Krooninen sairaus

tiivistelmä

hankkiminen runsas ja erittäin puhdasta syövän kantasolut (CSCS) on tärkeä edellytys CSC tutkimus. Tällä hetkellä tutkijat yleensä saada erittäin puhdasta CSCS kautta virtaussytometrialla lajittelu ja laajentaa ne lyhyen aikavälin alalla kulttuurin. On kuitenkin vielä epävarmaa voimme täydentää erittäin puhdasta CSCS pitkäaikaisilla alalla kulttuurin. Olemme ehdottaneet matemaattisen mallin avulla tavallisten differentiaaliyhtälöiden johtamiseksi jatkuva vaihtelu CSC suhde pitkällä aikavälillä alalla kulttuurin ja arvioidun mallin parametrien perustuu pitkän aikavälin alalla kulttuurin MCF-7 kantasoluja. Huomasimme, että CSC suhde pitkällä aikavälillä alalla kulttuurin esitetään vähitellen laski kulkeutumista ja saattaa olla stabiili alemmalla tasolla. Lisäksi olemme havainneet, että sovitetun mallin parametrit selittäisi Kasvun rakenteessa CSCS ja eriytetty syöpäsolujen pitkäaikaisissa alalla kulttuurin.

Citation: Peng T, Tsinghuan M, Zhenning T, Kaifa W, Jun J ( 2011) Pitkäaikaiset Sphere Culture voi säilyttää korkea suhde of Cancer Stem Cells: matemaattisen mallin ja Experiment. PLoS ONE 6 (11): e25518. doi: 10,1371 /journal.pone.0025518

Editor: Sui Huang, Järjestelmä- Biology, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 07 syyskuu 2011; Julkaistu: 16 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Peng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat National Natural Science Fund of kansantasavallan Kiinan (no. 30872517). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosikymmenen aikana yhä enemmän todisteita on osoittanut, että kasvaimia peräisin alaryhmästä soluja, jotka ovat itseuudistuvien ja monipuolista erotuskyvyn, nimeltään syöpä kantasolut (CSCS) tai kasvain aloittamisen soluja (-lämpökameroissa) [ ,,,0],1] – [3]. Lisäksi CSCS on vahvistettu olevan peräisin syövän uusiutumiseen ja etäpesäkkeiden [4] – [6]. Siksi tutkimus CSCS on tullut keskipiste syöpätutkimukseen.

Acquiring runsas puhtautensa CSCS on tärkeä edellytys CSC tutkimukseen. Vuonna 2003, Al-Hajj et al. Ensimmäinen ilmoitti, että vain pieni ryhmä rintasyövän soluja, jotka ovat CD44

+ CD24

– /matala fenotyyppi on kyky ylläpitää kasvaimen muodostumisen [7]. Näin ollen, korkea puhtaus CSCS voidaan saada virtaussytometrialla lajittelua. Kuitenkin alhainen suhde CSCS keskuudessa syöpäsolujen tarkoittaa, että voimme tuskin saada tarpeeksi CSCS lisäkokeita varten heti virtaussytometrialla lajittelun. Dario Ponti et ai. osoittaneet, että rintasyöpä solut voivat muodostaa mammospheres kun niitä viljellään ilman seerumia tarttumaton ruokia ja että tämä menetelmä voisi rikastuttaa CD44

+ CD24

– /matala rintasyövän CSCS [8]. Lisäksi gliooma, peräsuolen syöpä ja muunlaisia ​​CSCS on viljelty käyttäen samaa menetelmää. Siksi CSCS on laajennettu kautta alalla kulttuurin [9] – [12]. Kuitenkin myös pitkäaikainen pallo kulttuuri voi ylläpitää korkea suhde CSCS on epäselvä.

symmetrinen ja epäsymmetrinen jakautuminen on kahdenlaisia ​​kasvun kaavoja CSCS [13], [14]. Yksi CSC voi jakaantua joko kaksi identtistä CSCS kautta symmetrinen jako tai yksi CSC ja yksi eriytetty syöpäsolun läpi epäsymmetrisen jako. Lisäksi eriytetty syöpäsolut voivat muuntua CSCS epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [15]. Samaan aikaan eriytetty syöpäsolut sekoittaa CSCS alkaen virtaussytometrialla lajittelun ja johdettu epäsymmetrinen jako myös lisääntyä viljeltynä. Kuitenkin vaikutus edellä mainittujen prosessien CSC suhde suspensioviljelmässä ilman seerumia ei tunneta.

ennustamiseksi jatkuva vaihtelu CSC suhde pitkäaikaisiin alalla kulttuurin, ensin ehdotti kineettisen mallin tavallisilla ero yhtälöitä, jotka pidetään symmetrinen ja epäsymmetrinen jakautuminen CSCS sekä leviämisen ja transformaatio eriytetty syöpäsoluja. Teoreettinen analyysi osoitti, että olisi vakaa suhde CSCS pitkällä aikavälillä alalla kulttuurin mallista riippuen parametrien ja alkuperäinen suhde CSCS. Tukeakseen meidän teoreettinen tulos, suunnittelimme pitkäaikainen alalla kulttuurin ihmisen rintasyövän MCF-7 kantasoluja. Perustuen kokeellista tietoa, käyttämällä adaptiivista Metropolis-Hastings (M-H) algoritmin toteuttamaan laajan Markov-ketju Monte-Carlo (MCMC) simulointi, saimme arvioitujen parametrien arvot. Mukaan numeeristen simulaatioiden kokeellisiin tietoihin perustuvia, huomasimme, että havaitut osuus CSCS voisi olla kiinni meidän malli ja että asennettu parametrit oli kokeellinen merkitys.

Materiaalit ja menetelmät

Malli Kuvaus

Anna ja merkitään väkiluvuista CSCS ja eriytetyn syöpäsolujen hetkellä

pitkäaikaisiin alalla kulttuurin, vastaavasti. Koska soluja viljellään on tarttumaton astia on riittävästi ravinteita tässä keinotekoisessa ympäristössä, voimme olettaa, että havaitut muutokset lyhyellä aikavälillä, sanovat pituus, ovat verrannollisia väkiluvuista, eli kun vakiot kutsutaan netto syntyvyyden tai luontainen kasvu väestön vastaavasti. Näemme ja olevan tasaisen funktio. Sitten jakamalla ja kulkee raja antanut seuraavan differentiaaliyhtälöt:

Koska kasvukuvion CSCS kuuluu symmetrinen ja epäsymmetrinen jakautuminen [13], [14] ja koska eriytetty syöpäsolujen voi muuntua CSCS tietyillä säännöt , kuten EMT [15], jotkut eriytetty syöpäsoluja ja CSCS syntyy aikana leviämisen CSCS ja eriytetty syöpäsoluja, vastaavasti. Yksinkertaistaa mallia, me määrittelemme epäsymmetrinen jako prosessi, yksi CSC jakaa yhdeksi CSC ja yksi eriytetty syöpäsolujen kuin CSC ensimmäinen jakaa symmetrisesti kahteen CSCS ja sitten yksi heistä muuntuu eriytetty syöpäsolun. Kun sillä muunto CSCS erilaistuneita syöpäsoluja prosessissa CSC leviämisen ja kun muunto eriytetty syöpäsolujen CSCS prosessissa leviämisen eriytetty syöpäsolut, voimme käyttää seuraavaa matemaattista mallia kuvaamaan interaktiivinen kasvua n CSCS ja eriytetty syöpäsolujen pitkäaikaisen aloilla kulttuuri: (1) missä ja ja kaikki parametrit ovat ei-negatiivisia vakioita.

Koemenetelmä

Soluviljely.

Ihmisen rintasyövän MCF-7-solut (Shanghaista Cell Bank, Kiinan tiedeakatemia) viljeltiin toisissaan kiinni DMEM väliaineessa (Hyclone), 10% vasikan sikiön seerumia (Hyclone) ja 100 U /ml penisilliini-streptomysiiniä ratkaisu A. CD44

+ CD24

– /matala CSCS MCF-7-solut, jotka on saatu virtaussytometrillä lajittelu ja inokuloitiin 1000 solua /ml varren soluviljelmässä järjestelmän muodostamiseksi mammospheres kuten aiemmin on kuvattu [8]. Vuonna tarttumaton astiat, CSCS viljeltiin suspensiossa käyttäen seerumitonta DMEM-F12 -alustassa (01:01, Hyclone), jota oli täydennetty 20 ng /ml EGF: ää (BD Biosciences), 20 ng /ml bFGF: ää (BD Biosciences), 4 mg /ml B27 (Invitrogen) ja 100 U /ml penisilliiniä-streptomysiiniä liuosta A. mammospheres hajotettiin välein 10-12 päivä pilkkomalla entsymaattisesti 0,25% trypsiini-EDTA-liuosta (Invitrogen) 37 ° C: ssa 3 minuuttia ja mekaaniset sironta. Yhden solut vapautettiin pipetoimalla varovasti ja suodatetaan läpi 70 um solun siivilä. Solususpensio sentrifugoitiin 500 g: ssa 3 minuutin ajan. Sen jälkeen supernatantti heitetään pois, yksi solut ympättiin 1000 solua /ml ja viljeltiin muodostamaan mammospheres edellä mainitussa olosuhteissa.

virtaussytometrialla.

Virtaussytometria lajittelu ja testaus suoritettiin käyttämällä BD FACSAria II FACS lajittelija (BD Biosciences) poimia CD44

+ CD24

– /matala CSCS MCF-7 tarttuvien solujen ja tunnistaa CD44

+ CD24

– /alhainen CSC suhde mammospheres. Kiinnittyneet solut tai mammospheres hajotettiin entsymaattisesti ja mekaanisesti, kuten edellä mainittu, ja suodatetaan 40 um: n seulan läpi, jotta yksisolususpension. Sitten, vähintään 1 x 10

5-solut sentrifugoitiin 500 g: ssä 3 minuutin ajan 4 ° C: ssa, suspendoitiin uudelleen 10 ui PE-konjugoitu anti-CD44 (BD Biosciences) ja 10 ui FITC-konjugoitua anti-CD24 (BD Biosciences), inkuboitiin sitten 4 ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan. Samaan aikaan, soluja inkuboitiin vastaavasti isotyyppi CD44 ja CD24 negatiivisena kontrollina, ja PE-konjugoitu anti-CD44 tai FITC-konjugoitu anti-CD24 yhtenä positiivisena kontrollina, vastaavasti. Leimatut solut pestiin 3 kertaa ja analysoitiin sitten FACS: lla lajittelija. Kukin analyysi havaittu 10,000 solua.

Tulokset

Teoreettinen analyysi Model (1) B

Matematiikassa Laplace-muunnos on lineaarinen operaattori funktion todellinen argumentti ( ), ja se voi muuttaa toiminnon monimutkaisen argumentti, joka on määritelty. Käänteistä Laplace-muunnos saadaan monimutkainen kiinteä, jossa on reaaliluku siten, että ympärys yhdentymisen tiellä on alueella lähentyminen. Koska Laplace-muunnos on hyödyllinen ominaisuus, että monet suhteet ja toimintaa yli alkuperäiset vastaavat yksinkertaisempia suhteita ja toimintaa yli kuvien, sitä voidaan käyttää ratkaisemaan ero ja kiinteä yhtälöt. Antaa . Laplace-muunnos differentiaaliyhtälöiden (1) on (2) Näistä yhtälöistä (2) sen jälkeen, kun joitakin laskelmia, olemme obtainwhere ovat todellisia juuret asteen yhtälö yhden muuttujan.

Kun käänteistä muunnoksia johtaa (3), jotka ovat ratkaisuja malli (1).

Huomaa, että ja. Voimme obtainwhich tarkoittaa sitä, että prosenttiosuus CSCS pitkän aikavälin alalla kulttuurin taipumus olla kooltaan stabiileja. Huomautus thatUsing (3), meillä on (4) ja (5) Koska (4) on yksinkertaisempi kuin käytämme (4) mallin parametrien estimoimiseksi.

On syytä huomata, että voimme saada vakaan tilan suhteen yksinkertaisella algebran menetelmällä. Kuitenkin käyttäen algebran menetelmää, emme voi johtaa nimenomainen mallin parametrien tietojemme (katso liite S1). Niinpä yhä käyttää Laplace-muunnoksen täällä tehdä koko paperi näyttää enemmän sopusoinnussa.

Koetulokset

CSC suhde MCF-7 rintasyöpäsolujen oli 1,8% (kuvio 1A), joka on yhdenmukainen edellisen raportin [16]. Sen jälkeen virtaussytometrialla lajittelun, post-sort analyysi suoritettiin määrittämään puhtaus lajitellaan solupopulaatioiden. High-puhtaus CD44

+ CD24

– /matala CSCS joiden suhde oli peräti 96,2% saatiin (kuvio 1 B). CD44

+ CD24

– /matala CSCS MCF-7-solut tai yhden soluja mammospheres muodostunut kompakti aloilla 10-12 päivän suspensioviljelmässä ilman seerumia. Kuitenkin yhdessä pitkäaikaisen alalla kulttuurin käsittely, havaitut CSC suhdelukuja mammospheres esitetty vähitellen laski kulkeutumista (kuvio 1 B-G ja taulukko 1) ja lopuksi vakiintui noin 1,5%.

(A) CSC suhde MCF-7-soluissa viljelty seerumilla. (B): n puhtaus järjestetty CSC väestön havaitaan sen jälkeen virtaussytometrialla lajittelun välittömästi. (C-G) CSC suhde mammospheres viljeltiin 52, 84, 117, 150 ja 160 päivää vastaavasti.

Mallipohjaiset Arvioiden

laskemiseksi prosenttiosuus CSCS (taulukko 1), ensin määritetään suhde eriytetyn syöpäsolujen CSCS (taulukko 1). Arvioida ja käytimme adaptiivinen Metropolis-Hastings (MH) algoritmin toteuttamaan laajan Markov-ketju Monte-Carlo (MCMC) simulointi (kuvio 2) on kuvattu aiemmin [17], [18] ja saatu vakaa arvot 4 parametrit (,,,). Näin voimme päätellä, että luontainen kasvuvauhti CSCS ja eriytetty syöpäsolut ovat ja vastaavasti ja muuntokurssit CSCS erilaistuneita syöpäsolujen ja eriytetty syöpäsolujen CSCS ovat ja vastaavasti.

( A) Random sarja; (B) histogrammin. Algoritmi kesti 10000 toistojen kanssa burn-in 3000 toistojen. Alkuehdot oli

ja

.

Käyttämällä arvioituihin arvoihin, me piirretään parhaiten sopiva ratkaisu sovittamalla Kokeellisten tietojen (kuvio 3A). Lisäksi me piirretty pitkän aikavälin trendi, joka osoitti, että suhde eriytetty syöpäsolujen CSCS vakiintuu noin 71 kuluttua 200 päivää (kuvio 3B). Tämä tarkoittaa sitä, että prosenttiosuus CSCS on taipumus olla 1,4%.

(A) paras sovitus Kokeellisten tietojen. (B) pitkän aikavälin trendi.

Herkkyysanalyysi

Käytimme paikallisen herkkyyskertoimien (LSC) mitata herkkyys parametrit, mukaan lukien, ja. Kuten raportoitu aiemmin [19], [20], me tiedämme, että LSC määritellään aste vaihtelun suunnittelutoiminto alla pienet muutokset kunkin mallin muuttujan, joka voidaan laskea: (6) Koska jokaisella parametrilla on eri ulottuvuuksia , vertaamaan herkkyyskertoimien kunkin parametrin, me yhdenmukaistaa (6) aswhere on muutos valikoima parametrin.

kun summa poikkeamien neliöiden (SSD), kun suunnittelutoiminto ja lisäämällä tai vähentämällä 1% , 2%, 3%, 4% ja 5% kunkin parametrin, saimme vastaavan LSCs. Koska oli LSC jokaisen muutoksen jälkeen parametrin, oli kymmenen LSCs kunkin parametrin. Näin ollen, keskimääräinen ja standardipoikkeama LSCs laskettiin kunkin parametrin (kuvio 4). Yksisuuntainen ANOVA käytettiin vertaamaan eroja, ja Tamhanen T2 testiä käytettiin monimuuttujille takia varianssi on erisuuruinen. Tiedämme, että keino (+716,5037 ± 528,0119) ja (925,3620 ± +688,3240) ovat merkittävästi suurempia kuin (73,4361 ± 4,8421) ja (75,3665 ± 13,7670). Koska suurempi herkkyys kerroin vastaa korkeampi herkkyys, voimme päätellä, että sekä luontaisia ​​kasvuvauhti CSCS ja eriytetty syöpäsoluja, vastaavasti, ovat tärkeitä parametrit vakaa prosenttiosuus CSCS pitkällä aikavälillä alalla kulttuurin.

keskustelu

Vaikka tutkijat yleensä saada erittäin puhdasta CSCS kautta virtaussytometrialla lajittelu ja laajentaa niitä lyhyellä aikavälillä pallo kulttuuria tarttumaton ympäristössä ilman seerumia [21] kasvu malleja CSCS ja eriytetty syöpäsolujen pitkäaikaisiin alalla kulttuurin tämä ehto ei ole selvä. Olipa voimme saada runsaasti erittäin puhdasta CSCS kautta tämä menetelmä on myös epävarmaa. Tässä projektissa, ensin ehdotti matemaattisen mallin johtamiseksi jatkuva vaihtelu CSC suhde pitkällä aikavälillä alalla kulttuurin. Arvioida mallin parametrit, me sitten suunniteltu pitkäaikaisen alalla kulttuurin rintasyövän MCF-7 kantasoluja, koska MCF-7 solulinja seurasi CSC malli ja sen CSC merkki, CD44

+ CD24

– /alhainen, oli yleensä vahvistettiin ja helposti havaita virtaussytometrialla [7] – [8], [22]. Vuodesta kokeilun tulokset ja numeeristen simulaatioiden, huomasimme, että suhde CSCS pitkäaikaisiin alalla kulttuurin esitetään vähitellen laski kulkeutumista ja saattaa olla stabiili alemmalla tasolla. Lisäksi yhteydessä mallin ja kokeilun tiedot, huomasimme, että sovitetun mallin parametrit selittäisi tärkein kasvuprosessi CSCS ja eriytetty syöpäsoluja alalla kulttuurin.

Vuodesta asennettu parametrit mallimme, ensin huomasi, että luontainen kasvuvauhti eriytetty syöpäsolujen on suurempi kuin luontainen kasvuvauhti CSCS, mikä tarkoittaa, että vaikka viljellään tarttumaton ympäristössä ilman seerumia eriytetty syöpäsoluja myös lisääntyä ja niiden kasvu on hieman suurempi kuin CSCS. Kuitenkin, ero niiden leviäminen hinnat, kun viljeltiin tämä ehto on paljon pienempi kuin kiinnittynyt kulttuuriin. Tämä on tärkein syy jatkuvasti pienenee suhde CSCS. Samalla tämä tulos ja vähittäisen kasvun suhde eriytetty syöpäsolut voivat myös selittää, miksi lisääntymisaktiivisuus pallojen kasvaa hyvin myöhäisessä jatkoviljely vaiheita verrataan aiempiin kohtiin [23]. Samaan aikaan luontainen kasvuvauhti CSCS, on noin 20 kertaa suurempi kuin muunto CSCS erilaistuneita syöpäsoluja,, mikä osoittaa, että tässä kulttuurissa kunnossa tärkein leviämisen rakenteessa CSCS on symmetrinen jako sijaan epäsymmetrinen jako tai erilaistumista käytettäessä kiinnittyvä kulttuuri ympäristön seerumin [8] – [10], [23]. Tämä tulos johtaa suurempaan suhde CSCS vertailevan pitkään tätä viljelmää. Lisäksi, koska tulosprosentti CSCS erilaistuneita syöpäsoluja, on lähes 10 kertaa suurempi kuin tulosprosentti eriytetty syöpäsolujen CSCS, tämä tarkoittaa, että epäsymmetrinen jako CSCS on suurempi kuin muutos eriytetty syöpäsolujen CSCS tässä kulttuurissa kunnossa, mikä tukee myös pieni prosenttiosuus CSCS pitkällä aikavälillä alalla kulttuurin. Lisäksi vaikka tulosprosentti eriytetty syöpäsolujen CSCS, on pieni, sen olemassaolo merkitsee, että tässä viljelyolosuhdetta eriytetty syöpäsolut silti voi spontaanisti muuntavat CSCS, joka on yhdenmukainen aiempien koetulosten [24], ja ne voivat olla tärkeä syy, miksi alalla kulttuuri voi rikastuttaa CSCS [8].

meidän tutkimus, mukaan lukien kokeellisten tietojen teoreettisen analyysin matemaattisen mallin, huomasimme, että vaikka CSCS olivat vain viljeltiin tarttumaton ympäristössä ilman seerumia , oli drift CSC valtion kohti ilmeinen tasapainotilaan, jossa oli vähemmän CSCS kuin kylvämisen. Tämä tulos saattaa olla yksi todiste ei-geneettisen heterogeenisyyden kasvaimissa, koska ei ollut keinotekoisesti geneettinen muutos koko kulttuuri prosessi [25]. Saadaksemme runsas puhtautensa CSCS by pallo perustuvan kulttuurin ilmaus rajoittava suhde eriytetty syöpäsolujen ja CSCS in (5), suosittelemme seuraavaa sääntelytoimia: saadaan korkein alkuperäinen suhde CSCS, estämällä erilaistumisen tai epäsymmetrinen jako of CSCS ja edistää muuntaminen eriytetty syöpäsolujen CSCS, kuten viljelemällä TGF-β lisätä EMT [15], [26].

Huomaa, että parametrit arvio tämän matemaattinen malli perustui ainoastaan meidän kokeelliset tiedot testaus rintasyövän MCF-7 CSCS, jotka viljeltiin mammospheres. Näin ollen vaikka malli voitaisiin soveltaa ennustamiseksi jatkuva vaihtelu CSC suhteen lähes kaikenlaisia ​​kiinteän kasvaimen CSC alalla kulttuurin, parametreja ei voida soveltaa laajasti, koska eri ominaisuuksia eri kasvaimia. Samalla tämä tutkimus juuri keskustelleet prosessi viljellään erittäin puhdasta CSCS palloina. Kuitenkin menettely rikastamiseksi CSCS jonka pallojen kulttuuri voi olla erilainen. Eräässä toisessa menettelyssä, suuren määrän erilaistuneita syövän solut läpikäyvät apoptoosin alkuvaiheessa, koska virheellisen säädön suspensioon viljelyolosuhteissa. Kuitenkin meidän kunnossa, sopeutuminen suspensioviljelmään ympäristö saattaa olla syynä siihen, eriytetty syöpäsolujen kasvaa asteittain [22]. Siksi kuvaavat parametrit CSCS rikastusprosessia myös olisivat erillisiä verrattuna tässä asiakirjassa. Lisäksi vaikka meidän yksinkertaistettu malli oli pätevä vangita kasvuun ja siirtyminen rakenteessa CSCS kulttuuri (eli paljastaen mekanismi rakenteellisen heterogeenisyyden syöpäsolujen), monimutkaisempia dynaaminen järjestelmä (esim solujen määrä /tiheys riippuvainen kasvua ja muuntokurssit) voisi olla mahdollista mukauttaa nämä uusimmat keksinnöt CSCS [24], [27] – [28]. Haluamme tutkia näiden muuttujien ja vaihtoehtoisia malleja enää joutuisi tulevassa työssä.

tukeminen Information

Liite S1.

liitetiedot algebran laskentatapana vakaan STETE of suhteen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0025518.s001

(DOC) B

Kiitokset

Olemme erittäin kiitollisia kaksi nimettömänä tuomareita ja akateemisen editori huolellista käsittelyä ja arvokkaiden huomautuksia, jotka johtivat parantaminen alkuperäisestä käsikirjoituksesta. Tekijät haluavat kiittää Zhao Bin (dosentti, Englanti toimittaja Kiinan Journal of Breast Disease), Yu Shicang ja Wang bin (MD Institute of Pathology, Southwest Hospital, kolmas Military Medical University, PR China) kriittisiin käsittelyyn käsikirjoitus ja ystävällisesti antaa arvokkaita neuvoja.