Krooninen sairaus

tiivistelmä

immunoterapioiden kuten otto- siirto T-solujen tai luonnollisten tappajasolujen, tai monoklonaalinen vasta-aine (MoAb) käsittely on hiljattain tunnustettu tehokas keino hoitaa syöpäpotilaita. Kuitenkin, otto- siirto B-solujen tai plasmasolujen tuottavat kasvain-spesifisiä vasta-aineita ei ole käytetty, koska terapiassa, koska pitkän aikavälin kulttuurin ja selektiivinen laajentaminen antigeenispesifisiä B-soluja on ollut teknisesti hyvin vaikeaa. Tässä kuvaamme uuden syövän immunoterapia, joka käyttää B-solujen adoptiivisen siirron. Osoitamme, että siemennestettä-keskus kaltaisten B-solujen (iGB solut) indusoi in vitro hiiren naiiveja B-solut muuttuvat plasman soluja ja tuottaa IgG yli kuukausi luuytimessä ei-säteilytetty saajahiiret. Kun siirretään hiiriin, iGB solut tuottavat vasta-ainetta vastaan ​​korvike tuumoriantigeeniä tukahdutetaan keuhkometastaasitestissä ja kasvua hiiren melanoomasolujen ilmentävät saman antigeenin ja pidensi elinaikaa vastaanottajien. Lisäksi olemme kehittäneet uuden kulttuurin järjestelmää kutsutaan FAIS selektiivisesti laajentaa antigeenispesifisten iGB soluja käyttämällä, että iGB solut ovat herkkiä Fas-indusoitua solukuolemaa, ellei niiden antigeenin reseptorit liitettiin kalvoon sitoutuneiden antigeenien. Valitut iGB solut tehokkaasti tukahdutettu keuhkometastaasitestissä melanooman solujen adoptiivista immunoterapiaa mallia. Koska ihmisen veren B-soluja voidaan lisätä, kuten iGB soluihin käyttäen viljelyolosuhteet samanlainen hiiren iGB soluviljelmät, meidän tiedot osoittavat, että on mahdollista hoitaa syöpää kantavia potilaita adoptiovanhemmat siirto syöpää antigeenispesifisten iGB valittujen solujen vitro. Tämä uusi adoptiivinen immunoterapia olisi vaihtoehto työlästä kehittämiseen MoAb lääkkeiden syöpiä vastaan, joille ei ole tehokkaita hoitoja on tällä hetkellä olemassa.

Citation: Moutai T, Yamana H, Nojima T, Kitamura D (2014) uuden ja tehokas Syöpä immunoterapia Mouse Model käyttäminen Antigeenispesifisen B soluista in vitro. PLoS ONE 9 (3): e92732. doi: 10,1371 /journal.pone.0092732

Editor: Yoshiki Akatsuka, Fujita Health University, School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 28 joulukuu 2013; Hyväksytty: 24 helmikuu 2014; Julkaistu: 19 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Moutai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Takeda Science Foundation, Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (B) (22390097) Japanista Society for Promotion of Science (JSPS) ja Grants-in-tuki tieteellisen tutkimuksen Priority Areas (22021042) The Ministry opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan (MEXT) (DK), ja avustukset-in-tuki JSPS Fellows (TM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

immunoterapia on viime aikoina laajalti hyväksytty tehokas keino hoitaa syöpäpotilaita. Pääasiallinen toimija soluvälitteinen syövän immunoterapiassa on sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) on suunnattu tuumorisoluissa, jotka tunnistavat kautta T-solureseptorin (TCR) tietyn peptidin, joka on johdettu kasvaimen antigeeni (Ag) esittämä MHC I on kasvainsoluja. Tällaiset T-solut poistetun kasvaimen kudoksista tai potilaiden verestä selektiivisesti laajennetaan in vitro syngeenisillä Ag esittelevien solujen (APC: t), jotka ekspressoivat kasvaimen Ag sytokiinien, kuten IL-2 ja sitten siirretään takaisin potilailla [1], [2]. Suhteellisen ei-versioita solun immunoterapian on myös testattu kliinisesti, mukaan lukien ne, joissa käytetään T-solujen ja NK-solujen laajentunut stimulaatio IL-2 ja anti-CD3-vasta-aineita (Ab: t), kanssa /ilman sytokiinien [3], [4] . Äskettäin in vitro laajennettu dendriittisolut (DC: t), jotka ovat erittäin tehokkaita APC, on käytetty myös edistää kasvaimen-Ag-spesifisten CTL: ien sekä CD4

+ T-solujen in vivo [5] – [7]. Näiden hoitojen perustuvat adoptiovanhemmat solujen siirto ei toistaiseksi ole ollut yleisesti hyväksytty vaihtoehto syövän hoidossa, koska heidän kliininen menestys on ollut rajallista, kun ne vaativat aikaa vievää laboratorio, myös yksittäiset soluviljelmissä useita viikkoja on laatua valvotaan clean room .

Toisaalta, Ab-immunoterapian on kasvanut nopeasti lupaavana syövän immunoterapia. Itse asiassa yli tusina monoklonaalinen Ab (MoAbs) on nykyisin hyväksytty syövän hoitoon ihmisillä [8] – [10]. Koska syövän huumeiden, MoAbs on valtava ansioita verrattuna kemoterapiaa, koska ne kohdistuvat vain soluihin, jotka ilmentävät erityistä Ags. Biokemiallinen luonne ja biologiset ominaisuudet jokaisen isotyyppi Abs ovat hyvin tunnettuja, ja niin ovat mekanismeja, joilla ne välittävät kohde- solujen hajoamista, nimittäin, Ab-riippuvainen soluvälitteinen sytotoksisuus (ADCC) ja komplementista riippuva sytotoksisuus (CDC) [11], [12]. Kuten luonnollisesti nykyisten proteiineja kaikkia yksilöitä, Abs odotetaan olevan vähemmän sivuvaikutuksia, ja sellaisena se on helpompi ennustaa niiden käyttäytymistä kuin huume. Verrattuna soluvälitteinen immunoterapioiden edellä on kuvattu, Ab-välitteinen immunoterapia on yksinkertaisempaa suorittaa, jos tarjonta MoAb on riittävä. Kuitenkin MoAb lääkkeet myös haittapuolia: ne ovat kalliita ja niiden kehittäminen on edelleen haastava, vaativat huomattavasti aikaa ja kustannuksia, eläinten immunisointiin, seulonnalla hybridoomien, jotta geenikloonaus ja rekombinaatio menetelmät niiden inhimillistämisen, mikä on tarpeen, jotta vältettäisiin immuunivaste vastaanottaja [10], [13]. Kasvaimen Ags että MoAb lääkkeet kohteena ovat tyypillisesti transmembraaniproteiineja, jotka ovat usein vaikea valmistaa liukoisena immunogeeninä. Lisäksi jopa humanisoitu MoAbs, jäljellä hiiren johdettuja segmenttejä V-alue voi olla antigeeninen ihmisissä ja indusoivat ihmisen anti-hiiri-Ab: [14]. Koska näistä asioista, lääkeyhtiöt pyrkivät rajoittamaan MoAb tavoitteet niille ilmaisemat suhteellisen yleisimmistä syövistä.

Koska edellä mainitun ansioita MoAb huumeiden ja ansioita adoptiovanhemmat solun siirron hoitojen olevan pääasiassa mittatilaustyönä ja halvempi kehittää, se tuntuu uskottavalta kehittää hoidon siirtää potilaasta peräisin plasman soluja, jotka tuottavat kasvain-Ag-spesifisten, täysin ihmisen Ab. Olemme kuitenkin tietämätön mistään, jos tällainen hoito on onnistunut. Plasma solut ovat terminaalisesti erilaistuneita soluja ja siten eivät kykene kasvamaan viljelmässä. Sen sijaan, B-solujen, joka on suora prekursori plasman soluja, voidaan käyttää siirtoon. Vaikka B-solut ovat osoittautuneet vaikeiksi laajentua riittävästi adoptiiviseen siirtoon hoitoa. Lisäksi ei ole osoitettu, onko ja missä määrin siirretty B-solut voivat selviytyä ja erilaistua plasman soluja in vivo.

Tavallisesti MoAbs johdetaan antigeenispesifisten hybridoomat, hybridisoluilla välillä pernan B-solut alkaen toistuvasti immunisoiduista eläimistä ja fuusiopartnerista plasmasy- solulinjassa. Eläinten immunisoitu tietyllä Ag, Ag-sitoutuneet B-solut aktivoituvat ja proliferoituvat muodostaen itukeskuksissa (GC) pernoissa tai imusolmukkeet. Vuonna GC, B-solut läpikäyvät isotyypin vaihtumiseen ja somaattisen hypermutaatiosta immunoglobuliinigeenien lisäämään affiniteettia niiden Ag reseptorien (B-solureseptorin, BCR). Niistä, B-solut, jotka ilmentävät BCR spesifinen immunisoitiin Ag selektiivisesti laajennetaan ja erilaistuneet muisti-B-solut tai pitkäikäisten plasman soluja (LLPCs) [15], [16]. Olipa lopullinen tehosteimmunisaatiota, Ag-spesifisten muisti B-solut aktivoituvat ja lisääntyvät tulla plasmablasts, joka yleensä muodostavat antigeenispesifisten hybridoomat. Näin ollen, vaikka Ag-spesifisten B-muistisolujen löytyy huomattava määrä immunisoiduissa yksilöt, antigeenispesifisiä B-solut ovat tavallisesti harvoin ei-immunisoitujen henkilöiden. Näin ollen minkä tahansa B-solujen adoptiivisen siirron hoito vaatisi menetelmä valikoivasti laajentaa harvinainen kasvain-Ag-spesifisten B-solujen erittäin polyklonaalinen reuna-B-solujen potilaista.

kehittää järjestelmä valikoivasti laajentaa kasvaimen -Ag-erityinen B-solujen adoptiivista siirtoa terapia, käytimme aiheuttama GC B (iGB) soluviljelmässä, äskettäin raportoitu [17]. Tässä järjestelmässä, hiiren naiivi B-solut viljellään peräkkäin IL-4 ja IL-21 on syöttölaite, joka ilmentää CD40L ja BAFF (40 LB), jolloin laajan leviämisen (jopa 10000-kertaisesti 8 päivää) ja luokka- kytketään B-solut, joissa on GC-fenotyyppi, kutsutaan iGB soluja. Sen jälkeen kun viljely IL-21 ja siirtyvät säteilytetään hiirissä iGB solut erilaistuvat plasmasoluiksi ja taipumus asuttaa luuytimen (BM) ja erittävät Abs [17]. Mukauttamalla tätä järjestelmää ihmisen B-soluista, olisi mahdollista valmistaa suuria määriä ihmisen B-soluista, jotka tuottavat täysin ihmisen Abs kun siirretään potilaisiin. Kohti tavoitteemme luoda B-soluvälitteinen adoptiovanhemmat siirto hoitoa syöpään, olemme arvioitiin hiirimallissa, kuinka paljon ja kuinka kauan siirretyn iGB solut tuottavat Ab ei säteilytetty hiiret, ja ne estävät syöpäsolujen kasvua, jotka ilmaista Ag tunnustettu saman Ab in vivo. Lisäksi, käyttämällä iGB kulttuurin tekniikkaa, olemme kehittäneet järjestelmän, valita suhteellisen harvinaisia ​​B-solut, jotka sitoutuvat kalvoon sitoutuneen Ag, ja osoittivat, että valitut B-solut ovat tehokkaita adoptiivisen siirron syövän immunoterapiaa malli.

tulokset

iGB solut asuttaa Bone Marrow ja Tuota Ab siirtämisen jälkeen ei säteilytetty Hiiret

Kuten kerroimme aiemmin, useimmat iGB solut kuluessa toisen viljely IL-21 ovat läpikäyneet luokkavaihdoksen ja ilmaista joko IgG1 tai IgE päivällä 8. Hyvin harvat niistä ilmaista IgM, IgG2b tai IgA, ja melkein kukaan nimenomaista IgG2c tai IgG3 (kuvio 1A). Osoitimme aikaisemmin, että iGB solut erilaistuvat plasman soluja luuytimessä (BM), kun ne siirrettiin säteilytettyihin hiiriin. Täällä arvioimme Ab tuotannosta peräisin iGB johdettuja plasma solujen ei-säteilytettyjen hiirten. IGB solut syntyvät Hy10 hiiristä, joihin liittyy kananmunan lysotsyymiä (HEL) erityinen raskaan ketjun (VDJ9) ja kevyen ketjun (κ5) geenejä knock-in ja siirtogeenisiä kokoonpanoissa, vastaavasti [18]. Niistä iGB solujen IgE

– CD138

– HEL-sitovia (HEL

+) solut FACS-puhdistettiin ja siirrettiin ei-säteilytetty C57BL /6 (B6) hiiriä, jotka otettiin verta viikoittain mittaamaan pitoisuus anti-HEL lgG1. Kuten kuviossa 1B, korkeatasoinen HEL-erityisiä IgG1 havaittiin seerumista viikon kuluttua siirrosta, ja sitten se vähitellen laski alhainen, mutta silti havaittavissa taso ( 1 ug /ml) 10 viikon ajan. Anti-HEL IgG1 ei ollut havaittavissa seerumeissa ohjaus hiirillä, jotka saivat iGB solut, jotka ovat peräisin WT B6 hiirissä. Merkittäviä määriä anti-HEL IgG1 Ab-tuottavia soluja (APC: t), havaittiin BM, mutta hyvin harvat pernassa, hiirten, jotka saivat Hy10 johdettuja iGB solujen 4 viikkoa aikaisemmin (kuvio 1C). Anti-HEL Ab IgG2b luokan, mutta ei IgG2c tai IgG3 (tietoja ei esitetä), oli myös havaittavissa viikon kuluttua siirto Hy10 johdettujen iGB soluissa, mutta ei WT iGB soluja (kuvio 1 D). Vaikka tarkkaa pitoisuus IgG2b anti-HEL ei voitu arvioida, koska ei ole standardin isotyypin anti-HEL Ab IgG2b tiitteri oli paljon alhaisempi kuin anti-HEL lgG1 (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että in vitro syntyy iGB solut kykenevät erilaistumaan plasman soluja, jotka asuttaa BM ei-säteilytettyjen hiirien ja voivat edelleen tuottaa Ab siellä vähintään 4 viikon ajan.

(A ) Pernan B-soluja C57BL /6-hiiristä viljeltiin 4 päivää IL-4, sitten 4 päivää IL-21 on 40 LB-soluissa. Ilmentymisen Ig-isotyyppien, CD19 ja CD138 laajennetussa iGB solut analysoitiin virtaussytometrialla. Tiedot edustavat solujen lymfosyyttien portin määritelty sivu- ja sirontamittari. Numerot osoittavat prosenttiosuudet iGB solujen neljännesten tai ikkunoita. Esitetyt tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (B) naiivi, HEL-sitova tai kokonaan B-soluja pernat Hy10 tai WT C57BL /6-hiirissä, vastaavasti, viljeltiin kuten (A). Viljelyn jälkeen iGB solut kerättiin ja CD138

– IgE

– iGB soluja (2 x 10

7 solua /hiiri) puhdistettiin ja siirrettiin i.v. osaksi ei-säteilytetty C57BL /6-hiiristä. PBS: ää injektoitiin myös kontrollina. Nämä hiiret verta ilmoitettuina viikon kuluttua siirrosta ja seerumin anti-HEL lgG1 konsentraatio määritettiin ELISA: lla. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. Yksittäisten hiirten seerumista (n = 5 kussakin ryhmässä). Data edustaa kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta. (C) HEL-sitoutumisen tai täydellisen B-soluja viljeltiin ja siirretään ei-säteilytettyjen hiirten (B). Neljä viikkoa siirron jälkeen, numerot AFCs erittävät HEL-sitova lgG1 joukossa pernan tai luuytimen solut määritettiin ELISPOT-määrityksellä. Keskimääräinen lukumäärä ± S.D. n AFCs 10

6 pernan tai BM-soluissa osoitetaan kunkin bar. Näkyy ovat kollektiivisia tietoja kolmen erillisen kokeen, joissa kussakin käytetään 3 vastaanottaja hiirtä ryhmässä. * P 0,001. Määr .: ei havaittu. (D) anti-HEL IgG2b-tiitterit seeruminäytteistä (10-kertaiset laimennokset) saatu 1 viikko (B) määritettiin ELISA: lla. Kukin arvo on keskiarvo ± S.D. Näytteiden (n = 5 per kukin ryhmä). Tiedot edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

iGB Solut esto keuhkometastaasitestissä Hiiren melanoomasolujen in vivo

Nämä tulokset viittaavat mahdolliseen soveltamisen iGB soluviljelmässä kliinisessä käytössä, nimittäin Ab välittämän syövän hoidossa. Testasimme tämä mahdollisuus on hyvin tutkittu hiirimallissa kasvaimen etäpesäke käyttäen B16 hiiren melanoomasolulinja. Käytimme B16-solujen kalvoon ankkuroitunut muoto HEL (mHEL) [19] korvikkeena kasvain Ag, ja tuotti transfektantin klooni homogeeninen HEL ilmentymisen solun pinnalla, jota kutsutaan B16-mHEL (kuvio 2A). Testasimme HEL-erityisiä iGB solujen voi estää etäpesäkkeiden ja kasvua B16-mHEL solujen in vivo tuottamalla anti-HEL Abs. Koska HEL-sitoutumisaffiniteetti Hy10 pernan B-solujen tiedetään olevan heterogeeninen [18], me järjestetty niitä voimakkaasti sitoutuvia HEL päässä Hy10 pernan B-soluja ja viljellään niitä 40 LB feeder-soluja 3 päivää IL-4 ja sen jälkeen 3 päivää IL-21 tehdä iGB soluihin. Pernan B-soluja WT B6-hiiret olivat myös viljeltiin rinnakkain. IgE

– CD138

– B-solut lajiteltiin Hy10 iGB (Hy10-iGB) tai WT iGB (WT-iGB) soluja, tai vain PBS: ää kontrollina, injektoitiin sitten i.v. osaksi ei säteilytetty B6-hiiret, jotka olivat saaneet B16-mHEL 24 h ennen (kuvio 2B). Keuhkot Vastaanottajan hiiret tarkastettiin 3 viikkoa myöhemmin. Keuhkot hiiristä, jotka saivat WT iGB soluja tai vain PBS: ää, oli lukuisia möhkäleitä laajalti kasvainsolujen, enimmäkseen fuusioimalla toistensa kanssa muodostaen erottaa massat. Sitä vastoin, vain muutamia pieniä paakkuja kasvainsolujen havaittiin hiirillä, jotka olivat saaneet Hy10 iGB soluja (kuvio 2C). Kontrollina hiiriä inokuloitiin vanhempien B16-solujen kehittänyt lukuisia keuhkokasvaimia vaikka potilasta hoidettiin Hy10 iGB soluja (tietoja ei esitetty).

(A) ilmentyminen HEL Ag on B16-solut, jotka on transfektoitu mHEL ilmaisu vektori (B16-mHEL). B16-mHEL solut värjättiin anti-HEL lgG1 MoAb (musta viiva), tai isotyyppi-sovitettua kontrolli MoAb (varjostettu), ja sen jälkeen APC-konjugoidun anti-hiiri-lgG1 Ab, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Numero osoittaa prosenttiosuuden mHEL ilmentävien solujen. Data on edustaja kaksi toisistaan ​​riippumatonta koetta. (B) Experimental strategiaa. IgE

– CD138

– iGB soluja (2 x 10

7 solua /hiiri) johdettu HEL-sitova pernan B-solujen Hy10 hiirten (Hy10-iGB) tai koko pernan B-solut WT C57BL /6 hiirissä (WT-iGB), tai PBS: ää yksinään siirrettiin iv osaksi ei säteilytetty C57BL /6-hiiret, jotka oli siirretty i.v. B16-mHEL (C, D, E) tai B16-mHEL-GFP (F, G) soluja (2 x 10

5 solua /hiiri) 24 tuntia ennen. (C) Valokuvia keuhkoihin vastaanottajan hiiriä on kuvattu (B) 3 viikkoa siirron jälkeen. Kuvia kaksi hiirtä satunnaisesti valittu kymmenen per ryhmä näkyvät. Kun mahdollista, keuhkot loput hiiret silmämääräisesti kuolinpäivä. Ei-käsitellyillä ryhmillä oli fuusio yksittäisten etäpesäkkeiden osaksi erittäin suuri kasvain massoja, joten se merkityksetöntä laskea määrän kasvaimia. (D) Survival määrä samoja hiiren ryhmiä (n = 10 ryhmää kohti) kuin (B) verrattiin käyttäen logrank testiä. * P 0,001. (E) pitoisuus seerumin anti-HEL lgG1 samalla käytetyt hiiret (D) määritettiin ELISA: lla osoitetuissa aikapisteissä. Avoin ja suljettu symbolit osoittavat arvot yksittäisten näytteiden ja keskiarvot kunkin ryhmän, vastaavasti. Tiedot (D) ja (E) ovat edustavia neljä samanlaisia ​​kokeita. (F) sitoutuminen anti-HEL IgG1 B16-mHEL solujen keuhkojen kasvain kantavien hiirten. Keuhkot hiiristä, jotka olivat saaneet Hy10 iGB soluja (musta viiva) tai PBS: ää (varjostettu) ja B16-mHEL-GFP-soluja (2 x 10

5 solua /hiiri), kuten kohdassa (B) leikattiin 3 viikkoa siirron jälkeen. Yksisolukerrosviljelmänä keuhkoista värjättiin anti-hiiri-lgG1-APC ja analysoitiin FACSCantoII. Edustavia histogrammit näytteistä eroteltiin GFP

+ solut näkyvät. (G) Yhteenveto esitetyissä kokeissa (F). Pylväät edustavat keskiarvoja ± S.D. ja geometriset keskiarvot (geom. keskiarvo) APC fluoresenssin voimakkuus GFP

+ soluja hiiriltä kussakin ryhmässä (n = 3). Tiedot edustavat kahden riippumattoman kokeen. ** P 0,05.

Pitkän aikavälin tarkkailu samoja hiirillä että hiiret siirtyvät Hy10 iGB solujen selvisivät huomattavasti kauemmin kuin luovutetussa WT iGB solujen tai vain PBS: ää (kuvio 2D ). Näistä hiiristä, seerumin anti-HEL lgG1 havaittiin suhteellisen korkea pitoisuus alkuvaiheessa ajankulun vain hiirillä siirretään Hy10 iGB soluja, vaikka Ab pitoisuus laski vähitellen (kuvio 2E). Voisimme osoittaa virtaussytometrialla, että anti-HEL IgG1 sitoutunut B16-mHEL otetaan soluja keuhkokasvaimia ex vivo 3 viikkoa siirron jälkeen Hy10 iGB soluja (kuvio 2F ja 2G). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että HEL-spesifisten Ab: tuottama iGB-soluista peräisin plasman soluja suoraan inhiboi kolonisaation ja /tai kasvua B16-mHEL solujen keuhkojen ja pidensi elinaikaa vastaanottajan hiirillä. Mahdollisia mekanismeja Ab välittämää tuumorisuppressiogeeneksi ja mahdollisia syitä lopulta kuolemaan käsiteltyjen hiirten käsitellään alla.

Kehitetään Culture System valikoivasti laajentaa antigeenispesifisten iGB Cells

näiden in vivo tutkimukset esittivät, että se voisi olla mahdollista käyttää iGB-soluvälitteistä kasvaimen hoidossa ihmisillä. Kohti tätä varten olisi tarpeen valita oletettavasti harvinaisia ​​B-soluja, jotka ovat spesifisiä tietylle kasvaimen Ag. Siksi meidän ensin yrittäneet kehittää malli järjestelmä rikastuttaa ja laajentaa Ag-spesifisten hiiren B-solujen läsnä vähäisinä määrinä polyklonaalisen B-solun allas. Suunnittelimme järjestelmä, joka perustuu Fas /FasL-välitteistä apoptoosia, koska oleellisesti kaikki iGB solut ilmentävät Fas [17], ja ovat herkkiä Fas-välitteistä apoptoosia (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi, iGB solut tulevat vastustuskykyisiksi Fas-välitteistä apoptoosia, kun niiden IgG1 BCR liitetään kalvoon sitoutuneiden Ag (tuloksia ei ole esitetty), kuten aikaisemmin on raportoitu aktivoitu IgM

+ B-solujen [20]. Näin ollen vain Ag-sitoutumisen iGB solut selviävät hengissä olosuhteissa, joissa Fas on mukana (kuvio 3A). Tämän hypoteesin testaamiseksi valmistimme mallin järjestelmän ja syntyy kaksi uutta syöttölaite solulinjat, 40 LB-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti korvike Ag mHEL (40 LB-mHEL) ja ne, jotka ekspressoivat stabiilisti mHEL ja FasL (40 LB-mHEL-FasL). Aloitimme iGB soluviljelmät tavanomaisten 40 LB feeder-solujen seos pernan B-soluja CD45.1

+ Hy10 hiirillä ja CD45.2

+ WT-hiirissä suhteessa 1:99. Sen jälkeen, kun peräkkäiset viljely IL-4 ja IL-21 40 LB-soluja (laajennus), laajennetun iGB solut maljattiin 40 LB-mHEL feeder-soluja ja viljeltiin 6 tuntia (Ag-stimulaatio), ja sitten maljattiin 40 LB -mHEL-FasL 8 tuntia (valinta), ja lopulta 40 LB 5 päivää (palautus) IL-21 läsnä koko jälkeen kasvuvaiheessa. Nämä erityiset olosuhteet määritettiin monien tutkimusten eri asetuksia (kuva 3B). Kun kasvuvaiheessa, varmistimme, että osuus CD45.1

+ HEL-sitovia soluja pysyi 1% (kuvio 3C). Osuus pysyi samana, kun Ag-stimulaatio kulttuuri, ja teki niin kontrolliviljelmässä 40 LB tukisoluja samoin, vaikka intensiteetti HEL värjäyksen tuli pienempi entisessä luultavasti siksi, että BCR oli sisäistetty (kuvio 3D, ”valitut ”). Kun myöhemmin valintaa ja hyödyntämistä vaiheet kuitenkin osuutta CD45.1

+ HEL-sitovan-solujen määrä nousi jopa -80% keskimäärin taas väkevöimättömien nähtiin jälkeen rinnakkain kontrolliviljelmässä 40 LB soluissa ( ”non -selected ”). Valitun iGB solut enimmäkseen ilmaistuna BCR IgG1-isotyyppiä (tuloksia ei ole esitetty). Käyttämällä ”valittu” protokolla, keskimäärin 3 x 10

5 HEL-sitovan B-solut talteen viljelmän, joka alkoi 10

4 tällaisia ​​soluja joukossa 10

6 B-solut yhteensä (kuvio 3E ja 3F). Niinpä olemme laatineet valikoima kulttuuri-protokolla, joka mahdollistaa tehokkaan rikastaminen ja laajentaminen Ag erityisiä B-solut, jotka ovat läsnä pieni väestö joukossa valtaosa epäspesifisten polyklonaalista B-solut. Me kutsumme tätä valintaa järjestelmän ”Fas-välitteisten antigeenispesifisen iGB solun valinnan (FAIS) järjestelmä”. Olemme myös onnistuneet rikastuttaa iGB soluja, jotka ovat spesifisiä hapteeni-4-hydroksi-3-nitrofenyyli asetyyli (NP), alun perin läsnä -5%, jopa -80% olennaisesti samalla järjestelmän avulla FasL-ilmentävien 40 LB soluilla NP-konjugoidun proteiinin pinnalla (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Kaavamainen esitys periaatteen Fas-välitteisen Ag-spesifisen iGB solun valinnan (FAIS) järjestelmä. Vain iGB soluja, joiden BCR ligoidaan Ag esitetty syöttösoluja tulevat vastustuskykyisiksi kuolemaan kautta Fas-ligaation jonka FasL samalla syöttösoluja. (B) Menetelmä FAIS järjestelmän. Pernan B-soluja CD45.1

+ Hy10 hiirillä ja CD45.2

+ WT hiiret sekoitettiin suhteessa 1:99 (1%), ja viljeltiin 40-LB tukikerroksen kanssa IL-4 3 päivää ja sen jälkeen IL-21 2 päivää. Tuloksena iGB solut vaiheittain viljelty syöttölaite kerrosta 40 LB-mHEL 6 h (Ag-stimulaatio), 40 LB-mHEL-FasL 8 h (valinta), ja 40 LB 120 tuntia (hyödyntäminen) on ”valittu” protokolla. Kun ”valitsematta” protokolla, sopiva määrä iGB solujen maljattiin uudelleen on syöttölaite kerros 40 LB solut samalla ajoitus kuin ”valittu” protokolla. Kullakin hetkellä päällehitsaus iGB solut eristettiin syöttölaite, IgE

+ ja CD138

+ solujen molempia protokollia. (C-E) edustaja virtaussytometristen profiileja (HEL-sitova vs. CD45.1; aidatulla CD19

+ solua) sekoitetun iGB solut ennen Ag-stimulaation vaihe (0 h, C), kun Ag stimulaatio vaihe (6 h, D), ja sen jälkeen elpyminen vaihe (134 h, E). Kullakin ajanhetkellä, puhdistettua iGB solut värjättiin biotinyloidulla HEL ja streptavidiini-APC, anti-CD19 ja anti-CD45.1 Abs ja analysoitiin virtaussytometrialla. Profiilit iGB solujen viljellä ”valittu” (vasen) tai ”ei-valittu” (oikealla) protokolla on esitetty. Numerot kussakin ikkunassa edustaa prosenttiosuutta Hy10 iGB solujen (CD45.1

+, HEL-sitova) osuus koko CD19

+ iGB soluja. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (F) absoluuttinen määrä (vasemmalla) ja prosenttiosuus (oikealla) on Hy10 iGB solujen palauttamisen jälkeen kulttuurin kanssa joko ei-valitun tai valitut protokolla määritettynä analyysin kuvan (E) esitetään keskiarvoina ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * P 0,05. ** P 0,01.

Seuraavaksi tutkittiin, vähemmän Ag-spesifisten B-solujen epäspesifistä allas voitaisiin rikastaa, ennakointi mahdollisuus käyttää tätä järjestelmää kliiniseen käyttöön. Tällä kertaa aloitimme viljelmiä CD45.1

+ Hy10 pernan B-solut sekoitetaan taajuudella 0,1 tai 0,01%, 1 x 10

6 WT B6 pernan B-solut (CD45.2

+) , jonka taajuus on vahvistettu juuri ennen Ag-stimulaatio kulttuurin iGB soluja (kuvio 4A). Kukin B-solujen seos viljeltiin mukaisesti FAIS järjestelmään ( ”valikoitu”) tai pelkästään 40 LB soluihin verrokkina ( ”ei-valittu”). Kun palautus kulttuuri, HEL-sitovan iGB solut rikastetaan -40% ja -10%, kun se alun perin läsnä 0,1% ja 0,01%, vastaavasti (kuvio 4B ja 4C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että hyvin harvinaisia ​​Ag-spesifisten B-solujen, niinkin vähän kuin 1 10

4, voitaisiin rikastaa ja laajennetaan toistamalla FAIS kulttuuriin protokollaa.

(A ja B) pernan B-soluja CD45.1

+ Hy10 hiiret sekoitettiin taajuudella 0,1% tai 0,01%, 1 x 10

6 CD45.2

+ WT pernan B-solut. Sekoitettu solut (1 x 10

6) viljeltiin, kuten on kuvattu kuviossa 3B. On esitetty virtaussytometristen profiileja (HEL-sitova vs. CD45.1; aidatulla CD19

+ soluja) sekoitetun solujen ennen Ag-stimulaation vaihe (0 h, A) ja sen jälkeen elpyminen vaihe (134 h; B ) edustavassa kokeessa. Ilmoitettu määrä kunkin ikkunan osoittaa prosenttiosuuden Hy10 iGB solujen (CD45.1

+, HEL-sitova) osuus koko CD19

+ iGB soluja. (C) prosenttiosuus Hy10 iGB solujen talteenoton jälkeen kulttuurin joko ei-valitun tai valitut protokollan aloitetaan sekoitussuhde 0,1% (vasen paneeli, n = 3) tai 0,01% (oikea paneeli, n = 2), joka määritetään analysoimalla kuvan (B), on esitetty keskiarvoina ± SD ja riippumattomassa kokeessa. * P 0,01. ** P 0,05.

In-vitro Valittu Ag-spesifisen iGB solujen kasvaimien kasvua in vivo

Lopuksi testasimme, onko in vitro valittujen iGB solut ovat tehokas kasvainhoitojen että -melanoomaetäpesäkemallilla hiirissä. CD45.1

+ HEL-sitoutumisen B-soluja Hy10 hiiret sekoitettiin CD45.2

+ polyklonaalisten B-solujen WT B6 hiirissä suhteessa 1:99 ja viljellään FAIS järjestelmässä tai 40 LB-soluissa ei-valittujen ohjaus-, kuten on kuvattu kuviossa 3 (kuvio 5A). Kun palautus kulttuurin, taajuus HEL-sitovan iGB solut saavuttivat 85%, joka on yli 400-kertainen rikastus, kun FAIS kulttuurin verrattuna kontrolliryhmän viljelmässä (kuvio 5B). Siirsimme nämä iGB soluja (2 x 10

7) joko valitaan tai ei-valittu, tai vain PBS: ää, osaksi ei säteilytetty B6 hiiret, jotka oli siirretty 2 x 10

5 B16-mHEL soluja. Kolme viikkoa myöhemmin, B16-mHEL solut levitetään koko keuhkot ja muodostunut lukuisia möhkäleitä erikokoisia hiiret, jotka olivat saaneet ei-valittujen iGB soluja tai PBS. Sitä vastoin, vain pieni määrä kasvaimia, enimmäkseen pieniä kooltaan, havaittiin keuhkoissa hiiristä, jotka olivat saaneet valitut iGB soluja (kuvio 5C). Nämä tiedot osoittavat, että iGB soluja in vitro, jotka perustuvat niiden Ag sitova spesifisyys ovat edelleen kykenevät erilaistumaan plasman soluja in vivo ja inhiboimaan kasvainsolujen kasvua, jotka ilmentävät saman Ag.

(A) Experimental strategiaa. 1:99 seosta, pernan B-solujen CD45.1

+ Hy10 hiirillä ja CD45.2

+ WT hiiret alistettiin FAIS, kuten on kuvattu kuviossa 3B. Valittu tai ei-valittu iGB ​​solujen talteenoton jälkeen vaiheen, tai vain PBS: llä, injektoitiin ei säteilytetty C57BL /6-hiirillä, jotka oli siirretty i.v. B16-mHEL soluissa, kuten on kuvattu kuviossa 2B. (B) edustaja virtaussytometristen profiileja (HEL-sitova vs. CD45.1) ja iGB solujen palauttamisen jälkeen vaiheen ”valikoitu” ja ”ei-valittu” protokollia. Numerot kussakin ikkunassa osoittavat prosenttiosuuden Hy10 iGB solut (CD45.1

+, HEL-sitova; aidatulla CD19

+ solujen) joukossa yhteensä CD19

+ iGB soluja. (C) Valokuvia keuhkot hiiristä käsiteltiin kuten (A) 3 viikkoa siirron jälkeen. Edustavat kuvat kaksi hiirtä kolmesta on esitetty.

Keskustelu

tulosten perusteella käyttämällä hiirimallissa, tässä ehdotamme uuden järjestelmän adoptiovanhemmat siirto syövän immunoterapiaa käyttäen B-soluja. Tässä järjestelmässä, voidaan laajentaa naiivi B-solut tuottamaan suuri määrä GC-, kuten B (iGB) soluja ja niistä, harvoin Ag-spesifisten B-solujen voidaan valita ja edelleen laajennettiin FAIS järjestelmän käytettäväksi adoptiiviseen siirtoon terapiassa . Osoitimme, että siirretty iGB solut kolonisoivat luuytimessä ja tuotetaan Ab, pääasiassa IgG1-luokan, useita viikkoja. Käyttämällä tätä järjestelmää, osoitimme esimerkki tehokas syövän hoitoon. Siirto iGB solujen spesifinen korvike kasvaimen Ag (HEL) tukahdutti etäpesäke ja kasvua keuhkoissa melanooman soluissa, jotka ilmentävät saman Ag ja lisäsi elinaikaa vastaanottajan hiirillä. Jos tämä järjestelmä voidaan sovittaa toimimaan ihmisen B-solujen, B-solujen adoptiovanhemmat siirto pitäisi olla hyvin houkutteleva vaihtoehto MoAb syövän immunoterapiassa: se vaatii lyhyemmän ajan tunnistamisesta kasvaimen Ag käynnistää hoidon potilaista kuin tuottaa ihmistyyppiseksi MoAb, siis toimii mittatilaustyönä hoito, joka voitaisiin kohdistaa sairaudet esiintyy vähän. Lisäksi ihmisperäinen iGB soluista pitäisi tuottaa täydellistä ihmisen Ab vastaanottajan.

Tässä tutkimuksessa, on vielä virallisesti osoittanut, kuinka siirto iGB solujen johti tukahduttaminen melanooman kasvun keuhkoissa . Ottaen huomioon korkea seerumin tiitteri HEL-spesifisten IgG1 yllä vähintään 4 viikkoa siirron jälkeen (kuviot 1B ja 2E) ja sitovat tällaisten IgG1 on HEL-ilmentävien melanoomasolujen ex vivo (kuvio 2F ja 2G), kasvaimen suppression todennäköisesti välittää anti-HEL IgG1 tuotetaan iGB-soluista peräisin plasman soluja. Siten mekanismit vastaava tuumorisuppressiogeeneksi voi olla ADCC ja /tai CDC, samat mekanismit katsoneet MoAb lääkkeiden in vivo [9], [10]. Tässä suhteessa, edellisessä tutkimuksessa verrattiin eri isotyyppejä hiiren MoAbs niiden kasvaimen vastainen vaikutus in vivo sekä in vitro osoittivat, että IgG1 osoitti kohtalaista vaikutuksia in vivo ja in ADCC, mutta ei CDC, kun taas IgG2a oli tehokkain useimmissa tapauksissa, joissa IgG2b ja IgG3 on muuttuva joukossa raportteja erilaista MoAbs ja kohdesolujen [21] – [24]. Siten taipumusta B-solut ovat peräisin meidän hiiren iGB soluviljelmässä siirtyä lähes yksinomaan joko IgG1 tai IgE isotyyppien saattanut rajoittaa hoidon tehokkuus meidän hiirimallissa; kaikki hiiret, vaikka ne hoidettiin antigeenispesifisten iGB soluja, lopulta kuoli. On syytä huomata, että tällaiset hiiret kuolivat valtava möhkäleitä melanooman kasvaimia vatsaonteloon, mutta vain muutama pieni kasvaimia todettiin niiden keuhkot jopa kuoleman (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että anti-kasvain aktiivisuus Ab isotyyppien voi vaihtelevat kudosten soluttautuvat.