Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pieni ei-proteiinia koodaavan RNA microRNA (MIR), jotka säätelevät lähetti-RNA tasoja, on äskettäin tunnistettu, ja voi olla tärkeä rooli patogeneesissä erilaisia ​​sairauksia. Tässä tutkimuksessa keskityttiin miR-31 ja tutkittiin sen mahdollisuudet osallistua keuhkojen syövän synnyn. Ilmaisu Mir-31 oli muutettu keuhkosyövän soluihin joko vahvistus tai menetys isäntä geenilokuksen. Voimakas ilmentyminen miR-31 suurissa solukarsinoomat johtui geenimonistusmäärityksessä. Samaan aikaan menetys miR-31 ilmentyminen havaittiin useammin aggressiivisissa adenokarsinooman. Siten miR-31 voi olla pleiotrooppinen rooli kehitettäessä keuhkosyöpien eri histologisia tyyppejä. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa mahdollisia aiheuttava mekanismi muuttuneen ilmentymisen miR-31 ja ehdottaa sen mahdollisesti monipuolinen merkitys eri histologisia tyyppejä keuhkosyövässä.

Citation: Okudela K, Tateishi Y, Umeda S, Mitsui H, Suzuki T, Saito Y, et ai. (2014) Alleelisia Epätasapaino MIR-31 Host geenilokuksesta Keuhkosyöpä – sen mahdollisen roolin Carcinogenesis. PLoS ONE 9 (6): e100581. doi: 10,1371 /journal.pone.0100581

Editor: Salvatore Papa, Institute of Hepatology – Birkbeck College, Iso-Britannia

vastaanotettu: 23 tammikuu 2014; Hyväksytty: 26 toukokuu 2014; Julkaistu: 30 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Okudela et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Japanin opetus-, kulttuuri-, urheilu-, ja Science (Tokio), ja avustusta Yokohama sairaalan (Yokohama, Japani). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä syistä syöpään liittyvät kuolemat teollisuusmaissa [1], [2]. Vaikka primaarikasvaimen on onnistuneesti resektoitiin, toistumisen havaitaan suuri osa potilaista [1], [2]. Vaikka jotkut keuhkokasvaimia ovat herkkiä tavanomaisia ​​kemoterapeuttisia aineita tai tietyt mole- kohdistaminen aineita, monet eivät ole [3], [4]. Siten edelleen ymmärtämistä molekyylitason mekanismin taustalla keuhkojen karsinogeneesissä on tärkeää kehittää uusia terapeuttisia strategioita.

pienet ei-proteiinia koodaavan RNA: n, microRNA, jotka säätelevät lähetti-RNA-tasot, on äskettäin tunnistettu ja on on osoitettu olevan merkittäviä rooleja patogeneesissä erilaisia ​​sairauksia. Eri microRNA (MIR), mukaan lukien let-7, miR-21, miR-30d, miR-31, miR-155, ja miR-205, on ehdotettu olevan osallisena karsinogeneesissä erilaisten maligniteettien [5]. Niistä miR-31 oli kuitenkin voimakkaammin ilmaista kasvainkudoksessa kuin ei-kasvainkudoksessa, ja ehdotettiin olevan onkogeenisessä rooli keuhkojen syövän synnyn [6] – [12]. Lisäksi tuore tutkimus osoitti ennustetekijöiden arvo miR-31, koska korkeampi ilmentyminen miR-31 liittyi huonompi tulos potilailla keuhkosyöpä [13]. Samaan aikaan ero miR-31 ilmentyminen keskuudessa histologisia tyyppejä keuhkosyövässä ja mahdollinen mekanismi muuttuneen ilmentymisen miR-31, ei ole selvitetty.

Tässä tutkimuksessa analysoitiin ilmentymisen miR-31 ja tilan sen isäntä geenilokuksesta eri histologisia tyyppejä keuhkosyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

immortalisoitu ihmisen hengitysteiden epiteelin solulinja (16HBE14o Simian virus 40 (SV40) transformoiduista ihmisen keuhkoputken epiteelisolut) ovat kuvanneet Cozens aL et ai. (1994) [14] oli ystävällisesti Grunert DC (California Pacific Medical Center Research Institute). Sub-klooni 16HBE14o soluja, kuvataan NHBE-T tässä tutkimuksessa, on käytetty. Immortalized hengitysteiden epiteelin solulinjat (HPL1D ja HPL1A, SV40-transformoidut ihmisen pieni hengitysteiden epiteelisolujen) vahvistettiin Masuda A. et al. (1997) [15]. Ihmisen keuhkosyöpä solulinjat (A549, H322M-, H358, H522, H820, H2087, H23, EKVX, H226, H827, H1819, H441, H4006, HOP62, H1299 ja H460) ja ihmisen alkion munuais- solulinja (HEK293T-) olivat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ihmisen keuhkosyöpä solulinjaa LC2AD, Lu130, Lu135, Lu139, ja Lu140, ostettiin riken Cell Bank (Tsukuba, Japani). Ihmisen keuhkosyövän solulinjat, PC9 ja HARA, olivat Immuno-Biological Laboratories Co. (Gunma, Japani). Ihmisen keuhkosyövän solulinjat, TKB1, TKB2, TKB4, TKB5, TKB6, TKB7, TKB8, TKB9, TKB12, TKB14, TKB15, TBK17, ja TKB20, saatiin tri Hiroshi Kamma kautta Dr. Takuya Yatsawa (Kyorin University School lääketieteen) [16]. Ensisijainen pieni hengitysteiden epiteelisolujen (SAEC) ja normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (NHBE) ostettiin Sanko Kagaku (Tokio, Japani).

Ensisijainen keuhkosyöpää

yhteensä 129 ensisijaista keuhkokasvaimia (71 adenokarsinoomat, 38 okasolukarsinoomia, 18 suurta solukarsinoomat, 2 pientä solukarsinoomat) poistettiin radikaali kirurginen resektio Kanagawan Sydän- ja Respiratory Center Hospital (Yokohama, Japani). Tämä tutkimus suoritettiin noudattaen Helsingin julistuksen [17], ja hyväksyi eettisten toimikuntien Yokohama City University ja Kanagawa Prefectural Verenkierto ja Respiratory Center Hospital [18]. Kirjallinen suostumus saatiin kaikkien aineiden tarjota materiaaleja.

RNA

Solulinjat pestiin kylmällä fosfaattipuskurisuolaliuoksella ja sitten jäädytettiin. Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut kudosleikkeiden tutkittiin mikroskoopilla. Tumorous ja ei-tuumori- osat leikeltiin partaterällä. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen miRNeasy mini -kittiä (Qiagen, Valencia, CA).

Kvantitatiivinen RT-PCR

havaitsemiseksi miRNA, ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: sta käyttäen luki- X miRNA ensimmäisen Strand Synthesis Kit protokollien mukaisesti valmistajan (Takara, Kioto, Japani). CDNA syntyy käytettiin mallina reaaliajassa PCR SYBR Esiseos EXTaq (Takara) ja ajettiin PCR-laite DICE reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Takara). Forward-aluketta käytetään tunnistuksen miR-31 oli 5′-AGGCAAGATGCTGGCATAGCT (kypsä miR-31, MIMAT0000089). Käänteinen aluke oli yleinen MRQ 3 ’aluketta (Takara). Aluke käytetään havaitsemaan U6 snRNA ostettiin Takara Bio Inc. MiR-31 taso normalisoitiin U6 snRNA tasolle. Havaitsemaan mRNA, ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: sta käyttäen SuperScript III Ensimmäisen Strand Synthesis System (Invitrogen). CDNA syntyy käytettiin mallina reaaliajassa PCR TaqMan Gene Expression Assay järjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA) ja ajettiin PCR-laite DICE reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Takara). TaqMan-koettimet ja alukesarja käyttää havaitsemaan GAPDH [NM_002046.5], ITGA5 [NM_002205.2], MMP16 [NM_005941.4], ja RhoA [NM_001664.2], räätälöitiin ja osti Applied Biosystems. ITGA5, MMP16, ja RhoA tasot normalisoitiin GAPDH: hon tasolle.

PCR analyysi miR-31 lokuksen

Genominen DNA uutettiin syöpäsolulinjasta käyttäen DNeasy (Qiagen). Tila (poistetaan tai säilyttäminen) ja miR-31 hot geenilokuksesta analysoitiin genomista DNA PCR: llä käyttäen aluketta joukko F 5′- TAACTACATCTTCAAAAGCGGAC ja R 5’TACATAGCAGGACAGGAAGTAA. Tila CDKN2A geenilokuksen (D9S974) ja toinen kaukainen lokus lyhyen varren kromosomin 9 (D9S304) analysoitiin myös käyttämällä aluketta sarjaa F 5′- GAGCCTGGTCTGGATCATAA ja R 5′- AAGCTTACAGAACCAGACAG, ja F 5’GTGCACCTCTACACCCAGAC ja R 5 ’TGTGCCCACACACATCTATC, vastaavasti.

In situ

-hybridisaatio miRNA

In situ

-hybridisaatio suoritettiin menetelmällä, joka on kuvattu aiemmin [ ,,,0],19]. Lyhyesti, lukittu nukleiinihappo (LNA) modifioituja detektiokoettimia Mir-31 ja U6 snRNA, ja salattu negatiivinen kontrolli anturi (Exiqon, Vedbaek, Tanska) leimattiin digoksigeniinillä (DIG) käyttäen DIG Oligonukleotidi rikastushiekka kit (Roche, Basel , Sveitsi) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Formaliini-kiinnitetyille ja parafiiniin upotettujen kudosleikkeiden asetyloitiin ja hybridisoitiin DIG-leimattua koettimia, ja niitä tutkitaan sitten alkaliseen fosfataasiin konjugoitua anti-DIG-Fab-fragmenttien (Roche). Hybridisaatiosignaaliin visualisoitiin värinkehitettä liuosta (Roche).

fluoresoiva

in situ

-hybridisaatio (FISH) varten geenilokus

Formaldehydi-kiinteä ja parafinoidut kudosleikkeet käytettiin analyysiin. Leikkeitä keitettiin sitratoidussa puskurissa (0,01 M, pH 6,0), jotta suljettuun kromosomaalisten rakenteiden [20]. Nämä leikkeet hybridisoitiin Cy3-leimattua koetinta, joka kattaa miR-31 lokuksen (BAC-klooni: RP11-354P17) ja FITC-leimattua koetinta sentromeerin lokuksen kromosomissa 9 (Vysis INC., Downer Groves, IL). Signaalin miR-31 lokuksen ja sentromeeriantigeenin 9 laskettiin yli 50 solua joka kasvain, ja kopioluvun miR-31 lokuksen suhteessa kuin sentromeeriantigeenin 9 laskettiin.

hoito 5 -azacytidine ja trikostatiini

Soluja käsiteltiin joko 10 uM 5-atsasytidiini (Sigma, St. Louis, MO) 72 tunnin vaihtamalla väliaineen päivittäin tai 300 ng /ml trikostatiini A ( Wako, Osaka, Japani) 24 tuntia. Soluja käsiteltiin myös 5-atsasytidiini 48 tunnin ajan ja sitten seos 5-atsasytidiini ja trikostatiini A vielä 24 tuntia.

Metylaatiospesifinen PCR

Genominen DNA alistettiin bisulfate konversiokäsittelyssä käyttäen MethylEasy DNA bisulfaatti muutos kit (Human Genetic allekirjoitukset, Macquarie Park, Australia). Metylaatiospesifinen PCR kohdistaminen kaksi CpG-sivustoja promoottori lokukseen miR-31 vastaanottavan geenin (LOC554202), joka oli aikaisemmin osoitettu [21], suoritettiin menetelmän mukaisesti on kuvattu muualla [21].

bisulfaatti DNA Sequencing

GPC-sivusto promoottorin lokukseen miR31 vastaanottavan geenin (LOC554202), joka oli aikaisemmin osoitettu [21], PCR-monistettiin käyttämällä bisulfaatti käsitellyn genomista DNA: ta templaattina, mukaan menetelmä on kuvattu muualla [21]. PCR-tuote oli kloonattiin pT7 Blue plasmidivektoriin (Novagen, Darmstadt, Saksa), ja sitten altistettiin syklin dye terminator reaktio yleisen T7-promoottorin aluketta käyttämällä Big Dye Terminator Version 3.1 kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).

tilastollinen analyysi

erot keinot suhteellisen kopioluvun miR-31 lokuksen ryhmissä luokiteltu erilaisia ​​patologisia parametrit analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA . Erot avulla miR-31 tasot estävä kokeessa analysoitiin parittomalla Studentin t-testiä. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS ohjelmistoa (SPSS for Windows Version 10.0, SPSS, Chicago, IL, USA).

Muut

Koemenetelmät käytetään suorittamaan immunohistokemiallisesti Ki-67 ja analysoida onkogeenisten mutaatiot KRAS ja EGFR-geenejä on kuvattu muualla [22].

tulokset

MiR-31 ja ilmaus sen tunnettujen kohteiden keuhkosyövän solulinjoissa

asennuspalveli- 31 ilme näytti olevan vahvaa eräillä syöpäsolulinjoissa, mutta oli täysin puuttuu muista joissakin solulinjoissa (kuvio. 1). Ilmentyminen let-7i tutkittiin myös. Anna-7i ilmentyi kaikissa solulinjoissa ja sen tasot erosivat miR-31 (kuva S1). Se toimi kontrollina laadun arvioimiseksi materiaalien ja varmistettava, että merkittyjä muutoksia esiintyi ilmentymisen miR-31. Lisäksi alustava koe osoitti, että palauttaminen miR-31 merkittävästi tukahdutti kasvua syöpäsolun linja (LC2AD) että melkein menetti kykynsä ilmaista miR-31 (kuva S2). Nämä tulokset sai meidät edelleen tutkia mahdollisuuksia merkitys muuttuneen ilmentymisen miR-31 keuhkojen karsinogeneesissä.

MiR-31 tasoa normalisoituivat U6 snRNA tasolle. Tekninen rinnakkaisnäytettä tehtiin kolmena kappaleena. Keskiarvot ja keskihajonnat (virhepalkkien) näkyvät. AEC, hengitysteiden epiteelisoluissa (ei-syöpäsoluja); ADC, adenokarsinooma; SQC, okasolusyöpä; LCC, suuri karsinooma solu; SCC, pienisoluinen karsinooma.

Asema miR-31 geenilokuksesta keuhkosyövän solulinjoissa

LEDin miR-31-geenin lokus, CDKN2A lokuksen, ja viereisen lokus (D9S304), tutkittiin käyttämällä PCR-analyysi. Niistä neljäkymmentäyksi solulinjoissa tutkittiin, kuusi solulinjoissa (14,6%, 6/41 solulinjat, H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, ja TKB9) menetti miR-31 isäntä geenilokuksesta (Fig. 2, Taulukko 1 ), kun taas kaksitoista riviä (29,3%, 12/41 solulinjat, TKB14, H4006, A549, LC2AD, TKB4, H460, H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, TKB9) menetti CDKN2A lokuksen (Fig. 2, Taulukko 1 ). Kaikki kuusi riviä menetti miR-31 lokuksen menetti myös CDKN2A lokuksen (Fig. 2, taulukko 1). Viereisen lokus (D9S304) toimi positiivisena kontrollina PCR-analyysiä varten (Fig. 2).

Tulokset PCR-analyysi esitetään. AEC, hengitysteiden epiteelisoluissa (ei-syöpäsoluja); ADC, adenokarsinooma; SQC, okasolusyöpä; LCC, suuri karsinooma solu; SCC, pienisoluinen karsinooma.

Epigeneettiset muuttaminen miR-31-promoottori ja sen ilme

MiR-31 ilmaisun puuttui kaikista kuudesta solulinjoissa menettää miR -31 isäntä geenilokuksesta (Fig. 2, taulukko 1). Samaan aikaan viisi solulinjat (H441, LC2AD, Lu140, TKB15, ja TKB17) että säilytti miR-31-geenin lokus (Fig. 2, taulukko 1) menetti miR-31 ilmentyminen tai merkittävästi vähentänyt taso (Fig. 2, taulukko 1), joka osoitti potentiaalia osallistumista epigeneettiset muutos sen downregulation. Siten solulinjoja joka menetti miR-31 ilmentyminen, mutta säilytti geenilokukseen tutkittiin tutkia vaikutuksia estäjien DNA metyylitransferaasi ja histonideasetylaasi ilmentymistä koskevat miR-31. Joko ja /tai yhdistelmä-estäjien ei toistettavasti palauttaa miR-31 ilmentyminen näissä soluissa (kuvio. 3A). Metylaatiospesifinen PCR-analyysi kahden sivustoja promoottorialueen miR-31 isäntä geenin paljasti, että kaksi paikkaa metyloitiin kaikissa solulinjoissa tutkittiin (Fig. 3B). Bisulfaatti DNA: n sekvensointi analyysi CpG promoottorialueen paljasti myös, että se on toisinaan metyloitu kaikissa solulinjoissa tutkittiin (SAEc, NHBE-T, H820, H441, LC2AD, Lu140, TKB15, ja TKB17) (Fig. 3C). Tasot metylaatio vaikutti olevan merkitsevää eroa solujen säilyttää ilmaus miR-31 (SAEC, NHBE-T, ja H820) ja ne, menettää sen (H441, LC2AD, Lu140, TKB15, ja TKB17) (Fig. 3C) . Metylaatiostatuksen oletetun promoottorialueiden miR-31 isäntä geeni ei liity talteenotto asemaan miR-31 tasoa käsittelyjen jälkeen estäjien kanssa (Fig. 3A ja 3C). Täten DNA: n metylaatio on otaksuttu tutkittavalla alueella tässä ei johdu downregulation miR-31.

Solut käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (CTL), 5-atsasytidiini (AZA), trikostatiini A (TRC), tai yhdistelmä AZA ja TSA (AZ /TR) tutkittiin palauttamista miR-31 ilmentyminen käyttäen kvantitatiivista RT-PCR. Suhteellinen taso miR-31 normalisoitu kuin U6 snRNA: laskettiin. Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin. Tekninen rinnakkaisnäytettä PCR-analyysi tehtiin kolmena kappaleena. Keskiarvot ja keskihajonnat (virhepalkkien) esitetään (A). Kaksi aluetta (S1 ja S2), oletetusta promoottori miR-31 PCR-monistettiin spesifisillä alukkeilla joko metyloitu (M) tai metyloimattomia (UM) DNA: lla käyttäen natriumbisulfaatilla-muunnetun genomisen DNA: ta templaattina, menetelmän mukaisesti kuvattu aiemmassa tutkimuksessa [21]. Edustavia tuloksia on esitetty (B). Alueella MIR-31-promoottorin, joka sisältää CpG-kohdille oli PCR-monistettiin käyttämällä natriumbisulfaatilla-muunnetun genomisen DNA: ta templaattina, menetelmän mukaisesti kuvattu aiemmassa tutkimuksessa [21]. Kahdeksan subklooneja PCR-tuotteet analysoitiin niiden metylaatiostatuksen käyttäen DNA-sekvensoinnilla. Open (○) ja täytettiin (•) piireissä merkitty metyloimattomia ja metyloituja sytosiinin ilmoitetuilla CpG sivustoja, vastaavasti (C). AEC, hengitysteiden epiteelisoluissa (ei-syöpäsoluja); ADC, adenokarsinooma; SQC, okasolusyöpä; LCC, suuri karsinooma; SCC, pienisoluinen karsinooma.

Expression of miR-31 ensisijainen keuhkosyövässä

kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi paljasti, että jotkut tumorous ja ei-syöpäkudoksissa ilmaistu miR-31 havaittavia tasot (Fig. 4A). Nämä tasot vaihtelivat, mutta olivat merkittävästi suuri joidenkin kasvainten tutkittiin (Fig. 4A). Nämä näytti olevan hieman suurempi suurissa solukarsinoomat ja hieman pienempi adenokarsinoomia (Fig. 4A). Niistä adenokarsinoomat tutki, ilmentymisen miR-31 oli pienempi huonosti eriytetty karsinooma (Fig. 4B ja 4C) sekä kiinteän alatyypin (Fig. 4D). Vakavia kudosvaurioita mukana regeneratiivisen reaktioita havaittiin ei-tuumori- kudoksiin ilmentävät miR-31 (ei esitetty).

MiR-31-tasot arvioitiin ensisijaisesti keuhkojen kasvaimet ja vastaavat keuhkojen ei-kasvainkudoksessa. Kopion määrä miR-31 ja U6 snRNA mitattiin käyttäen kvantitatiivista RT-PCR. Tekninen rinnakkaisnäytettä tehtiin kolmena kappaleena. Välineet ja keskihajonnat (virhepalkkien) Mir-31 tasoa normalisoitu kuin U6 snRNA näkyvät saadut tulokset kaikista kasvaimista (A) ja ne ADC (B). Merkittäviä eroja keskimääräisessä miR-31 tasot adenokarsinoomat kesken eri histologisia laadut (9 hyvin eriytetty karsinoomat (HTP); 3 kohtuullisesti erilaistunut karsinoomat (MOD); 8 huonosti eriytetty karsinoomat (POR)) ja alatyyppejä (8 bronchioloalveolar karsinooma (BAC) ; 3 acinar karsinooma (ACN); 8 kiinteää karsinooma (SOL) (yksi papillaarinen karsinooma (= hyvin erottamaan karsinooma) jätettiin tilastollinen analyysi) analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA. keinot ja standardipoikkeamat (virhepalkkien) of histologinen laadut (C) ja alatyyppejä (D) on esitetty.

in situ

hybridisointi- analyysistä miR-31 kudosleikkeiden vahvisti, että miR-31 on ilmaistu neoplastisten solujen ja paljasti myös, että se jopa vaihteli neoplastisten solujen jopa samassa kasvaimen (Fig. 5). Regenerative epiteelisolut, interstitiaalinen solujen ja tulehdussolujen ilmaisi myös miR-31 eri tasoilla (Fig. 5).

koetin, joka koostuu salattu satunnainen sekvenssi toimi negatiivisena kontrollina (alapaneelit). Edustavia valokuvia tumorous (vasen kaksi paneelia) ja ei-kasvainkudoksessa (oikealla kaksi paneelit), joka ilmaisi miR-31 (keskellä kaksi paneelit) tai ei (sivusuunnassa kaksi paneelia), esitetään.

asema miR-31 isäntä geenilokuksesta ensisijainen keuhkosyövässä

FISH-analyysi paljasti, että miR-31 isäntä geenilokuksesta hävisi neoplastiset solut joidenkin kasvainten, koska signaali laskea pois miR-31 lokuksessa oli pienempi kuin päässä sentromeerin kromosomin 9 (Fig. 6A). Geeni annostus miR-31 lokuksen arvioitu suhde miR-31 /sentromeerien sisään adenokarsinooman ja okasolusyöpää oli hieman alhaisempi kuin ei-syöpä keuhkoputken epiteelin (Fig. 6B). Kuitenkin joissakin kasvaimissa suurten solukarsinoomat MIR-31-lokus monistettiin (Fig. 6C). Geenin annos oli merkittävästi suurempi suuri solukarsinoomat kuin ei-syöpä epiteelissä ja muita histologisia tyyppejä (Fig. 6C, taulukko 2). Kaikki kasvaimet, joiden vahvistus geenin lokuksen, jotka availably tutkittiin ilmaistuna korkeatasoinen MIR-31 transkriptio. Sen sijaan, joukossa adenokarsinoomat, geeniannoksen lisäksi yleensä olla pienempi aggressiivisempia kasvaimia (huonosti eriytetty kasvaimet tai kiinteät alatyypin kasvaimia) (taulukko 2).

edustajan tulokset tumorous ja ei-tuumori- kudoksiin on esitetty, ja vihreä ja punainen signaalit osoittavat miR-31 lokuksen ja sentromeeriantigeenin lokukseen kromosomissa 9, vastaavasti (A). Signaali count päässä miR-31 lokuksen normalisoitu päässä centromere lokuksesta kromosomi 9 määritettiin FISH pisteet. FISH tulokset mitattiin esitetään (B). Keskiarvot ulkopuolisissa tuumori- keuhkoputken epiteelin ja eri histologisia tyyppejä keuhkosyöpätapauksista esitetään (C). Erot keskimääräinen pisteet analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA testi. P-arvot on osoitettu. BEC, keuhkoputken epiteelisolut (ei-syöpäsoluja); ADC, adenokarsinooma; SQC, okasolusyöpä; LCC, suuri karsinooma.

Keskustelu

alustava tutkimus rintasyöpiä ehdotti, että miR-31 voisi olla kasvain vaimennin, joka esti invasiivisia ja metastaattinen leviäminen neoplastiset solut [23]. Muut tutkimukset ovat tukeneet tätä alustavan havainnon paljasti mahdollisen molekyylitason mekanismeista, miten miR-31 väistää hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden [24]. MiR-31 osoitettiin myös vaimentua mahalaukun syövistä ja ehdotettiin toimia tuumorisuppressorina [25]. Sen sijaan, miR-31 havaittiin voimistuvan ja peräsuolen syöpiä, ja ehdotti edistää invasiivinen ja metastaattinen leviäminen neoplastisten solujen [26], [27]. Siten mahdollista roolia miR-31 karsinogeneesis- voivat vaihdella kesken eri syöpiä. Keuhkosyövän, ilmentymisen miR-31 on yleensä raportoitu olevan suurempi kasvainkudoksessa kuin vastaavilla ei-kasvainkudoksessa [6] – [12]. Tuloksemme määrällisiä RT-PCR-analyysi, jossa useat ensisijainen keuhkokasvaimet osoitettiin voimakkaasti ilmaista miR-31, näytti olevan yhdenmukainen aiempien havaintojen [6], [7], [9] – [12]. FISH-analyysi paljasti, että vahvistus vastaanottavan geenin lokus voi olla yksi niistä mekanismeista vastaavan voimakkaan ilmentymisen miR-31. Tuore tutkimus osoitti ennustetyövälineenä arvo miR-31, koska korkeampi ilmentyminen miR-31 liittyi huonompi tulos keuhkosyövässä [13], ja ehdotti myös sen kasvaimia synnyttävän roolin kautta

in vitro

kokeissa [ ,,,0],13]. Yhdessä nämä havainnot, miR-31 ehdotettiin edistää Karsinogeneesin erityisesti suurten solukarsinoomat. Sen sijaan, miR-31 ilmentyminen oli merkittävästi vähentää tai kokonaan poissa joissakin keuhkosyövän solulinjat. Lisäksi sen tasot vaihtelivat ensisijainen keuhkokasvaimia. Jotkut kasvaimet ilmaisivat miR-31 matalammalla tasolla kuin vastaava ei-kasvainkudoksessa, kun taas muut kasvaimet eivät ilmaisseet sitä ollenkaan. Niistä adenokarsinoomat tutkittu geeni annostus oli hieman alhaisempi aggressiivisempia kasvaimia (huonosti eriytetty tai kiinteät alatyypin kasvaimet). Nämä tulokset viittaavat siihen, miR-31 voi olla tukahduttava rooli karsinogeneesissä of adenokarsinoomien. Siten miR-31 voi olla pleiotrooppinen rooli kehitettäessä keuhkosyöpien eri histologisia tyyppejä. Ilmaisu on joitakin tunnettuja tavoitteista miR-31, kuten ITGA5, MMP16, ja RhoA [28], oli alustavasti tutkittu miR-31-transfektoitujen solujen ja keuhkosyövän soluja (kuvio S3). Kuitenkin, pakko ilmentyminen miR-31 ei vähentää mRNA-tasot näiden molekyylien. Kotimainen keuhkosyövän solulinjoja, ei havaittu korreloivan tason näiden molekyylien ja miR-31 tasoa eri histologisia tyyppejä (kuva S3). Tavoitteita miR-31 voivat vaihdella eri tilanteissa, ja monimutkainen välistä ylikuulumista tavoitteita voidaan ovat piilossa keuhkojen syöpäsoluja. Lisätutkimukset että kokonaisvaltaisesti tutkia alavirtaan tavoitteet oikeutettuja sen selvittämiseksi mahdollisten molekyylimekanismin taustalla kuinka miR-31 edistää syövän synnyn eri histologisia keuhkosyöpään.

Ei-syöpäkudoksissa näytteille vakavia vahinkoja ja tulehdus voimakkaasti ilmaisseet miR-31.

In situ

-hybridisaatioanalyysin vahvisti myös vahva ilmaus miR-31 uudistava epäneoplastisis- epiteelisolujen ja mesenkymaaliset solut. Siten miR-31 voidaan indusoida ärsykkeiden edistämällä solujen kasvua vasteena kudosvaurion ja ne voivat valvoa regeneratiivisen reaktioita. Muuttuneen ilmentymisen miR-31, onko se vaimentua tai voimistumista, voi aiheuttaa häiriöitä solun homeostaasin ja voivat myös osallistua neoplastisen transformaation.

analyysi tilan geenilokuksen osoitti, että homotsygoottinen deleetio miR-31-geenin lokus on yksi syy menetys sen ekspression keuhkosyövän solulinjat. Kuitenkin jotkut solulinjat, jotka säilytti miR-31-geenin lokus myös vakavasti vaimentunut sen ilme. Aiemmat tutkimukset raportoitu, että hypermetylaatiota DNA: n tai histoni promoottorissa lokukseen miR-31 isäntä geeni oli syy vakavan downregulation miR-31 rintasyöpiä [21] tai aikuinen T-solujen leukemiaa [29]. Kuitenkin meidän tulokset kokeesta käyttäen estäjät DNA metyylitransferaasi ja histonideasetylaasi eivät tue osallistumista epigeneettiset muutoksia vaimennus miR-31 ilme. Metylaatiospesifinen PCR ja bisulfaatti sekvensointi analyysit eivät myöskään pystyneet osoittamaan kausaalinen suhde DNA hypermetylaatiota promoottorin ja tällaiset vakavat vaimennus. Mahdollinen mekanismi muu kuin epigeneettisellä muutos saattaa olla mukana downregulation Mir-31 ilme. N oletettu promoottori lokukseen miR-31 isäntä geeni sisältää useita CCAAT tehostinelementteihin [30]. CCAAT elementti sitova proteiini (C /EBP) -β havaittiin indusoivan miR-31 ilmentyminen hengitysteiden epiteeli vastauksena tiettyihin ulkoisiin ärsykkeisiin [30]. C /EBP-α osoitettiin vakavasti vaimentua sisään keuhkosyövässä [31] – [34], ja se voi olla syy häiriintyneestä ilmentymisen miR-31. Tutkimus mahdollisesta osallistumisesta C /EBP perheensä vaimennus miR-31 ilmentyminen keuhkosyövässä on perusteltua. Samaan aikaan ei-syöpä kuolemattomaksi hengitystie-epiteelin solulinjat transformoitu SV40: n suurta T-antigeeniä (NHBE-T, HPL1D, ja HPL1A), jossa p53 ja RB-välitteisten reittien on inaktivoitu, havaittiin ilmentävän miR-31 merkittävästi alemmilla tasoilla kuin pieni hengitysteiden epiteelisolujen (SAEC) ja keuhkoputken epiteelisolut (NHBE). Tämä virusperäinen antigeeni voi suoraan ja välillisesti ilmentymisen moduloimiseksi miR-31.

Yhteenvetona tulokset toteamme, että muuntunut ilmaus miR-31 johtuen joko vahvistus tai menetykseen sen isännän geenilokuksen voi osallistua keuhkojen syövän synnyn. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus kuvaamaan mahdollisia aiheuttava mekanismi taustalla muuttunut ilmentyminen miR-31 keuhkosyövässä.

tukeminen Information

Kuva S1.

kopio lukumäärät let-7i ja U6 snRNA mitattiin käyttäen kvantitatiivista RT-PCR. Anna-7i tasot normalisoitiin U6 snRNA tasolle. AEC, hengitysteiden epiteelisoluissa (ei-syöpäsoluja); ADC, adenokarsinooma; SQC, okasolusyöpä; LCC, suuri karsinooma solu; SCC, pienisoluinen karsinooma.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0100581.s001

(TIF) B Kuva S2.

biologinen vaikutus palauttaminen miR-31 on keuhkosyöpä solulinja (LC2AD) esitetään. Pro-retrovirus vektori pLHCX (BD Clontech) varustettujen DNA-fragmenttien lukien miR-31 koodaava alue (MIMAT0000089) reunustavat noin 100 emäsparia marginaalin molempiin suuntiin, saatiin. Retrovirus-vektorit (tyhjän vektorin (mock), juosteelle miR-31 (SS), ja antisense-juoste miR-31 (AS)) infektoitiin, kuten samalla menetelmällä edellä kuvatulla tavalla [17]. Lyhyen valinta hygromysiini B (BD Clontech), elossa solut kerättiin ja laskettiin, ja 2,0 x 10

4 valittiin uudelleen ympättiin 10 cm: n maljalla. 15 päivän kuluttua solut olivat metanolilla kiinnitettyjen ja Giemsa-värjättiin (A). Välineet ja keskihajonnat (virhepalkkien) pesäkkeitä lukemien rinnakkaisessa kokeessa on esitetty (B). Soluista kasvatettiin ja johdetaan useita kertoja. Kasautua populaation kaksinkertaistumista esitetään (C). Solut kerättiin heti valintaprosessin tutkittiin ekspressiota miR-31 ja U6 snRNA kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Taso miR-31 normalisoitu kuin U6 snRNA on esitetty (D).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0100581.s002

(TIF)

Kuva S3.

kopio numerot ITGA5, RhoA, MMP-16, ja GAPDH mRNA mitattiin käyttäen kvantitatiivista RT-PCR. ITGA5 (A), RhoA (B), ja MMP-16 (C) tasot normalisoitiin GAPDH-tasojen on esitetty. AEC, hengitysteiden epiteelisoluissa (ei-syöpäsoluja); TRAS, LC2AD keuhkosyövän solulinjaa – pohjainen transfektanteilla (tyhjän vektorin (MOCK), juosteelle miR-31 (SS), ja antisense-juoste miR-31 (AS)); ADC, adenokarsinooma; SQC, okasolusyöpä; LCC, suuri karsinooma solu; SCC, pienisoluinen karsinooma.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0100581.s003

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme erityisesti EMI HONDA ja Misa Otara (Kanagawa prefektuurin Verenkierto ja Respiratory Center Hospital, Yokohama, Japani) niiden apua.