Krooninen sairaus

tiivistelmä

uudelleenjärjestely solun tukirangan kautta aktiini remodeling on perus askel solujen liikkumisen. Vaikka solujen migraatio normaalit ja syöpäsolut voivat stimuloida erilaisia ​​sisäisen ja ulkoisen solutekijöitä, kaikki polut perimmäinen sääntelystä cofilin toimintaa. Cofilin on pieni aktiini-sitovan proteiinin kykenee sitomaan molemmat muodot aktiini, pallomainen ja hehkulamppuja, ja säätelee fosforylaatio Serine 3. Sen jälkeen fosforylaatio seriinillä 3 cofilin ei ole aktiivinen, siis voi sitoa aktiini molekyylejä ja solun tukiranka remodeling on heikentynyt. Histoni metyylitransferaasi EZH2 on usein yli ilmaistu monissa kasvaintyypeissä lukien peräsuolen syöpä (CRC). EZH2 yliaktiivisuus, mikä johtaa epigeneettisellä geenien hiljentäminen, on liittynyt monien kasvainten ominaisuuksia kuten invaasio, angiogeneesi ja etäpesäkkeiden mutta vähän tiedetään alla molekyylitason mekanismeja. Tässä me raportoimme että EZH2 pystyy valvomaan cofilin toimintaa ja näin ollen solun liikkumisen CRC solulinjojen avulla kuin perinteisen romaanin akselia, johon integriini signalointi. Todellakin, osoitamme, miten geneettiset ja farmakologinen esto (DZNep ja GSK343) sekä EZH2 toiminto tuottaa hyper fosforylaatioon cofilin ja vähentää solujen vaeltamiseen. Olemme aiemmin osoittaneet chromatin immunosaostuksella että integriini alfa 2 (ITGα2) ilmentymistä säätelee EZH2. Tässä tutkimuksessa olemme todistettava, että EZH2-vaimennettu solujen signalointi aktiivisuutta de-tukahdutettu ITGα2 pystyy lisäämään cofilin fosforylaatio, mikä puolestaan ​​vähentää solujen vaeltamiseen. Tutkimuksessa ehdotetaan myös uusia mekanismeja, jotka voisivat tarjota uusia antimetastaattisia strategioita CRC hoito perustuu estyminen epigeneettiset tekijä EZH2 ja /tai sen kohdegeenin.

Citation: Ferraro A, Boni T, Pintzas A ( 2014) EZH2 säätelee Cofilin Activity ja Colon Cancer Cell Migration by kohdistaminen ITGA2 Gene. PLoS ONE 9 (12): e115276. doi: 10,1371 /journal.pone.0115276

Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 06 elokuu 2014; Hyväksytty: 20 marraskuu 2014; Julkaistu: 30 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Ferraro et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki EU FP7 myöntää FP7-241783 EpiDiaCan AP.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Kasvain solujen vaeltamiseen on välttämätöntä metastasoituneen voimavarojen hankintaan [1], [2]. Migration osaaminen edellyttää aktivoinnin signaalipolkuja yhdentyessä aktiini polymerointi ja de-polymerointi, joka ajaa muodostumista erityisen solukalvon ulokkeita kuten lamellipodioihin, invadopodia ja filopodia. Aktiini dynamiikkaa säätelevät lukuisat aktiini-sitovia proteiineja, niiden joukossa aktiini-depolymeroimiseksi tekijä (ADF), cofilin-1 (ei-lihas tyyppi) ja cofilin-2 (lihas tyyppi) ovat ne, jotka sallivat solun liikkumisen kautta edellä kuvatun kalvon rakenteisiin [3], [4]. Koska cofilin-1 on kaikkein arjen muoto aktiini-sitovien proteiinien, esillä olevassa tutkimuksessa analysoitiin vain tämäntyyppinen, ja tässä me kutsuvat sitä cofilin. Cofilin aktivointi on tärkeä askel kasvaimen solujen vaeltamiseen [5], [6], vaikka, todennäköisesti, se on yleistä aktiivisuuden cofilin säätelevä polkuja, jotka ajavat motiliteettia syöpäsolujen [4]. Useat mekanismit cofilin asetuksen tunnetaan [3], [4]. Paras tunnettu ovat kautta fosforylaation Serine 3 (p-cofilin) ​​by LIM kinaasi 1 ja 2 (LIMK1, LIMK2) [7], kivesten proteiinikinaasi 1 ja 2 (TESK1, TESK2) [8], sekä de-fosforylaation seriinin 3 fosfataasin ritsa (SSH) ja chronophin [9], [10]. Fosforylaatio seriinillä 3 inaktivoi cofilin, estäen sen sitoutuminen tärkeimpään alustoille globular-aktiini (G-aktiini) ja hehkulamppuja-aktiini (F-aktiini) [11], kun taas de fosforylaation Serine 3 mahdollistaa substraatin sitoutumisen ja F-aktiini katkaisulaitteen . Useat viestinvälitystekniikoita ohjata cofilin tehtäviksi ja näin ollen solun muotoon ja -locomotion. Ne vaihtelevat Rho perheen pienten GTPaasit toimivat LIMKs, että integriini-välitteisen signaloinnin toimiva TESK1 /2 [12]. SSH fosfataasi voi aktivoida F-aktiini, 14-3-3 proteiineja, PKDs ja PLCβ /PI3Ky-GSK3 signalointireitistä [12].

Enhancer of Zeste Homologi 2 (EZH2) kuuluu Polycomb ryhmään perhe [13], ja se on katalyyttinen alayksikkö histoni metyylitransferaasi monimutkainen kutsutaan Polycomb Tukahduttamistoimet Complex 2 (PRC2). PRC2 sitoutuu kohdistaa geenin promoottorit epigeneettisellä tukahduttamisen kautta di- tai trimethylation histoni H3 lysiinin 27 jäännöksen (H3K27me2-3). EZH2 yli-ilmentyminen liittyy monissa aggressiivinen kasvaimissa [14], [15], huonon ennusteen [16] ja läsnäolo kaukainen etäpesäke kolorektaalisyövässä (CRC) [17]. EZH2 downregulation voi vähentää kasvua invasiivisen Rintasyövän [18], kasvaimen angiogeneesi [19] ja

in vitro

Solujen migraation /invaasion CRC solulinjojen [17].

hyvin määritelty arkkitehtuuri epiteelikudosten, kuten paksusuolen limakalvon, riippuu suurelta osin spesifisten solun pinnan adheesiomolekyylejä, kuten integriinit, jotka ovat vuorovaikutuksessa ekstrasellulaarisen matriksin (ECM) ja naapurisoluja. Nisäkkäiden genomit koodaavat 18 α- ja 8 β-integriiniä alayksiköistä, jotka yhdessä tuottavat 24 erilaista integriiniä (α-β-) heterodimeerejä ilman tarpeettomia toimintoja vaihtelevat solunulkoisia kollageenireseptoreihin signaali transduktio välittäjiä [20]. Muutokset integriinin ilmentyminen tapahtuu monissa syövän tyypit ja onko integriinit toimivat ainoastaan ​​kasvain parantajina tai tuumorisuppressoreilla keskustellaan yhä. ITGα2 muodostaa heterodimeerejä ITGβ1 -α2β1- ja vuorovaikutuksessa ECM: n kollageenikuituja [20]. On raportoitu, että integriinin α2β1 kykenee estämään solujen proliferaatiota [21] – [23], ja tukahduttaa etäpesäkkeiden hiirillä ja ihmisillä [24]. Eturauhassyövän, ITGα2 alas sääntely on ehdotettu mahdollisiksi tuumorimarkkeri [25]. Olemme äskettäin osoittaneet, että EZH2 epigeneettiseltä tukahduttaa ITGα2 ilmaisun [17]. Mielenkiintoista aikana luonnehdinta vasta perustetun EZH2-vaiennetaan solulinja (nimetty HCT-shEZ-2), merkittävä hyper-fosforylaatiota cofilin HCT-shEZ-2 verrattuna HCT116 vanhempien soluihin havaittiin.

Vaikka cofilin toiminto on kuvattu tuumorisolun biologiassa, säätelyverkkoja, jotka integroituvat epigeneettiset tekijät, vapautuminen signaalitransduktioreaktioteiden ja cofilin aktiivisuus ovat huonosti kuvattu. Tässä osoitamme, että histoni metyylitransferaasi EZH2 valvontaa cofilin fosforylaatiota, ja näin ollen solujen liikkumisen kautta uusi polku, johon ITGα2 ja sen signaali-välittävää aktiivisuutta.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Caco-2, DLD-1, HT-29, HCT116 ja RKO solulinjoja ylläpidettiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1X penisilliini, 1X streptomysiiniä, ja 2 mM L-glutamiinia. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kostutetussa ilmakehässä. Kaikkia solulinjoja käytettiin tutkimuksessa on ostettu American Type Culture Collection (ATCC). Kloonaus menettely HCT-shEZ-2 solulinja on kuvattu Ferraro et. al. [17].

Western blot ja vasta-aineet

Yhteensä proteiini uutettiin 60 ui RIPA-lyysipuskuria, ja Western-blottaus suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Blotteja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa sopivan primaarisen vasta-aineita. Vasta-aineita käytettiin: EZH2 BD Bioscience, USA koodi 612667; Milliporesta, USA H3K27me3 koodi 07-449; RAC-1 koodi 05-389; Santa Cruz, Saksa: H3 yhteensä SC-8654; Tubuliinia code sc-8035; ITGα2 code sc-74466; RhoA code sc-418; ROCK1 code sc-17794; Cdc42 code sc-87; p-cofilin (Serine 3) SC-12912-R; cofilin sc-33779; TESK1 code sc-366681 (lisäämiseksi spesifisyyden TESK1 vasta-WB määrityksissä nitroselluloosa- blotting kalvot leikattiin vaakasuunnassa välillä -60 ja -80 kDa). Proteiiniuutoksia on valmistettu vähintään kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta ja blotit toistettiin ainakin kahdesti.

Konfokaalimikroskopia

Solut käytetään immunofluoresenssi- määritykset kiinnitettiin metanoli /asetoni-liuosta (08:01), pesty, läpäiseviksi 0,3% Triton-X-100, ja blokattiin 5% BSA ennen inkubointia primääristen vasta-aineiden tai Alexa fluor 546 phalloidin (Invitrogen USA, koodi A22283). Tumat vastavärjättiin Hoechst.

estäjät ja siRNA transfektio

ROCK-1-estäjä (Y-27632 Sigma, USA koodi Y0503-1MG) käytettiin lopullisena pitoisuutena 30 uM 24 tuntia . EZH2 estäjät (3-Deazaneplanocin A (DZNep) Santa Cruz, Saksa koodi sc-351856, GSK-343 Active Biochemicals, Hong Kong-koodi A-1416) käytettiin lopullisena pitoisuutena 1, 3 ja 5 uM 48-72 tuntia . Sillä siITGα2 transfektion jälkeen solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin Lipofectamnine 2000, siEZH2_4 ja siEZH2_7 (Qiagen, Saksa koodit SI00063973, SI02665166) siITGα2 (Qiagen, Saksa koodit SI02664081, SI02664088) ja siRhoA (Dharmacon, USA code L-003860 -00-0005), on käytetty lopullisena pitoisuutena 50 uM mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

kolmiulotteisen kulttuuri

kolmiulotteisen kulttuuri Matrigel (BD, Bioscience) käytettiin . Polylysiini esipäällystettyjä peitelaseihin laitettiin 24-kuoppalevylle. Matrigel laimennettiin kylmällä täydellistä DMEM-väliaineella loppukonsentraatioon 50%, 200 ui sijoitettiin kuhunkin kuoppaan, joka sisälsi peitinlaseja ja levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa 15 ’. 0,5 x 10

3-solut laimennettiin 100 ui kylmää DMEM ja sekoitettiin 100 ui 100% Matrigel. Saatu 200 ui lisättiin kuoppiin, joissa esilämmitettyyn matrigeeliä. Levyä inkuboitiin kostutetussa atmosfäärissä 37 °: ssa, 5% CO

2 3 päivää.

Migration määrityksessä

Solut trypsinoitiin, pestiin, joka sisälsi 1% FBS: ää, ja laskettiin . 10

5 solua maljattiin ylempään kammioon 8 um huokosia TranswellTM suodatin (Corning), joka on asennettu 24-kuoppaisella alustalla, joka sisälsi 10% FBS: ia. Suodattimet esipäällystetty fibronektiinin. Solujen annettiin kulkeutua 37 ° C: ssa, 5% CO

2 36-40 tunnin ajan, kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 0,1% w /v kristalliviolettia. Alapuoli suodattimet havaittiin 40X tavoite ja vaeltavat solut määritettiin kussakin kuopassa. Kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena ja toistettiin kahdesti. Sillä migraatiokokeessa yhdistettynä siITGα2 transfektion jälkeen solut trypsinoitiin 24 tuntia transfektion jälkeen, ympättiin transwell ja inkuboitiin 37 ° C: ssa muiden 24 tuntia. Sillä migraatiokokeessa yhdistettynä ROCK1 estäjä, solut ympättiin transwell läsnä inhibiittorin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 24 tuntia.

Pallomainen (G-) ja Hehkulangan (F-) aktiini määrityksessä

80-85% konfluentteja soluja pestiin suoraan 15 cm petrimaljoille kahdesti PBS: llä huoneenlämmössä lämpötilassa, kaavittiin PBS ja pellettirehuun. Solupelletit suspendoitiin uudelleen 800 ul: aan 37 ° C: ssa lyysipuskuria (1 mM ATP: tä, 50 mM PIPES, pH 6,9, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2: a, 5 mM EGTA: a, 5% tilavuus /tilavuus glyserolia ja 0,1% tilavuus /tilavuus varten: Nonidet P-40, Tween 20, ja Triton X-100), johon on proteaasinestäjät. Solut homogenisoitiin varovasti pipetoimalla 10 kertaa ylös ja alas ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Näytteitä sentrifugoitiin 16000 g 75 minuutin ajan 22-25 ° C: ssa. Supernatantit poistettiin määritykseen G-aktiini. Pelletit, jotka sisältävät F-aktiini sekoitettiin 800 ul: aan RIPA-puskuria ja sonikoitiin jäillä 5 min (30 sec. ON /30 s OFF, maksimiteho) käyttäen Bioruptor ultrasonicator (Diagenode, Belgia) niiden liuottamiseksi. Kaksikymmentä mikrolitraa kutakin fraktiota sekoitettiin SDS-latauspuskuria, denaturoitiin 8 minuuttia 95 ° C: ssa ja ladattiin polyakryyliamidigeelillä. Aktiini havaitseminen suoritettiin käyttäen anti-aktiini monoklonaalinen vasta-aine (koodi sc-8432) ostettiin Santa Cruz, Saksa.

RNA /Käänteinen transkriptio ja Real Time PCR

Yhteensä RNA erillään viljeltyjen solujen suoritettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa). Käänteiskopiointi suoritettiin 3,0 ug puhdistettua RNA: ta käyttäen SuperScript-käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Reaaliaikainen kvantifiointi mRNA-tasolla toteutettiin 96-kuoppaisen PCR- levyt käyttäen Bio-Rad iCycler ja iQ5 monivärinen real-time PCR tunnistusjärjestelmä (Bio-Rad, Hercules CA, USA). Kukin reaktio sisälsi 1 x iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules CA, USA) ja 150 nmol /l kutakin aluketta. Kaikki geenit testattiin kolmena rinnakkaisena. Tulokset analysoitiin iCycler ohjelmisto. Arvot normalisoitiin GAPDH. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat: glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH): GAAGGTGAAGGTCGGAGT (Fw) ja CATGGGTGGAATCATATTGGAA (Rv); TESK1: GCCCTGACACACAATCAG (Fw) ja AAGAGGTCTGACCGGCTTC (Rv).

GST pull-down määritys

Rac1-GTP ja Cdc42-GTP GST avattavan määrityksessä soluja viljeltiin 10 cm petri astiat ja solulysaatteja valmistettiin hajotuspuskuria käytettiin western blottauksella. 50 ug sama proteiiniuutetta inkuboitiin GST-PAK (p21-aktivoitu kinaasi) glutationi agaroosihelmillä 1 tunti pyörittämällä 4 ° C: ssa ja helmet pestiin 4 kertaa pesupuskurilla (50 mM Tris-HCI (pH 7,4 ), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2: a, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM ditiotreitolia (DTT), 10 ug /ml aprotiniinia, 10 ug /ml leupeptiiniä ja 0,2 mM PMSF: ää).

tulokset

Cofilin fosforylaatio lisääntyy kun geneettinen hiljentämisen ja farmakologinen esto EZH2 CRC solulinjoissa

aiemmin transfektoitu HCT116 koolonkarsinoomasoluja lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) vektori, jossa varren silmukka oligonukleotidia EZH2 mRNA. Vakaa shEZH2 kloonit (HCTshEZ-2) näyttö hyvin pieni määrä EZH2 proteiinia sekä alhainen trimethylation lysiinin 27 histoni H3 (H3K27me3), The EZH2-spesifinen substraatti (Fig. 1A). Me kertoi, että HCTshEZ-2-solut osoittavat pienentää vaeltavia ja invasiivisen kapasiteetti verrattuna vanhempien ja valetransfektoidut (HCTshpSUP) HCT116-solut [17]. Tunnistaa mahdolliset tekijät, jotka saattavat ohjata solun liikkumiskyky on HCTshEZ-2-solujen, proteiinien ilmentyminen tekijöiden analysointi säätelyyn osallistuvan solun tukirangan dynamiikkaa kuten RhoA, Cdc42, ROCK1, Rac1, Cofilin ja p-cofilin (alavirtaan efektoreita Rho GTPaasi-reitti) on analysoitu western blot (WB). Kuten raportoitu kuvassa. 1B, hiljentämisen EZH2 ei vaikuttanut proteiinin ekspressiotasot yksikään analysoitiin aktiini-moduloimalla tekijät. Toisaalta, merkittävä hyper-fosforylaation Serine 3 pienen aktiini-sitovan proteiinin cofilin havaittiin (Fig. 1 B). Lisäksi HCTshEZ-2-solut hiljentäminen of EZH2 ei muuttanut GTPaasi aktiivisuutta Cdc42 ja Rac1 että arvioitiin käyttämällä GST-PAK kaatamaan määritys (S1 Kuva.). Tutkimme myös epäsuorasti mahdollinen aktivoituminen RhoA in HCTshEZ-2-soluissa. Hiljentämällä RhoA siRNA tekniikkaa huomasimme, että p-cofilin säilyi samana kaikissa solulinjoissa (HCT116, HCTshpSUP ja HCTshEZ-2). Siksi ehtyminen EZH2 ilmaisua ei vaikuttanut RhoA toimintaa ja näin ollen cofilin fosforylaatiota (S2A Fig.). Sen todistamiseksi, että havaitut hyper-fosforylaation cofilin ei ole off-tavoite vaikutus kloonausmenettelyssä, EZH2 oli ohimenevästi köyhdytetyn kahdella eri siRNA oligoja vuonna HCT116 ja RKO soluja ja 48 tunnin kuluttua tasot p-cofilin analysoitiin WB. Kuten on esitetty kuviossa. 1C HCT116 ja S2B kuvassa. for RKO, ohimenevä EZH2 hiljentäminen johti merkittävään lisääminen p-cofilin sekä ITGα2 tasot molemmissa solulinjoissa.

. Proteiinin ilmentyminen ja maailmanlaajuinen metyylitransferaasin aktiivisuus EZH2 vuonna HCT116 ja HCTshEZ-2 vakaa kloonien sekä HCTshpSUP mock ohjaus solut analysoitiin WB. B. Proteiinin ilmentymisen analyysi Rho GTPaasina perheen komponentteja ja ITGα2 in HCT116, HCTshEZ-2 ja HCTshSUP soluja. C. Ohimenevä ehtyminen EZH2 kahdella eri siRNA oligoja kasvattaa cofilin fosforylaation samalla tavalla vakaa hiljentäminen. D. faasikontrastimikroskopiaa kuvia HCT116, HCTshEZ-2 ja HCTshSUP solu-fenotyyppejä, asteikko bar 150 mikrometriä. E. Edustavia kuvia konfokaali fluoresenssimikroskoopilla vuonna HCT116 ja HCTshEZ-2-solut, joissa p-cofilin värjättiin (vihreä). Nuclei on vastavärjättiin Hoechst (sininen). Mittakaava koko 150 um. F. EZH2 proteiinitasot verrataan cofilin ja p-cofilin tasot 7 CRC solulinjoissa. Pienemmät luvut blots osoittavat bändi kvantifiointiin joka suoritettiin käyttäen ohjelmistoja ja Tubulin ilmaisun viitteenä latauskontrollina. Kaikki WB kokeita on toistettava vähintään kolme kertaa, edustava pyyhkii ja kvantitatiivinen esitetään.

vaikutus cofilin inaktivaation fenotyyppiin ja kasvun ominaisuudet HCTshEZ-2-soluissa on hyvin ilmeistä standardin kaksiulotteinen kulttuuri. Itse asiassa HCTshEZ-2-solujen määrä solukalvon ulokkeita on huono, vähemmän näkyvä ja pitkänomainen muoto ohjaus HCT116-solujen menetetään, on HCTshEZ-2-soluissa enemmän pyöreä ja litteä (Fig. 1 D). Käyttämällä konfokaalimikroskopia ja fluoresoiva immunomääritys tahra p-cofilin, me vahvisti, että aktiivinen p-cofilin lisääntyy HCTshEZ-2-soluissa verrattuna vanhempien HCT116-solut ja että p-cofilin pääasiassa tumassa on HCT116, kun taas HCTshEZ- 2-solujen p-cofilin on lokalisoitu sekä tumassa ja sytoplasmassa (Kuva. 1 E).

Voit tarkistaa, onko suhde EZH2 ja p-cofilin on yleinen ominaisuus CRC solulinjojen, analysoimme cofilin , p-cofilin ja EZH2 ekspressiotasot 7 CRC solulinjoissa. Näiden 7 CRC solulinjat edellisen vertailu EZH2 proteiinin ja maailmanlaajuisesti sen substraatin H3K27me3 osoitti, että solut yli-ilmentävät EZH2 (HCT116, RKO ja SW620) on myös läsnä korkea H3K27me3 (tietoja ei ole esitetty, katso viite [17]. ). Mielenkiintoista on, että solulinjat, joilla on korkea EZH2-proteiinin tasot ovat osoittaneet lähes huomaamaton (HCT116) tai matala (SW620 ja RKO) p-cofilin verrattuna muihin tutkittu solulinjat, lukuun ottamatta Caco-2-välituote adenooma-solulinjassa (kuvio. 1F ). Sen sijaan, tasot cofilin proteiinin (yhteensä-cofilin) ​​olivat oleellisesti samat kaikkialla 7 solulinjat tutkittu. Jotta määrittää korrelaatio EZH2 ilmaisun ja cofilin fosforylaatio kaikissa CRC solulinjoissa, lukuun ottamatta Caco2, absoluuttinen intensiteetti EZH2 WB bändejä kuvion. 1F on funktiona absoluuttinen intensiteetti p-cofilin WB bändejä käyttäen pistekaavion. Merkittävä negatiivinen korrelaatiokerroin (

R

= -0,7532) Suoran saatu data-pisteitä osoittaa, että p-cofilin tasot ovat korreloi käänteisesti suhteessa EZH2 tasolle 6 ulos 7 CRC solulinjojen ( S3 kuvassa.).

edelleen vahvistaa p-cofilin western blot tiedot ja varmista, että p-cofilin ei edistä solumigraatiota kun tumassa, HCT116, HCTsh-EZ-2, HT29 (korkein WB p-cofilin taso) ja RKO (matala WB p-cofilin taso) solulinjat analysoitiin -konfokaalimikroskoopilla co-värjäys p-cofilin G-aktiini ja erikseen koko-cofilin. Kuva. Kuviossa 2A on esitetty, että HT29-solujen p-cofilin värjäytyminen on korkea verrattuna HCT116, HCT-shEZ-2 ja RKO, vahvistaa WB tietoja. Lisäksi p-cofilin in HT29 on yksinomaan sytoplasmassa toisin HCT116, HCTshEZ-2 ja RKO solulinjoissa. Vuonna HT29, samassa sytoplasman malli havaittiin myös täydellistä-cofilin (HT29 yhdessä tasossa kuva kuvassa. 2B). Mielenkiintoista on, että HCT116, HCT-shEZ-2 ja RKO solut yhteensä cofilin pääasiassa lokalisoitu sytoplasmassa toisin p-cofilin (kuviot. 1E ja 2B). Koskee G-aktiini, co-värjäys kokeita totesi, että G-aktiini on lokalisoitu sytoplasmassa sekä tumassa kaikissa solulinjoissa. Havaitsimme, että ydin- p-cofilin harvoin kolokalisoituvat G-aktiini in HCT116 ja RKO soluja, jotka osoittavat, että p-cofilin ei pysty sitomaan G-aktiini tumassa. Lisäksi vaikka HCT-shEZ-2-solut ovat peräisin HCT116 ne osoittavat p-cofilin myös sytoplasmassa samalla HT29 tunnusomaista alhainen muuttolintujen kapasiteetti (Fig. 2A).

. HCT116, RKO, HCT-shEZ-2 ja HT29 on yhteistyössä värjätty p-cofilin (vihreä) ja G-aktiini (punainen), jotta voidaan tutkia solunsisäistä lokalisointia molemmat proteiinit. Ytimet vastavärjätään Hoechst (sininen). Sulauttaminen kaikki kolme väriä on myös esitetty (yhdistää). Mittaviivat 10 pm. B. Cofilin (vihreä) värjäytymistä CRC soluissa. Vain HT29 esitellään lähes yksinomaan sytoplasman lokalisointi kuten on esitetty yhden plane konfokaali kuva. Mittaviivat 50 pm. C. Farmakologiset keskeytyminen EZH2 proteiinin DZNep CRC solulinjoja korkea EZH2 proteiinin ilmentymisen. D. Farmakologinen inhibitio EZH2 entsyymiaktiivisuuden GSK343. Alhainen H3K27me3 hoidetuissa soluissa osoittaa, että GSK343 ​​tehokkaasti estää EZH2 aktiivisuutta. E. TESK1 proteiini (ylhäällä) ja mRNA (alhaalla) lauseke analyysejä CRC solujen korkea (HCT116 ja HCT-shpSUP) ja vaiennettu (HCTsh-EZ-2a /b) EZH2 proteiinin tasot. F. siRNA: t verrattuna ITGα2 mRNA on käytetty vähentämään ITGα2 proteiinin ilmentymisen. Vaikutukset ITGα2 hiljentämisen on cofilin ja p-cofilin analysoitiin WB. Pienemmät luvut blots osoittavat bändi kvantifiointiin joka suoritettiin käyttäen ohjelmistoja ja Tubulin ilmaisun viitteenä latauskontrollina. P-cofilin kvantifiointiin HCT116 ja HCT-shEZ-2-soluja kaikki arvot on normalisoitu suhteessa p-cofilin arvo transfektoimattomia HCT116. Kaikki WB kokeet on toistettu ainakin kaksi kertaa ja edustavat blotit on esitetty.

suhde EZH2 ja p-cofilin tutkittiin myös estämällä metyyli-transferaasin aktiivisuus EZH2 kaksi EZH2 estäjien 3 -Deazaneplanocin A (DZNep) ja GSK-343 [26], [27] solulinjoissa jossa EZH2 ilmentyy voimakkaasti: HCT116, SW620 ja RKO. DZNep hoito häiritsi EZH2 proteiinin kaikissa solulinjoissa, mikä johtaa p-cofilin lisäys vaikuttamatta koko cofilin ilmentymistä (Fig. 2C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin GSK-343 hoitoa, joka tehokkaasti estää entsymaattisen toiminnan EZH2, koska merkittävä maailmanlaajuinen väheneminen H3K27me3 merkki havaittiin käsitellyissä soluissa, vaikuttamatta EZH2 ja cofilin ekspressiotasot, vaikka cofilin fosforylaatiota (Fig. 2D).

Euroopan EZH2-kohde-geenin ITGα2 osittain valvonnan cofilin fosforylaatio /de-fosforylaatiota CRC solulinjoissa

kromatiinia immunosaostuksella (Chip) me aikaisemmin osoittaneet [17], että EZH2 hyper- metyloi lysiini 27 histoni H3 ITGα2 geenin promoottori aiheuttaa epigeneettiset geeni-tukahduttamisen (Fig. 1 B). Mielenkiintoista on, TESK1, kinaasi kykenee fosforyloimaan cofilin seriinin 3 ja siten kykenevät säätelemään sen aktiivisuutta, voi aktivoida integriini-välitteistä signalointia, [8], [28], joka ehdottaa ITGα2 reitti ehdokkaaksi lisätutkimuksia varten. De-tukahdutettu signalointi aktiivisuutta ITGα2 kautta TESK1 voi olla vastuussa, ainakin osittain, parantamiseksi p-cofilin in EZH2-vaiennetaan soluissa. Voit tarkistaa tämän hypoteesin, ensimmäinen Real-Time PCR ja WB analyysit tehtiin tarkistaa ilmentymisen TESK1 CRC solulinjassa, jota käytetään tutkimuksessa. Se on esitetty (Fig. 2E), joka TESK1 ilmennettiin HCT116-soluissa ja että hiljentäminen EZH2 ei vaikuta sen ilmaisua, koska mitään muutoksia TESK1 mRNA: ta ja proteiinia tasoja on havaittu joukossa ohjaus ja EZH2-silinced soluja. Sitten käsitellä rooli ITGα2 on cofilin reitti, pieniä häiritseviä RNA-oligot versus ITGα2 (siITGα2) käytettiin vähentämään ITGα2 ilmentymisen HCTshEZ-2 ja HCT116 kontrollisoluja. Mielenkiintoista, vähentäminen ITGα2 proteiinin taso vaikutti negatiivisesti p-cofilin pääasiassa HCTshEZ-2-solut (Fig. 2E). Vertailukelpoisia tuloksia saatiin myös sen jälkeen, kun hoidon DLD1 solujen siITGα2. DLD1 ilmentävät korkeita ITGα2 proteiinin verrattuna HCT116 (Fig. 2E) [17].

Cell hoidon EZH2 estäjien säädetty lisänäyttöä uuden ehdotetun epigeneettiset mekanismi p-cofilin sääntelyä. Kuten on esitetty kuviossa. 2C ja 2D, DZNep ja GSK-343 hoitoja tehokkaasti de-tukahdutettu ITGα2 geenin HCT116, RKO ja SW620-solut, jotka on ominaista alhainen ITGα2 ilmaisun [17]. Todellakin, EZH2 estäjä hoitoja johti merkittävä lisäys p-cofilin in HCT116 ja SW620-soluissa, ja oli vähemmän, mutta silti huomattava vaikutus p-cofilin tasoja RKO soluissa.

kolmiulotteisen solun tukirangan organisaation ja muuttoliike kyky CRC solulinjojen ohjaa cofilin fosforylaatio

morfologisia muutoksia, jotka tapahtuvat kun HCTshEZ-2-solut ympätään Matrigelillä (kolmiulotteinen kulttuuri, 3D) osoittavat, että cofilin reitti voi myös olla vastuussa tartuntaominaisuudet ratkaiseva metastasoineeseen solujen leviämistä. HCT116 ja HCTshEZ-2-soluja viljeltiin 3D on värjätty -falloidiinia joka sitoutuu F-aktiini, joka on konjugoitu fluoresoiva kemiallista yhdistettä ja analysoitiin fluoresoivalla konfokaalimikroskopialla (Fig. 3A). In HCTshEZ-2-soluissa aktiivinen p-cofilin stabiloi aktiini rakenteiden tarpeen vuorovaikutus ECM. Itse asiassa, kun 3 päivää Matrigelillä, HCTshEZ-2-solut osoittivat litteä solu-elin, selvästi näkyvissä ytimet ja, mikä tärkeintä, yhden yksisolukerros hyvin näkyvissä aktiinifilamenttien (nuolet kuviossa. 3A). Sen sijaan, HCT116-solut eivät osoittaneet korkeita F-aktiini ja solut kykenivät kasvamaan kasvaimeen alalla.

. F-aktiini värjättiin phalloin konjugoitu fluorofori (punainen) in HCT116 ja HCTshEZ-2 soluja viljeltiin matrigeeliä. Edustavia faasikontrastimikroskopiaa kuvia saman viljelmät on esitetty myös kunkin solulinjan. Nuolet osoittavat pitkään F-aktiini molekyylejä. Mittakaava 20 um. B. Analyysi suhteellisen määrän F- ja G-aktiini in CRC solujen korkea (HCT116 ja HCT-shpSUP) ja vaiennettu (HCTsh-EZ-2a /b) EZH2 proteiinin tasot. Intensiteetti WB bändejä on määrällisesti ja lasketaan mielivaltaisina yksikköinä. Edustaja blot F- ja G-aktiini on myös esitetty kullekin solulinjassa. Student T-testiä käytettiin arvioimaan tilastollinen merkitys (*** = p-arvo 0,01) välillä HCTsh-EZ-2a /b solut ja HCT116-soluissa. C. Migration kyky CRC solulinjojen transfektoitu siITGα2. D. WB analyysi p-cofilin tasot CRC-soluissa, joilla on korkea (HCT116 ja HCT-shpSUP) ja vaiennettu (HCTsh-EZ-2) EZH2-proteiinia käsiteltiin ROCK1 estäjä (Y27632), verrattuna käsittelemättömiin soluihin. E. Migration kyky CRC solulinjojen käsitelty ROCK1 estäjä (Y27632) verrattuna käsittelemättömiin soluihin.

Paremmin tarkistaa uudelleenjako aktiinisäikeiden in HCTshEZ-2-solut, G-aktiini ja F- aktiini oli differentiaalisesti eristettiin HCTshEZ-2-soluja sekä valvonnan kasvatettujen solujen vakio 2D kulttuuriin. Kuten selvästi on esitetty kuviossa. 3B F-aktiini tasot HCTshEZ-2 solut olivat paljon runsaammin kuin verrokeilla HCT116-soluissa. Itse asiassa keskimääräinen F-aktiini /G-aktiini-suhde oli noin 3,5 kertaa suurempi HCTshEZ-2-soluissa verrattuna kontrolleihin. Lopuksi, todistaa, että poikkeavaan inaktivointi ITGα2-cofilin akseli, välittyy EZH2, kasvattaa kasvain solujen vaeltamiseen mittasimme vaeltavien kykyä HCT116, HCTshSUP, HCTshEZ-2 ja DLD1 solujen jälkeen ITGα2 hiljentäminen. Kuten jo kuvassa. 2D ja edellä, siITGα2 tehokkaasti vähentäneet ilmentymistä ITGα2 kaikissa solulinjoissa analysoitiin alenevasta cofilin fosforylaation että pahentaa F-aktiini /G-aktiini liikevaihdon. Erityisesti siITGα2 pääasiassa HCTshEZ-2 ja DLD1 solujen lisääntynyt maahanmuutto kapasiteettia noin 25% ja 12% vastaavasti, mikä vahvistaa, että EZH2-vaiennettu ITGα2-cofilin akseli on tärkeää syöpäsolu liikkumiskyky (Fig. 3C). Vastaavia tuloksia on saatu myös haavan paranemista määritys (S4 Fig.).

avainasema p-cofilin in aktiini dynamiikkaa ja solumigraatio vahvisti myös farmakologinen esto ROCK1 toimintaa, joka ei liity manipulointi ITGα2 ilmaisun. Tarkemmin, olemme käyttäneet ROCK1 estäjä Y-27632 estää cofilin fosforylaatioon [29]. ROCK1 estäjä vähensi p-cofilin in HCT116, HCTshpSUP ja HCTshEZ-2 solulinjoissa (Fig. 3d). Vähentäminen p-cofilin parannettu osa aktiivista cofilin joka käännettiin voitto migraatiokykyä pääasiassa HCTshEZ-2 (Fig. 3E). Nämä tulokset osoittavat, että CRC-soluissa suhde p-cofilin /cofilin on ratkaiseva syövän solujen leviämistä ja että ITGα2 voi säädellä cofilin myös kautta väyliä, joihin ROCK1.

Keskustelu

muunlaisia ​​mekanismeja on on kuvattu selittää pro-metastaattisen aktiivisuuden histoni metyylitransferaasin EZH2 eri syöpätyypeissä [30] – [32], mutta vähän tiedetään rooliaan CRC. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet tätä kysymystä käyttämällä loss of perustuvaa lähestymistapaa arvioida roolia histoni muokkaaja EZH2 CRC solujen vaeltamiseen. Erityisesti meidän käytti mahdollisuutta edelleen luonnehtia CRC solulinja (HCT-shEZ-2), jossa EZH2 pysyvästi vaiennetaan ja uuden yhdisteen kykenee spesifisesti inhiboimaan EZH2 metyylitransferaasiaktiivisuus, nimeltään GSK-343, sekä yhdiste pystyä häiritä PRC2 monimutkainen, nimeltään DZNep. On osoitettu, että tässä solulinjassa EZH2 epigeneettiseltä ohjaa solua liikkumiskyky pitämällä cofilin tasaisesti aktiivinen. Todellakin, kun geneettinen ja farmakologinen esto EZH2, cofilin fosforylaatio seriinillä 3 lisättiin. Seriini-3-fosforyloitiin cofilin on aktiivinen. Seurauksena cofilin inaktivaation, invadopodia kokoamalla kärjessä vaeltavia solujen sekä purkamista takana-solu-puoli ei voi moduloida, mikä aiheutti solujen liikkumiskyky [3], [6]. Tämä saattaa selittää merkittävän vähentämisen solun liikkuvuutta HCT-shEZ-2 verrattuna emo-HCT116-soluja [17]. Suora hiljentäminen toiminta EZH2 on alkupään komponenttien cofilin koulutusjakso on suljettu pois. Todellakin, ei muutoksia proteiinien ilmentyminen ja toiminta on havainnut WB, GST-PAK vetää alas ja siRNA määrityksiä, Cdc42, Rac1, RhoA, ROCK1 sekä kokonaisia ​​cofilin HCT-shEZ-2-solujen suhteen kontrolloida soluihin. Vahvista oletusta, että EZH2 säätelee solujen vaeltamiseen kautta vaihtoehtoisen biologisen akselia eikä tukahduttaa Rho GTPaasi perhe komponentit, pyrimme tutkimaan roolista ITGα2 geenin. Itse ITGα2 suoraan säätelee EZH2 [17] ja mahdollisesti voi toimia cofilin kautta. Näin ollen, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että TESK1 pystyy fosforyloimaan cofilin seriinin 3 ja erityisesti TESK1 voi aktivoida integriini-välitteistä signalointia, [8], [28]. Kvantitatiivinen PCR ja WB-analyysi paljasti, että TESK1 ilmentyy HCT116 solulinjassa ja että EZH2 hiljentäminen ei muuttunut TESK1 ekspressiotason. Lisäksi on osoitettu, että ITGα2 on tärkeä säätelijä cofilin fosforylaation hiljentäminen ITGα2 proteiinia HCT116, HCT-shEZ-2 ja DLD1 soluissa. Todellakin, kun ITGα2 hiljentäminen p-cofilin tasot vähenevät, todistaa suorassa suhteessa keskuudessa ITGα2 ja p-cofilin mahdollisesti välittämä TESK1, mutta emme voi sulkea pois osallistumista muiden kinaasien kohteena integriinien. [35].