Krooninen sairaus

tiivistelmä

Fork-perälaatikko proteiini A1 (FOXA1) on ”edelläkävijä tekijä”, jonka tiedetään sitoutuvan androgeenireseptorin (AR) ja säätelevät transkriptiota AR-geenejä. Kuitenkin tarkka rooli FOXA1 eturauhassyövässä (PC) on edelleen tuntematon. Tässä tutkimuksessa, me raportoimme että FOXA1 on ratkaiseva rooli PC solujen lisääntymisen. Ilmaus FOXA1 oli korkeampi PC kuin normaalissa eturauhasessa kudoksissa (P = 0,0002), ja käyttäen immunohistokemiallinen analyysi, havaittiin, että FOXA1 on tumassa. FOXA1 ekspressiotasot olivat merkittävästi korreloivat sekä PSA: n ja Gleason tulokset (P = 0,016 ja P = 0,031, vastaavasti). Lisäksi FOXA1 ylössäätöä oli merkittävä tekijä PSA vika (P = 0,011). Köyhtyminen FOXA1 Eturauhassyöpätutkimuksessa solulinja (LNCaP) käyttäen Sirna (siRNA) esti merkittävästi AR aktiivisuutta, johti solujen kasvun tukahduttaminen, ja indusoi G0 /G1 pidätykseen. Anti-proliferatiivista vaikutusta FOXA1 siRNA oli välittyy insuliinin kaltaista kasvutekijää sitova proteiini 3 (IGFBP-3). Kasvu IGFBP-3, välittävät ehtyminen FOXA1, inhiboi fosforylaatiota MAPK ja Akt, ja lisääntynyt ilmentyminen solun lukiertosäätelijöistä p21 ja p27. Olemme myös havainneet, että anti-proliferatiivista vaikutusta FOXA1 ehtyminen merkittävästi kumota samanaikaisesti siRNA ehtyminen IGFBP-3. Nämä havainnot tarjoavat suoria fysiologisia ja molekyylitason näyttöä roolin FOXA1 säätelyssä solujen lisääntymisen kautta sääntelyn IGFBP-3: n ekspressio PC.

Citation: Imamura Y, Sakamoto S, Endo T, Utsumi T, Sulake M , Suyama T, et ai. (2012) FOXA1 Edistää syövän etenemisen eturauhassyöpä kautta Insuliini kasvutekijä sitova proteiini 3 Pathway. PLoS ONE 7 (8): e42456. doi: 10,1371 /journal.pone.0042456

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2012; Julkaistu: 03 elokuu 2012

Copyright: © Imamura et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan-in-tukea opetus-, tiede-, urheilu ja kulttuuri Japanin (no. 20390420, no. 22791469). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC), yleisin syöpä miehillä, on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat useimmissa länsimaissa ja yleistyy Aasian maissa sekä [1]. Hormoni androgen ja androgeenireseptorin (AR) ovat välttämättömiä normaalin kasvun, erilaistumisen ja ylläpito eturauhanen, ja ne myös on keskeinen rooli kehitettäessä PC [2]. Siten edenneen PC liittyy tuotanto estyy androgeenien tai antagonisoimaan AR ja sen kohdegeenien [1]. Kuitenkin PC pahenemisvai- hankinnan jälkeen kastraation vastarintaa. Tuore tutkimus osoitti, että alhainen sisäisen kasvaimen androgeenireseptorin aikana androgeeniablaatio hoidon edelleen aktivoida AR, mikä johtaa edelleen etenemisen PC etäpesäkkeiden [3]. Siksi jopa edennyt pitkälle PC, sääntely AR toiminta on tärkeää hoitoon PC.

Perustuen aiempaan mikrosiruanalyysi jossa vertasimme geenin ilmentymistä eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) ja PC, tunnistimme Fork-perälaatikon proteiini A1 (FOXA1) kuin geeni, jonka ilmentyminen on huomattavasti säädellään ylöspäin PC [4]. FOXA1 on transkriptiotekijä, joka kuuluu ihmisen forkhead laatikko geeniperheen, ja FOXA1 on mukana endodermaalinen organogeneesin, aineenvaihduntaa ja homeostaasin [5]. FOXA1 suoraan sitoutuu AR ja säätelee transkriptiota eturauhasen-spesifisten geenien [6]. FOXA1 toimii myös ”Pioneer tekijä” AR paikoissa transkription asetuksen [7], [8]. Siten sitoutuminen FOXA1 modifioituihin histoni liittyy aktiivinen chromatin helpottaa myöhempää rekrytointi tumareseptoreja ja transkription aktivointi [7], [8]. Useat linjat todisteet ovat sidoksissa FOXA1 eturauhasen kehittämiseen. Epiteelin FOXA1 ilmentyminen on havaittu kaikissa kehitysvaiheissa ja erilaistumista hiiren eturauhasen [6], [9]. FOXA1-defecient hiiren osoitettu vahinko eturauhasen morfogeneesin ja erilaistumista [9], [10]. FOXA1 vaikuttaa myös estrogeenin signalointia rintasyöpä, ja on liittynyt luminaalisen alatyypin ja hyvää ennustetta [11], [12]. Lisääntynyt FOXA1 ilme on havaittu myös koolon-, keuhko-, kilpirauhasen, ruokatorven syöpä ja eturauhassyöpä [13] – [15].

Vaikka FOXA1 liittyy eturauhasen kehittämiseen ja androgeenin sääntely, tarkkaa mekanismia miten FOXA1 osaltaan varten PC etenemisen, erityisesti sääntely FOXA1 riippuvaisten kohdegeenien PC edelleen suhteellisen tunnistamatta.

Tässä tutkimuksessa tutkittiin miten FOXA1 PC etenemistä. Havaitsimme insuliinin kaltainen kasvutekijää sitova proteiini 3 (IGFBP-3) uutena kohteena FOXA1 sääntelyä soluproliferaation PC soluissa.

Tulokset

Expression of FOXA1 in Prostate syöpä kudokset ja sen Korrelaatio kliiniset tekijät

Tutkimme proteiinin ilmentymistä FOXA1 PC immunohistokemiallisella analyysi (IHC) PC yksilöitä. Edustaja IHC tulokset FOXA1 proteiinin ilmentymisen normaalissa vieressä kasvain (NAT) ja PC kudoksissa on esitetty kuviossa 1A ja B. Positiiviset FOXA1 immunoreaktiivisuus havaittiin tumassa ja osittain sytoplasmassa. Vahva FOXA1 immunoreaktion havaittiin tumien solujen syöpä vaurio, kun taas solut NAT osoitti heikkoa immunovärjäystä pääasiassa sytoplasmassa. IHC tulokset FOXA1 värjäytymisen NAT ja PC vaurioiden vaihtelivat 30,2-123,0 (mediaani 73,3) ja 20,4-260,1 (mediaani, 125,1), tässä järjestyksessä. IHC tulokset FOXA1 värjäytymisen PC vauriot olivat huomattavasti korkeammat kuin NAT (kuvio 1 C, P = 0,0002). IHC pisteet, 62% PC näytteistä oli positiivinen FOXA1, kun taas loput 38% näytteistä olivat negatiivisia. Väliset korrelaatiot kliinis ominaisuudet potilailla, joilla on PC ja asema FOXA1 proteiinin ilmentymisen käyttäen IHC pisteytysjärjestelmä on esitetty taulukossa 1. Nämä tiedot osoittivat, että FOXA1-positiiviset PC korreloivat PSA-arvo (P = 0,016), Gleason pistemäärä tietokoneiden (P = 0,031) ja ilmentymistä AR (P = 0,002) (taulukko 1). Tietokoneita, jotka olivat positiivisia sekä FOXA1 ja AR oli merkittävästi korkeammat Gleason tulokset kuin tietokoneita, jotka olivat molemmat FOXA1- ja AR-negatiivinen (P = 0,027) (taulukko 2).

proteiinin ilmentymistä FOXA1 edustavissa viereisistä normaaleista kasvaimen (NAT) kudoksen (A) ja PC-kudoksen (B), kuten analysoitiin käyttäen IHC, on esitetty. NAT näkyy pieni FOXA1 proteiinin ilmentymisen. FOXA1-positiivista värjäytymistä havaittiin tapauksissa PC. Positiivinen FOXA1 immunovärjäys havaittiin tumassa. Alkuperäinen suurennos, × 400. (C) kvantifiointi FOXA1 värjäytymisen NAT ja PC kudoksiin. FOXA1 IHC tulokset laskettiin seuraavasti: IHC pisteet = 1 × (lukumäärä heikosti värjäytyneiden solujen alalla) + 2 x (lukumäärä kohtalaisen värjäytyneiden solujen alalla) + 3 × (lukumäärä voimakkaasti värjätään solujen alalla) . FOXA1 IHC pistemäärät normaalissa eturauhasessa kudoksia ja PC vaihtelivat 30,2-123,0 (mediaani 73,3) ja 20,4-260,1 (mediaani, 125,1), tässä järjestyksessä. Sääteli FOXA1 lauseke (D) oli merkitsevästi yhteydessä PSA vika (P = 0,011), mutta sääteli AR lauseke (E) ei (P = 0,4457). Log-rank tilastoja käytettiin testaamaan ero hengissäpysymisajat ryhmien välillä. FOXA1 (+), sääteli FOXA1; FOXA1 (-), alassäädetty FOXA1. AR (+), sääteli AR; AR (-), alassäädetty AR. ** Osoittaa tilastollista eroa P 0,01.

Survival analyysi käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä osoitti, että FOXA1 ylössäätöä oli merkittävä tekijä PSA vika (Kuva 1D ; log-rank testi, p = 0,011) verrattuna AR ylössäätöä (kuvio 1 E, log-rank testi, p = 0,4457). PSA epäonnistuminen eloonjäämislukuja tapauksia säädelty ja alassäädetty FOXA1 olivat 50,7 ja 87,7%, tässä järjestyksessä. PSA epäonnistuminen eloonjäämisluvut tapauksissa jopa säädelty ja alassäädetty AR olivat 58,5 ja 73,8%, tässä järjestyksessä.

arviointi FOXA1 Protein Expression in PC solulinjat

Seuraava tutkittu FOXA1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen PC kvantitatiivisen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) analyysi ja Western blotting vastaavasti neljä PC-solulinjat, mukaan lukien androgeenien riippumaton solulinja (PC-3 ja DU145), androgeenin herkkiä soluja line (LNCaP), androgeenireseptorin tunteeton solulinja (C4-2) perustetaan kastroitu isäntä LNCaP ja ei-tuumorigeeniset eturauhasen solulinja (RWPE-1) [16] – [19] (kuvio 2A). Molekyylipaino FOXA1 Western-blottauksella oli 49 kDa. Sekä FOXA1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen olivat merkittävästi korkeammat androgeenin herkän LNCaP-solujen ja C4-2-solut kuin muissa solulinjoissa.

(A) mRNA: n ilmentyminen ja proteiinin ilmentymistä FOXA1 neljä PC- solulinjat (PC-3, DU-145, LNCaP, C4-2) ja ei-tuumorigeeniset eturauhasen solulinja (RWPE-1) analysoitiin qRT-PCR ja Western blottauksella, vastaavasti. (B) LNCaP-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA (neg) tai yksi kolmesta eri FOXA1 siRNA: ita (siFOXA1 # 1-3). 48 tunnin kuluttua transfektion, RNA uutettiin ja FOXA1 mRNA analysoitiin käyttäen qRT-PCR-analyysi. FOXA1 mRNA: n ilmentymisen on ilmaistu suhteessa GAPDH-mRNA: n ilmentymisen samassa solussa. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ± S.E.M. Kolmen riippumattoman kokeen. Proteiinit uutettiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja FOXA1 ja GAPDH-proteiinin ilmentymistä tutkittiin Western blot-analyysit. (C, D) LNCaP-solut transfektoitiin pGL3-PSAP 5,8 lusiferaasireportteriplasmidi ja yhdellä kolmesta eri FOXA1 siRNA: t. (# 1-3) ja kasvatettiin sitten Fenolipunainen-RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 5% CS-FBS: ää. (C) 72 tunnin kuluttua transfektion, lusiferaasin aktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-lusiferaasireportteri- määritysjärjestelmää. Lusiferaasiaktiivisuudet ilmaistaan ​​suhteessa kontrolliin, joka oli annettu arvo 1. Proteiinit uutettiin 72 h transfektion jälkeen ja ilmaisu AR ja GAPDH tutkittiin Western blot -analyysillä. (D) Transfektoituja soluja inkuboitiin osoitettujen konsentraatioiden dihydrotestosteroni 72 tuntia, ja lusiferaasin aktiivisuudet mitattiin kuten kohdassa (C). (E, F) ei-transfektoituja LNCaP-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla dihydrotestosteroni (E) tai bikalutamidi (F) 48 tuntia, ja FOXA1-mRNA analysoitiin sitten käyttäen qRT-PCR: ää. FOXA1 mRNA: n ilmentymisen on ilmaistu suhteessa GAPDH-mRNA: n ilmentymisen samassa solussa. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD vähintään 3 itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. * Ja ** osoittavat tilastollista eroa P 0,05 ja P 0,01, vastaavasti.

Jos haluat saada soluja, joissa FOXA1 ilmentyminen tilapäisesti pudotettiin, transfektoimme LNCaP yhdellä kolmesta eri FOXA1 siRNA: illa (siFOXA1 # 1-3) plasmidit tai negatiivisella kontrolli siRNA (nega) plasmidi. Sitten analysoimme FOXA1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen näissä siFOXA1-transfektoiduissa soluissa käyttäen qRT-PCR ja Western blot analyysit, vastaavasti. SiFOXA1-transfektoiduissa soluissa näkyy vähentäminen FOXA1 mRNA-tasolla lähes 90% verrattuna, että nega-transfektoiduissa soluissa (nega). FOXA1 proteiinin tasot siFOXA1-transfektoiduissa soluissa oli myös vahvasti vähenikin nega-transfektoiduissa soluissa (kuvio 2B).

Vaikutus FOXA1 on androgeenireseptorin Toiminta ja vaikutus AR Aktivointi on FOXA1 Expression

vaikutuksen määrittämiseksi FOXA1 pudotus on AR aktiivisuutta, me transfektoitiin siFOXA1 transfektoitiin LNCaP-solujen kanssa lusiferaasin ekspressioplasmidin vetämänä prostataspesifisen antigeenin (PSA) promoottori, pGL3PSAp-5,8. Vaikka ei ollut eroa proteiinin ilmentymistä AR siFOXA1-transfektoituja soluja tai neg-transfektoiduissa soluissa, siFOXA1-transfektoidut solut osoittivat lähes 80% alenema PSA-promoottorin aktiivisuutta verrata kuin neg-transfektoiduissa soluissa (kuvio 2C). Kun ohjaus LNCaP-soluja, jotka oli vain transfektoitiin pGL3PSAp-5,8 käsiteltiin AR-ligandin dihydrotestosteroni (DHT), PSA-promoottorin aktiivisuus kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla. Kuitenkin kotransfektio näiden solujen kanssa siFOXA1 merkittävästi vähentää PSA-promoottorin aktiivisuus käsittelyn jälkeen eri pitoisuuksilla DHT (kuvio 2D). Katsoa vaikutuksen FOXA1depletion endogeeninen PSA ilmaisua, koska FOXA1 säädöksiä remontoida kromatiinin analysoimme PSA mRNA: n ekspression siFOXA1-transfektoiduissa soluissa käyttäen qRT-PCR. Kuvio S1A osoittaa, että FOXA1 ehtyminen välitteinen merkittävä väheneminen PSA-mRNA: n taso verrattuna, että neg-transfektoiduissa soluissa.

Sen määrittämiseksi, onko FOXA1 mRNA: n ilmentymisen välittää AR aktiivisuutta, testasimme hoidon vaikutuksen LNCaP-solujen kanssa DHT ja tai AR-antagonisti bikalutamidi on FOXA1 mRNA ilmaisun. QRT-PCR-analyysi osoitti, että ei ollut eroa mRNA ilmaus FOXA1 androgeeni herkkien LNCaP seuraavat kasvua väliaineessa, joka sisältää DHT tai väliaineessa, joka sisältää bikalutamidin (kuvio 2E ja F). Nämä tulokset osoittivat, että FOXA1 välittää aktivoinnin AR kuitenkin ilmaus FOXA1 itsessään ei säännellä androgen.

FOXA1 Säätelee soluproliferaatiota PC Solut

vaikutuksen tutkimiseksi FOXA1 knockdown solujen proliferaatio, solujen kasvua siFOXA1-transfektoitujen LNCaP-soluja seurattiin yli 4 päivää. SiFOXA1-transfektoidut solut osoittivat merkittävää vähenemistä solujen kasvua verrattuna neg-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3A). Toisaalta, FOXA1 yli-ilmentävät solut lisäsi merkittävästi solujen kasvua verrattuna neg-transfektoiduissa soluissa (kuvio S1C). Tutkia vaikutus FOXA1 solusyklin etenemisen, olemme analysoineet solusyklin vaiheissa siFOXA1-transfektoitujen solujen käyttämällä virtaussytometria-analyysiä. Prosenttiosuus siFOXA1-transfektoiduista soluista G0 /G1 faasi oli korkeampi kuin neg-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3B), mikä viittaa siihen, että down-regulation of FOXA1 inhiboi solujen lisääntymisen indusoimalla G0 /G1 pidätys.

(A) LNCaP-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA (neg) tai yksi kolmesta eri FOXA1 siRNA: ita (# 1- # 3), ja sitten ne siirrostettiin uudelleen 24-kuoppaiselle viljelylevylle. Solujen proliferaatio määritettiin sitten yli 4 päivää laskemalla solujen määrä kutakin transfektiota kunnossa, kuten on osoitettu. (B) Solujen syklin vaiheessa solut analysoitiin käyttämällä propidiumjodidivärjäys ja FACS-analyysi 24 h kuluttua siRNA transfektion ja solujen prosenttiosuus kussakin transfektoitu populaation, joka oli jokaisessa syklissä vaiheessa laskettiin. (C) LNCaP-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA (neg) tai yksi kolmesta eri FOXA1 siRNA: ita (siFOXA1 # 1-3). 48 tunnin jälkeen transfektion IGFBP-3-mRNA: n ilmentyminen analysoitiin qRT-PCR: llä. IGFBP-3-mRNA: n ilmentyminen on ilmaistu suhteessa GAPDH-mRNA: n ilmentymisen samassa solussa. (D) LNCaP-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA (neg) tai yksi kolmesta eri FOXA1 siRNA: ita (siFOXA1 # 1-3). 72 tunnin jälkeen transfektion, IGFBP-3 pitoisuus media analysoitiin ELISA-. (E) Proteiinit uutettiin 72 h transfektion jälkeen, ja ilmentymisen IGFBP3, insuliinin reseptorin liittyvä signalointi proteiineja (kokonaismäärä MAPK, fosfo-MAPK, kokonaismäärä Akt ja fosfo-Akt), ja G0 /G1 arrest- liittyvät solusyklin säätelyproteiineja (p21cip1, p27kip1) ja GAPDH tutkittiin western blot -analyysillä. Proteiini molekyylipainot on esitetty oikealla puolelle paneelin. Nämä tulokset ovat keskiarvoja ± S.E.M. Kolmen riippumattoman kokeen. ** Osoittaa tilastollista eroa P 0,01.

ehtyminen FOXA1 Säätelee IGFBP-3: n ja IGF Signaling

Saadakseen käsityksen geenejä, jotka ajan säädellään FOXA1 ehtyminen PC-solujen, teimme geenin ilmentymisen mikrosiruanalyysi solujen köyhdytetty FOXA1 (taulukko 3 ja 4). Havaitsimme 421 geeniä, jotka olivat vahvemmin ilmaistu FOXA1-köyhdytettyä soluja kuin negatiivisessa verrokkitransfektantteja. Klusterointi ylös geenien funktionaalisiin ryhmiin osoitti, että suurin osa ylös geenien liittyi solujen lisääntymistä, jonka jälkeen vaste haavan tekemistä, lihasten järjestelmän prosesseja, puolustus vasteita, tulehdusreaktioita, negatiivinen solujen jakautumisen, vastauksena hypoksia ja solujen kypsymiseen (taulukko 3). Ylös-geenien, jotka liittyvät negatiiviseen säätelyyn soluproliferaation on lueteltu taulukossa 4. Näistä up-geenien, olemme edelleen tutkineet insuliinin kaltaista kasvutekijää sitova proteiini 3 (IGFBP-3), koska tämä geeni on hyvin -established kasvain heikentävän geenin PC [20] – [23].

vahvista säätely ylöspäin IGFBP-3 LNCaP-soluissa FOXA1 ehtyminen, joka oli merkitty mikrosirulla data, olemme analysoineet IGFBP-3-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen LNCaP-soluissa, jotka on transfektoitu siFOXA1 plasmideilla tai negatiivisen kontrollin siRNA plasmidi, käyttäen qRT-PCR: ää ja Western blot-analyysit, vastaavasti. Kuvio 3C osoittaa, että IGFBP-3 mRNA: n ekspression siFOXA1-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi korkeampi kuin neg-transfektoiduissa soluissa. IGFBP-3-proteiinin tasot siFOXA1-transfektoidut solut myös voimakkaasti lisääntynyt verrattuna tasolla nega-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3E). Lisäksi muutosten arvioimiseksi tasot eritetyn IGFBP-3, teimme ELISA-. Kuvio 3D osoittaa, että IGFBP-3 pitoisuus tiedotusvälineissä siFOXA1-transfektoiduissa soluissa oli myös voimakkaasti lisääntynyt (yli 30 kertaa) verrattiin nega-transfektoitujen solujen. Koska IGFBP-3 moduloi IGF-1 signalointia, tutkimme seuraavaksi, jos FOXA1 sääntely IGFBP-3: n ekspressio liittyi modulaatio ekspressiotason tai aktivoinnin tilan IGF-1 alavirran signaalit näissä soluissa (kuvio 3E). Western blot-analyysi osoitti merkitty säätely ylöspäin IGFBP-3, alas-säätely fosforylaation MAPK ja Akt, ja ajan säätely proteiinin ilmentymistä sykliiniriippuvaisen estäjät (p21cip1, p27kip1) in siFOXA1-transfektoiduissa soluissa verrattuna neg-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3E). Lisäksi FOXA1 ehtyminen merkittävästi estänyt aktivointi AKT vastauksena IGF-1 hoito LNCaP (kuva S1E). Nämä tulokset osoittivat, että FOXA1 sääntely IGFBP-3 on liitetty säätely IGF-1 alavirran signaalit.

Sen määrittämiseksi, että on tärkeää IGFBP-3 FOXA1 sääntelyn PC leviämisen, vertasimme kasvua siFOXA1 -transfected LNCaP-soluja ja että siIGFBP-3-transfektoituja soluja. IGFBP-3 oli ohimenevästi pudotti transfektoimalla LNCaP kanssa IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3) plasmidin ja IGFBP-3 mRNA ja proteiini ilmaisun siIGFBP-3-transfektoiduissa soluissa arvioitiin käyttäen qRT-PCR ja western blot-analyysi vastaavasti. Kuvio 4A osoittaa, että IGFBP-3-mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä siIGFBP-3-transfektoituja soluja, oli merkittävästi alhaisempi kuin että neg-transfektoiduissa soluissa. Vaikka siFOXA1-transfektoidut solut osoittivat merkittävää vähenemistä solujen kasvua verrattuna neg-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3A ja 4B), anti-proliferatiivista vaikutusta siFOXA1 purettiin kaksi transfektion siFOXA1 ja siIGFBP-3 (kuvio 4B). Tämä tulos osoitti, että FOXA1 säätelee solujen lisääntymistä in IGFBP-3-riippuvalla tavalla.

(A) LNCaP-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA (neg) tai IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3) ja, 48 tuntia myöhemmin, IGFBP-3-mRNA: n ja proteiinin tasot analysoitiin käyttämällä qRT-PCR: ää ja Western blot-analyysi. IGFBP-3-mRNA: n ilmentyminen on ilmaistu suhteessa GAPDH-mRNA: n ilmentymisen samassa solussa. (B) LNCaP-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA (neg) tai yksi kolmesta FOXA1 siRNA: iden (siFOXA1 # 1- # 3) ja /tai IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3), ja ne siirrostettiin uudelleen 24 kuoppaiset kulttuuri levy. Solujen proliferaatio mitataan 4 päivää ja solujen lukumäärä kullekin transfektoitujen väestöstä on osoitettu. (C, D) LNCaP-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA (neg) tai AR siRNA (SI AR) ja /tai FOXA1 siRNA (si FOXA1 # 1), ja 48 h transfektion jälkeen, AR-mRNA: n ja proteiinin ( C) tai IGFBP-3-mRNA-tasoja (D) analysoitiin käyttäen qRT-PCR: ää ja /tai western blot -analyysillä. MRNA-tasot on ilmaistu suhteessa GAPDH-mRNA: n ilmentymisen samassa solussa. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ± S.E.M. Kolmen riippumattoman kokeen. ** Osoittaa tilastollista eroa P 0,01.

Koska aktivaation AR on raportoitu alas-säädellä IGFBP-3: n ekspressio [24], olemme edelleen tutkittiin vaikutusta AR FOXA1 säätelyyn ja IGFBP-3 käyttäen SIAR-transfektoiduissa soluissa (kuvio 4C ja 4D). Ehtyminen AR teki lisätä IGFBP-3 mRNA: n ilmentymisen (2,8 kertaa). Kuitenkin kasvu IGFBP-3: n ekspressio havaittiin siFOXA1-transfektoiduissa soluissa oli paljon korkeampi (16,4 kertaa) kuin että SIAR-transfektoiduissa soluissa. Lisäksi samanaikainen ehtyminen AR ja FOXA1 johti kasvaa edelleen IGFBP-3 lauseke (24,0 kertaa) verrattuna ehtyminen FOXA1 yksin, mikä viittaa siihen, että FOXA1 ja AR yhteistoiminnallisesti säädellä IGFBP-3 lauseke (kuvio 4D).

rooli FOXA1 on kastraatio Kestää eturauhassyöpä (CRPC) mallit

arvioitiin roolia FOXA1 on androgeenista riippumaton eturauhassyöpä käyttäen C4-2 soluja, perustetaan kastroitu isäntä LNCaP. Ehtyminen FOXA1 esti merkitsevästi solujen kasvua C4-2 solujen edes matalan androgeenireseptorin ympäristössä (5% hiili suodatettua FCS) vrt nega-transfektoiduissa soluissa (kuvio 5A). Overexpresssion of FOXA1 vuonna C4-2 soluissa merkittävästi edistänyt solukasvun (kuvio S1D). Kun ohjaus C4-2 soluja käsiteltiin alhaisen annokset DHT (1-100 pM), PSA promoottori aktiivisuus oli ajan säännelty DHT pitoisuutena 100 pM. Kuitenkin transfek- FOXA1 siRNA esti säätely ylöspäin PSA promoottorin aktiivisuutta, joka tapahtui vastauksena DHT hoito 100 pM C4-2 soluissa (kuvio 5B). Samoin ehtyminen FOXA1 estivät merkittävästi PSA mRNA: n ekspression qRT-PCR (Kuva S1B). Analysoimme myös IGFBP-3-mRNA: n ilmentyminen C4-2-soluissa, jotka on transfektoitu siFOXA1 plasmidit tai negatiivisen kontrollin kanssa, käyttäen qRT-PCR: ää. Kuvio 5C osoittaa, että IGFBP-3 mRNA: n ekspression siFOXA1-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi korkeampi kuin neg-transfektoiduissa soluissa. Kuvio 5D esittää, että IGFBP-3 pitoisuus tiedotusvälineissä siFOXA1 transfektoidut solut vahvasti lisääntynyt (yli 40 kertaa) verrattuna tasolla nega-transfektoiduissa soluissa. siFOXA1 esti merkittävästi fosforylaation Akt jälkeen stimuloivan IGF-1: C4-2-soluissa samanlainen kuin LNCaP-solujen, mikä osoittaa negatiivisen säätelyn IGF-1 signalointia, kun FOXA1 väheneminen (kuvio S1F).

(A) C4- -2-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA (neg) tai yksi kolmesta FOXA1 siRNA: iden (# 1- # 3), ja sitten ne siirrostettiin uudelleen 24-kuoppaiselle viljelylevylle kanssa Fenolipunainen-RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 5% CS-FBS: ää. Solujen proliferaatio mitattiin sitten yli 4 päivää, ja on esitetty solujen lukumäärä kullekin transfektoitujen väestöstä. (B) C4-2-solut transfektoitiin pGL3-PSAP 5,8 lusiferaasireportteri ja jonka FOXA1 siRNA (# 1) ja kasvatettiin Fenolipunainen-RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 5% CS-FBS: ää ilmoitettuina pitoisuuksina dihydrotestosteroni (1-100 pM). Seuraavat 72 h transfektion lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-lusiferaasireportteri- määritysjärjestelmää. (C) C4-2-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA (neg) tai yksi kolmesta eri FOXA1 siRNA: ita (siFOXA1 # 1-3). 48 tunnin jälkeen transfektion IGFBP-3-mRNA: n ilmentyminen analysoitiin qRT-PCR: llä. IGFBP-3-mRNA: n ilmentyminen on ilmaistu suhteessa GAPDH-mRNA: n ilmentymisen samassa solussa. (D) C4-2-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA (neg) tai yksi kolmesta eri FOXA1 siRNA: ita (siFOXA1 # 1-3). 72 tunnin jälkeen transfektion, IGFBP-3 pitoisuus media analysoitiin ELISA-. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ± S.E.M. Kolmen riippumattoman kokeen. * Ja ** osoittavat tilastollista eroa P 0,05 ja P 0,01, vastaavasti.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tutkittiin miten FOXA1 PC etenemistä. Olemme tunnistaneet tuumorisuppressori IGFBP-3 uutena kohteena FOXA1, ja osoitti, että FOXA1 kohdistaminen IGFBP-3 on tärkeä rooli säätelyssä PC-solujen lisääntymisen.

IGFBP-3 on tiedetty toimia tuumorisuppressori tai solusykliä estäjää PC-soluissa [21], [24]. Lisääntynyt IGFBP-3: n ekspressio, kun FOXA1 ehtyminen esti fosforylaation MAPK ja Akt ja välittämän solusyklin pysähtymisen lisäämällä ilmentymistä solun lukiertosäätelijöistä p21 ja p27 PC-soluissa. FOXA1 on viime aikoina raportoitu säädellä solusyklin ja soluproliferaatiota LNCaP-solujen [15]. Tuloksemme osoittivat, että IGFBP-3 voi olla tärkein säätelijä FOXA1 riippuvaista soluproliferaatiota LNCaP. Tutkimustulosten perusteella, ei vain AR myös IGFBP-3 voi olla keskeinen tekijä FOXA1 välitteistä signalointia PC.

FOXA1 on transkriptiotekijä, joka moduloi toimintaa steroidihormonireseptoreihin. Eturauhasen, FOXA1 vuorovaikutuksessa AR ja ohjaa androgeenin indusoiman aktivaation eturauhasen-spesifisten geenien [6]. Äskettäin AR ja viereisen FOXA1 sitoutumiskohdat on löytyy useita promoottoreita eturauhasen soluissa [7], [25]. Samanlainen toiminto AR, FOXA1 ekspressio on välttämätöntä normaalille kehitykselle sekä androgeenin asetukseksi PC [26]. Lisääntynyt ilmentyminen FOXA1 on havaittu kaikissa eturauhasen kehityksen hiirimallissa [27]. Huomasimme, että FOXA1 yliekspressoitui ytimet PC soluja, ja että tämä yli-ilmentyminen oli yhteydessä lisääntyneeseen PSA, Gleason tulospalvelu ja AR ilme. Lisäksi yliekspressio FOXA1 oli merkittävä tekijä PSA vika. Ne tulos ovat yhdenmukaisia ​​aiempien käy ilmi, että FOXA1 värjäytymisen intensiteetti oli huomattavasti heikompi viereisessä syövätöntä kuin syöpäkudoksen [28] ja että vahva FOXA1 värjäytyminen yhteydessä huonoon ennusteeseen, korkeammat pT vaiheissa ja lisääntynyt Gleason Grade [15], [28 ]. Korkea FOXA1 aiemmin oli 89% metastaattisen PC ja ilmentyminen FOXA1 korreloi positiivisesti kasvaimen kokoa, extraprostatic invaasio, AR ja imusolmuke hyökkäys [29]. FOXA1 edistää androgeenistä riippuvaista kasvua PC [30]. FOXA1 myös keskeinen rooli ilmentymisessä ubikitiinistä konjugointientsyymiä E2C (UBE2C), geenin, joka inaktivoi M-vaiheen tarkastuspiste, ja UBE2C on yli-ilmentynyt androgeeni-riippumaton PC solulinjojen ja kliinisiä tapauksia [31]. Genomin laajuinen yhdistys tutkimukset osoittivat, että läsnä on yhden nukleotidin polymorfismi (rs119986220) on FOXA1 sitoutumiskohdan sisällä 8q24 alleelien, joka on liitetty PC riski [25]. Yhdistetty todistusaineisto tukee yhteyden FOXA1 ja syövän etenemisen PC.

kautta geeniekspressioanalyysissä tunnistimme IGFBP-3: a alaspäin-stream tavoite FOXA1. IGFBP-3 on insuliinin kaltaisen kasvutekijää sitova proteiini, jonka pääasiallinen toiminto liittyy IGF toimitus ja saatavuus [32]. IGFBP-3 on suurempi affiniteetti IGF-1 kuin IGF-1-reseptorin ja estää IGF-1-välitteisen reitin. IGFBP-3 voi näin ollen vähentää IGF-1 hyötyosuus ja estää IGF-1 vuorovaikutusta IGF-1-reseptorin, mikä toimii tuumorisuppressorina [21], [24]. IGF-riippumattoman aseman IGFBP-3 on myös äskettäin tunnistettu. IGFBP-3 sitoutuu transformoivan kasvutekijä-β tyypin V reseptoria ja estää siten solujen kasvua riippumatta sen vaikutuksista IGF [20], [33]. Apoptoosin induktio kautta synergistisen vuorovaikutuksen IGFBP-3 tumareseptorin kuten retinoidi-X-reseptori (RXR) -alfa on havaittu myös PC-soluissa [24], [34]. Tuloksemme osoittivat myös, että lisääntyneen ekspression IGFBP-3, kun ehtyminen FOXA1 esti merkittävästi PC proliferaation androgen-herkkien LNCaP-soluja, todennäköisesti kautta IGF-1-signalointireitin. Lisääntynyt IGFBP-3 upon FOXA1 ehtyminen esti fosforylaatiota signalointi välittäjäaineiden IGF-1 signalointireitin myös MAPK ja Akt, ja välittämän solusyklin pysähtymiseen kautta p21 ja p27 PC soluissa. Jälkimmäiset tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiemman raportin, joka FOXA1 oli säädelty on kilpirauhassyöpä vaurion ja että ehtyminen FOXA1 aiheuttama solusyklin pysähtymiseen ja vähentää solujen lisääntymisen kautta p27-riippuvaisen mekanismin [14].

androgeenin vastus PC, jota kutsutaan kastraatio vastus, on suuri ongelma, joka rajoittaa potilaan elämänlaatuun sekä elinajanodote. Vaikka useita mekanismeja on ehdotettu selittämään kehitystä kastraation vastustuskykyisten PC (CRPC), suuret reitin tämän resistenssin silti näyttää liittyvän AR, edes antiandrogeeninen hoito. Monistamisen AR, mutaatio AR, yliekspressio AR koaktivaattoreiden tai purkamista kasvutekijöiden /sytokiinit voivat kaikki esiintyä CRPC ja aiheuttaa muutoksen vasteena AR-antagonistit. Toinen mekanismi CRPC kautta paeta apoptoosin tappioiden kasvaimen esti geenin PTEN ja suppressio anti- apoptoottisen geenin BCL-2 [35]. Toinen tunnettu syy CRPC on, että AR voidaan aktivoida ihmisen PC-soluissa ilman androgeenien IL-6 [36], [37]. Olemassaolo niin monia monimutkaisia ​​reittejä liittyvät säätelyyn AR aktivointi tekee vaikeaksi kontrolloida kasvua CRPC. Perustuu tietojen kohdentaminen FOXA1 voi tarjota käytännön lähestymistapa alas-säätely AR toiminnan CRPC. Ehtyminen FOXA1 merkittävästi alassäädetty ligandista riippuvaa AR-aktivointi (jopa 80%) LNCaP-soluissa ja C4-2 soluja. Lisäksi ehtyminen FOXA1 säädelty IGFBP-3: n ekspressio ja inhiboi IGF-1 signalointia, joka on tärkeä reitti ligandista riippumattoman aktivaation AR [38]. Kuitenkin toinen rivi todisteiden osoitti kaksoisrooli FOXA1. Vaikka FOXA1 toimii edelläkävijänä edistävänä tekijänä AR ja chromatin vuorovaikutusta, se myös luo corepressor komplekseja estämällä AR ja chromatin sitovia. Näin FOXA1 ehtyminen johtaa ulkonäön suuri määrä uusia ARBs, jotka liittyvät androgeenin sääntelyyn lähellä geenejä [28], [39]. Koska FOXA1 säätelyyn AR ei ole täysin selvitetty, lisäanalyysi paljastaa terapeuttista merkitystä FOXA1 vuonna CRPC.

Koska seuraava askel, vahvistettaessa FOXA1 toiminnon, olemme parhaillaan tarkkaa mekanismia, joilla FOXA1 säätelee IGFBP-3 ilme. Välttää ei-spesifinen sitoutuminen, joka on immunisoimalla peptidi estää koe suoritettiin. 2+, kohtalainen; Kolmen riippumattoman kokeen.