometastaasitestissä in vivo. Mekaaniset tutkimukset paljastivat, että EMMPRIN-2 yli-ilmentyminen edisti eritystä solunulkoisten signalointimolekyylien, mukaan lukien metalloproteinaaseja-2 (MMP-2), urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA), ja katepsiini B, pään ja kaulan syövän soluissa. Vaikka MMP-2 ja uPA on osoitettu olevan tärkeitä välittäjiä EMMPRIN signaloinnin roolia katepsiini B EMMPRIN välittämän molekyyli kaskadeja ja kasvaimen kehittymisen ei ole osoitettu. Huomasimme, että EMMPRIN-2 yli-ilmentymisen ja katepsiini B alassäätöä merkittävästi esti hyökkäyksen, migraation ja adheesion Tca8133 soluja, mikä viittaa siihen, että katepsiini B vaaditaan EMMPRIN-2 tehostetun solumigraatio ja hyökkäyksen pään ja kaulan alueen syöpä. Tulokset Tutkimuksemme osoittavat tärkeän roolin EMMPRIN-2 pään ja kaulan syövän etenemisessä ensimmäistä kertaa ja osoittavat, että lisääntynyt solunulkoista erittymistä katepsiini B voi olla tuntematon mekanismi taustalla EMMPRIN-2 tehostetun syövän etenemisen pään ja kaulan alueen syöpä.

Citation: Huang Z, Tan N, Guo W, Wang L, Li H, Zhang T, et al. (2014) yli-ilmentyminen EMMPRIN isoformiseosten 2 liittyy pään ja kaulan alueen syöpä Metastasis. PLoS ONE 9 (4): e91596. doi: 10,1371 /journal.pone.0091596

Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu 4 marraskuuta 2013 Hyväksytty: 12 helmikuu 2014; Julkaistu: 04 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (# 81101592, Z. Huang) ja Guangdong Natural Science Foundation (# S2013010014794, jotta Z. Huang), ja jonka palkintoja lentoemäntä Medical Research Institute (# 062545, Z. Guo) ja avustuksia National Natural Science Foundation of China (# 81272951, on J.Li). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan alueen syöpä (HNC) on kuudenneksi yleisin syöpä maailmassa [1], ja on yleistynyt kehitysmaissa viime vuosikymmenen aikana [2]. Yli 650000 uutta tapausta HNC diagnosoidaan vuosittain maailmanlaajuisesti [3], [4]. Pelkästään Euroopassa noin 143000 uutta tapausta ja yli 68000 kuolemantapausta johtua taudin vuosittain [4]. Leikkaus yhdistettynä kemoterapiaa ja sädehoitoa on nyt hyväksytty tehokkain hoito potilailla, joilla pään ja kaulan okasolusyöpä. Kuitenkin kuolleisuus johtuu pään ja kaulan alueen syöpä ei ole muuttunut merkittävästi viimeisten 30 vuoden aikana, ja 5 vuoden pysyvyys on edelleen alle 50% [2]. Hoidon epäonnistuminen on kohdistunut pääosin paikallisen uusiutumisen ja etäinen etäpesäke [5]. Tällä hetkellä terapeuttisia päätökset tehdään perustuvat ennusteeseen viittaavia parametreja, kuten ikä, kasvaimen etäpesäke vaiheessa, ja histologinen. Vaikka hyödyllinen, nämä tekijät eivät useinkaan antamaan tarkkoja tietoja biologiset ominaisuudet kasvainten [3]. Siksi käsityksen molekyyli muutoksia liittyy pään ja kaulan alueen syöpä etäpesäkkeiden antaa kriittistä oivalluksia perusmekanismeista taustalla pään ja kaulan alueen syövän etenemistä ja edelleen osaltaan parantaa kliinisessä hoidossa pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta.

soluväliaineen metalloproteinaasi-induktori (EMMPRIN), joka tunnetaan myös nimellä CD147 tai basigin, on solukalvon proteiini immunoglobuliinin (Ig) superperheen ja nimettiin perustuu sen toiminta tuotannon indusoimiseksi soluväliaineen metalloproteinaasien (MMP: t), avain entsyymit osallistuvat eheyden säilyttämiseksi ja liikevaihto soluväliaineen (ECM) [6]. EMMPRIN osallistuu erilaisiin solun normaalin fysiologioiden, mukaan lukien lymfosyyttien reagointia, naisten lisääntymisterveyttä prosesseja, ja solunsisäinen kuljetus [7] – [9]. Kohonnut EMMPRIN ilme on korreloinut syövän etenemiseen glioomis-, jättiläinen solu kasvain luun, kurkunpään okasolusyöpä, serous munasarjakarsinooma ja ihosyövän [10]. EMMPRIN edistää syövän etenemisen tehostamalla syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäke. Toiminnallinen merkitys EMMPRIN aikana kasvaimen etenemistä on pääosin johtuvan sen kyvystä stimuloida MMP [8] – [10]. Tuumorisoluissa, EMMPRIN edistää tuotannon MMP-1, MMP-2, ja MMP-9 ja helpottaa synteesiä MT1-MMP ja MT2-MMP [11] – [13]. Välittämisen lisäksi hajoamista ECM, EMMPRIN lähettää monitoiminen rooli syövän etenemisessä. Jopa säätelevä VEGF: n ilmentymistä, ja sen tärkein reseptori, VEGFR-2, sekä tuumorisoluissa ja endoteelisolujen, EMMPRIN voi edistää angiogeneesiä, joka on kriittinen tapahtuma ei vain kasvaimen kasvun aikana, vaan myös aikana syöpäsolumetastaasi [14], [15]. EMMPRIN voivat toimia myös adheesiomolekyyli ja vuorovaikutuksessa β1-integriini [16], [17]. Monet muut molekyylit, on raportoitu olevan vuorovaikutuksessa EMMPRIN, mukaan lukien caveolin-1, uPA, monokarboksylaatti kuljettajat (MCT), ja CYP450s [18].

johtuen vaihtoehtoisen silmukoinnin, vähintään 4 eri versioita EMMPRIN koodaavan mRNA: n eri EMMPRIN proteiini-isoformit (EMMPRIN-1–4) on tunnistettu. Näistä neljä variantteja, EMMPRIN-2 on runsain isoformi ilmaistuna kasvainsoluissa [19]. EMMPRIN-1 koodaa pisin, verkkokalvon erityisiä isoformia, joka on ominaista lisäksi Ig-kaltaisen domeenin (kolme Ig-kaltaista domeenia kokonaismäärästä) solunulkoisen osan [20]. Muut kaksi vaihtoehtoa, EMMPRIN-3 ja EMMPRIN-4, ensin tunnistettu ihmisen kohdun limakalvon strooman solujen ja kohdunkaulan karsinooman solulinjoissa [19]. EMMPRIN-3 on lyhin isoformi, joka koostuu vain yhdestä Ig-kaltaisen domeenin sen solunulkoinen osa [21], ja se on vuorovaikutuksessa sisäistää EMMPRIN reseptori-ligandi-kompleksin [19].

aikaisemmassa tutkimuksessa tunnistettiin EMMPRIN tehokkaana tavoite immunoterapiaa kielen okasolusyöpä [22]. Kuitenkin tarkka ominaisuudet EMMPRIN isoformeja ja niiden roolit aloittamisen ja etenemistä pään ja kaulan alueen syöpä ei vielä tunneta. Vaikka EMMPRIN isoformi 3 on osoittanut negatiivinen säätelijä in leviämisen ja invaasion syöpäsolujen [23], EMMPRIN isoformit 1, 2 ja 4 on ehdotettu pelata onkogeenisessä merkitys ihmisen maligniteettien, mukaan lukien suun syöpä. Tässä tutkimuksessa selvitimme perustavanlaatuinen roolit EMMPRIN isomuotojen pään ja kaulan syövän etenemisessä. Meidän havainnot osoittavat tärkeän roolin EMMPRIN-2 ja siihen liittyvät mekanismit pään ja kaulan alueen syövän eteneminen ja metastaasit ensimmäistä kertaa.

Materiaalit ja menetelmät

1. Ihmisen kudokset ja Solulinjat

yhteensä 51 paria pään ja kaulan alueen syöpä kudoksiin ja vastaavien viereisten nontumorous kudokset kerättiin 2009-2011 laitoksella Suu- ja leukakirurgia, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Senin yliopistossa, Kiinan Guangzhoussa. Kudosnäytteet välittömästi snap-pakastettiin nestetyppeen resektion jälkeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Sekä tumorous ja viereisten nontumorous kudokset histologisesti tutkittiin. Kirjallinen suostumus saatiin keräämiseen kaikkien ihmisen materiaaleja, ja tutkimuksen hyväksyi Medical Ethics komitean Sun Yat-sen Memorial Hospital at Zhongshan yliopisto. Kaikki näytteet kerättiin potilailta ennen kliinistä hoitoa. Kliiniset piirteet potilasta yhteenveto taulukossa 1.

Tca8113 ja ACCM pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja ystävällisesti College of hammaslääketieteen, Shanghai Jiao Tong-yliopiston (Shanghai, Kiina) [24 ], [25]. TSCCA solut ystävällisesti Sun Yat-Senin yliopistossa Cancer Center [26] ja lähde SCC25 solujen kuvattu edellisessä julkaisussa [27]. Tca8113 ja ACCM solulinjoja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA), kun taas TSCCA3 ja SCC25 solulinjoja viljeltiin DMEM: ssä (Invitrogen Carlsbad, CA). Kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (Gibco), 100 IU /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ja soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa yrityshautomot sisälsi 5% CO

2 ja kosteutetussa ilmakehässä.

2. Käänteistranskriptio ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA uutettiin kudoksista tai soluista käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan suosittelemaa menetelmää. Täydentävä DNA syntetisoitiin kanssa Prime-Script RT Reagent Kit (Takara, Dalian, Kiina). Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) analyysit tehtiin SYBR Premix Ex-Taq (Takara). Käytetyt alukkeet on esitetty taulukossa S1.

3. Western blotting

Solut hajotettiin NP-40-hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi-inhibiittori cocktail ja fosfataasinestäjällä cocktail (Roche, Rotkreuz, Sveitsi). Erottamisen jälkeen käyttäen SDS-PAGE, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Bio-Rad, Hercules, USA). Tämän jälkeen kalvot estettiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 0,1% Tween-20: ssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Blotit tutkittiin asiaa primaaristen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa, pestiin ja tutkittiin lajispesifinen piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Cell Signaling, Beverly, USA). Parannettu kemiluminesenssidetektiolla menetelmällä (Pierce ECL Western-blottaus Substrate, Thermol, Beverly, MA, USA) käytettiin visualisoimaan blotit. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat anti-EMMPRIN, anti-MMP-2, anti-uPA, anti-katepsiini B (Santa Cruz Biotechnology, USA), ja anti-β-aktiini (Sigma-Aldrich, MO, USA).

4. EMMPRIN-2 plasmidikonstrukteja, transfektio, lentivirus tuotannon ja perustamalla stabiilisti ilmentävien solulinjojen

EMMPRIN-2 lentiviraalinen ekspressiovektorin pWPXL-EMMPRIN-2 rakennettiin korvaamalla GFP fragmentti pWPXL vektorin (Addgene plasmidi 12257 Didier Trono) kanssa, koodaavan sekvenssin EMMPRIN-2 (hakunumero NM_198589), joka monistettiin ihmisen maksan cDNA-kirjastosta käyttäen EcoRI ja BamHI, kuten kloonaus entsyymejä. Oligonukleotidit syntetisoitiin muodostamaan hehkutus shRNAs, joka kohdistaa sekvenssi EMMPRIN-2 asennosta 430-449 (5′-GTCGTCAGAACACATCAAC-3 ’) ja sekvenssi katepsiini B asennosta 670-689 (5’-GTGGCCTCTATGAATCCCA- 3 ’). Sekvenssit oligonukleotidit plasmidirakenteet on lueteltu taulukossa S2. Fragmentit kloonattiin erikseen osaksi pLVTHM vektoriin (Addgene plasmidi 12247, Didier Trono) käyttäen Mlul ja Clal-restriktiokohdat. Lentivirus- partikkeleita kerättiin 48 tunnin kuluttua kotransfektoimalla pWPXL-EMMPRIN-2 tai pLVTH-shRNA kanssa psPAX2 ja pMD2.G HEK-293T-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen). Kohdesoluja (Tca8113 ja ACCM) transdusoitiin rekombinantilla lentiviruksen plus 6 ug /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich). 2 viikon kuluttua viljelyn 37 ° C inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2 ja kosteassa ilmakehässä, kokonais-RNA ja proteiinit uutettiin ja ilmentymistä EMMPRIN-2 tai katepsiini B Lisäksi todennettiin käyttämällä western blot ja kvantitatiivinen RT- PCR [28].

5. In vitro muuttoliike ja invaasion määritykset

TranswellTM muuttoliike määrityksissä, 2 x 10

4 solut levytettiin päälle kammion kunkin insertin (BD Biosciences, NJ). Sillä invaasio määrityksissä, 1 x 10

5 solua maljattiin ylemmässä kammiossa kunkin insertin, joka oli päällystetty 150 ug matrigeelin (BD Biosciences, MA). Solut molemmissa määrityksissä trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen DMEM, ja 700-900 ui elatusainetta, joka oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia lisättiin alakammioissa kunkin kuopan. 12 tunnin kuluttua inkuboinnin 37 ° C: ssa, jäljellä oleviin soluihin ylä- kammioihin tai ylemmän limakalvoja insertit poistettiin varovasti, ja soluja, jotka olivat vaeltaneet tai tunkeutunut osaksi alakammioissa kiinnitettiin ja värjättiin väriaineella, joka sisälsi 0,1% kristalliviolettia ja 20% metanolia. Vaeltavat ja tunkeutuvat solut kuvattiin ja laskettiin käyttämällä IX71 käännettyä mikroskooppia (Olympus, Tokio, Japani). Samat kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa.

6. Soluadheesiokoe

soluadheesioanalyysin suoritettiin protokollan mukaisesti, joka oli komission aiemmin julkaistu [29]. Tässä määrityksessä 96-kuoppaisen tasapohjaisille kulttuuri levyt päällystettiin 30 ug Matrigel (BD Biosciences, MA) DMEM: ssa 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Levyt, jotka oli päällystetty 0,2% naudan seerumin albumiinia (BSA) 2 tuntia huoneen lämpötilassa, toimi negatiivisena kontrollina. Solut kerättiin käyttäen trypsiini /EDTA: lla, pestiin kahdesti PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen DMEM: iin. -Soluja (2,5 x 10

4) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Levyjä ravisteltiin 1000 rpm 30 sekunnin ajan ja pestiin kolme kertaa DMEM poistamiseksi sitoutumattomat solut. Solut, jotka jäivät kiinni levyt kvantitoitiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8) määritys (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani) mukaan valmistajan käyttöohjeiden. Vähentämisen jälkeen tausta solun sitoutumisen BSA-päällystettyihin kuoppiin, prosenttiosuus kiinnittyneet solut laskettiin jakamalla optinen tiheys adherenttien solujen, että alustavan solun tuloon. Lopuksi solut, jotka oli kiinnitetty ja värjättiin väriaineella, joka sisälsi 0,1% kristalliviolettia, ja 20% metanolia oli kuvattu käyttäen IX71 käännettyä mikroskooppia (Olympus). Kaikki tarttuvuus kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin vähintään kolme kertaa.

7. Hiiri malleja in vivo analyysejä etäpesäkkeiden

in vivo

analyysit metastaattisen kapasiteetin solulinjoista, kukin nude mouse (kymmenen per ryhmä, BALB /c-nu /nu ) oli hännän laskimoon injektoitiin 1 x 10

6 Tca8113 soluista jotka ilmentävät pysyvästi EMMPRIN-2 tai Tca8113 soluissa, jotka ilmentävät tyhjän vektorin. Hiiret tapettiin 6 viikkoa, ja keuhkot leikattiin, kiinnitettiin fosfaattipuskuroidussa neutraali formaliiniin ja parafiiniin upotettu. Metastaasipesäkkeiden keuhkoissa laskettiin mikroskooppisesti H 0,05 asetettiin tasolle tilastollista merkitystä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 17.0.

Tulokset

1. EMMPRIN-2 yliekspressoituu pään ja kaulan alueen syöpä ja liittyy pään ja kaulan alueen syöpä etäpesäkkeiden

Vaikka muuttunutta ilmentymistä eri EMMPRIN isoformeja on ollut mukana sen rooli HNC tuumorigeneesiprosessin yksittäisiä kommentteja eri EMMPRIN isoformit aloittamiseen ja etenemisessä HNC jäävät epäselviksi. Edelleen selvittämiseksi roolit EMMPRIN isoformien HNC, tutkimme ilmaisun eri EMMPRIN isomuotojen HNC kudoksissa ja solulinjoissa. Ilmaisu Kaikkien 4 EMMPRIN isomuodot tutkittiin ensin 12 tapauksessa suusyövän kudoksiin käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikaista PCR. Vaikka EMMPRIN isoformit 1, 2 ja 4 oli suhteellisen runsas ilmentyminen, EMMPRIN isoformi 3 oli tuskin havaittavissa testattiin suun syöpä kudoksiin (kuvio S1). Siksi meidän jatkuva tutkimus keskittyi roolit EMMPRIN isomuotojen 1, 2 ja 4 pään ja kaulan syövän etenemisessä. Ekspressio EMMPRIN isoformit 1, 2 ja 4 analysoitiin edelleen 51 HNC kasvaimia ja niiden vastaaviin normaaleihin suun kudoksiin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR: llä. Kuten kuviossa 1A on esitetty, EMMPRIN-2 ja EMMPRIN-4 näytti olevan pääasiassa isoformeja, jotka oli ilmaistu pään ja kaulan kudosten, kun taas EMMPRIN-1 näytetään vain hyvin alhainen ilmaisun. Havaitsimme, että EMMPRIN-2 oli ainoa EMMPRIN isoformi, jossa mRNA: n ilmentymisen tasot lisääntyivät merkitsevästi kasvainten verrattuna sovitettu viereisen ei-syöpä kudoksiin (Fig. 1A). Arvioitu 2-kertainen nousu (C /A, 1,90) keskimäärin EMMPRIN-2 ekspressiotasot havaittiin kasvaimen kudoksissa yli viereisen normaalia valvontaa. Ei merkittäviä eroja EMMPRIN-1 ja EMMPRIN-4-mRNA: n ekspression välillä havaittiin kasvaimia ja viereisen ei-syöpä kudoksiin (Fig. 1A).

(A) EMMPRIN mRNA: n ekspression 51 pään ja kaulan alueen syöpä kudoksiin ja viereisen ei-syöpä kudoksia analysoitiin käyttäen qPCR. EMMPRIN-2 mRNA: n ekspression pään ja kaulan kasvainten kudokset on korkeampi kuin viereisillä ei-syöpä kudoksiin (

p

0,01). Mitään merkittäviä eroja ei havaittu EMMPRIN-1 ja EMMPRIN-4-mRNA: n ekspression välillä kasvainkudoksissa ja viereisen ei-syöpä kudoksiin (

p

0,05). (B) vertailu EMMPRIN-2 mRNA ilmaisun välillä 26 tapausta etäispesäkekasval- ja 25 tapausta kasvaimet ilman mitään merkkiä paikallisten ja kaukaisten etäpesäkkeitä. EMMPRIN-2 mRNA: n ekspressio lisääntyi merkitsevästi metastasoitunut pään ja kaulan alueen syöpä kudoksiin verrattuna ei-metastasoitunut pään ja kaulan alueen syöpä kudoksiin (

p

0,05). (C) qPCR havaitseminen EMMPRIN mRNA: n ekspression pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja. (D) havaitseminen EMMPRIN ilmaisun pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja käyttäen Western blot. Korkea koodaaman proteiinin EMMPRIN-2-geenin havaittiin kaikissa 4 syöpäsolulinjoja.

edelleen määrittää yhteydestä EMMPRIN-2: n ilmentymisen ja etenemisen ja etäpesäkkeiden HNC, me verrattuna EMMPRIN-2 mRNA: n ekspression 26 tapauksessa etäispesäkekasval- ja 25 tapausta kasvaimet ilman mitään merkkiä paikallisten ja kaukainen etäpesäke. Vaikka marginaalisesti EMMPRIN-2: n ilmentymisen havaittiin kasvainten verrattuna viereiseen normaaliin kudoksissa potilailla, joilla on ei-etäpesäkkeitä (Fig. 1 B), jotka on merkitty erot EMMPRIN-2: n ilmentymisen havaittiin välillä kasvaimia ja normaalin valvonnan kudoksissa potilailla, joilla on metastaattinen kasvaimet (Fig. 1 B). Lisäksi EMMPRIN-2: n ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi etäpesäkkeitä kuin muilla etäpesäkkeitä (Fig. 1 B). Mitään merkittäviä eroja sukupuolten tai iän metastasoituneen ja ei-etäpesäkkeitä todettiin.

havainnot HNC kudoksista lisävahvistusta analyysien suoritettiin HNSCC solulinjoissa (ACCM, Tca8113, TSCCA ja SCC25). EMMPRIN-2 ja EMMPRIN-4 olivat tärkeimmät isoformit, jotka ilmaistiin kaikki 4 solulinjoissa, ja suhteellinen ekspressiotasot EMMPRIN-2 oli paljon suurempi syöpäsolulinjoissa (vaihteluväli 0,05-0,15, Fig. 1 C) kuin ei-syöpä HNC kudoksiin (joka oli keskimäärin noin 0,01, Fig. 1A). Korkeita proteiini, joka oli koodaa EMMPRIN-2-geenin havaittiin myös kaikissa 4 syöpäsolulinjoissa käyttämällä western blot (Fig. 1 D).

2. EMMPRIN-2 edistää pään ja kaulan syöpäsoluinvaasiota, muuttoliike, ja tarttuvuus in vitro, ja etäpesäkkeitä in vivo

määrittämiseksi toiminnallinen roolit EMMPRIN-2 yli-ilmentymisen hyökkäyksen, migraation ja adheesion HNC solujen olemme kokeellisesti yli-ilmentynyt ja alassäädetty EMMPRIN-2 ilmaisua käyttäen eksogeenisen EMMPRIN-2 ekspressiovektoriin ja siRNA (siEMMPRIN-2) pään ja kaulan solulinjoissa, ACCM ja Tca8113. Kuten kuviossa 2 on esitetty, parannettu ekspressio EMMPRIN-2 edisti pään ja kaulan syöpäsoluinvaasiota, adheesion ja siirroille sekä ACCM ja Tca8113 solulinjat. Sen sijaan, kokeellinen alas-säätely EMMPRIN-2 käyttäen siRNA heikennetty soluinvaasiota, migraation ja adheesion testatussa solulinjoissa (kuviot. 2A, B ja C).

Eksogeeninen yli-ilmentymisen EMMPRIN-2 käyttäen lauseketta rakentaa parannettu pään ja kaulan syöpäsoluinvaasiota (A), muuttoliike (B) ja tarttuvuus (C), kun taas alas-säätely EMMPRIN-2 käyttäen siRNA (siEMMPRIN-2) tukahdutetaan pään ja kaulan syöpäsoluinvaasiota (A), muuttoliike ( B) ja tarttuvuus (C). Erot soluinvaasiota, migraation ja adheesion välillä rakennet- tai siRNA-transfektoiduissa ryhmät ja mock kontrollit olivat tilastollisesti merkitseviä (

p

0,05). Vaikutukset EMMPRIN-2 ilme kasvaimen etäpesäkkeitä in vivo tutkittiin tarkemmin paljaisiin hiiren malleissa. (D) Tca8113 pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoissa pysyvästi ilmensivät EMMPRIN-2 tai mock-ohjaus vektori injektoitiin suonensisäisesti nude-hiiriin. Etäispesäkkeitä keuhkoihin nude-hiirten laskettiin viikolla 6 injektion jälkeen. Keskimäärin metastaasipesäkkeiden keuhkot hiiristä kanssa EMMPRIN-2 ilmentävät solut oli 28,4 verrattuna 6,4 keuhkot hiiristä injektoitu soluja varustettujen kontrollivektorille (

p

0,01).

edelleen laajentaneet in vitro huomautuksissa vaikutusten tutkimiseksi EMMPRIN-2 HNC solujen etäpesäkkeitä in vivo. Tca8113 solut stabiilisti yli-ilmentävät EMMPRIN-2 tai kontrollivektorilla injektoitiin suonensisäisesti nude-hiiriin häntälaskimon kautta. Hiiret tapettiin 6 viikkoa injektioiden jälkeen ja keuhkot leikattiin, kiinnitettiin fosfaattipuskuroidussa neutraali formaliini ja parafiiniin upotettu. Etäispesäkkeitä keuhkoihin nude-hiirten laskettiin mikroskooppisesti H 0,05). (B) mRNA: n ekspressio havainnot varmistettiin analysoimalla proteiinin ilmentymisen käyttäen western blot. (C) havaitseminen ekstrasellulaarisen MMP-2, katepsiini B ja uPA ELISA. MMP-2, katepsiini B ja uPA erittymistä elatusaineeseen lisättiin soluissa, jotka oli transfektoitu EMMPRIN-2-ekspressiovektoriin, kun eritys väheni EMMPRIN-2 siRNA transfektoiduissa soluissa (

p

0,05). (D) analyysi solunulkoisen MMP-2: n aktiivisuuden käyttämällä gelatiinitsymografialla määrityksessä. Ekstrasellulaarinen MMP-2-aktiivisuus lisääntyi, kun EMMPRIN-2 ekspressio oli lisääntynyt, kun taas MMP-2-aktiivisuus vähentää, kun EMMPRIN-2: n ilmentymisen pudotus.

Lisäksi tutkimme solun- kaikki kolme proteiinia ELISA. Solunulkoista MMP-2, uPA ja katepsiini B soluviljelyalustassa korotettiin EMMPRIN-2 ekspressiovektorin transfektio ja pieneni EMMPRIN-2 siRNA-transfektiolla sekä ACCM ja Tca8113 solut (Fig. 3C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että EMMPRIN-2 edistää erityisesti solunulkoisen erityksen, pikemminkin kuin ilmaus, uPA, MMP-2 ja katepsiini B pään ja kaulan syövän soluissa. Vaikutukset EMMPRIN-2 MMP-2 solunulkoinen eritys oli edelleen todentaa käyttäen gelatiinitsymografialla määritystä. Kuten on esitetty kuviossa 3D, solunulkoinen MMP-2 lisääntyi sekä ACCM ja Tca8113 soluja, jotka oli transfektoitu EMMPRIN-2-ekspressiovektoriin, kun taas solunulkoinen MMP-2: n aktiivisuus vähenee solulinjoissa, jotka oli transfektoitu EMMPRIN-2 siRNA (Fig. 3d).

4. Katepsiini B on tärkeä välittäjä vaikutuksista EMMPRIN-2 hyökkäystä, migraation ja adheesion pään ja kaulan syöpäsolut

määrittämiseksi toiminnallista roolia katepsiini B EMMPRIN-2-aiheuttama invaasio, muuttoliike ja tarttuvuus, me alassäädetty katepsiini B ilmentymistä Tca8113 soluissa yli-ilmentävät EMMPRIN-2 käyttäen katepsiini B siRNA. Hoito Katepsiini B siRNA aiheutti alennettava katepsiini B mRNA ja proteiini tasoilla sekä vanhempien ja EMMPRIN-2 yliekspressoivia Tca8113 soluja, kun taas EMMPRIN-2 ja MMP-2 ei vaikuttanut katepsiini B transfektiolla (kuviot. 4A ja B). Ekstrasellulaarinen eritys katepsiini B vähensi myös siRNA käsittely Tca8113 soluissa, sekä läsnä ollessa ja puuttuessa EMMPRIN-2 yli-ilmentymisen (Fig. 4C). Kuten havaittiin kokeissa Edellä esitettyjen Tca8113 solut yli-ilmentävät EMMPRIN-2 näkyy lisääntynyt solujen invaasiota, migraation ja adheesion verrattuna vanhempien Tca8113 soluja (kuvio 4D). Sen sijaan, alas-säätely katepsiini B käyttämällä siRNA merkittävästi estivät hyökkäyksen, migraation ja adheesion Tca8113 solujen yli-ilmentävät EMMPRIN-2 (Fig. 4D), syyllistämättä toiminnallinen merkitys katepsiini B EMMPRIN-2-välitteisen signaloinnin kasvaimen invaasio ja etäpesäke.

(A) Käsittely katepsiini B siRNA aiheutti alennettava katepsiini B mRNA-tasojen sekä EMMPRIN-2 yliekspressoivassa ja vanhempien Tca8113 solut (

p

0,05), kun taas EMMPRIN -2 ja MMP-2 ei vaikuttanut katepsiini B siRNA transfektiolla (

p

0,05). (B) Vaikutukset katepsiini B, EMMPRIN-2: n ja MMP-2: n ilmentymisen jälkeen, katepsiini B siRNA-transfektiolla EMMPRIN-2 yliekspressoivassa ja vanhempien Tca8113 solut edelleen vahvisti käyttäen western blot-analyysit. (C) solunulkoiset eritys katepsiini B vähensi myös siRNA käsittely Tca8113 soluissa sekä läsnä ja poissa ollessa EMMPRIN-2 yli-ilmentymisen (

p

0,05). (D) Kuten havaittu kokeissa edellä, Tca8113 solut yli-ilmentävät EMMPRIN-2 näytetä lisääntynyt solujen invaasiota, migraation ja adheesion verrattuna vanhempien Tca8113 soluihin. Sen sijaan, alas-säätely katepsiini B käyttämällä siRNA merkittävästi estivät hyökkäyksen, migraation ja adheesion Tca8113 solujen yli-ilmentävät EMMPRIN-2.

Keskustelu

Huolimatta edistyksestä, jota on saavutettu hoidossa paikallisesti levinneen pään ja kaulan alueen syöpä, ennuste on edelleen synkkä, ja 5 vuoden pysyvyys ei ylitä 40% [34]. Paikallisen uusiutumisen ja etäpesäke ovat vastuussa useimpien kuolemista johtuu pään ja kaulan alueen syöpä.