Krooninen sairaus

tiivistelmä

systeeminen potilaiden hoidossa varhaisvaiheen syöpiä yrittää hävittää okkultismin etäpesäkkeitä toistumisen estämiseksi ja lisääntynyt sairastuvuus. Kuitenkin ennustaminen uusiutumisen analyysistä primaarikasvaimen on rajallista, koska levitetään syöpäsoluja edustaa vain pieni joukko ensisijaisen vaurion. Tässä analysoimme ilmaisun kiertävän MikroRNA (MIRS) seerumin saatu valmiiksi kirurgisesti varhaisvaiheen potilaiden peräsuolen syöpiä. Ryhmät viisi potilasta kanssa ja ilman taudin uusiutumista käytettiin tunnistamaan informatiivinen paneeli kiertävän Mirs käyttämällä kvantitatiivista PCR genominlaajuisten miR ilmentymisen sekä joukko julkaistun ehdokas Mirs. Paneeli kuusi informatiivinen Mirs (miR-15a, mir-103, miR-148a, miR-320a, miR-451, miR-596) oli peräisin tämän analyysin ja arvioitiin erillisessä validointi joukko kolmekymmentä potilasta. Hierarkkinen ryhmittely ekspressiotasoja näiden kuuden kiertävän MIRS ja Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että riski taudin uusiutumisen varhaisessa vaiheessa paksusuolen syöpä voidaan ennustaa tämän paneelin Mirs jotka ovat mitattavissa verenkierrossa aikaan diagnoosi (P = 0,0026; riskisuhde 5,4; 95%: n luottamusväli 1,9-15).

Citation: Shivapurkar N, Weiner LM, Marshall JL, Madhavan S, Deslattes Mays A Juhl H, et al. (2014) uusiutuminen Alkuvaiheen Colon Cancer ennustivat ekspressiokuviota Kiertävä MikroRNA. PLoS ONE 9 (1): e84686. doi: 10,1371 /journal.pone.0084686

Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 elokuu 2013; Hyväksytty: 18 marraskuu 2013; Julkaistu: 06 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Shivapurkar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tuettiin osittain NIH avustuksia CA108440 (AW), P30 CA051008 (LW), HHSN2612200800001E (SM), Lombardi Cancer Center (NS) ja Ruesch Center (NS, JLM, SM, ja AW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Yksi kirjoittajien (Dr. Juhl) on affiliatiated Indivumed, GmbH. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja eikä tarjoa eturistiriitoja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmas johtava syy syövän kuolleisuus, joka vaikuttaa miehiin ja naisiin. Maailmanlaajuinen sen osuus on noin miljoona uutta syöpää ja puoli miljoonaa kuolemantapausta eli 10 prosenttia syöpäkuolemista [1]. Tulokset potilaille, joilla on aikaisen vaiheen CRC ovat heterogeenisiä, tiettyyn tautiin 5 vuoden eloonjäämisluvut potilailla, joilla on vaiheen II 72-88% ja 40-71% vaiheen III [2]. Useimmat potilaat, joilla on vaiheen II tauti paranee pelkkä leikkaus taas ylimääräisiä kemoterapia voi tarjota selviytymisen etuja potilaille, joilla myöhemmin tauti. Silti noin 1: 4 varhaisvaiheen potilaiden tauti kärsii toistuminen ja biomarkkerit että tunnistaa potilaat on suuri riski aikaan alustavan diagnoosin ja leikkaus antaisi valita niille potilaille tarkempaa seurantaa ja mahdollisesti systeemisiä hoitoja ([3], [ ,,,0],4], [5] tarkastellaan hiljattain [6]).

MikroRNA (miRNA tai MIRS) ovat pieniä, ei-koodaavat RNA: t, jotka on merkittävä rooli toimien valvonta solureiteillä sekä fysiologian ja patologia (katso esim [7]). Erillinen toiminto Mirs eri syöpien on tullut yhä ilmeisemmäksi viime vuosina [8], [9], ja monet tutkimukset osoittavat, että miR allekirjoituksia voidaan käyttää erottamaan eri syöpiä [10], [11], [12], [13], ennusteita [14], [15], paljastaa potentiaalisia kohteita [16], muuttunut signalointireitteihin [17], tai pahanlaatuinen siirtymisestä in situ kohdunkaulan ja invasiivisen sairauden [18]. Useimmat yllättäen, vertailun miR ja mRNA profiilit ensisijainen ja metastaattinen vaurioita osoitti, että Mirs luotettavammin ja erottuva allekirjoitus kuin mRNA: iden ja totesi, että miR allekirjoitukset olivat paremmat kuin mRNA: iden tunnistamisessa elin lähde etäpesäkkeiden tuntematonta alkuperää [19] , [20]. Aiemmassa tutkimuksessa [21] käytetään ilmaisua profiloinnin 315 Mirs kudoksissa vaiheesta II koolonsyöpien osoittivat eroja kaavoja uusiutuva sairaus. Ilmentymistasojen erityisiä Mirs kudoksissa korreloi todennäköisyys toistumisen vapaan eloonjäämisen monimuuttuja-analyysi. Nämä tulokset viittaavat siihen, että häiritään ilmentyminen MIRS paksusuolen syöpä voi olla ennusteen potentiaalia.

Näiden analyysien normaaleissa ja sairaissa kudoksissa, lisää Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että miR lajeja voidaan havaita verenkierrossa [22] ja jopa ehdottaneet, että analyysi seerumin näytteiden määritelty MIRS voitaisiin käyttää tunnistamaan potilaita, joilla syöpiä [23], [24], [25], [26]. Tutkimukset veren välityksellä miRome osoitti myös soveltuvuus tauteja kuin syöpä ([27]; tarkistetaan [28], [29]). Mirs verenkierrossa näyttävät olevan erittäin pysyvä [30], [31], ja ehdotettiin, että vakaus johtuu MIRS sisällytetään lipoproteiinien rakkulat, joka tunnetaan eksosomeiksi [32]. Täällä olemme tutkineet Mirs verinäytteistä saatu valmiiksi kirurgisesti varhaisvaiheen potilaiden paksusuolensyöpä että pysyi uusiutumista vapaa tai oli tauti uusiutuu. Oletimme, että muuttuneessa malleja verenkierrossa Mirs saattaa viitata lisääntynyt riski taudin uusiutumisen vuoksi okkultismin metastasoitunut siemeniä aikaan alustavan diagnoosin. Kerromme, että niistä kuudesta Mirs voi olla hyödyllistä ennustettaessa riskiä taudin uusiutumisen varhaisen vaiheen paksusuolen syöpiä.

Tulokset

Kiertävä microRNA Expression Vertailu Käyttämällä Candidate Gene Approach

mittaamiseksi Mirs verenkierrossa perustimme kvantitatiivinen RT-PCR [33] osoitusmenetelmäksi jonka dynaaminen alue jopa 10

6-kertainen MIRS seeruminäytteistä [18]. Koska lähtökohdasta, poimimme paneeli kuudentoista Mirs joka oli osoitettu ekspressoitua eri välillä paksusuolensyöpä ja normaalin paksusuolen kudoksiin [21], [34], [35]. Alussa juoksi pilottitutkimus ja analysoitiin joukko seeruminäytteiden varhaisessa vaiheessa paksusuolen syöpä potilaat, jotka jäivät taudista vapaan (n = 5) tai oli uusiutunut (n = 5) sisällä keskimäärin 26 kk ( 0,05 vs. no toistuminen; Fig. 1A, B). Kuva. 2A esittää suunnilleen 100000-kertainen pitoisuusalue kuudestatoista kiertävän Mirs analysoidaan pilottitutkimus. Havaitsimme odotetut suuntaukset vastaavien ylä- tai down-regulation joidenkin valittujen Mirs (ts miR-20, miR-135b, miR-195, miR-320, miR-615). Kuitenkin, erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (Fig. 2B). On huomionarvoista, että miR-320 oli toinen kahdesta MIRS, joka osoitti downregulation kudoksissa, joka korreloi huonon uusiutumista elinaika [21]. Täällä miR-320 verenkierrossa oli noin kaksi kertaa pienempi potilailla, joilla tauti uusiutuu, vaikka se downregulation ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio. 2B). Ilmaisu Mir-498, muut miR tutkimuksesta in Ref. [21], havaittiin vain hyvin pieniä määriä verenkierrossa ja siten ei sovellu analysointiin.

, esitutkimuksessa, jossa 10 potilasta ehdokas MIRS ennustava taudin uusiutumisen tunnistettiin ja testattiin niiden ennustaminen taudin uusiutumisen validointitutkimuksessa. B, Kaplan-Meier juoni taudin uusiutumisen potilailla pilottitutkimuksen. Potilaat, joilla tauti uusiutuu (n = 5) vs toistuminen (n = 5): Chi square 5.47, p = 0,0193; mediaani aika-to-uusiutuminen = 26 kuukautta. Gehan-Breslowin-Wilcoxonin algoritmeja käytettiin.

Candidate miR lähestymistapaa. Verenkierrossa 16 Mirs merkitty x-akselilla, joka oli julkaistu ilmentyvät differentiaalisesti välillä paksusuolen syöpä ja ei-pahanlaatuisten koolonin kudosta analysoitiin [21], [34], [35]. Pre-leikkaus seeruminäytteet olivat peräisin potilaista pilottitutkimus. Potilaita oli noudatettu taudin uusiutumisen ja vastaavat tiedot ovat kuvassa. 1B. A pitoisuus verenkierrossa Mirs (suhteessa U6). Huomaa log-asteikko, joka kattaa useita 100000-kertainen. B, suhde ilmaisun potilasryhmien välillä. Alhough miR-20, miR-195 ja miR-320 osoitti ≥2-kertaiseksi downregulation, ja miR-135b ja miR-615 ≥2-kertainen säätelyyn ylöspäin seerumia potilailla, joilla tauti uusiutuu, kumpikaan vertailut olivat tilastollisesti merkitseviä, jonka ANOVA (p 0,05).

Kiertävä microRNA Expression vertailu käyttäen Puolueettomat, genominlaajuiset Analysis

yllä pilottitutkimus valitsimme kaksi potilasta näytteitä toistumisen vapaa ( NRec) ja toistuminen (Rec) ryhmä ennakkoluulotonta genominlaajuisia miR analyysi. Poimimme potilaita edellä pilottitutkimus, joka oli osoittanut eniten ero ilmentymä ehdokas Mirs. Me perusteltu, että vertailu tällaisessa näytteessä pari voisi tarjota paremmat mahdollisuudet poimien uusiutumisen erityisiä Mirs. Analysoimme tämän parin potilaan näytteitä SYBR Green qPCR perustuu genominlaajuisten miR ilmaisun paneelit 760 MIRS perustettu laboratoriossamme käyttäen kaupallisesti saatavilla olevia reagensseja (SBI, Mountain View CA). Vastaava tulos top 70 Mirs on esitetty kuvassa. 3 lämpökarttana. Riippumattoman validointitutkimusta me valittu tästä paneelista kuudesta MIRS jotka täyttivät kaksi kriteeriä: (1) riittävä ilmentymistasoissa seeruminäytteistä eli RT-PCR Ct arvot ≤32 ja (2) differentiaalikaavojen ( 3-kertainen ylä- tai down-regulation) tietyn miR vertaillaan Rec ja NRec näytteitä.

Heat kartta genominlaajuisten microRNA ilmentymisen analyysi käyttäen kvantitatiivista RT-PCR. Kaksi potilasta valittiin pilottitutkimuksen (katso kuviot. 1 ja 2). Mirna ilmentymisanalyysit suoritettiin 760 miRNA käyttäen qPCR-pohjainen ilmentymisanalyysiä. Tietojen suodatus ja analysointi tehtiin ja 70 Mirs jotka osoittavat suurimmat ero ilmaisua ovat edustettuina lämpökartassa.

validointi Kiertävä mikroRNA Ekspressiokuvioiden kuin Predictor sairauden uusiutumisriski

sen arvioimiseksi, onko kiertävien Mirs yksilöity edellä pilottitutkimuksessa voi ennustaa taudin uusiutumisen matalan riskin potilaita, käytimme erillinen, riippumaton ryhmä kolmekymmentä varhaisvaiheen potilaiden paksusuolensyöpä, joiden tiedetään tuloksia. Viisitoista näistä potilaista oli taudin uusiutumisen sisällä keskimäärin 25 kuukauden ajan, kun toinen viidentoista pysyi uusiutumista vapaa. Kliiniset ominaisuudet potilaiden tässä validointi asetettu aikaan niiden alustavan diagnoosin annetaan taulukossa 1. Aikaan diagnoosi kahden potilasryhmien kanssa ja ilman taudin uusiutumista ei osoittanut merkittäviä eroja suhteessa ikään, sukupuoleen, kasvaimen koko , kasvain vaiheessa sijainti niiden primäärivamma tai histopatologia (taulukko 1). Kaikilla potilailla oli solmu-negatiivinen sairaus ja yli kaksitoista imusolmukkeet tutkittiin. Vain yksi potilas (ei-toistuminen ryhmä) oli T4, kaikki muut olivat T1-T3 kasvaimia ja näin alhaisella tunnettu riski toistumisen.

Expression kuudesta Mirs johdetut tunnistettu pilottitutkimus mitattiin qRT-PCR ja tuloksien esitetään raaka Ct-arvoja sekä pitoisuusalue kuvassa. 4A (vasen ja oikea akselit vastaavasti). Pitoisuus kuuden valitun Mirs verenkierrossa kattaa monia noin 1000-kertaiseksi, ja siten 100 kertaa kapeampi kuin Mirs seurataan pilottitutkimuksessa (vertaa kuviot. 4A ja 2A). Korrelaatio analyysi osoittivat vahvan korrelaation ekspressiotasot miR-15a, miR-148a, miR-320a ja miR-451 (r = 0,746-0,897; p 0,0001), kun taas tasojen miR-103 ja asennuspalveli- 596 ei korreloi tasot muiden Mirs. Pääkomponenttianalyysiin (PCA) Tietueen osoittivat selvä ryhmittelyä potilaiden kanssa ja ilman toistumisen (Fig. 4B) viittaa siihen, että paneeli Mirs voi erottaa eri uusiutumisen riskiä potilailla.

Validation -tutkimus kuusi Mirs tunnistettu Pilottitutkimus. Potilaiden ominaisuudet annetaan taulukossa 1. Kuusi MIRS olivat peräisin pilottitutkimus. A Ilmentymistasoja perustuu syklin kynnys (Ct) arvot qRT-PCR (vasen akseli) ja miR pitoisuus lasketaan (oikea akseli). B, pääkomponenttianalyysiin tietojen kanssa kaksi ryhmää esitetään musta ja punainen symbolit vastaavasti.

Sokkoutettu hierarkkinen klusterointi analyysi [18] (Fig. 5A), osoittivat merkittävää subsetting kahteen eri ryhmään . Kolmetoista viidentoista potilaita, joilla tauti uusiutuu ja yksitoista viidentoista potilaita, jotka olivat toistuminen vapaa oli luokitellut oikein Mirs verinäytteissä kerättävä ennen niiden alkuperäisen leikkausta (p = 0,0025; riskisuhde = 17,9; suht. Riski = 5,5, 95% CI = 1,5-20,7). Kaplan-Meier analyysi kertaa taudin uusiutumisen potilailla osoitettu korkea tai matala riski, jonka hierarchival klusterointi oli merkittävästi erilainen lopputulos ryhmien välillä (P = 0,0026, Fig. 5B). Näin ollen kuusi Mirs tässä valittu voidaan käyttää ennustamaan riski taudin uusiutumisen varhaisessa vaiheessa, alhaisen riskin paksusuolen syövän analyysi verinäytteestä kerättiin aikaan alkuperäisen diagnoosin.

A, hierarkkinen klusterointi potilaita validointitutkimuksessa matalan ja korkean riskin ryhmiin perustuu seerumin miR tasoilla. Analyysi johti erottaminen kahteen ryhmään. B, Kaplan-Meier juoni potilaiden ennustettu olevan korkea ja matala riski taudin uusiutumisen. Vertailu johti P = 0,0026, riskisuhde 5,4 (1,9-15,0 95% CI). Paneelissa A potilaalla on tauti uusiutuu ovat # 1 # 15 ja ilman toistuminen: # 16 # 30.

Keskustelu

Nykyinen tutkimus arvioi mahdollinen käyttö kiertävän MikroRNA ( Mirs) tunnistaa paksusuolensyöpä potilaita, joilla on suuri riski taudin uusiutumisen inspite diagnoosi varhaisessa vaiheessa alhaisen riskin tauti merkitty perustettu tuumorin luokitus. Tämä voisi auttaa tunnistamaan ne yksilöt, jotka hyötyisivät tarkempaa valvontaa ja /tai systeemistä hoitoa ja vältettäisiin yli potilaiden hoitoon, jotka eivät hyödytä johtuen niiden alhaisen riskin (tarkistetaan äskettäin [6]). Analyysi voidaan tehdä pieni määrä (alle 1 ml) seerumia.

alkuperä verenkierrossa Mirs on ollut keskustelun aiheena. Kasvaimeen liittyvä MIRS havaitaan verenkierrossa voi luonnollisesti aiheutua kasvainsolujen kuolemaan sekä aktiivisesta vapautumisen kasvainsoluja. Lisäksi Mirs pakattu suojaavia kantajia kuten eksosomeiksi voidaan toimittaa vastaanottajalle soluihin, joissa ne aiheuttavat geenien kautta samalla mekanismilla kuin solujen MIRS [36] tai voidaan irtoa verenkiertoon. Lisäksi erittyvän Mirs on arveltu osallistuvan välittämisessä solu-solu viestintä. Myös valita sarjaa Mirs vapautuu syöpäsolujen ja koostumus näiden sarjaa Mirs on liittynyt pahanlaatuisen [37]. Vaikka syöpään liittyvän kiertävien MIRS ovat voivat olla peräisin syöpäsoluja itseään, immuuni- tai muiden stroomasolut kasvaimen mikroympäristössä, sekä muissa elimissä, jotka vastaavat signaaleja kasvain ovat mahdollisia lähteitä [38]. Täten immuunijärjestelmän solut voivat erittää syöpään liittyvän Mirs, mikä edistää tai proliferaation, invaasio ja apoptoosin [38], [39] ja säätelyhäiriö näiden Mirs voi olla tärkeä yhteys immuniteetti ja syöpä. Vaikka joissakin tutkimuksissa havaittu rinnan suuntauksia välillä kiertävän MIRS ja kudoksen MIRS (esim. [18], [24]) toiset viittaavat siihen, etteivät kaikki vapautettu Mirs heijastavat miR runsaus tuumorisoluissa (esim. [37], [40]). Yleensä Mirs havaittu verenkierrossa tarjoavat eri elimiin ja fysiologinen sääntely tai patologisten muutosten muuttavat ilmentymiskuviot kiertävän Mirs (viimeaikaisia ​​esimerkkejä ja tarkastele viitteet. [29], [41], [42], [43 ]).

analysoitaessa Mirs nykyisessä tutkimuksessa yksi kerrallaan eikä monimuuttuja-analyysissä, kaksi Mirs havaittiin differentiaalisesti ilmaistut liikkeessä eli miR-103 (vaimentua) ja miR-596 (voimistunut). miR-103 oli merkitsevästi alassäädetty (p = 0,038) verinäytteistä potilaista, joilla tauti uusiutuu verrattuna uusiutumista vapaa potilailla (Fig. 4A). Suolen imukerässoluista miR-103 on osa G1 /S siirtyminen sääntelyverkon aikana IGF-1 stimuloi leviämisen ja tämä viittaa merkittävä rooli solujen kasvua ja selviytymistä [44]. Sen sijaan miR-596 oli merkitsevästi sääteli (p = 0,0012) verinäytteistä potilaista, joilla tauti uusiutuu. Expression of miR-596 korreloi huonon eloonjäämistä potilailla, joilla ependymoma [45] mutta inaktivoituu HCC [46] ja vaimentua haiman adenokarsinooma [47]. Näin ollen ei ole selkeää näyttöä vielä yhdistää kudosilmentämisen tämän miR erilliseen toiminnallisuutta, joka liittää sen taudin etenemistä. Mirs vain pieni yleinen väliset muutokset potilasryhmät olivat miR-148a, joka on osa ryhmää alipaineensäätöventtiileillä proinflammatoristen geenien ydinsoluissa [48], mutta on vähentynyt haimasyövän kudoksissa [18], ekspressoidaan korkeilla tasoilla maksan kudoksissa [49] ja liittyy maksavaurion [50]. miR-320a raportoitiin aikaisemmin lupaavana indikaattorina pahanlaatuisia etenemistä paksusuolensyöpä [25], vaikka emme nähneet selviä viitteitä vaikutuksista miR-320 muutoksia omaan tässä tutkimuksessa. miR-15a voi aiheuttaa apoptoosia [51], ja on raportoitu osallistua ohjaus kasvaimeen strooman ylikuulumisen eturauhassyövässä [52] sekä välittävät proangiogeeninen väyliä iskemia liittyvä patologia [53]. Mielenkiintoista, miR-451 luonnehdittiin kiertävä indikaattori läsnäolo rintasyövän [54] ja sen osoitettiin valikoivasti vapautuu muuttaneet rintarauhasen epiteelin ja edistää muuttunut herkkyys kemoterapeuttisten tai hormonitoimintaa kohdennettuja lääkkeitä rintasyövän (tarkistetaan [ ,,,0],55]). On houkuttelevaa spekuloida, että kiertävä Mirs tunnistettu tässä indikaattoreina riskiä taudin uusiutumisen voivat edistää prosessia vaikuttamalla tuumorisolujen selviytymistä, kasvain strooman vuorovaikutukset, angiogeneesi tai tulehdussolujen vastauksia okkultismin etäpesäkkeitä.

vuonna Johtopäätös

toistumisen riskiä varhaisessa vaiheessa paksusuolen syöpä voidaan ennustaa tarkkailemalla MIRS potilaan verinäytteistä aikaan alustavan diagnoosin.

Materiaalit ja menetelmät

miR havaitseminen ja kvantitointi verinäytteistä

kerääminen ja käyttö biospecimen hyväksyi Institutional Review Board (IRB) Georgetown University alle pöytäkirjan # 2007-345 viimeksi 10.24.2012. Kaikki potilaat allekirjoittavat suostumuslomakkeen jolloin voidaan käyttää lahjoitti kudosten ja kehon nesteen näytteistä. Suostumuslomakkeet ja niiden sisältö tarkistettiin ja hyväksynyt IRB. Seeruminäytteet ( 1 ml), käsiteltiin poistamisen jälkeen henkilökohtaisten tunnisteiden. miR eristäminen kuvattu aiemmin [18]. Lyhyesti, seerumi- näytteitä sekoitettiin suhteessa 1:10 Qiazol hajotusreagenssia ja vorteksoitiin. Lysaatti uutettiin CHCl3: lla ja vesipitoinen faasi käsitellään edelleen kokonais-RNA käyttäen miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ja rikastettiin miR käyttäen RT2 qPCR-luokan miR Isolation Kit, MA-01 (SABiosciences).

Data Analysis

PCA ja hierarkkinen klusterointi tehtiin perustuu keskimääräisen keskitetty ja skaalata miR ekspressiotasoja. Klusterijärjestelyssä menetelmät XLSTAT (Addinsoft Inc.) Excelistä (Microsoft Inc.) OSX 10.7.5. Nämä menetelmät mahdollistavat laskennan merkitystä välillä hierarkkisen klustereiden ja saada niistä p-arvot käyttämällä Fisherin tarkkaa testiä. Prism 5.0 (Graphpad) ohjelmistoa käytettiin muita kokeita ja esittämään data.

Kiitokset

Haluamme tunnustaa Daksnapriya Balasubbramanian, Anju Preet ja Ryan Navarro (kaikki Georgetownin yliopistossa) teknisistä apua. Drs. Daniel F. Hayes (U Michigan, Ann Arbor), John M. Jessup (National Cancer Institute, Bethesda) Michael B. Atkins, Stephen Byers ja Beppe giaccone (kaikki Georgetownin yliopistossa) lukea luonnoksia käsikirjoituksen ja edellyttäen kommentteja ja ehdotuksia tietojen analyysit ja tulkinta.