Krooninen sairaus

tiivistelmä

leviäminen eturauhasen syöpäsolujen luuytimen mikroympäristön ja kastraatio kestävä kasvu ovat keskeisiä askeleita taudin etenemistä ja merkittävät lähteet sairastuvuutta. Kuitenkin biologinen merkitys mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) ja luuytimestä peräisin solunulkoisen matriisin (BM-ECM) tässä prosessissa ei täysin ymmärretä. Siksi perustanut

in vitro

suunnitellut luuydinkudokseen mallin, johon sisältyy hMSC ja BM-ECM helpottamiseksi mekaaniset tutkimukset eturauhassyövän solujen selviytymistä androgeeni-tyhjennetty kasvualusta vastauksena parakriiniseen tekijöitä ja BM-ECM. hMSC-johdettu paracrine tekijöiden lisääntynyt LNCaP solujen eloonjäämistä, mikä oli osittain johtuvan IGFR ja IL6 signalointi. Lisäksi BM-ECM kasvoi LNCaP ja MDA-PCa-2b solujen selviytymistä androgeeni-köyhdytettyä olosuhteissa, ja aiheuttama chemoresistance ja morfologisia muutoksia LNCaPs. Määrittää vaikutus BM-ECM solun signalointi, fosforylaatiota tilan 46 kinaasien tutkittiin. Kohonneita fosforylaation MAPK-reitin liittyviä proteiineja sekä jatkuva Akt fosforylaation havaittiin BM-ECM kulttuureissa verrattuna viljelmiä kasvatetaan plasmakäsitelty polystyreeniä. Blocking MEK1 /2 tai PI3K polku johti huomattavaan vähenemiseen LNCaP selviytyminen viljeltynä BM-ECM androgeeni-köyhdytettyä olosuhteissa. Kliinistä merkitystä Näiden havaintojen määritettiin analysoimalla Erk fosforylaatio ihmisen luun metastaattisen eturauhassyövän vs. ei-metastaattinen eturauhassyöpä, ja fosforylaatio lisääntyy nähtiin metastaattisen näytteissä. Ohessa kuvataan muokattua luuytimen malli, joka ottaa monia ominaisuuksia potilailla ja tarjoaa alustan mekanistinen

in vitro

tutkimuksissa.

Citation: Lescarbeau RM, Seib FP, Prewitz M, Werner C Kaplan DL (2012) In vitro malli etäpesäke luuydinrekisteri sovittelee Eturauhassyöpä kastraatio Kestää kasvua paracrine ja soluväliaineen tekijät. PLoS ONE 7 (8): e40372. doi: 10,1371 /journal.pone.0040372

Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 7 kesäkuu 2012; Julkaistu: 01 elokuu 2012

Copyright: © Lescarbeau et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health avustuksen P41 EB002520-05 (Tissue Engineering Resource Center) (DL Kaplan). FP Seib tukee Mildred Scheel tutkijatohtorin Saksan Cancer Aid. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

luuytimen mikroympäristön tarjoaa monia vihjeitä, jotka mahdollistavat selviytymistä ja lisääntymistä eturauhasen syöpäsoluja. Se on vakiinnuttanut, että erityisesti, osteoblastien erittyy tekijät mahdollistavat androgeeniriippumattomaksi kasvua metastasized eturauhassyöpäsolujen [1], [2]. Lisäksi, luuytimestä peräisin solunulkoisen matriisin (BM-ECM) on osallisena etenemisen muiden syöpien, mukaan lukien multippeli myelooma, aktivaation kautta reitit, jotka liittyvät selviytymisen [3].

Koska merkittäviä tropismista eturauhassyövän luuytimen, lukuisat

in vivo

on kehitetty tutkia tätä vuorovaikutusta. Näitä ovat ksenografti hiiri malleja, joissa syövän solut injektoidaan intratibially [4], humanisoitu hiiren malleja, joissa ihmisen luusta on sijoitettu ihon alle ja sen jälkeen ympättiin eturauhasen syöpäsolujen, subkutaanista implantaatiota kudosmuokkaustuotteille luun [5], ja ontot kuidut, jotka sisältävät sekä eturauhasen syöpä ja luun kuten solut [6]. Nämä

in vivo

malleja ovat kuitenkin alhaiset läpäisyä ja mahdollisesti kärsivät vierassyntyinen vuorovaikutusta. Ratkaista joitakin näistä rajoituksista, ja sallia parannettu mekanistinen ja tehoseulonnan tutkimuksia, tutkijat käyttävät

in vitro

soluviljelymalleissa. Vasta viime aikoina on tavanomainen plasmakäsitellä polystyreeniä (PTP) kudosviljelmässä ware korvattu viljelysubstraatille lähemmin matkivat

in vivo

kasvain microenvironment. Näihin ovat kuuluneet malleja tutkimalla paracrine vuorovaikutusta ja, viime aikoina, ECM vuorovaikutukset [7], [8], [9]. Kuitenkaan mikään näistä tutkimuksista ovat käyttäneet suunniteltu luuydinkudokseen malli yhdistettynä androgeenien tyhjennetty kasvualusta mallintaa kastraatio kestävä eturauhassyövän etenemisen

in vitro.

kasvua ja selviytymistä eturauhassyöpäsolujen androgeenien köyhdytettyä olosuhteissa syyksi on erilaisia ​​mekanismeja. Ylössäätöä androgeenireseptorin mahdollistaa lisääntynyt herkkyys, mutaatiot mahdollistavat lisääntynyt promiscuity muihin ligandeihin, sekä intracrine synteesi androgeenista eturauhasen syöpäsolujen edistää androgeeniriippumattomaksi kasvua [10]. Muita menetelmiä androgeenireseptorin riippumattomaan kasvuun kuuluu aktivoinnin mitogeenisen reittejä ja transkriptiotekijöiden, kuten MAPK, PI3K, STAT3 ja β-kateniinin [11], [12]. Aktivointi näistä reiteistä mahdollistaa androgeenista riippumattomaan kasvuun tai solujen selviytymistä yhteistyön avulla aktivoitumisen androgeenireseptorin.

Edellinen

in vitro

tutkimukset ehdotti, että yksittäinen ECM komponentit voivat toimia ligandeina aiheuttavan mitogeenisesta solusignalointia ja selviytymistä. Esimerkiksi, fibronektiini, joka on osa BM-ECM, indusoi MEK-fosforylaation kautta FAK: n ja Src [13]. Vastaavasti, integriinin β1 ja IGF-1 R vuorovaikutus fibronektiinin välittämien chemoresistance eturauhasen syövän solulinja DU145 [14]. Nämä tutkimukset osoittavat mahdollista roolia BM-ECM-ligandit aktivoivat reitit liittyy androgeenista riippumattomaan kasvuun ja taudin etenemiseen.

Co-Ihmisen mesenkymaaliset kantasolut (hMSC) ja eturauhassyövän solut sallii paracrine signalointi, indusoi Osteogenesis, ja tukee eturauhassyöpä selviytymisen. For paneelit A, B, C raaka-arvot normalisoitiin negatiiviseen kontrolliryhmään. (A) hMSC hoidettiin normaalin kasvualustojen, LNCaP väliaine, PC3 elatusaineesta tai osteogeeninen media 14 päivää. Ne värjättiin sitten alitsariinipunaisella joka sen jälkeen uutetaan ja määrällisesti määrittää kalsiumin saostumista. (B) qRT-PCR määritetyn selostukset. Kukin ryhmä viljeltiin, kuten on kuvattu (A), ja RNA uutetaan sen jälkeen. (C) Epäsuora co-viljelmiä hMSC kanssa LNCaPs androgeenien poistetaan median läsnäollessa IGFR estäjän AG1024, tai IL6 inhibiittorit, AG490 ja anti-IL6 mAb. Solut levytettiin elatusaineeseen annettiin toipua 24 tuntia, ja sen jälkeen kytketään androgen köyhdytettyä alusta plus inhibiittori. LNCaP elinkelpoisuus mitattiin 7 päivän jälkeen. (D) IL6 pitoisuudet conditioned viljelyalustassa. (E) IGF-1-pitoisuudet elatusaineessa 48 tunnin kuluttua kustakin solutyypistä viljeltiin yksinään. (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, n = 3, ± SEM).

Bone luuytimestä johdettujen solunulkoisen matriisin (BM-ECM) suojaa eturauhassyövän soluja vastaan ​​androgeenireseptorin ehtyminen ja kemoterapiaa. For paneelit A, B, C raaka-arvot normalisoitiin negatiiviseen kontrolliryhmään. (A) kasvu LNCaP ajan viljellään androgeenireseptorin tyhjennetty kasvualusta mitattuna kautta MTT. Yhtä suuret määrät LNCaPs ympättiin BM-ECM tai PTP jossa n on 4 per ryhmä aikapistettä kohti, ja määritettiin asianmukaisesta päivänä. (B) MDA-PCa-2bs maljattiin ja kytketään androgen poistetaan mediaa, kuten on kuvattu (A) ja solujen elinkelpoisuus määritettiin sen jälkeen, kun 4 päivää. MDA-PCa-2bs soluja viljeltiin myös kaupallisilla ECM. (C) Cell elinkelpoisuus LNCaP 72 tunnin kuluttua kasvatusliuoksessa 25 nM doketakselin. (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, n = 3, paitsi mitä kohdassa (A), ± SEM).

Luuydinperäiset soluväliaineen (BM-ECM) indusoi klusterin kuten kasvua LNCaPs joka vastustaa androgeenien ehtyminen. LNCaPs ympättiin BM-ECM ja PTP yksityiskohtaisena kuviossa 2A. Pyyhkäisyelektronimikrografeja 7 päivää kulttuurien (A) normaali kasvualustojen ja (B) androgen tyhjennetty kasvualusta. (C) Suurempi suurennos pyyhkäisyelektronimikrovalokuva LNCaP (musta tähti) soluja viljeltiin BM-ECM (valkoinen tähdellä). (D) kehämäisyys LNCaPs on PTP androgeenien tyhjentynyt ja kasvualustaa ja LNCaPs BM-ECM androgeenien tyhjennetty kasvualusta kvantifioitiin alkaen pyyhkäisyelektronimikroskoopilla kuvat 7 päivän jälkeen viljelmässä (* P 0,05; ** P 0,01; * ** P 0,001, ± SEM).

Expression of a vp 3-integriinin LNCaP-solut välittää tarttumista luuytimestä peräisin solunulkoisen matriisin (BM-ECM). (A) ilmentyminen solun pinnalla avp3-integriinin mitattuna virtaussytometrialla. (B) Anti-a vp 3-integriinin vasta-aine vähensi soluadheesiota BM-ECM. Raaka-arvot normalisoitiin kontrolli-lgG-ryhmän. (N = 3, * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, ± SEM).

Differential fosfo-proteomiikka LNCaP-soluja viljeltiin luuytimestä peräisin solunulkoisen matriisi (BM-ECM). (A) Hierarkkinen ryhmittely paljastaa LNCaPs BM-ECM androgeenien tyhjennetty kasvualusta ryhmittyneet läheisimmin kanssa LNCaPs viljelty PTP kasvatusväliaineessa (B) Differential fosforylaatio LNCaPs BM-ECM androgeenien tyhjennetty kasvualusta versus LNCaPs on PTP androgeeni tyhjennetty kasvualusta. (C) Differential fosforylaatio LNCaPs on PTP androgeenien tyhjennetty kasvualusta versus LNCaPs on PTP kasvatusväliaineessa. (D) Differential fosforylaatio LNCaPs BM-ECM androgeenien tyhjennetty kasvualusta versus LNCaPs on PTP kasvatusväliaineessa.

Luuytimen johdettujen soluväliaineen (BM-ECM) indusoi differentiaalisen signaloinnin LNCaP-soluissa, jotka välittää solujen eloonjäämistä. Kuva paneelit C, D, E raaka arvot normalisoitiin negatiiviseen kontrolliryhmään. (A) Western blot of LNCaPs osoittaa lisääntynyt fosfo-Erk1 /2 ja fosfo-p90RSK vastauksena BM-ECM. (B) vaikutus PI3K, LY294002, tai MEK1 /2, U0126, estäjien LNCaPs viljelty BM-ECM. Solut maljattiin tasaisin tiheyksiä BM-ECM tai PTP elatusaineessa ja sen jälkeen 24 h kytketään androgen tyhjennetty kasvualusta ± estäjiä. Solujen elinkelpoisuus mitattiin 7 päivää (n = 3). (C) Suhteellinen apoptoosin mitattuna käyttämällä glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin määrityksessä 72 tunnin kuluttua. Kirkas palkki osoittaa kasvualustojen, mustat palkit androgen tyhjennetty kasvualusta. Hajotetut solut ovat positiivinen kontrolli (n = 8). (D) LNCaPs viljeltiin PTP välillisesti hMSC, BM-ECM, tai molemmissa olosuhteissa samanaikaisesti kun androgeenien tyhjennetty kasvualusta. Suhteellinen solujen elävyys mitattiin 7 päivän jälkeen (n = 3, paitsi mitä kohdassa (D), * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, ± SEM). (E) Vähennykset fosfo-Erk1 /2 LNCaP-soluissa BM-ECM hoidetuilla U0126 ja LY294002.

Värjäys Erk fosforylaatio kudos microarray peräisin primäärikasvain näytteistä, ja luun metastaattisen näytteitä (A) edustaja kudosleikkeiden värjätty p-Erk alkutuotannosta eturauhaskasvainnäytteissä. Näyte VI sisälsi ainoa merkittävä positiivista värjäytymistä perusterveydenhuollossa eturauhasessa. (B) Tissue leikkeet oli värjätty p-Erk luusta metastaattinen eturauhassyöpänäytteissä (asteikko palkit ovat 200 pm).

keskimääräinen arvo piirretään kullekin ryhmälle otetaan kahdesta sokkoutetuilla tutkijat (musta ympyrä). Värjäys luun etäpesäkkeiden kohdissa on merkitsevä sekä normaalia kudosta ja primaarisen kasvaimen kohdat (n = 8 normaalin eturauhasen kudosta, n = 72 primaarikasvaimen, ja n = 4 luuetäpesäkkeitä, *** P 0,001, ± std. Dev. ).

Tässä esitettävä

in vitro

alustan, joka mahdollistaa tehokkaan ja tarkan tutkimisen luuytimen kasvain mikroympäristön kanssa keskitytään erityisesti BM-ECM. Käytimme tätä järjestelmää tutkia vaste eturauhasen syöpäsolujen ja pystyivät indentify lukuisia tekijöitä, jotka vaikuttivat taudin etenemiseen lukien androgeeniriippumattomaksi kasvua ja chemoresistance. Tunnistetut tekijöitä olivat IGF1 ja IL6 paracrine signalointi, ja aktivointi MAPK-reitin kautta BM-ECM signalointi.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja BM-ECM alustan

LNCaP, PC3 ja MDA-PCa-2b-solut äskettäin hankittiin ATCC (Manassas, VA), joka vahvistaa solulinjoja käyttämällä STR analyysiä. Koko luuydinaspiraatit saatiin Lonza (Basel, Sveitsi), ja hMSC: t eristettiin ja karakterisoitiin yksityiskohtaisesti muualla [15]. Eristämisen jälkeen, hMSC: t viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% penisilliini streptomysiiniä, 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja, ja 1 ng /ml emäksistä fibroblastikasvutekijää. LNCaP ja PC3-soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, ja 1% penisilliiniä streptomysiiniä. Vaikka MDA-PCa-2b-soluja kasvatettiin BRFF-HPC1 väliaineessa (Athena ES, Baltimore, MD), johon oli lisätty 20% FBS: ää, jossa ei ole penisilliini streptomysiiniä. For tutkimuksia androgen tyhjennetty kasvualusta, fenolipunaista vapaata emästä mediaa käytettiin 10% hiilellä käsiteltyä FBS: aa. Epäsuora co-viljelmiä käytettiin 1 um huokoskoko transwell insertit (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), jossa yhden solun tyyppi ympätty annetun kudosviljelymaljalla ja toinen soluviljelyinsertissä. Epäsuora yhdessä viljelemisen tutkimuksissa käytettiin 1:01 suhde median kahdesta solutyypeistä kohteisiin. Androgeenien köyhdytettyä tutkimuksissa sekä mediatyyppejä valmistettiin edellä kuvatulla tavalla. Soluviljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Luuytimestä peräisin ECM synnytettiin yksityiskohtaisesti muualla [16]. Ellei toisin mainita kaikki soluviljelmäreagenssit hankittu Invitrogen (Carlsbad, CA).

Androgeenien köyhdytettyä kasvua tutkimukset

androgen riippumaton kasvu /eloonjäämisen tutkimukset, eturauhassyövän solut ympättiin 5000 solua /cm

2 kasvatusväliaineessa joko PTP tai BM-ECM. Tutkimukset, mukaan lukien MDA-PCa-2b-solut, PTP-ohjaus levyt on myös päällystetty ensin oma solujen kiinnittymistä matriisi, joka sisältää fibronektiiniä, kollageeni ja albumiini (Athena ES, Baltimore, MD) helpottaa solun tarttumisen. Solujen annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan, minkä jälkeen viljelmät pestiin PBS: llä, ja kytketään androgen tyhjennetty kasvualusta. LNCaP-solujen BM-ECM tai PTP testattiin kuten alla on kuvattu niiden vastaavien ajankohtina loppuun kasvukäyrän tai median korvattiin. MDA-PCa-2b-soluja viljelmässä 4 päivää, Kasvualusta vaihdettiin 2 päivää, ja solujen suhteellinen määrä arvioitiin kautta 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT, Invitrogen ) lopussa viljelmän jälkeistä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Voimassaolo MTT-määritystä varmistettiin vertaamalla manuaaliseen laskenta ja DNA: n kvantifiointiin (Fig. S1A, S1B). MTT-arvot normalisoitiin negatiiviseen kontrolliin, joka oli mielivaltaisesti asetettu arvoon yksi.

integriini estää kokeen

Suspended LNCaP-soluja esi-inkuboitiin estävän monoklonaalinen vasta-aine a vp 3 (20 ug /ml), klooni 23C6 (eBioscience, San Diego, CA), tai IgG isotyyppikontrollilla 30 minuuttia ja sitten ympätään BM-ECM. 12 tunnin kuluttua, alusta imettiin pois ja solut pestiin kerran PBS: llä. Suhteellinen solujen määrä mitattiin sitten käyttämällä MTT-menetelmää edellä kuvatulla tavalla.

doketakselihoidon tutkimukset

Eturauhassyöpä solut ympättiin PTP tai BM-ECM kuten edellä ja annettiin toipua 24 tuntia. Seuraavaksi solut pestiin PBS: llä ja korvataan kasvualustaan, jota oli täydennetty 25 nM doketakselin tai ajoneuvon vain. Solut altistettiin hoitoa 72 tuntia ja suhteellinen solujen elinkyky mitattiin sitten käyttämällä MTT-määritystä, joka normalisoitui kuten aikaisemmissa MTT määrityksissä.

ELISA-määritykset

Kerätä väliaine näytteitä jokaisen solutyyppi ympättiin PTP ja yhteistyön kulttuureissa käyttäviin siirtokuoppaan inserttejä kanssa hMSC on PTP ja LNCaP kylvetään inserttien. Esikäsitelty väliaine kustakin ryhmästä oli poistettu 48 tunnin välein, ja korvattiin tuoreella kasvatusliuoksella. Sekä IL6 ja IGF-1 ELISA suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden (eBioscience ja R 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001). Data edusti keskiarvona ± SEM, ellei toisin ole mainittu. Kuva kehämäisyys analyysi valmistui käyttäen ImageJ ja ehdotti kynnystämisen asetukset. Lisääntyvä arvoja kehämäisyys mittakaavassa osoittavat yhä pyöreä soluja. Proteiini microarray tiedot skannattiin kuvatiedostona ja integroitu pikselin intensiteetti kunkin kohdan mitataan ImageJ. Keskimääräinen kaksoiskappaleita otettiin, data oli keskiarvo keskitetty, ja hierarkkinen klusterointi analyysi suoritettiin. Differential proteiini fosforylaatio ryhmien välillä ilmaistiin ero kahden mittauksen jaettuna populaation keskihajonta.

Tulokset

parakriinisen vuorovaikutuksia hMSC ja LNCaPs edistää osteogeeninen hMSC: eiden erilaistumista ja androgeeniriippumattomaksi selviytyminen LNCaPs

Ymmärtääksemme paremmin paracrine välinen signalointi hMSC ja eturauhassyövän solut, käytimme epäsuoria co-viljelmistä LNCaPs ja hMSC: eitä. LNCaPs indusoivat osteogeeninen hMSC: eiden erilaistumista (Fig. 1A, 1 B), joka muistutti osteoblastien aktivoinnin usein nähty eturauhassyöpäpotilailla [20]. Lisäksi selviytymistä LNCaP hMSC yhteistyössä viljelmistä oli merkittävästi parannettu yli monotypic LNCaP kulttuureissa androgeenien tyhjennetty kasvualusta (Fig. 1 C). Kysellä näitä vaikutuksia, IL6 signalointi inhiboitui anti-IL6 monoklonaalinen vasta-aine tai AG490, pieni molekyyli estäjä Jak2 kinaasi, ylävirran aktivaattori Stat3. Nämä hoidot vähensi elinkelpoisuutta LNCaPs verrattuna estoton yhteistyötä kulttuurin ryhmä androgeenien köyhdytettyä olosuhteissa (Fig. 1 C). Toteaa, että väheneminen elinkelpoisuus, ei ollut tasolle LNCaPs viljeltiin yksinään, myös vaikutus testattiin AG1024, joka on IGFR estäjä. Tämä lääke vähensi merkitsevästi myös elinkelpoisuuden LNCaP epäsuorasti viljeltiin yhdessä hMSC. Nämä inhibiittorit yksinään eivät olleet sytotoksisia soluihin (kuvio. S2). Lopuksi, ilmaus IL6 ajan ollessa vahvistettiin ELISA hMSC: eistä elatusaineesta eri olosuhteissa (Fig. 1 D). Erityisesti hMSC joka oli etukäteen eriytetty kohti osteogeeninen linage oli johdonmukaisesti korkeampia IL6 ilmaisua. Ottaen huomioon LNCaPs aiheuttaa hMSC: eiden läpi osteogeeninen erilaistuminen, tämä voi olla lähde lisäys IL6 ligandeja tasoilla. Lisäksi, IGF-1 tasot mitattiin elatusaineessa kanssa ELISA-määrityksessä. Ei aikaa erilaisia ​​vaikutuksia nähtiin kuitenkin merkittäviä vakaan tilan vapautuminen hMSC havaittiin verrattuna PC3 ja LNCaP-soluissa (kuvio. 1 E).

BM-ECM edistää selviytymistä LNCaP-solujen androgeenireseptorin tyhjennetty kasvualusta ja chemoresistance

lisäksi liukoisten paracrine signaaleja, me arveltu, että luuytimestä kuten ECM voi olla rooli selviytymisen androgeeniriippuvaisen syöpäsolujen. Decellularized matriisi oli peräisin ECM erittämät proteiinit hMSC [16]. Viikon kuluttua kulttuurin androgeenin riistää mediassa oli kasvanut merkittävästi elävien solujen lukumäärä on BM-ECM verrattuna solujen androgeenireseptorin tyhjennetty kasvualusta on PTP (Fig. 2A). Mekanismia vaikutus varmistettiin toisella androgeeniriippuvaisissa solulinjassa, nimittäin MDA-PCa-2b-soluissa (kuvio. 2B). MDA-PCa-2b-soluja viljellään rutiinisti kaupallisesti saatavilla ECM tukea soluadheesion ja kasvua. Tämä ECM alustaan ​​ei tue kasvua MDA-PCa-2b solujen androgeenireseptorin köyhdytetyn olosuhteissa osoittaa vaikutus on spesifinen BM-ECM komponentteja tai rakenteen (Fig. 2B). Seuraavaksi tutkittiin, BM-ECM voi antaa chemoresistance käyttäen kasvualusta täydennetty doketakselin. BM-ECM viljellyt LNCaP-solut osoittivat merkittävää kasvua solujen eloonjäämistä verrattuna PTP viljelmät (Fig. 2C). Nämä tiedot osoittavat, että komponentit BM-ECM rooli määritettäessä selviytymisen vastauksena androgeenideprivaatio ja doketakselihoidon.

BM-ECM muuttaa LNCaP morfologia

Tuottaa parempi käsitys BM-ECM ja LNCaP ylikuulumisen, analysoimme solumorfologiaan pyyhkäisyelektronimikroskoopilla. LNCaPs voitiin havaita kiinnitetty ECM kuitujen ja matriisin (Fig. 3A, 3B ja 3C). LNCaP-solut viljeltiin androgeenireseptorin tyhjennetty kasvualusta oli huomattava kasvu venymän kuin määrällisesti seuraava SEM kuvantaminen 4 päivän kuluttua (Fig. 3B). Kuitenkin tämä elimellisen muutoksen estettiin saa silloin, kun soluja viljeltiin androgeenien tyhjennetty kasvualusta BM-ECM. Tässä tilassa solut näyttivät kasvavan klustereissa johtaen merkittävään kasvuun mitattiin kierron (Fig. 3d).

Esto a vp 3-integriinin rajat kiinnitys BM-ECM

Seuraavaksi pyrimme tutkia roolia avp3-integriinin monimutkainen BM-ECM kiinnitys, koska tämä integriini kompleksi on liitetty ECM kiinnitys ja sen jälkeen luuytimen etäpesäke [21]. Virtaussytometria osoitti solun pinnalla merkinnät a vp 3-integriinin (Fig. 4A). Määrittää toiminnallinen merkitys, suspendoidut solut inkuboitiin estävän vasta-aineen a vp 3-integriinin tai isotyyppikontrollilla ja solujen kiinnityksen BM-ECM mitattiin sitten. Merkittävä väheneminen soluunkiinnittymisaktiivisuutta mitattiin, mikä viittaa siihen, että a vp 3-integriinin tässä tapauksessa on rooli välittäjänä kiinnitys BM-ECM (Fig. 4B).

vaikutus BM-ECM MAPK ja PI3K signalointireitteihin

mekanismin määrittämiseksi välittäjänä vaste LNCaPs BM-ECM tutkimme suhteellinen fosforyloitumisaste 46 proteiinien useita eri reittejä pitkin käyttämällä käänteisfaasi-proteiinin microarray. Kun hierarkkinen klusterointi analyysi suoritettiin, LNCaPs BM-ECM androgeenien tyhjennetty kasvualusta ryhmittyneet parhaiten kanssa LNCaPs kasvatusväliaineessa on PTP (Fig. 5A). Differential fosforylaatio arvioitiin sitten välillä LNCaPs BM-ECM androgeenien tyhjennetty kasvualusta ja LNCaPs on PTP androgeenien tyhjennetty kasvualusta, ja lukuisia proteiineja näytti olevan erilaisesti fosforyloitu (Fig. 5B). Kuitenkin kun tutkimme myös fosforylaation eroja LNCaPs on PTP kasvatusväliaineessa versus androgen tyhjennetty kasvualusta useita proteiineja säännellään vastaavasti (Kuva. 5C).