Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vain pieni joukko lupaavia lääkkeitä tavoite haimasyöpä, joka on neljänneksi yleisin syy syöpäkuolemista on 5 vuoden pysyvyys on alle 5%. Tavoitteena on kehittää uusi bioterapeuttiset ainetta, jossa lysosomaalisen proteiinin (saposin C, SAPC) ja fosfolipidi (dioleoylphosphatidylserine, DOPS) kootaan nanovesicles (SAPC-DOPS) hoitoon haimasyöpä. Erottava piirre SAPC-DOPS nanovesicles on niiden korkea affiniteetti fosfatidyyliseriini (PS) rikas mikrodomaineja, jotka ovat poikkeuksellisen alttiina kalvon pinnalle ihmisen haiman syöpäsoluja. Arvioidaan roolin ulkoisen solun PS,

in vitro

määrityksissä käytettiin korreloivan PS altistumisen ja sytotoksista vaikutusta SAPC-DOPS ihmisen kasvainten ja ei aiheuttanut kasvaimia haiman soluja. Seuraavaksi haiman tuumoriksenografteja (potilaalle tehdä ja ihonalainen mallit) käytettiin kasvaimen kohdentamiseen ja terapeuttinen teho tutkimuksissa systeeminen SAPC-DOPS hoitoa. Havaitsimme, että nanovesicles selektiivisesti tappoi ihmisen haimasyövän soluja

in vitro

indusoimalla apoptoottista kuolemaa, kun taas transformoimattomia solut pysyivät muuttumattomina. Tämä

in vitro

solumyrkkyvaikutuksessa korreloi pintaan valotuksen taso PS kasvainsoluihin. Käyttämällä ksenografteja, eläimiä käsiteltiin SAPC-DOPS osoitti selkeitä selviytymisen etuja ja niiden kasvaimet kutistuivat tai katosi. Lisäksi käyttäen kaksinkertaisen seurantamenetelmä elävien hiirillä, osoitimme että nanovesicles oli erityisesti kohdennettu ortotooppisesti-istutettu, bioluminesoivia haiman kasvaimia. Nämä tiedot viittaavat siihen, että hapan fosfolipidi PS on biomarkkeri haimasyövän, jotka voidaan tehokkaasti suunnattu hoito hyödyntäen syöpään selektiivinen SAPC-DOPS nanovesicles. Tutkimus tarjoaa vakuuttavaa näyttöä tueksi kehittää uusi terapeuttinen lähestymistapa haimasyövän.

Citation: Chu Z, Abu-Baker S, Palascak MB, Ahmad SA, Franco RS, Qi X (2013) kohdistaminen ja Sytotoksisuus of SAPC-DOPS Nanovesicles in Haimasyöpä. PLoS ONE 8 (10): e75507. doi: 10,1371 /journal.pone.0075507

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: May 1, 2013 Hyväksytty: 14 elokuu 2013; Julkaistu: 04 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Chu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain NIH /NCI Avustukset Number 1R01CA158372-01 (Qi), 1R43CA117283-01 (Qi ja Xu), ja New Drug valtion Key Project Grant Number 009ZX09102-205 (Qi). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet seuraavat edut: Xiaoyang Qi listattu keksijä on patentin tekniikka (SAPC-DOPS), joka on tehty tämän tutkimuksen. Yhdenmukainen nykyisen Cincinnati Lasten Hospital Medical Center politiikkaa, kehittämiseen ja kaupallistamiseen tätä tekniikkaa on lisensoitu Bexion Pharmaceuticals, LLC, jossa Dr. Qi omistaa pieni (alle 5%) omistusosuuden. Dr. Qi on keksijä tieteellistä tutkimusta, joka on pre-kliinisessä vaiheessa Bexion Pharmaceuticals. Tällä hetkellä, Bexion lääketeollisuus ei tarjoa mitään markkina hoitoja tai lääkkeitä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi yleisin syy syöpäkuolemista, jossa on 5 vuoden pysyvyys vähemmän kuin 5% [1], [2], [3]. Se on yleensä oireeton alkuvaiheessa, kun taas usein tunkeutuvat paikallisiin imusolmukkeisiin ja maksassa, ja harvemmin keuhkoihin ja sisäelimissä. Nykyinen multimodaalisten strategioita, mukaan lukien kirurgia, kemoterapia, ja sädehoito, ole parantaneet pitkäaikaista säilyvyyttä. Nykyinen standardi hoitoa, nukleosidianalogi gemsitabiinin [4], pidensi elinaikaa vain useita kuukausia. Huolimatta tyhjentävä pyrkimyksiä kartoittaa geneettiset muutokset liittyvät haiman syövän kasvua, muutama lupaava lääke tavoitteet on raportoitu, ja uusia, tehokkaita hoitoja tarvitaan kiireellisesti. Kokeellinen hoitostrategioita ovat pienet ja suuret molekyyli estäjät onkogeenisten kulkuväylillä antiangiogeenisiä aineita, rokotus /immunoterapian, geeniterapian, ja monet muut, mutta ei selvästi parempia hoitomuotoja on syntynyt.

Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, solu kalvot ovat tavoitteita syöpälääkkeet. Useat todistelinjat ovat ehdottaneet sidos solukalvon poikkeavuudet ja keramidin-välitteisen apoptoosin kasvaimissa [5], [6], [7], [8], [9]. Näiden havaintojen perusteella, aineet, jotka häiritsevät solukalvojen on kehitetty moduloida kalvoon organisaatio, sujuvuutta, aineenvaihduntaa, ja signaalitransduktion [10], [11], [12]. Tiedetään vähän, mutta perustana olevien signalointipolkujen vaikuttavat kalvoon kohdistetun syöpälääkkeiden.

Olemme pyrkineet kehittämään uusia bioterapeuttiset huume, joka voi valikoivasti tavoite solukalvon haiman kasvaimia ja tehokkaasti tuhota pahanlaatuiset haiman soluja vahingoittamatta normaalit kudokset ja solut. Tämä aine koostuu kahdesta puhdistetun luonnollisen solukomponenttien – pieni luonnollinen proteiini (saposin C, SAPC) ja luonnollinen lipidien (dioleoylphosphatidylserine, DOPS) – jota koota syöväksi-selektiivinen nanovesicles (SAPC-DOPS). SAPC on pieni ei-entsymaattisesta glykoproteiini läsnä kaikissa normaaleissa kudoksissa, joka toimii biologisten aktivaattori lysosomaalisten entsyymien [13]. Toiminnallinen organisaatio SAPC sisältää kalvon fusogeenisen domain ja alueen aktivoimiseksi lysosomaalisten entsyymien [14], [15].

N

linkatun glykosylaatiota ei ole olennainen SAPC toimintaa [16], [17]. SAPC tehostaa hajoamista glukosyyliseramidin, sfingomyeliiniä, ja galaktosyyliseramidi seramidiksi kautta hapon β-glukosidaasin, hapan sfingomyelinaasi, ja hapon β-galacotsylceramidase, vastaavasti [13], [18], [19]. Potilailla, joilla on lysosomaalinen sairauksia, SAPC kertyy yhdessä glykosfingolipidit makrofageissa [20], ja näyttää siltä, ​​että liiallinen SAPC ja lipidejä voivat olla myrkyllisiä näille soluille.

yleinen ominaisuus saposins on heidän lipidikalvoihin sitoutumisaktiivisuus [ ,,,0],21], koska niillä on tärkeä merkitys lipidikuljetukseen [22], lipidejä microdomain kokoonpano [23], ja uudelleenjärjestely biologisia kalvoja [24], [25], [26]. SAPC ensisijaisesti vuorovaikutuksessa tyydyttymättömiä, negatiivisesti varautuneita fosfolipidejä (esim DOPS), happamassa pH: ssa [15], [21]. Tämä vuorovaikutus on tarpeen SAPC aktivointi lysosomaalisten entsyymien.

Oletimme, että koska fosfatidyyliseriini (PS) on suhteellisen runsaasti pinnalla syövän solujen ja kudosten [27], [28], se antaisi kasvain- erityinen tavoite SAPC. Verrattuna transformoimattomaan solut, neoplastiset solut ovat hypermetabolinen ja siten tuottaa merkittäviä määriä happoa ja hiilidioksidia (CO

2) sivutuotteina anaerobisen glykolyysin ja aerobinen hengitys, vastaavasti. Vetyioneja kerääntyä kasvainkudoksissa, ja sen seurauksena, keskimääräinen solunulkoinen pH kiinteitä kasvaimia on alempi (pH ~ 6), kuin normaaleissa kudoksissa (pH ~ 7) [29], [30]. Syöpäsoluja myös näyttää muita ainutlaatuisia ominaisuuksia, kuten yleistyneen kalvo muutokset [31], [32], [33] ja ”vuotamisen” lysosomaalisten entsyymien [31]. Kiehtovan, useat lysosomaalisen hydrolaaseja ovat koholla tuumorikudoksissa [34], [35]. Näin ollen, on ainutlaatuinen hapan mikroympäristön solunulkoisen vuoto lysosomaalisten entsyymien tekee kasvainkudoksen optimaalinen tavoite SAPC [9].

Aikaisemmassa tutkimuksessa havaittiin, että SAPC-DOPS aiheuttaman apoptoosin useissa syöpäsolujen tyypit, mukaan lukien neuroblastooma, pahanlaatuinen ääreishermoston tuppi kasvain, ja rintasyöpä soluja, säästäen normaalit solut ja kudokset [36]. Mekanismi SAPC-DOPS apoptoosin induktio määritettiin olevan, osittain kautta solunsisäisten keramideja, jota seuraa kaspaasi aktivointi. Tutkimme myös antituumorivaikutuksen tehosta ja systeeminen biologinen jakautuminen on SAPC-DOPS nanovesicles prekliinisissä syövän malleissa [9], [36], [37]. Huomasimme, että SAPC-DOPS nanovesicles merkittävästi kohdennettua ja esti kasvua prekliinisen ksenograftien neuroblastooma, pahanlaatuinen ääreishermoston tuppi kasvain, ja ihosyöpä ja osoitti myrkyllisiä vaikutuksia nontumor kudoksissa [9], [36], [37].

nykyisessä tutkimuksessa arvioimme syövän hyödyllisyyttä SAPC-DOPS, ja sen

in vitro

ja

in vivo

syöpää kohdistamisen ja antineoplastinen ihmisen haimasyöpäsoluissa ja haiman tuumoriksenografteissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

Ihmisen haiman solulinjat (MiaPaca-2, PANC-1, BxPC-3, Capan- 1, AsPC-1, HPAF-II, Hs766T) American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä penisilliiniä /ml, ja 10 mg streptomysiiniä /ml. Ihmisen haimatiehyen epiteelin (HDPE) luovutti ystävällisesti A. Lowry (Moores UCSD Cancer Center, La Jolla, CA), ja kasvatettiin kuten kirjallisuudessa on kuvattu [38]. Ihmisen haiman cfPac1-Luc3 noomasolulinjasta toimittanut O. Wildner (Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Saksa) [39]. Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Ei ristikontaminaatio havaittiin näissä soluissa.

valmistaminen Proteiinit ja Nanovesicles

SAPC tuotettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [17] muutoksin. Lyhyesti, rekombinantti saposins ilmaistiin käyttämällä pET järjestelmää

E. Coli

soluja. Ilmaistaan ​​proteiinit puhdistettiin nikkeli- pylvästä ja täysin suolat C4 käänteisfaasi-korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC). Lyofilisoinnin jälkeen, saposin jauhetta käytettiin ja sen konsentraatio määritettiin sen paino. Kaikki fosfolipidit hankittiin Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Haudesonikoinnilla käytettiin muodostamaan SAPC-DOPS nanovesicles kuten aikaisemmin on kuvattu vähäisin muutoksin [40]. Liuottimen poistamisen jälkeen typpikaasussa, fosfolipidit oli sekoitettu puhdasta saposin proteiinien 20 ui happo-puskuria (pH 5) ja nopeasti laimennettiin 50X tilavuuteen fysiologista vesiliuosta. Proteiini-lipidi Sitten seos varovasti sonikoitiin ja kaksi osaa helposti koota nanovesicles. Sonikoitua nanovesicles voidaan käyttää varastoinnin jälkeen 4 ° C: ssa vähintään viikon. Pitkäaikaisessa varastointi, vakaa lyofilisoitu SAPC-DOPS näytteet valmistettiin veden ja orgaanisen tukiliuotin järjestelmä. Kun liuotin oli poistettu, kuivattiin DOPS liuotettiin 80% tert-butyylialkoholi. SAPC ja sakkaroosi (10 mg /ml) liuos tehtiin veteen. DOPS ja SAPC /sakkaroosi (tilavuus: tilavuus = 1:0.6) seos lyofilisoitiin jauheeksi kakku pakastekuivaimessa (VirTls Unitop, The Virtis Co., Gardiner, NY). Eläinten injektio, kakku rehydratoitiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), jolloin muodostuu SAPC-DOPS nanovesicles. Ne nanovesicles osoitti samaa kasvaimeen kohdistaminen ja sytotoksisuus

in vitro

ja

in vivo

.

SAPC-DOPS nanovesicles karakterisoitiin ja valvoo N4 plus partikkelikokoanalysaattorilla kuin edellinen kuvattu [9], [36]. Vakaa SAPC-DOPS nanovesicles keskimääräinen halkaisija on noin 200 nm, joiden keskimääräinen zeta-potentiaali -42. SAPC sitoo lipidejä molekyylejä ja spontaanisti sisältää lipidikaksoiskerrokseen liposomien kun ultraäänen avulla. Seuraavat sonikoimalla ja ultrasentrifugaation pelletoimiseksi SAPC-DOPS kytketty liposomeja, ei SAPC havaittu supernatanttifraktiossa, syytetään erittäin lastaus /kytkennän tehokkuutta [9]. Kuiva SAPC liuotettiin PBS ratkaisu SAPC hoitoa ilman DOPS. DOPS ilman SAPC valmistettiin käyttämällä samaa valmistusmenetelmää varten SAPC-DOPS nanovesicles.

Live Imaging

fluoresoiva merkintöjä SAPC-DOPS nanovesicles.

Joissakin osia kokeen The SAPC-DOPS nanovesicles oli fluoresoivasti leimattu vakaa ja korkea intensiteetti väriaine, CellVue® Maroon (CVM, Molecular Targeting Technology Inc., Exton, PA – Viritysjärjestelmät max = 647 nm; Emission max = 677 nm [9], [36 ]). CVM on osoittanut apuohjelman kuvantamisen ihonalaisen kasvaimissa, sekä piilossa, ortotooppisesti istutettu, ja etäpesäkkeitä. Kohtalo väriaine saattaa seurata live hiirillä käyttäen koko-eläimen kuvantamislaite [IVIS-200X (Cy5.5 suodatin), Xenogen]. Kaikkien kuvantaminen, hiiret varovasti nukutettiin isofluraanilla ja sijoitetaan lämpimään alustan kuvantamislaite.

alikvootti CVM etanolissa sekoitettiin fosfolipidin liuotin haudesonikoinnilla valmistamiseksi menetelmällä, joka on kuvattu yllä. CVM leimattu SAPC-DOPS nanovesicles erotettiin vapaasta CVM fluoroforin käyttäen Sephadex ™ G25 -pylväässä (PD-10, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Bioluminescence haiman syöpäsoluja.

seurata kasvainsoluja, lusiferaasi ilmentävät cfPac1-Luc3 ihmisen haiman kasvainten soluja käytettiin. Injektion jälkeen lusiferiini, saman live kuvantamislaite (IVIS-200X, Xenogen) käytettiin visualisointiin ja lokalisointia bioluminisenssimääri-.

In vitro

Studies

Vaikutus SAPC-DOPS nanovesicles kasvainsoluihin.

kolme laajalti käytetty haiman adenokarsinooma solulinjoja (MiaPaca-2, PANC-1 ja BxPC-3) ja transformoimattomien solujen (HDPE) ympättiin (10

4 /100 ul /kuoppa) 96-kuoppaisille tasapohjaisille kudosviljelylevyille (Falcon, Becton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ) ja niitä viljeltiin niiden elatusaineeseen 24 tuntia, jonka jälkeen SAPC-DOPS (0,14 mg) tai PBS: ää ajoneuvon lisättiin viljelyalustaan. Arvioida solujen elinkykyä, standardi 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) -dye määritystä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [9], [36] kolmen päivän kuluttua hoidon aloittamista. Mikroskooppinen arviointi kasvainsolujen ja HDPE-soluissa suoritettiin.

Jotta voitaisiin arvioida apoptoosin, MiaPaca-2 haimasyövän soluja käsiteltiin SAPC-DOPS, PBS, tai DNAase (positiivinen kontrolli), ja sen jälkeen arvioidaan terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasilla välittämää dUTP nick end merkinnät (TUNEL) määritys käyttäen in situ Cell Death Detection Kit, POD (Roche Applied Science, Saksa) kuvatulla tavalla valmistajan protokollan.

sen varmistamiseksi, että se oli kootaan SAPC-DOPS nanovesicles joka aiheutti solujen kuoleman, MiaPaca-2 haimasyövän soluja ja HDPE käsiteltiin joko SAPC-DOPS, SAPC yksin tai DOPS yksin. Solujen elinkyky arvioitiin kanssa MTT-väriaine-määrityksessä.

Sen määrittämiseksi, onko SAPC-DOPS: n indusoiman apoptoosin välittävät kaspaasi aktivaation, proteiinien nanovesicles-käsiteltyjen MiaPaca-2-solut analysoitiin Western blot. Soluja käsiteltiin 48 tuntia SAPC-DOPS, DOPS, PBS, tai staurosporiinille (positiivinen kontrolli) ja sen jälkeen hajotettiin proteiinin analyysiin immunoblottauksella käyttämällä NuPAGE Novex Bis-Tris-geelillä (4-12%), ja elektroforeesi menettelyä per valmistaja (Invitrogen, Carlsbad, CA). Proteiini siirrettiin käyttäen Semi-Dry blottauksella yksikkö (FB-SDB-2020, Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) Hybond-ECL nitroselluloosa kalvo (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Anti-ihmis-kaspaasi-9 ja anti-aktiini-vasta-aineita (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) käytettiin havaitsemiseen aktiivisten kaspaasien ja aktiini (kontrolli), vastaavasti.

Nämä kokeet suoritettiin neljänä rinnakkaisena, ja tiedot olivat analysoitiin analyysi varianssi (ANOVA). T-test-analyysi tai Kaksisuuntainen ANOVA Tukey testin määrittämiseen käytettiin tilastollista merkitystä kokeissa on kaksi tai enemmän kuin kaksi ryhmää, vastaavasti. Analyysit tehtiin SPSS 12.0.

Korrelaatio tappaminen vaikutus SAPC-DOPS ja PS altistumisen haiman solujen pinnalla.

virtaussytometrianalyysin FITC leimattu anneksiini V suoritettiin 8 solulinjoissa (Hs766T, AsPC-1, cfPac1-Luc3, Capan-1, BxPC-3, MiaPaca-2, HPAF-II, ja PANC-1) määrittää taso PS altistumisen solun pinnalla. Solulinjat erotettiin sitten kahteen ryhmään: ”High-PS” ryhmä sisälsi ne, joissa oli keskimääräinen fluoresenssi (MF) yli 50 (mielivaltaisina yksikköinä) ja ”Low-PS” ryhmä sisälsi niitä, joilla on MF alle 50. solut käsiteltiin SAPC-DOPS nanovesicles ja solukuoleman prosenttiosuutta määritettiin MTT-määrityksellä. MTT kokeet suoritettiin neljänä rinnakkaisena ja tulokset analysoitiin ANOVA. Esitetyt tiedot ovat aritmeettinen keskiarvo ± SEM.

In vivo

Studies

Ethics selvitys eläinten käyttöä.

Kaikki eläinkokeet oli hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komitean University of Cincinnati (IACUC Protocol Number: 11-05-05-02) ja Cincinnati Lasten Hospital Medical Center (IACUC Protocol Number: 1E03031). Eläimet nukutettiin isofluraanilla tai pentobarbitaali turvajärjestelmien ennen injektioita syöpäsolujen mahdollisimman vähän kipua ja kärsimystä. Anestesian syvyyden seurattiin tarkastamalla kipuvastetta (toe tai hännänpuristuskokeen), lihas- ja leuka laxity, ja läsnäolo säännöllisesti respirations. Eläimet lopetettiin kun kasvaimet saavuttivat 20% painoindeksi (eli koko pään) haavauma tai necrotized. Kasvain eläimet lopetettiin hiilidioksidilla kun normaali fysiologisia toimintoja kuten syöminen ja juominen, virtsaaminen ja ulostaa joiden arvo on alentunut. Varhainen poistaminen kriteerien vuoksi komplikaatioita leikkauksen mukana purkautua sivuston leikkauksen, ruokahaluttomuus, laihtuminen, ja epäonnistuminen sulhasen. Varhainen poistaminen kriteerit seurauksena kasvaimen kasvun mukana hemiplegia, ei vastausta ärsykkeille kuten melua tai kosketuksen ajaksi yli 12 tunnin kuluttua kipulääke annon, painonpudotus yli 20% viikoittain punnitus, kuivuminen, epäonnistuminen sulhasen, tai uneliaisuus enemmän kuin 24 tuntia. Nämä kriteerit käsitellyt kuultu hoitavan eläinlääkärin.

In vivo

malleissa käytettiin tutkimaan spesifisyyden, antituumorivaikutuksen ja herkistymistä tehostetun sytotoksisuuden SAPC-DOPS nanovesicles kohdentamisessa haiman kasvainsoluja. Kaikille

in vivo

tutkimuksissa female nude /nude kateenkorvattomissa hiirissä (Taconic Farms, Germantown, NY, yhteensä 98), jotka painavat noin 20-25 grammaa käytettiin. Kasvaimen solut joko ihon alle tai ortotooppisesti (kuva S1, Materials S1). Kaikki IV injektiot suoritettiin häntälaskimoon. Vahvistaa läsnäoloa ihmisen haiman kasvaimia, hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Esimerkkejä on esitetty kuvassa S2.

Dose arviointi eston haiman tuumorikasvun SAPC-DOPS.

Hiiret (yhteensä 24) istutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen suspensiolla, jossa oli PANC- 1 kasvainsolujen (10

7cells /hiiri). Kaksikymmentäneljä päivää inokulaation, kasvaimen koko mitattiin käyttämällä noniusmittaharppia ja kaava V = (π /6) LW

2 (V = tilavuus, L = pituus, W = leveys) [36]. Seuraavana päivänä (päivä 1), ryhmät kasvaimen kantavien hiirten (n = 6 /ryhmä) injektoitiin suonensisäisesti SAPC-DOPS (1, 4 tai 8 mg /kg 0,2 ml: n annos tilavuus) tai ajoneuvon ohjaus ( 0,2 ml PBS: ää). Kasvaimen koko Mittaukset tehtiin päivittäin ja injektiot jatkuivat joka toinen päivä, kunnes suurin kasvaimet saavutettu 2000 mm

3 koko (18 päivää). Sitten hiiret tapettiin ja todellinen tuumorin paino mitattiin. Tilastolliset analyysit tässä osassa Tutkimuksen suoritettiin GraphPad PRISM® v4 ohjelmisto. Erot lopullinen kasvainten painot vahvistettiin käyttäen ANOVA Dunnettin useita Vertailu Post Test.

arviointi kykyä SAPC-DOPS kohdistaa pintaan PS haimasyöpäkasvainsoluissa.

Voit selvittää SapC- DOPS nanovesicles kohdistuvat erityisesti haimasyöpäkasvainsoluissa

in vivo

, MiaPaca-2-solut (5 x 10

6 solua) injektoitiin subkutaanisesti kyljissä hiirillä. Jälkeen 5 viikkoa, jolloin kasvainten olivat palpoitavissa, yksi seuraavista oli IV injektoitiin kuhunkin hiiren: fluoresoivasti leimattu SAPC-DOPS nanovesicles (6 mg /kg), ei-kompleksoitu SAPC ja fluoresoivasti leimattua DOPS, fluoresoivasti leimattuja DOPS yksin, tai PBS: ää ohjaus (5 hiirtä /ryhmä, yhteensä 20). Arviointi

in vivo

jakeluun fluoresenssi suoritettiin live-eläin kuvantamislaite. Kuvat otettiin useita aikavälein 5 minuutista 100 tuntia injektion jälkeen.

määrittämiseksi estovaikutus PS sitovia, lusiferaasi ilmentävät cfPac1-Luc3 haimakasvaimesta soluja käytettiin. Solut esikäsiteltiin PS sitovien proteiinien lactadherin-C2 [41] ja β2-glykoproteiini [42] (0,1 mg /ml), tai se on jätetty väliaineessa ilman hoitoa kontrollina yhden tunnin ajan ja sitten injektoitiin ihonalaisesti yläosassa johtaja nude-hiirten (yhteensä 8). Bioluminesenssi kuvantaminen suoritettiin visualisoida kasvainsoluihin. Yhden tunnin kuluttua implantaatiosta, fluoresoivasti leimattuja SAPC-DOPS nanovesicles olivat IV pistetään, ja fluoresenssi signaali dokumentoitiin käyttäen eläviä kuvantamisjärjestelmä.

tutkimiseksi SAPC-DOPS välys normaalista hiirikudoksessa, fluoresoivasti leimattuja SAPC-DOPS oli IV ruiskutettiin 5 hiirtä. Sitten hiiret tapettiin ja maksassa, pernassa, keuhkoissa, sydämessä ja munuaisissa poistettiin ja kuvattiin 1, 12 ja 24 tuntia injektion jälkeen arvioida läsnäolon fluoresoivasti leimattuja SAPC-DOPS.

Vaikutus SAPC-DOPS nanovesicles haiman kasvaimen kasvua.

MiaPaca-2 haimasyöpäkasvainsoluissa (5 x 10

6 solua), jota on dokumentoitu

in vitro

tutkimukset olivat herkkiä SAPC -DOPS hoito ( 80% solukuolema), injektoitiin ihonalaisesti yläselän hiirillä. Kasvaimen koko mitattiin jarrusatulat 3 päivän välein ja tilavuus laskettiin. Kun kasvaimen keskimääräinen tilavuus kasvoi ~500 mm

3, hiiret IV injektoitiin joko SAPC-DOPS (6 mg /kg) tai pelkkää PBS: ää (5 hiirtä /ryhmä, yhteensä 10). Injektiot toistettiin päivänä 3, 6, 12, 15, 18, 21, ja 24, ja kasvainten mittaukset jatkettiin kunnes päivä 30. T-testi analysointi tai Kaksisuuntainen ANOVA Tukey testin määrittämiseen käytettiin tilastollista merkitystä kokeita kahdella tai enemmän kuin kaksi ryhmää, vastaavasti. Analyysit tehtiin SPSS 12.0.

Tracking kasvaimen bioluminenssin ja SAPC-DOPS fluoresenssi hiirillä potilaalle tehdä haiman kasvaimia.

Voit kokeilla SAPC-DOPS valikoivasti suunnattu potilaalle tehdä haimatuumorien, ihmisen cfPac1- Luc3-soluja injisoitiin haimaan nude-hiirtä. Sen jälkeen kun potilaalle tehdä haiman kasvain havaittiin käyttäen eläviä kuvantamisen päivänä 6, fluoresoivasti leimattuja SAPC-DOPS nanovesicles, fluoresoivasti leimattuja SAPC, fluoresoivasti leimattuja DOPS, tai PBS (kontrolli) oli IV injektoitiin (6 hiirtä /ryhmä, yhteensä 24).

Survival of SAPC-DOPS-käsitellyistä hiiristä ortotooppisesti implantoitu haiman kasvaimia.

ryhmät hiiriä (n = 6 kussakin, yhteensä 12), jossa ortotooppisesti ruiskutetaan haiman kasvainsoluja (lusiferaasi-ilmentävät cfPac1-Luc3 line) vahvistettu bioluminesenssi elävien kuvantaminen oli IV injektoitiin useita annoksia (päivä 6, 9, 12, 15, 19, 23, 27, 30, 34, 41) SAPC-DOPS (6 mg /kg 30 ui PBS: ää) tai ajoneuvon ohjaus (PBS 30 ui). Fluoresoivasti leimattu SAPC-DOPS nanovesicles sitten havaittiin käyttäen eläviä kuvantamisjärjestelmä. Elossa eläimiä tarkkailtiin, kunnes kaikki hiiret kontrolliryhmässä päättynyt. Survival käyrät luodaan käyttämällä Kaplan ja Meier menetelmää GraphPad Prism-ohjelmiston. Bioluminescent kasvaimia seurattiin live kuvantamislaitteen 23 viikon ajan.

Pitkäaikainen seuranta kasvaimen bioluminenssin ja SAPC-DOPS fluoresenssi hiirillä potilaalle tehdä haiman kasvaimia.

Luciferase ilmentävien cfPac1- Luc3 haiman kasvainsoluja ortotooppisesti injektoitiin hiiren haimassa. Sen jälkeen 110 päivää, jakelu bioluminesoivista kasvaimia seurattiin käyttämällä elävien-eläin kuvantamislaite. Jälkeen bioluminesenssi haihtunut, fluoresoivasti leimattuja SAPC-DOPS nanovesicles injektoitiin (6 mg /kg), ja hiiret kuvattiin uudelleen.

kohdentaminen piilotettu ortotooppisesti-siirteitä ja etäpesäkkeitä, jonka fluoresoivasti leimattu SAPC-DOPS nanovesicles.

Orthotopic haimatuumorien kertyi istuttamalla lusiferaasia ekspressoivan haiman kasvain linja (cfPac1-Luc-3) hiirillä. Jälkeen 6 viikkoa, hiiret kuvattiin tunnistaa kaikki tuumorikohdissa. Kun bioluminisenssimääri- oli haihtunut, fluoresoivasti leimattuja SAPC-DOPS oli IV pistetään.

Tulokset

In vitro

Studies

vaikutus SAPC-DOPS nanovesicles päälle kasvainsoluissa.

Aiemmissa tutkimuksissa havaittiin, että optimaalinen moolisuhde SAPC ja DOPS oli 1:03-01:10 maksimaalisen sytotoksinen vaikutus ihmisen neuroblastooma ja ihosyöpä solujen [36], [37 ]. Olemme todenneet, että tämä molaarinen erilaisia ​​SAPC: DOPS suhde oli myös huomattava tappava vaikutus ihmisen haiman (MiaPaca-2) syöpäsolujen (kuvio 1A). Kun kolme haiman adenokarsinooma solulinjojen ja HDPE-soluja käsiteltiin SAPC-DOPS, useimmat kasvaimen solut kuolivat, kun taas HDPE solut pysyivät elinkelpoinen (kuvio 1 B). Mikroskooppinen tarkastus SAPC-DOPS-käsitellyissä soluissa osoitti, että kasvaimen solut oli morfologisia ominaisuuksia sopusoinnussa apoptoottisen kuoleman, kun taas ei-transformoitu HDPE solut näyttivät normaaleilta (kuvio 2). TUNEL-analyysi paljasti, että SAPC-DOPS todellakin apoptoosin (kuvio 1 C). Toisin SAPC-DOPS ja positiiviseen kontrolliin DNAase, negatiivisen puskurivertailusta ollut apoptoottista vaikutusta. Molemmat osat SAPC-DOPS olivat välttämättömiä optimaalista kasvainsolujen tappaminen. Jos vain proteiini (SAPC) tai fosfolipidi (DOPS) komponentit lisättiin yksitellen soluihin, ei ollut apoptoosin induktio ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen oli verrattavissa PBS (kuviot 1B ja 1D). Western blot -analyysi paljasti, että lohkaisu proentsyymi pre-kaspaasi-9-aktiivinen muoto on tapahtunut vain SAPC-DOPS-käsiteltyjä soluja ja staurosporiini-käsiteltyjen solujen (kuvio 1 E).

(A) rooli SAPC ja DOPS moolisuhde sytotoksisuus ihmisen haiman (MiaPaca-2) syöpäsoluja. (B) Solujen kuolema (%) ihmisen haimasyövän soluja (MiaPaca-2, PANC-1 ja BxPC-3) ja normaalit kontrollit (HDPE) altistumisen jälkeen SAPC-DOPS. (Data in 1B-1D raportoidaan aritmeettinen keskiarvo ± SEM.) (C) Apoptosis (%) in MiaPaca-2 haimasyöpäsoluissa hoidon jälkeen joko SAPC-DOPS, PBS (negatiivinen kontrolli), tai DNAase (positiivinen kontrolli). (D) Solukuolemaan (%) ihmisen haimasyövän soluja ja HDPE altistumisen jälkeen SAPC-DOPS, SAPC yksin tai DOPS yksin. (E) Western blot-analyysi osoittaa, että hoito MiaPaca-2 haimasyöpäsoluissa kanssa sekä SAPC-DOPS ja staurosporiinille positiivinen kontrolli (P) johti pilkkominen pre-kaspaasi-9 aktiiviseen kaspaasi-9, kun taas käsittely DOPS, PBS , ja negatiivinen kontrolli (N) ei aiheuttanut entsyymin aktivoitumisen.

kasvainsolujen (PANC-1, Capan-1 ja MiaPaca-2 (B), (C), ja (D) , vastaavasti) oli morfologisia ominaisuuksia sopusoinnussa apoptoottisen kuoleman jälkeen hoidon SAPC-DOPS, kun taas transformoimattomassa HDPE solut (A) näyttivät normaaleilta.

Korrelaatio tappaminen vaikutus SAPC-DOPS ja PS altistumisen haiman solun pinnalla.

fluoresenssi histogrammi kuviossa 3A osoittaa, että ulkoinen PS tasolla PANC-1-soluissa oli korkeampi kuin AsPC-1-soluissa. Suhteellinen PS ekspressio solun pinnalla ihmisen haiman kasvainsolulinjojen on osoitettu kuviossa 3B. Näistä solulinjoista, MiaPaca-2, HPAF-II, ja PANC-1 oli MF yli 50 ja siksi käsittivät ”High-PS” ryhmä. Kuten kuviossa 3C, solut korkean PS ryhmä osoitti merkitsevästi enemmän sytotoksisuutta vastauksena SAPC-DOPS kuin solut Low-PS (p 0,05).

(A) Fluoresenssi histogrammi PS tasoilla PANC-1 ja AsPC-1 solujen pinnalla mitattiin anneksiini V-FITC. (B) differentiaalinen PS ekspressio ihmisen haiman solujen pinnalla 9 solulinjoissa. (C) Yhdistetty prosenttiosuus solun eloonjäämisen kahteen ryhmään solulinjoja käsiteltiin SAPC-DOPS määritettynä MTT: llä (p = 0,0032).

In vivo

Studies: ihonalainen haiman Kasvainmalli

Dose arviointi eston haiman tuumorikasvun SAPC-DOPS.

kasvaimen koot antamisen jälkeen SAPC-DOPS annoksilla 4 mg /kg ja 8 mg /kg joka toinen päivä oli huomattavasti pienempi kuin kontrolliryhmässä ja 1 mg /kg-hoitoryhmässä (p = 0,003 * ja 0,00015 **) jälkeen 18 päivää hoidon jälkeen (kuvio 4). Näiden tietojen perusteella, päätimme annos on 6 mg /kg tehon tutkimista varten.

PANC-1 ksenograftikasvaimina nude hiiriä käsiteltiin joka toinen päivä 1, 4 tai 8 mg /kg SAPC -DOPS tai PBS ohjaus. Kasvaimen koot suurilla annoksilla (4 mg /kg ja 8 mg /kg) olivat huomattavasti pienempiä kuin kontrolli ja 1 mg /kg ryhmissä (p = 0,003 * ja 0,00015 **, vastaavasti).

Arviointi ja kyky SAPC-DOPS kohdistaa pintaan PS haiman syöpäsoluja.

live kuvantamisen osoittivat, että fluoresoivasti leimattu SAPC-DOPS nanovesicles oli nopeasti suunnattu kas- vaimesta 5 minuutin kuluessa (tuloksia ei ole esitetty), ja fluoresenssia kesti yli 4 päivää (kuvio 5). Fluoresenssin koottu SAPC-DOPS nanovesicles kohdistettu tuumorikohdat, kun taas mitään kasvaimen fluoresenssia todettiin sen jälkeen, kun co-injektion ei-kompleksoituneen SAPC ja fluoresoivasti leimattua DOPS tai injektion jälkeen fluoresoivasti leimattuja DOPS yksinään tai PBS (kuviot 6A ja 6B). Vaikka fluoresoivasti leimattu SAPC-DOPS todettiin kertyvän maksaan alussa (2 tuntia injektion jälkeen), ei ollut jälkeäkään maksan fluoresenssin elävillä kuvantamisen jälkeen 24 tuntia (kuvio 6A). Samoin ei-kompleksoitu SAPC ja fluoresoivasti leimattu DOPS, ja fluoresoivasti leimattu DOPS yksin, havaittiin maksassa 0,5 tuntia live kuvantamisen, mutta nopeasti haihtunut (kuvio 6B).

nanovesicles olivat nopeasti suunnattu että palpoitavissa kasvaimen 5 minuutin kuluessa (dataa ei esitetty). Fluoresenssin kesti yli 1 (A) ja 4 (B) päivää. SAPC = 3,2 mg /kg, DOPS = 1,8 mg /kg, CVM = 6 uM.

Heterotooppista MiaPaca-2 kasvaimet (ympyröity) tuotettiin ihon alle kyljen yläosasta nude-hiirten. (A) hiiret 1 2 oli tuumoreita kantavaa hiirtä, injektoitiin fluoresoivasti leimatulla SAPC-DOPS nanovesicles; Hiiri 3 oli ei-kasvain, PBS pistetään. Hiiret, 1 ja 2 molemmat osoittavat lokalisoinnin fluoresoivan leiman tuumorikohtaan. Fluoresenssi myös paikantuu maksaan 2 tuntia, mutta on mennyt 24 tuntia. (B) Kasvaimen kantavien hiirten 4, 5, ja 6 injektoitiin ei-kompleksoidun SAPC ja fluoresoivasti leimattua DOPS, fluoresoivasti leimattuja DOPS vain, ja vastaavasti PBS: llä. Ei ole mitään fluoresenssia lokalisoitu kasvaimen tahansa näistä hiirillä. OLEN.