Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Lisääntynyt ilmentyminen COX-2-entsyymiä (COX2) on yksi tärkeimmistä ominaisuuksista mahasyövän (GC), joka on johtava kuolinsyy vuonna maailmassa, erityisesti Aasiassa ja Etelä-Amerikassa. Vaikka Wnt /β-kateniinin signalointireitin on ollut mukana transkription aktivointi COX2 geenin, tarkkaa mekanismia moduloiva tämä vastaus on vielä tuntematon.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkittu transkriptionaalinen sääntely COX2 geenin GC solulinjoissa ja arvioi tämä ilmiö moduloidaan Wnt /β-kateniinin signalointi. Ensin tarkasteltiin ilmentymisen COX2 mRNA GC soluissa ja totesi, että on olemassa ero ilmaus yhtäpitävä korkea ydinvoiman-lokalisoitu β-kateniinin. Lääkehoidon joko litiumin tai valproaatin ja molekyylitason induktio puhdistetulla kanonisen Wnt3a merkittävästi parannettu COX2 mRNA: n ilmentymisen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Serial poistetaan 1,6 kiloemäsparin COX2 promoottorifragmentti ja vahvistus- tai menettämisestä toiminnon kokeissa pystyimme tunnistamaan minimaalinen Wnt /β-kateniinin reagoiva alue koostuu 0,8 kep että COX2 promoottori (pCOX2-0.8), joka osoitti maksimaalista vastetta geeni–reportteri määrityksissä. Aktiivisuus Tämän pCOX2-0.8 promoottorialueen vahvistettiin edelleen kohdennetulla mutageneesilla ja DNA-proteiini-sitoutumismääritykset.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme päätellä, että pCOX2-0.8 minimaalinen promoottori sisältää novel toiminnallinen T-solu tekijä /lymfaattisen tehostajana tekijä (TCF /LEF) -suhteen elementti (TBE Site II; -689 /-684), joka reagoi suoraan parannettu Wnt /β-kateniinin signalointi ja jotka voivat olla tärkeitä puhkeamista /etenemistä GC.

Citation: Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, De Ferrari GV (2011) Wnt /β-kateniinin Signaling Parantaa COX-2 (COX2) transkriptioaktiviteettia mahasyövän Cells. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10,1371 /journal.pone.0018562

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 5. marraskuuta 2010 Hyväksytty: 11 maaliskuu 2011; Julkaistu: 06 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Nuñez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CTI-syöpä, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) – Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) lupanumeroon PBCT-6 Chilen hallituksen (MM ja GVD). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on monitekijäinen sairaus, jolle on ominaista erittäin pahanlaatuisten kasvaimien mahalaukun limakalvon, ja edustaa toiseksi suurin syy syövän kuolemaan maailmanlaajuisesti korkein esiintyvyys Aasiassa ja Etelä-Amerikassa [1], [ ,,,0],2], [3]. Ympäristön liittyviä riskitekijöitä ovat ruokavalio, nuuska kulutus, liikalihavuus ja

helikobakteeri

infektion [4]. Useat mutaatiot kasvaimen synnyssä, kuten P53, adenomatoottisen polypoosin coli (APC), E-kadheriinin ja RUNX3 [3], [5], sekä onkogeenit kuten k-ras, HER2 ja β-kateniinin [3], [6], [7], on dokumentoitu GC. Lisäksi yli ilmentyminen eri geenien on dokumentoitu, mukaan lukien WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], ja syklo-oksigenaasi 2 (COX2) entsyymi, joka katalysoi ratkaiseva askel prostaglandiini E2, avainvälittäjä yhteisten tulehduksen [10], [11].

on havaittu, että ilmaus COX2 geenin lisääntyy merkittävästi ihmisen mahalaukun adenokarsinooman kudoksissa verrattuna pariksi mahalaukun limakalvon yksilöitä vailla syöpäsolujen [10 ]. Tällainen lisääntynyt ilmentyminen on ehdotettu vaikuttavan intensiteetti hyökkäyksen, koko, imusolmukemetastaaseja, kasvaimen kehittymisen ja huono ennuste [4], [12], [13]. Tässä suhteessa suuria tietomääriä kuvaavat kemiallis-ehkäiseviä ja syövänvastainen aktiivisuus steroideihin kuulumattomia tulehduskipulääkkeitä (NSAID), mukaan lukien selektiiviset COX2-estäjät, kuten mahdollisia hoitoja GC [10], [11], [14].

transkriptionaalisen säätelyn COX2-geenin riippuu mole- koneiden kanssa vuorovaikutuksessa COX2-promoottori, joka näyttää ohjata toiminnan eri signalointireittien [15], [16], [17]. Itse asiassa se perustettiin alun perin, että CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) ja NF-KB (-233 /-214) konsensus sekvenssit COX2 promoottori olivat välttämättömiä ilmentymisen geeni [16]. Myöhemmät toiminnalliset tutkimukset on COX2-promoottori tunnistetaan useita säätelyelementtejä, jotka osallistuvat geenin transkriptiota, mukaan lukien AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBPβ [18], [19], [20] ja proteiinien kuuluvat T-solujen tekijä /Lymfaattinen tehostajana tekijä (TCF /LEF) perheen transkriptiotekijöitä, jotka ovat ratkaisevia Wnt /β-kateniinin signaalitransduktion [21].

Wnt /β-kateniinin signalointireitin on laajalti tunnustettu tärkeä rooli ihmisen sairauksien, erityisesti puhkeamista ja syövän kehittymisen [22], [23], [24]. Mielenkiintoista on, viime kokeiluja GC peräisin olevat solut ovat osoittaneet suhde COX2 ilmaisun ja inhibition Glykogeenisyntaasikinaasi-3β (GSK3p) entsyymi [25], joka on keskeinen Wnt komponentti, joka fosforyloi β-kateniinin ja edistää sen myöhemmän hajoamisen kautta proteasomin [26]. Suhde Wnt /β-kateniinin ja COX2 sen erilaisissa syöpäsolun mallia tukee lisäksi seuraavista tutkimuksista. Ensinnäkin, se on havaittu rintaepiteelin että Wnt /β-kateniinin olla välillinen vaikutus COX2 transkriptio, jotka voivat välittyä säätely ylöspäin välittäjänä tekijä PEA3 [27]. Toiseksi ja toisin kuin epäsuoraan toimintatavasta, Araki ja työtoverit. [21] raportoi, että vuonna koolonkarsinoomasoluissa on olemassa induktion COX2 ilmaisun kautta β-kateniinin /TCF riippuvainen mekanismi, ja osittain tunnettu yksimielisyyteen TCF /LEF sitoutumiskohta (TBE: core CTTTG) on sijoitettu 1079 bp ylävirtaan transkription alusta sivusto COX2 promoottori. Kolmanneksi havaittiin, että paksusuolen syöpäpotilaiden ja solulinjat on yhdistyksen välillä yli-ilmentyminen Wnt reittiin liittyvien proteiinien LEF-1 ja Pontin52 /TIP49a ja ylös-säätely COX2 ilmaisun [28]. Lopuksi, käyttäen kondrosyyttien, on osoitettu, että LEF-1, yhdessä β-kateniinin, säädellään COX2-ilmentymisen suora sitoutuminen LEF-1 /β-kateniinin monimutkainen 3’UTR-alueella COX2 genomisen lokuksen [29] . Näin ollen tällä hetkellä ei ole selvää kuvaa siitä, onko Wnt signalointi on osallisena COX2 geeniekspression, tai sen roolia GC puhkeamista /etenemistä. Täällä pyrimme ymmärtämään, onko suora sääntely COX2 geenin ilmentymisen kautta Wnt /β-kateniinin signalointi ja tunnistamiseksi Wnt /β-kateniinin säätelyelementtejä että promoottorialueen COX2 geenin, joka voi ylössäätää COX2 transkription GC soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja viljelyolosuhteet

Ihmisen solulinjoja MKN45 (Japani kerääminen Research Bioresources, Japani), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38- ja HEK293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) käytettiin tässä tutkimuksessa. MKN45, N87, SNU1 ja KATOIII soluja kasvatettiin RPMI media (Gibco); AGS in F12K väliaineessa (Hyclone); WI38- in EMEM (Gibco); ja HEK293 DMEM (Gibco). Kasvatusväliaine täydennetty 10% FBS: ää (Gibco), (AGS 20%) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Solulinjat pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 ja kyllästyskosteus.

Plasmidit ja mutageneesin

SuperTOPFlash-lusiferaasi ja PRL-TK renilla- lusiferaasi plasmidit [30], konstitutiivinen aktiivisen β-kateniinin (S33Y) [31], ja vallitsevasti negatiivinen ΔTCF4 ekspressioplasmidien [32] on kuvattu aiemmin. Kimeeriset COX2-promoottori-lusiferaasi-fragmentit muodostettiin PCR: llä ihmisen genomisesta DNA: sta käyttämällä erityisiä alukkeita, jotka sisältävät restriktiokohdat, ja sen jälkeen insertoitiin pGL3-Basic-vektoriin (Promega). Mutaatiot TBE-II-sivuston (-689 /-684) ja COX2-promoottorin käyttäen alukkeita pCOX-0,8-TBEMUT kanssa QuickChange paikka- suunnattua mutagesis (Stratagene). Konstrukteja todentaa suoralla sekvensoinnilla (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Alukkeet sekvenssit on kuvattu taulukossa S1.

semikvantitatiivinen ja Real Time RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin RNAasi-vapaa olosuhteissa käyttäen TRIZOL (Invitrogen) ja 2 ug RNA: ta käänteistranskriptio 200 U SuperScript II Reverse Transcriptase (RT) (Invitrogen) käyttäen 500 ng Oligo (dT) alukkeita. Kokeellinen määritys COX2, c-myc ja CCND1-mRNA-tasot suoritettiin [33]. Lyhyesti, cDNA alistettiin Real-Time PCR käytettäessä iCycler iQ System (Bio-Rad Laboratories). Kukin 25 ui reaktiotilavuudessa sisälsi 1 yksikön Platinum Taq DNA-polymeraasia (Invitrogen), 1X reaktiopuskuria (20 mM Tris-HCI, pH 8,4, ja 50 mM KCI), 1,5 mM MgCl

2, 2,5 ug BSA, 0,01% glyseroli , 200 uM dNTP, 0.3x SYBR Green ratkaisu ja 0,4 uM spesifisiä alukkeita (katso taulukko S1). PCR-olosuhteet asetettiin seuraavasti: 90 sekuntia 94 ° C: ssa ja sitten 30 sykliä 30 sekuntia 94 ° C: ssa, 30 sekuntia 62 ° C: ssa ja 30 sekuntia 72 ° C: ssa. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja saadut tulokset kunkin geenin normalisoitiin niihin, jotka saatiin samanaikaisesti β-aktiini. Laatu RNA: n ja PCR-tuotteiden seurattiin koko kokeiden kautta elektroforeesilla 1% agaroosigeeleillä, värjättiin etidiumbromidilla.

induktio Wnt /β-kateniinin signalointireitin

Wnt signalointia oli farmakologisesti indusoitu MKN45 soluissa ympätään 6-kuoppaisille soluviljelylevyille 80-90% konfluenssiin (eli 1, 2, 4 ja 8 tunnin inkuboinnin) joko 10-20 mM LiCl: a (Sigma) tai 5-10 mM valproiinihapon (VA; Sigma), kuten aiemmin on kuvattu [34], [35]. Sitten solut kerättiin mRNA uuttamalla ja reaaliaikainen-PCR määritys edellä kuvatulla tavalla. Vastaavasti, MKN45 soluja stimuloitiin 2 tuntia 200 ja 400 ng /ml puhdistettua Wnt3a proteiinia. Puhdistus Wnt3a suoritettiin, kuten on kuvattu [36].

transkription aktiivisuus COX2 promoottorin

aktiivisuus COX2-promoottorin mitattiin 80-90% konfluentteja MKN45, AGS, WI38- ja HEK293 solut ympättiin 6 kuoppaviljelylevyillä. Lyhyesti, solut ko-transfektoitiin käyttämällä Fugene (Roche) 24 kanssa pCOX2-lusiferaasi tai pSuperTOPFlash toimittajille ja joko konstitutiivista aktiivista β-kateniinin (S33Y) [31] tai vallitsevasti negatiivista ΔTCF4 [32] konstrukteja. PRL-TK renilla lusiferaasi plasmidia käytettiin sisäisenä kontrollina. Firefly ja Renilla Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) kanssa Victor-3 monilevylukija väline (Perkin Elmer), kuten aiemmin on kuvattu [30]. Suhteellinen Lusiferaasiaktiivisuudet kuvata jakamalla tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuus Renillan lusiferaasivaikutusta kullekin näytteelle (N = 3, kukin kolminkertaisena).

Kromatiini immunosaostuksella (chip) määritykset

ChIP tutkimuksista tehtiin MKN45 soluja kuten aiemmin on kuvattu [37]. Osa ydin- β-kateniinin sidottu joko TBE Sites I, II, III tai IV ihmisen COX2 promoottori immunosaostettiin anti β-kateniinin vasta-aineita (Santa Cruz) ja arvioi reaaliaikaisesti PCR käyttäen spesifisiä alukkeita (taulukko S1) . Lisäksi, osa RNA-polymeraasi II (Pol-II) ja asetyloitu histonien H3 ja H4 (H3ac ja H4ac) sidottu joko TBE-II-alueen (-793 /-594) tai proksimaalinen alue (-118 /+ 62 ) on COX2 promoottorin samalla arvioitiin (anti-Pol-II, Santa Cruz, H3ac ja H4ac, Upstate). Positiivisena kontrollina käytettiin c-myc-TBE-sivusto [38]. Vasta-aineen spesifisyyden määritettiin normaalilla kanin-IgG: tä (Santa Cruz).

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) B

EMSA suoritettiin käyttäen oligonukleotideja, jotka sisältävät joko villityypin COX2 TBE-II konsensussekvenssin (katso taulukko S1) tai aikaisemmin raportoitu mutantti TBE sekvenssit [39]. Lyhyesti, villityypin ja mutatoidun

32P-leimattujen oligonukleotidien inkuboitiin sitoutumispuskurissa kanssa tumauutteita MKN-45-soluissa 30 minuutin ajan 30 ° C: ssa. Myöhemmin DNA-proteiini-kompleksit erotettiin vapaa oligonukleotidien 5% ei denaturoivissa polyakryyliamidigeelissä. Elektroforeesin jälkeen geeli kuivattiin ja valotettiin filmille 1 päivä. Visualisointi radioaktiivisen nauhojen analysoitiin autoradiografialla. Sitova spesifisyys tarkastettiin inkuboimalla DNA-proteiini-komplekseja, kun läsnä on ylimäärän ei-merkittyä villityypin tai mutatoitujen oligonukleotidien [21], [39].

Tilastollinen analyysi

Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa kolme toistoa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Useita ryhmän vertailut tehtiin yksisuuntaisella ANOVA käyttäen STATISTICA 9.0 ohjelmisto.

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

COX2 ilmaisu korreloi ydin- β-kateniinin tasoja GC soluissa

perin määritetty ilmaisua tasot COX2-mRNA: n ihmisen GC solulinjojen MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII ja AGS [40], [41], [42], samoin kuin WI38- fibroblastien käytetään tässä kontrollina solulinja [43], tutkimalla onko ne korreloivat Wnt /β-kateniinin signalointi. Kuten on esitetty kuviossa 1, vahva tasot COX2 ilmentymisen havaittiin niinkin aikaisin kuin 26 sykliä PCR-monistusta metastaattisessa solulinjoissa MKN45, SNU16 ja KATOIII, ja myös AGS solulinja, joka on johdettu primaarisen kasvaimen. Tämä tulos on yhtäpitävä COX2 ekspressiotasot havaittiin aiemmin MKN45, KATOIII ja AGS solujen [44], [45], [46]. Sen sijaan, COX2 mRNA-tasot olivat joko hyvin alhainen WI38- fibroblastien tai havaitsematon N87 ja SNU1 soluja (kuvio 1A), mikä viittaa siihen, että tämä ero ilmentymiskuvio ei liity metastaattista vaiheita tai tasoa solutransformaatiota. Merkillistä, ydin- β-kateniinin tasoja liittyy läheisesti COX2 ilme, koska korkeita proteiinin havaittiin MKN45, AGS, SNU16 ja KATOIII soluja verrattuna N87, SNU1 ja WI38- soluja (kuvio 1 B), mikä rooli Wnt signalointia COX2 mRNA ilmaisun GC soluissa.

(A) COX2 mRNA: n ekspression kontrolli (WI38-) ja GC solulinjojen (MKN45, AGS, SNU1, SNU16, KATOIII ja N87). Kokonais-RNA uutettiin viljellyistä soluista ja semikvantitatiivinen RT-PCR: ää käytettiin sen määrittämiseksi, COX2 ja β-aktiini RNA-tasot sisäisenä kontrollina. Kaksikymmentäkuusi jaksoa valittiin riittävä PCR-sykliä. (B) NMR-tasot β-kateniinin proteiinia samassa solussa-linjat, kuten on esitetty (A), tutkittiin kautta Western Blot -analyysillä käyttämällä tumauutteet. TFIIB yleinen transkriptiotekijä käytettiin sisäisenä kontrollina.

tehostaminen COX2 ilmaisun kautta Wnt /β-kateniinin signalointi

Jotta voidaan tutkia, jos Wnt kaskadin osallistuu COX2 ilme, MKN45 soluja farmakologisesti stimuloitiin eri aikoja (eli 1, 2, 4 ja 8 h) joko litiumin (LiCl) tai valproiinihappoa (VA), koska molemmat lääkkeet ovat aiemmin osoitettu moduloivan Wnt signalointia eston kautta GSK3p aktiivisuus ja siten lisätä ydin- tasoja β-kateniinin [34], [35]. Mielenkiintoista on, havaitsimme merkittävä parantaminen COX2 ilmentymisen indusoima 10-20 mM LiCl: a tai 5-10 mM VA, joka alkoi pian sen jälkeen, kun oli inkuboitu yhdisteiden kanssa ja joka oli huipussaan kahden tunnin kuluttua hoidon (kuvio 2A). Reaaliaikainen määrittäminen COX2 mRNA- määriä MKN45 cells samalla käsitelty LiCl tai VA (2 h) osoitti, että COX2 oli merkitsevästi sääteli (kuvio 2B) ja että tämä vaikutus yhteydessä järjestettiin yksi havaittu Wnt /β-kateniinin kohdegeenien c-myc [47] ja sykliini D1 [48]. Seuraavaksi jotta voidaan sulkea pois sitä mahdollisuutta, että havaittu ilmiö heijastuu epäspesifisiä vaikutuksia huumeiden toimivat proteiinit vaikuttavat eri signalointikaskadien, me levittää suoraan täysin toimiva puhdistettu Wnt3a proteiinin MKN45 soluihin (katso menetelmät). Nämä kokeet osoittavat selvästi, että 200-400 ng /ml puhdistettua Wnt3a merkittävästi parannettu COX2 mRNA: n ekspression sen jälkeen, kun lyhyitä inkubaation (kuvio 2), osittain selittää nopea vaikutus LiCI ja VA ja tukea suoraa korrelaatiota kanoninen Wnt /β-kateniinin aktivointi ja stimulaatio COX-2-transkription GC-soluissa.

(A) COX2 mRNA: n ekspression tasojen MKN45 soluissa hoidettiin 1-8 h joko 10-20 mM litiumia (LiCl: a), tai 5-10 mM valproiinihapon (VA) arvioitiin kautta RT-PCR. Sisäisenä kontrollina, β-aktiini-tasot määritettiin. (B) Q-PCR COX2, c-myc ja CCND1 mRNA ilmaisun stimuloidaan farmakologisesti litiumin (LiCl) ja valproaatti (VA) aikana 2 h (yläpaneeli). Pohjalevy, Q-PCR COX2 vuonna MKN45 stimuloitu puhdistetulla Wnt3a 2 tuntia. Q-PCR tulokset ilmaistiin suhteellisina Määrä (DRN) ja β-aktiini-mRNA: n tasot olivat käytettiin sisäisenä kontrollina. Jokainen luku vastaa vähintään 3 itsenäisen kokeen. Tilastollinen merkittävyys määritettiin ANOVA-testi (* p 0,05, ** p 0,01).

tunnistaminen uusia TBE sivustoja promoottori COX2 geenin

Aiemmat tutkimukset osoittivat että Wnt /β-kateniinin reagoivan TBE-sivuston (konsensus ydin: CTTTG) sijaitsee -1079 /-1074 bp ylävirtaan transkription aloituskohdasta (TSS) ihmisen COX2-geenin [21] (site IV, kuvio 3A, ks myös kuvio S1). Edelleen skannaus 1600 bp ylävirtaan sekvenssin TSS [49] antoi meille mahdollisuuden tunnistaa 3 uusia otaksuttu TBE sites: -877 /-872 emäsparin (Site III; sense suuntautuminen), -689 /-684 bp ja -318 /-313 bp (Sites II ja I, vastaavasti, molemmat antisense suuntautuminen) (kuvio 3A), jotka eivät ole konservoituneet ihmisen ja hiiren COX2 geenien (kuvio S1). Siksi kloonattu 1600 bp: n palanen ihmisen COX2-promoottori (pCOX2), mukaan lukien kaikki neljä TBE sivustoja, pGL3-perusvektoriin fuusioitu lusiferaasigeeniin voidaan käyttää myöhemmin reportteri määrityksissä (kuvio 3A). Huomattavaa on, vastaavuuksia transfektio 10 ng tätä konstruktin MKN-45 ja HEK293-soluissa paljasti, että pCOX2 näytetään aiempaa suurempi (9-kertainen) pohjapinta-promoottorin aktiivisuutta MKN45 soluissa (kuvio 3B ja C). Oletimme, että tämä korkeampi pCOX2 pohjapinta promoottorin aktiivisuutta voitiin liittyy kohonnut pitoisuus ydin- β-kateniinin tässä GC solulinjassa (kuvio 1 B). Näin ollen, MKN45 ja HEK293-solut kotransfektoitiin pCOX2 läsnä ollessa pienempiä annoksia konstitutiivisen aktiivisen β-kateniinin proteiini (S33Y) [31]. Kuten havaitaan kuviosta 3, pCOX2 aktiivisuus todellakin parannettu molemmissa solutyypeissä, mikä viittaa siihen, että β-kateniinin voivat sitoa ja aktivoi sitten TCF /LEF transkriptiotekijöiden toiminnalliseksi TBE sivustoja sisällä pCOX2 promoottori.

(A) Kaaviokuva kuvaa genomisen yhteydessä ca. 1.6 kep alkaen transkription aloituskohdasta (TSS) ihmisen COX2 promoottori, kuten sijainti tunnetaan transkription sääntelyviranomaisten (valkoiset laatikot) ja asento kolme uutta TCF /LEF-sitovia elementtejä (TBE: ydin CTTTG; mustat laatikot) määritettiin

in silico

. (B 0,05, ** p 0,01). Nuclear tasot β-kateniinin proteiini tutkittiin samassa solulinjoissa kautta Western Blot-analyysi (oikea paneeli). TFIIB yleinen transkriptiotekijä käytettiin sisäisenä kontrollina.

Osuus TBE auttaakseen COX2 promoottorin aktiivisuutta GC soluissa

leikellä osuus Wnt /β-kateniinin reagoiva TBE sivustoja transkriptionaalisen aktiivisuuden COX2 promoottorin neljä pCOX2 deleetioita konstruktit tuotetaan: pCOX-1,2 (-1123 /+ 35 bp); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 emäsparia); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bp); ja pCOX-0,4 (-371 /+ 35 bp) (kuvio 4A). Näitä rakenteita myöhemmin analysoitiin niiden toiminnan kautta lyhytaikaisissa transfektioissa vuonna MKN45 ja AGS soluja käyttämällä WI38- fibroblasteja verrokkina solulinja. Yhdenmukainen endogeenisen COX2 ekspressiotasot näissä GC solulinjoissa (kuvio 1A), pCOX2 deleetiot säilytetään eri toiminnan MKN45 ja AGS-soluja (kuvio 4B ja C). Sitä vastoin ei-promoottorin aktiivisuutta havaittiin WI38- fibroblasteissa (kuvio 4D), jopa silloin, kun transfektio annoksia näitä soluja kasvoi 8-kertaiseksi (eli 50-400 ng) (kuvio S2). Tärkeää on, ja yhteisymmärryksessä aiempien raporttien kanssa [50], WI38- solut tehokkaasti ilmaisseet lusiferaasia reportterikonstruktista sisältävä promoottori p21-geenin (kuvio S2), mikä osoittaa, että näissä kontrollisoluissa molekyylitason koneisto vastuussa asiakkuutta COX2 transkriptio ei ole aktiivinen . Lisäkokeet osoittivat, että transfektion MKN45 ja AGS solujen pCOX2-0.8 konstruktilla, joka on 859 bp poistetaan 1,6 Kb pCOX2 toimittaja (kuvio 4A), johti merkittävään lisääntymiseen promoottorin aktiivisuutta verrattuna pCOX2-1.2 toimittaja (kuvio 4A-C). Koska ei havaittu merkittäviä eroja välillä 1,6 Kb pCOX2 ja pCOX2-1.2 konstruktioita (kuvio S3), emme suorita edelleen analyysejä kanssa suuremman konstruktion. Tärkeää on, pCOX2-0.8 edustaa vähimmäiskoko promoottori fragmentti, joilla maksimi perusaktiivisuutta, koska edelleen poistetaan joko 159 tai 370 bp: n 5′-päähän, koska se on asianlaita pCOX2-0.65 tai pCOX2-0.4 konstruktioita, vastaavasti väheni yli 2-kertainen tasot pCOX2 perusaktiivisuutta. Nämä tulokset osoittavat, että alue on välillä 0,8 ja 0,65 kep ylävirtaan TSS on COX2 geenin, ja joka sisältyy uusi TBE elementin (TBE Site II; -689 /-684), voi olla avainasemassa aikana sääntelyä pohjapinta taso COX2 geeniekspression GC soluissa.

(A) Kaavamainen esitys pCOX2 poistot. (B-D) Gene reportteri määritys MKN45 (B), AGS (C) ja WI38- (D) solulinjat transfektoitiin ohimenevästi 50 ng pCOX deleetioita (pCOX2-1.2, pCOX2-0.8, pCOX2-0.65 ja pCOX2-0.4) ja 50 ng tyhjän vektorin. Kaikissa kokeissa solut transfektoitiin 1 ng PRL-SV40 Renillaa sisäisenä kontrollina. Promoottorin aktiivisuus normalisoitiin suhde tulikärpäsen lusiferaasi ja Renilla lusiferaasi yksikköä. RLU: Suhteellinen lusiferaasiyksikköinä. Jokainen luku vastaa vähintään kolmen erillisen kokeen. Tilastollinen merkittävyys määritettiin ANOVA-testi (* p 0,05, ** p 0,01).

lisääntymisen merkkejä pCOX2-0.8 kautta Wnt /β-kateniinin signalointi

Seuraava tutkitaan vaikutusta Wnt /β-kateniinin signalointi on romaani TBE Site II. Transfektoimme MKN45 solujen pCOX2-0.8 reportteri-konstrukti ja koekspressoitiin konstitutiivista aktiivista β-kateniinin S33Y proteiinin toteamalla, että oli merkittävä (2-kertainen) parantaminen transkriptionaalista aktiivisuutta pCOX2-0.8. Tämä β-kateniinin-välitteisen lisäys oli spesifinen, koska pCOX2-0.4 konstrukti ei stimuloitu tässä β-kateniinin yli-ilmentyminen olosuhteissa (kuvio 5A ja B). Kontrolloida Wnt /β-kateniinin signalointi MKN45 soluissa käytimme Wnt /β-kateniinin reagoivan SuperTOPFLASH (STF) toimittaja kuljettaa 12: sta TBE peräkkäin [32], joka oli transfektoitu joko yksin tai kun läsnä oli plasmidin koodaavan mutantti-β-kateniinin S33Y-proteiinia. Mielenkiintoista on, että vaikka ilmentäminen rinnakkain mutantti β-kateniinin S33Y proteiinin MKN45 solut pystyttiin parantamaan (1,9-kertainen) aktiivisuutta STF reportteri, korkea perustason STF aktiivisuuden havaittiin puuttuessa mutantin β-kateniinin (kuvio 5C). Tämä tulos on yhtäpitävä aiempien havaintojen korkeita endogeenisten ydin- β-kateniinin tässä solutyypissä (katso kuvio 1 B), ja vahvistaa, että tämä ydinvoima tekijä on toimiva. Edelleen vahvistaa tämän havainnon, suoritimme samanlaisia ​​kokeita HEK293-soluissa ja saatiin oleellisesti samanlaiset tulokset, vaikka tässä tapauksessa selvä annos-vaste-käyrä saatiin, kun pCOX2-0.8 transfektoitiin, kun läsnä on kasvavia pitoisuuksia konstitutiivisesti aktiivisen β-kateniinin S33Y proteiinia (kuvio S4). Lisäksi olemme havainneet, että STF aktiivisuus HEK293-soluissa oli hyvin herkkä tasoja eksogeenisia mutantti β-kateniinin (kuvio S4C).

Gene reportteri määrityksissä MKN45 soluihin väliaikaisesti transfektoitu joko 10 ng pCOX2-0.8 ( A) tai pCOX2-0.4 (B), sekä 5-10 ng β-kateniinin S33Y ja 10 ng tyhjän vektorin kontrollina. (C) SuperTOPFlash (STF, 10 ng) oli ko-transfektoitiin 10 ng β-kateniinin S33Y positiivisena kontrollina Wnt /β-kateniinin signalointi aktiivisuutta. (D) vaikutus vallitsevan negatiivisen TCF-4 (ΔTCF) rakentaa aktiivisuudesta pCOX2-0.8. MKN45 solut ohimenevästi kotransfektoitiin 50 ng pCOX2-0.8 ja 20-50 ng ΔTCF. (E) välinen vertailu aktiivisuutta villityypin pCOX2-0.8 ja mutantti MpCOX2-0.8 rakenne, joka sisältää mutatoidun jäämiä TBE Site II on pCOX2-0.8 promoottori tausta. Solut transfektoitiin kasvavilla pitoisuuksilla pCOX2-0.8, MpCOX-08, tai yhtä suuret määrät tyhjällä vektorilla kontrollina. Kaikissa kokeissa 1 ng PRL-SV40 Renillaa transfektoitiin sisäisenä kontrollina. Promoottorin aktiivisuus normalisoitiin suhde tulikärpäsen lusiferaasi ja Renilla lusiferaasi yksikköä. RLU: Suhteellinen lusiferaasiyksikköinä. Jokainen luku vastaa vähintään kolmen erillisen kokeen. Tilastollinen merkittävyys määritettiin ANOVA-testi (* p 0,05, ** p 0,01).

edelleen tutkia vaikutuksia Wnt /β-kateniinin polku on aktiivisuudesta pCOX2-0.8 suoritimme menettämisestä toiminnon kokeita vallitsevaa negatiivista TCF4 (ΔTCF) rakentamiseksi, joka koodaa transkriptiotekijän puuttuu 30 tähteillä sen Aminoterminaalista ja joka ei kykene sitoutumaan β-kateniinin [32]. Olemme havainneet, että MKN45 soluissa ΔTCF ilmentyminen vähentää korkeita pCOX2-0.8 pohjapinta transkription annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 5D). Tämä tulos vahvistaa avainroolia TCF /LEF transkriptiotekijöiden joukossa sääntelyviranomaiset aktiivisuuden pCOX2-0.8 promoottorisekvenssin, ja edelleen tukee ajatusta siitä, että TBE sivusto II (-689 /-684) osallistuu vastauksena Wnt /β-kateniinin signalointi.

Lopuksi mahdollisuus ratkaista roolia TBE site II Wnt /β-kateniinin välittämää säätelyn COX2 promoottorin, me käyttöön mutageneesillä muutos 2 avain nukleotidiä konsensus-sekvenssin TBE-sivuston II ytimen (eli pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Nämä muutokset on osoitettu aiemmin lakkauttaa Wnt /β-kateniinin-välitteisen transkription [39]. Ohimenevä transfektio tutkimukset osoittivat, että mutaatio TBE Site II laski merkittävästi (2-3-kertainen) pohjapinta aktiivisuus pCOX2-0.8 konstruktin MKN45 soluissa (kuvio 5E) verrattuna villityypin pCOX2-0.8 promoottorikonstruktiin. Lisäksi ja sopimus meidän aiempien tulosten, mutaatio Tämän TBE sivuston II lähes täysin tukossa β-kateniinin välittämää parantaminen pCOX2-0.8 konstruktin (kuva S4). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että TBE sivusto II (-689 /-684) on toiminnallinen komponentti COX2 geenin transkription säätelyyn.

β-kateniinin sitoutuu COX2 geenin promoottorialue sisälsi TBE Site II

Koska transkriptionaalisesti aktiivisen konformaation kromatiinin rakenteen heijastuu kohonnut histoni asetylaatio [51], me saostetaan silloitettu chromatin fragmentit (keskimääräinen koko 300-500 bp) eristettiin MKN45 soluista käyttäen polyklonaalisia vasta-aineita tiettyjä for asetyloitu histonien H3 ja H4. Samoin olemme havainneet sitovat RNA-polymeraasin II (Pol II) parametri tavallisesti liittyvät transkriptionaalista aktiivisuutta. Tutkimme rikastumista meidän saostumat kahden promoottorisekvenssit: proksimaalisen promoottorin (PP) alue (-118 /+ 62 TSS) ja distaalisen alueen (-793 /-594) ja COX2 promoottorin sisältävä konsensus TBE Site II ( -689 /-684). Erityisesti TBE Site II oli suunnattu sillä aiemmat tutkimukset osoittivat, edullisen sitoutumisen β-kateniinin tämän promoottorialueen (kuva S5). Positiivisena kontrollina, arvioimme sitova, TBE sivuston promoottori c-myc-geenin (-1447 /-1144 päässä TSS), joka oli aikaisemmin kuvattu koolonkarsinoomasoluissa [38].

Asetyloitu histonien H3 ja H4 ja Polimerase II entsyymi havaittiin sitoutuvan proksimaalisen promoottorialue (kuvio 6A), mikä osoittaa, että kromatiinirakenteeseen ympärillä COX2 promoottori MKN45 soluissa on avoimessa konformaatiossa, mikä kanssa edellisessä tuloksia, jotka osoittavat COX2 geeni aktiivisesti transcribing. On huomattava, että β-kateniinin proteiini immunosaostettiin MKN45 näytteistä lähinnä yhdessä promoottorialueen ulottuu -684 /-689 TBE-sekvenssin COX2-geenin (kuvio 6B). Tämä seikka oli lähes mahdoton havaita proksimaalisessa promoottorialueen, mikä osoittaa, että endogeeninen ydin- β-kateniinin ensisijaisesti rekrytoitu TBE Site II näissä GC soluissa. Kuten odotettua, endogeeninen β-kateniinin oli samalla sitoutunut c-myc promoottori TBE-sivuston, tasoilla, jotka ovat verrattavissa havaittiin COX2 geenin promoottori (kuvio 6C).

(A-C) pelimerkin määritykset in MKN45 soluissa käyttäen spesifisiä vasta-aineita β-kateniinin (β-kissa), polymeraasi II (Pol), H3 ja H4 asetyloidut histonien (H3ac, H4ac) ja immunoglobuliini G (IgG). Kvantifiointi tehtiin reaaliaikaista PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita proksimaalisen promoottorin (PP) alue (A), TBE Site II (-689 /-684) ihmisen COX2 promoottori (B) ja TBE-sivuston sisällä c-myc promoottori, positiivisena kontrollina (C). (D) EMSA määritys ydin- otteita MKN45 soluista. DNA-proteiini-komplekseja on muodostettu inkuboimalla tumauutteita (N.E.) päässä MKN45 solujen radioaktiivisesti koettimet sisältävät ehjä ja mutatoitunut TBE Site II (kaistat 3 ja 5) ratkaistiin natiivin polyakryyliamidigeeleillä 5% ja paljastetaan autoradiografialla. Spesifisyyden määrittämiseksi sitovan 50 kertaa suurempi kuin ei-radioaktiivisesti villityypin (linja 4) ja mutantti (6 ja 7) lisättiin oligonukleotidit. Kaistat 1 ja 2 vastaavat villityypin ja mutantti radioaktiivisesti oligonukleotideja ilman inkubointi N.E. Nämä kokeet edustavat kolmen erillisen kokeen.