Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä (PDAC) on tappava sairaus, jossa viiden vuoden eloonjääminen 3- 5%. Mutaatiot K-Ras löytyy lähes kaikissa tapauksissa, mutta K-Ras mutaatiot eivät yksin riitä kehittämiseen PDAC. Muita tekijät aktivointi Ras signalointi ja johtaa kasvaimen muodostumiseen. Galektiini-3 (Gal-3), monitoiminen β-galaktosidi-sitova proteiini, ilmentyy vahvasti PDAC. Siksi tutkittiin toiminnallista roolia Gal-3 haimasyövän etenemiseen ja sen suhteesta Ras signalointi. Expression of Gal-3 määritettiin immunohistokemiallisesti, Q-PCR: llä ja immunoblottaus. Toiminnalliset tutkimukset suoritettiin käyttäen haiman solulinjoja geneettisesti ekspressoimaan korkea tai alhainen Gal-3. Ras aktiivisuus tutkittiin Raf avattavan määrityksissä. Samanaikainen immunosaostus ja immunofluoresenssilla arviointiin käytettiin proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että Gal-3 oli erittäin säädelty ihmisen kasvaimissa ja mutantti K-Ras hiirimallissa PDAC. Down-regulation of Gal-3 by lentivirus shRNA vähentynyt PDAC soluproliferaatiota ja invaasiota in vitro ja pienentää kasvaimen tilavuus ja koko käytettäessä potilaalle tehdä hiirimallissa. Gal-3 sitoutuneen Ras ja ylläpidetään Ras toimintaa; down-regulation of Gal-3 vähentynyt Ras aktiivisuus sekä Ras alavirtaan signalointi kuten fosforylaatioon ERK ja AKT ja Ral toimintaa. Transfektio Gal-3 cDNA PDAC soluihin matalan tason Gal-3 täydennetty Ras aktiivisuus ja sen alavirtaan signalointi. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Gal-3 edistää haimasyövän etenemisen, osittain sitomalla Ras ja aktivoimalla Ras signalointi. Gal-3 voi siis olla potentiaalinen uusi tavoite tätä tappavaa tautia.

Citation: Song S, Ji B, Ramachandran V, Wang H, HAFLEY M, Logsdon C, et al. (2012) yli-ilmentyy galektiini-3 in Haimasyöpä edistää solujen jakaantumista ja Invasion Sidonta Ras ja aktivointi Ras Signaling. PLoS ONE 7 (8): e42699. doi: 10,1371 /journal.pone.0042699

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 helmikuu 2012; Hyväksytty: 10. heinäkuuta 2012 Julkaistu: 10 elokuu 2012

Copyright: © Song et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoittivat National Institutes of Health /National Cancer Institute myöntää R01CA69480 (RSB), American Gastroenterologinen Association Research Scholar Award (S. Song), ja Public Health Service Grant DF56338, joka tukee Texas Medical Center Digestive Diseases Center (S. Song) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on tällä hetkellä neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat, arviolta 43140 uutta tapausta ja 36800 kuolemantapausta Yhdysvalloissa [1]. Koska sen aggressiivinen kasvu, varhain metastasoitunut levittämistä ja tehokkaiden hoitojen puute, viiden vuoden eloonjäämisaste tähän sairauteen edelleen 3-5% [2]. Huomattavia ponnistuksia vuoksi on saatava ymmärtämään molekyylitason tapahtumia, jotka voivat ajaa synnyssä PDAC. Joukossa lukuisia molekyylitason muutoksia tunnistettu PDAC, mutaatiot pro-onkogeeni K-Ras löytyy lähes kaikissa tapauksissa [3] ja on varhainen tapahtuma kehittämiseen PDAC [4]. K-Ras mutaatiot eivät yksin riitä kehittämiseen PDAC. K-Ras-mutaatioita esiintyy usein krooninen haimatulehdus ja voi jopa löytyä terveillä henkilöillä [5]. Lisäksi K-Ras-mutaatio hiirimallissa matalan Ras toiminta ei itsestään johda kehitykseen PDAC [6], kun taas K-Ras-mutaatio hiirimallissa, jossa on korkea Ras-aktiivisuus liittyy nopea kehitys CP kanssa runsas fibroosia ja eteneminen PDAC joka jäljittelee ihmisen sairauden [3]. Sen vuoksi on ehdotettu, että se on aktiivisuus K-Ras sijaan läsnä mutaation sinänsä, joka on biologisesti merkityksellinen parametri, joka liittyy patogeneesiin haimasyövän [2]. Muita tekijöitä ovat tarpeen, jotka edistävät Ras toimintaa; kuitenkin, mekanismeja, joiden Ras aktiivisuus on edelleen käytössä ovat suurelta osin tuntemattomia.

galektiini-3 (Gal-3), joka on b-galaktosidi-sitova proteiini osoittaa pleiotrooppisia biologisia ja patologiset toimintoja, ja se on osallisena solujen kasvu, erilaistuminen, adheesio, RNA käsittely ja pahanlaatuisiksi [7] – [10]. Gal-3 löytyy useita solun osiin, mukaan lukien sytoplasman, solun pinnalla, tumaan, ja Gal-3 erittyy myös [11]. Merkitys Gal-3: n ekspressio on arvioitu monissa syöpätyypeissä, mukaan lukien haimasyöpä [12] – [16]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että Gal-3 mRNA on säädelty haiman kasvain kudoksissa verrattuna kontrollisilkkipaperia [15], [17], [18], [19], ja ohimenevä tukahduttaminen galektiini-3 on raportoitu aiheuttavan haiman syöpäsolun muuttoliike ja invaasiota [16]. Wang et al havaitsivat, että Gal-3 oli myös säädellään ylöspäin krooninen haimatulehdus ja ehdotti, että se oli mukana molemmissa soluväliaineen (ECM) muutokset ja ductal kompleksin muodostumisen [20]. Kuitenkin täysi merkitys Gal-3 in PDAC jää epäselväksi ja vähän tietoa mahdollisista toiminta mekanismeja Gal-3 patogeneesissä on PDAC. Äskettäin Kloog ja kollegat osoittivat, että K-RAS GTP rekrytoi Gal-3: n sytosolista plasmamembraanin, jossa se tulee olennainen nanocluster komponentti. Sytosolin taso Gal-3 määrittää suuruuden K-Ras GTP nanoclustering ja signaalilähtö rintasyöpäsoluissa [21]. Viime aikoina havaintoja sama ryhmä osoitti, että K-Ras yhdessä Gal-3 edistää kilpirauhasen pahanlaatuisen [22]. Koska mutaatiot K-Ras ovat lähes universaaleja PDAC ja aktiivisuuden taso Ras näyttää olevan keskeinen mekanismi ohjaa kehitystä PDAC, etsimme onko Gal-3 vaikuttaa Ras aktiivisuus myötävaikuttaa patogeneesiin haimasyövän.

tässä tutkimuksessa olemme järjestelmällisesti arvioitu ilmentymistä Gal-3 120 pariksi ihmisen haiman kudoksista normaaleista haima, haimatulehdus ja haiman kasvaimet, ja ensimmäistä kertaa määritelty ilmaus Gal-3 kudoksissa ja kasvainsoluissa johdettu alkaen mutantti K-Ras hiirimallissa haimasyöpä. Olemme pidentäneet tuloksia aiempien tutkimusten ja edelleen rajattuja toimintaa Gal-3 in vivo ja in vitro osalta haimasyöpä muodostumiseen. Gal-3: n ekspressio oli lisääntynyt haimasyöpä ja syöpäsoluja, ja stimuloitiin haimasyövän solujen lisääntymistä ja invaasiota, ja edistää kasvaimen kasvua. Gal-3 sitoo Ras ja parantaa Ras aktiivisuus ja alavirtaan signalointi. Nämä havainnot tukevat johtopäätöstä, että Gal-3 voi olla mahdollinen uusi tavoite tätä tappavaa tautia.

Materiaalit ja menetelmät

Eläinten liittyvät tutkimukset ovat hyväksyneet MD Anderson Cancer Center Institutional IACUC komitea (ACUF 09-04-08832). Kaikki muut tutkimukset esitellään tässä olivat tutkinnan aloitti ja ei vaadi hyväksyntää muiden sääntelyelinten.

Solut ja reagenssit

Ihmisen PaCa solulinjat (L3.6pl, BxPC-3, Mpanc96, Panc-1, ja MiaPaca-2) on säädetty ystävällisesti Dr. C. Logsdon (Department of syöpäbiologian) ja Dr. S. Guha (Department of Gastroenterology, Hepatology Nutrition) UT MD Anderson Cancer Center ja on kuvattu aiemmin [23], [31]. Kaikki solulinjaa identiteettien varmistettiin DNA-sormenjälkien. Soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja antibiootteja (100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 IU /ml penisilliiniä). Anti-Gal-3-vasta-aine saatiin, kuten on kuvattu aiemmin [8]. Anti-Ras monoklonaalinen vasta-aine, anti-RALA monoklonaalinen vasta-aine, anti-fosfo-AKT ja anti-fosfo-ERK vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Anti-sykliini D1 ja anti- C-MYC vasta-aine oli Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA).

Protein eristäminen ja immunoblottausanalyysillä

Yhteensä haimasyöpä solulysaateista myös ihmisen ja K-Ras G12D hiirimallissa [25] valmistettiin 2% SDS lysis-puskuria, kuten aikaisemmin on kuvattu [9]. Sytoplastiset ja ydin- uuttoa valmistettiin käyttäen NE-PER Ydin- ja soluliman Extraction reagenssit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) mukaan valmistajan ohjeiden. Western blot analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [9].

Generation vakaa Gal-3 hiljentäminen ja yliekspressoivat PADC solulinjoissa lentivi- shRNA

Tuottaa lentivirusta Gal-3 yli-ilmentymisen (L- gal3) tai Gal-3-shRNA (A3), pLVTHM-Gal3 tai pLVTHM-shGal3, vastaavasti, ja ohjaus vektori kotransfektoitiin pakkaus plasmidi (MD2G) ja kirjekuori plasmidi (PAX2) tarvitaan viruksen tuotannon 293FT soluihin käyttämällä lipofektamiinia 2000-reagenssia (Invitrogen). Medium sisältävä lentivirusta Gal-3 shRNA (nimeltään A3) ja kontrollivektorille (nimeltään GN10) käytettiin transdusoimaan Mpanc96, MiaPaca-2 ja Panc-1 solulinjat, joilla on korkea Gal-3 ilme. Väliaineessa, joka sisälsi lentivirus Gal-3 yliekspressio (nimeltään L-gal-3) ja kontrollivektori (nimetty V) käytettiin transdusoimaan BXPC-3 ja L3.6pl PaCa solulinjat, joilla on alhainen Gal-3: n ekspressio. Cell lajittelu suoritettiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu ARIA-virtaussytometrillä (BD Biosciences). Gal-3: n ekspressio on stabiilien solulinjojen edelleen vahvistettiin Western bloting.

Soluproliferaatiomääritys

Solujen elinkyky mitattiin käyttämällä CellTiter Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit, kuten on kuvattu [24].

Soft agar pesäkemuodostusta

5 x 10

3 MPanc96 soluista jotka ilmentävät pysyvästi pLVTHM-shRNAGal3 tai pLVTHM kontrollivektorille sekoitettiin 0,6% agaria DMEM. Solu /agar seokset laitettiin 6-kuoppaisille levyille päällystettiin 0,3% agaria kolmena kappaleena. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 10 päivää. Pesäkkeet värjättiin Diff-Quik (Dade Behring). Koe toistettiin kolme kertaa itsenäisesti.

Co-immunosaostus

Co-immunosaostus valvonta GN10 ja Gal-3 shRNA A3 solut molemmista Panc-1 ja Mpanc96 solut suoritettiin kuten on kuvattu [9 ].

Ras ja Ral aktiivisuusanalyysiä

Samanlaiset määrät solulysaattia proteiinin GN10 ohjaus soluista tai A3 shRNA gal-3 soluja Pancin-1 ja Mpanc96 tai BXPC-3 L-gal -3 ja sen ohjaus BXPC-3 V inkuboitiin 45 minuutin ajan 4 ° C: ssa, jossa agaroosihelmet päällystetty Raf1-RBD täydellistä Ras toimintaan tai -agaroosihelmien päällystetty Ral BP1 agaroosia yhteensä Ral aktiivisuus (Upstate Biotechnology, Inc. , Lake Placid, NY). Helmet pestiin sitten ja sitoutunut proteiini eluoitiin 2 x Laemmli-näytepuskuriin, joka oli esilämmitetty 95 ° C: ssa ja analysoitiin immunoblottauksella Ras käyttäen anti-Ras-vasta-ainetta tai RALA aktiivisuus käyttäen anti-RALA-vasta-aine.

Matrigel invaasiomääritys

invasiivisia kyky solujen määritettiin käyttämällä Matrigel pinnoitettu invaasio kammiot 0,8-um huokoskoko (BD Biosciences). Yksi-solususpensiota, joka sisälsi 1 x 10

5-soluja lisättiin sisäkammioon. 16 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa 5% CO2: ta, solut yläpinnan sisäkammion poistettiin vanutupoilla. Hyökkäsi solut, jotka tarttunut alapinnalle kalvon kiinnitettiin, värjättiin Diff-Quik (Dade Behring), ja laskettiin.

Epäsuora immunofluoresenssivärjäyksen ja konfokaali laser mikroskopian

Epäsuora immunofluoresenssivärjäyksen vuonna BXPC-3-soluissa suoritettiin, kuten on kuvattu [9]. Expression ja lokalisointi proteiinien havaittiin alle -konfokaalimikroskoopilla järjestelmä (FluoView FV500, Olympus, Melville, NY) ja analysoitiin CellQuest PRO ohjelmisto (BD Biosciences, San Jose, CA) on virtaussytometria ja kuva-analyysi Core yliopiston laboratoriossa Texas MD Anderson Cancer Center.

reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

määrällisesti muutoksia Gal-3-mRNA-tasoja, reaaliaikaisen RT-PCR suoritettiin ABI Prism 7900 ( Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen kaupallisesti saatavilla geeniekspression määritystä Gal-3 (Mm00802901_m1), ja syklofiliinin A (4326316E; Applied Biosystems), kuten aiemmin on kuvattu [9]. 7900 Sequence Detection System 2.2 ohjelmisto (Applied Biosystems, Foster City, CA) automaattisesti määrittänyt kertamuutosta Gal-3 kussakin näytteessä käyttäen δδCt menetelmällä 95%: n luottamusväli.

Immunohistokemia

immunohistokemiallinen värjäys Gal3 suoritettiin mikrosirujen kudokseen dioja koostuu 125 haimatiehyen adenokarsinomia ja niiden pariksi ei-neoplastisia haiman kudoksista potilailta, joille tehtiin pancreaticoduodenetomy MD Anderson Cancer Center. Tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of M. D. Anderson Cancer Center. Sen jälkeen, kun antigeeni haku ja endogeeninen peroksidaasi tukos, osat inkuboitiin sitten vasta-ainetta vastaan ​​Gal3 (1:100 laimennos) 4 ° C: ssa yön yli, sitten inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen huoneenlämpötilassa 60 min. Standard avidiini-biotiini immunohistokemiallinen analyysi jaksoissa suoritettiin valmistajan suositusten mukaisesti (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Värjäytyminen tuloksia arvioitiin patologi (HW), joka perustuu prosenttiosuus värjäytymisen kasvainsoluissa (0, mitään värjäytymistä, 1, ≤10%, 2, 10-50% ja 3, 50%) ja värjäyksen voimakkuuden (0-negatiivinen, 1-heikko, 2-kohtalainen ja 3- vahva). Kasvaimet olivat luokiteltu Gal3-low (yhdistetty scores≤3) ja Gal3-korkea (yhdistetty pistemäärä ≥4).

Othotopic PADC malli

MPanc96 pysyvästi transfektoitujen solujen Gal-3 shRNA ja vastaavan ohjaus-vektori transdusoitu stabiilisti lusiferaasin kanssa, kuten aikaisemmin on kuvattu [25], [26]. Eläimet jaettiin 2 ryhmään (n = 5 ryhmää kohden). Ensimmäinen ryhmä injektoitiin MPanc96 soluja, jotka transfektoitiin vektorilla (GN10) vain toinen ryhmä MPanc96 transfektoitujen solujen Gal-3 shRNA (A3). Eläimet nukutettiin ketamiini-ksylatsiini ratkaisu, pieni vasen vatsan keskityksen, tehtiin viilto, ja (1 x 10

6) MPanc-96 solua 50 ui PBS: ää injektoitiin subkapsulaariseen alueelle haima käyttäen 27 gaugen neula ja kalibroitu painikkeen-ohjattu annostelulaitteeseen (Hamilton ruisku Company). Vatsan haava suljettiin yhteen kerrokseen haavan leikkeet (Braintree Scientific, Inc.).

Viikko istutuksen jälkeen, kasvainten tilavuudet seurattiin viikoittain non-invasiivisen reaaliaikaisia ​​bioluminenssina kuvantaminen mukaan IVIS 200 (Xenogen) käyttämällä kryogeenisesti jäähdytettyyn bioluminescence kuvantamisjärjestelmä on kytketty tiedonkeruutietokonetta käynnissä Living Image-ohjelmiston (Xenogen) kuten aiemmin on kuvattu [23]. Hiiret kuvattiin päivänä 7, 14, 21, ja 28 sen jälkeen, kun kasvainsolujen istutuksen. Eläimet tapettiin 28. päivänä sen jälkeen, kun kasvainsolujen istutuksen. Ensisijainen kasvaimia haimassa leikattiin, ja lopullinen paino mitattiin. Kaikki mittaukset verrattiin joukossa kahteen ryhmään käyttämällä paritonta Studentin

t

testiä. Kasvainkudoksen ja ympäröivien elinten upotettiin parafiiniin ja sarjanumero 5-um: n leikkeitä leikattiin, värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla ja tutkittiin valomikroskoopilla läsnäolon toteamiseksi kasvaimen ja mikroskooppiset etäpesäkkeitä. Kasvaimen kudoksia käsiteltiin immunohistokemiaan ja värjättiin ilmentymisen galektiini-3, Ras ja phopho-ERK. kuten edellä on kuvattu.

Tilastollinen analyysi

Analyysit on esitetty kuvaajat keskiarvona ± SD ja ovat tulosta vähintään kolmen kokeen. Merkitys eroja ryhmien arvioitiin käyttäen kaksisuuntaista Student

t

testiä. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkitsevä, jos

P

arvo oli 0,05.

Tulokset

Gal-3 on erittäin säädelty ihmisen haiman kasvain kudosten

geeniekspressioprofilointi tutkimukset viittaavat siihen, että Gal-3 on säädellään ylöspäin haimatuumorien verrattuna kontrollisilkkipaperia [18], [19]. Teimme immunohistokemiallinen värjäys ja ihmisen haiman kudossiruina anti-Gal3-vasta-ainetta (kuvio 1A). Olemme havainneet, että Gal-3: n ekspressio kasvoi vähitellen järjestyksessä sairauden etenemisen normaali (kuvio 1A, a, b), haimatulehdus (c, d) ja haiman adenokarsinooma (e, f). Gal-3 värjäys luokiteltiin kahteen ryhmään, Gal-3 Low (pisteet 3) ja Gal-3-korkea (pisteet 4), joka perustuu värjäytymisen intensiteettiä ja positiivista värjäytymistä prosenttiosuus kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Huomasimme, että 83 125 (66,4%) haiman adenokarsinooma näytteet osoittivat korkeita Gal-3 lauseke (Gal3-korkea). Näistä tapauksista, pariksi ei-neoplastisia haiman kudoksista olivat käytettävissä arviointia 108 tapausta (72 näytteet krooninen haimatulehdus ja 36 normaalin haiman kudosnäytteitä) ja 32 (29,6%) oli Gal3 korkea. Gal-3: n ekspressio oli merkittävästi suurempi haiman adenokarsinooma kuin pariksi ei-neoplastisen haiman kudosnäytteistä (p 0,0001). 28 72 (38,9%) krooninen haimatulehdus näytteet Gal3 korkea verrattuna 11,1% (4/36) normaalin haiman kudosnäytteistä (P 0,001) (kuvio 1 B). Nämä tulokset osoittavat, että Gal-3 on säädelty aikana ihmisen haiman taudin etenemistä normaali, haimatulehdus ja haiman adenokarsinooma.

, Tissue mikrosiru dioja koostuu 125 haimatiehyen adenokarsinomia ja pariksi ei-neoplastisia haiman kudosnäytteistä oli immunohistokemiallisesti värjättiin käyttäen monoklonaalista Gal-3-vasta-aine, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Gal-3: n ekspressio oli lisääntynyt pitkin taudin sekvenssi-normaali (kuvio 1A, a, b), haimatulehdus (c, d) ja haiman adenokarsinooma (e, f). B. Yhteenveto Gal-3 IHC on PDAC kudossiruina. Kasvaimet olivat luokiteltu Gal3-low (yhdistetty tulokset ≤3) ja Gal3-korkea (yhdistetty pistemäärä ≥4), joka perustuu prosenttiosuus Gal-3 värjäys tuumorisoluissa (0, mitään värjäytymistä, 1, ≤10%, 2, 10-50% ja 3, 50%) ja värjäyksen voimakkuuden (0-negatiivinen, 1-heikko, 2-kohtalainen ja 3- voimakas).

Gal-3 on erittäin ylä- säännelty haiman kasvain kudosten ja solujen päässä K-Ras mutantti hiirimallissa

äskettäin kuvattu mutantti K-Ras hiirimallissa esitetään yhteenveto ihmisen haimasyövän etenemistä järjestyksessä tulehdusta Panin sen PDAC [25]. Se oli kiinnostavaa määrittää, onko tämä hiirimallissa myös matkivat muutoksia Gal-3 ilmentymisen havaittiin ihmisen näytteitä. Kuten kuviossa 2A on esitetty, Gal-3: ta ei havaittu haimassa kudoksissa normaaleilla hiirillä (kaistat 1-3), mutta erittäin säädelty seitsemän kasvainsolulinjoissa (kaistat 4-10), jotka olivat peräisin seitsemästä eri hiiren kasvaimia.

. Gal-3: n ekspressio analysoitiin soluissa, jotka ovat peräisin normaalista haiman ja haiman kasvaimia K-Ras mutanttihiirissä western-blottauksella, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. B. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR Gal-3 RNA ilmentymisen käyttäen Gal-3-spesifisiä alukkeita jälkeen kokonais-RNA uuttamalla normaalista haima, haimatulehdus kudosten ja haiman kasvaimet ja eristettyjä soluja eri kasvaimia, joka kertyy K-Ras mutantti hiirimallissa on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kertainen muutos määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Sen määrittämiseksi, jos Gal-3 mRNA oli myös säädellään ylöspäin hiiren kasvain kudoksissa verrattuna normaaliin ja haimatulehduksen kudoksista, kudosten yksittäisistä hiiristä, jotka olivat normaalit, oli haimatulehdus tai ne, joilla on kasvaimia uutettiin ja reaaliaikaisen PCR suoritettiin käyttämällä spesifisiä hiiren Gal-3-alukkeita (Mm00802901_m1, Ambion, USA) (kuvio 2B). Havaitsimme, että Gal-3: n ekspressio oli vähäistä normaaleissa haiman kudoksista (kaistat 1-3), mutta lisääntyi 10-27 kertaiseksi kroonisen haimatulehduksen (kaistat 4-9) ja nousi 45-215-kertaisesti K-RAS mutantti hiiren tuumorikudoksia (kaistat 10-12). Gal-3 mRNA-tasot olivat jopa suuremmat (62 kertaiseksi 831 kertaisesti), mitattuna eristetyissä kasvainsoluissa (kaistat 13-24).

Generation Gal-3 yli- ja ilmentävät PDAC Cells

jotta manipuloida Gal-3 tasoa PADC soluissa, ensin määritetty taso Gal-3 ilmentymistä erilaisissa PADC solulinjoissa (kuvio 3A, yläpaneeli). MPanc96, MiaPaca-2 ja Panc-1-solut oli korkea pohjapinta Gal-3: n ekspressio (kuvio 3A) ja transfektoitiin stabiilisti lentivirus Gal-3 shRNA (A3-solut) tai vektorilla (GN10 solut). Galektiini-3 tasoa onnistuttiin vähentämään vuonna MiaPaca-2, Panc-1 ja Mpan96 solujen 90%, 95% ja 92% vastaavasti (kuvio 3A, keskimmäinen paneeli). Jotta vaikutusten tutkimiseksi säätely ylöspäin galektiini-3, Gal-3 cDNA lentivirus transfektoitiin PDAC soluihin alempi pohjapinta Gal-3 tasoa (kuvio 3A, alempi paneeli). Nämä variantit nimettiin L-gal3 ja V (vektorisäätö), kuten on esitetty kuviossa 3A, alapaneeli. Nämä PDAC soluja käytettiin edelleen määrittää funktio Gal-3: n patogeneesissä haimasyövän.

. Gal-3 sen erilaisissa PDAC solulinjoissa määritettynä Western blottauksella (yläpaneeli). Knockdown Gal-3 by lentivirus shRNA of Gal3 (A3) tai kontrollivektorille (GN10) Gal-3 korkea solu lines- Mpanc96, MiaPaca-2 ja Panc-1 määritettiin immunoblot (kuvio 3A, keskimmäinen paneeli). Yliekspressio Gal-3 BXPC-3 ja L3.6pl solut alemman Gal3 ilmaisseet soluissa lentivirukselle infektio Gal3 cDNA (L-gal3) tai vektorisäätö (v) varmistettiin immunopilkkujen (kuvio 3A, alapaneeli. B. Vaikutukset Gal -3 soluproliferaatioon. leviämisen MiaPaca-2, ja Mpanc96 solut, joissa Gal-3 down-säännelty shRNA tai BXPC-3 ja L3.6pl solut, joissa yli-ilmaiseman Gal-3 cDNA määritettiin käyttämällä CellTiter vesikerros Solution Cell Proliferation Assay kit kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. C. vaikutus Gal-3 syöpäsolujen invaasiota in PDAC soluissa. Edustavia kentät näytetään PDAC soluja (1 x 10

5), jossa Gal-3 ilmentyminen oli tippuu alas shRNA (A3) ja vektori transfektoidaan ohjaus soluja (GN10) ympättiin Matrigel kuorrutettu invaasio kammiot; 24 tuntia myöhemmin hyökkäsi solut, jotka tarttunut alapinnalle kalvon kiinnitettiin, värjättiin Diff Pika, ja lasketaan kuvattu materiaalit ja menetelmät. D. Bar kuvaaja prosenttia Invasion sekä Mpanc96 ja MiaPaca-2-solujen Gal3 taintumisen (A3) tai Control (GN10) edustaa keskiarvoa kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena; baareja, keskivirheet, p 0,001.

Gal-3 säätelee solujen lisääntymistä, invaasiota ja pesäkkeenmuodostusta PADC soluissa in vitro

Sen määrittämiseksi, jos Gal-3: lla on toiminnallinen rooli haimasyöpäkasvainsolulinjo- käyttäytymistä in vitro, käytimme solulinjoja geneettisesti muutettujen ilmaista eri Gal-3 tasoa, kuten on esitetty kuviossa 3A vaikutusten määrittämiseksi Gal-3 kasvainsolujen kasvua (MTS-määritys), invaasiota (Matrigel invaasiomääritys ) ja in vitro kasvainten muodostumiseen (pehmeä agar pesäkemuodostusta). Knock down Gal-3 MiaPaca-2 ja Mpanc96 solujen laski merkittävästi solujen kasvun 72 tuntia (kuvio 3B, yläpaneeli). Täydentävästi kokeessa, yli-ilmentyminen Gal-3 L3.6PL ja BXPC-3-soluja (L3.6PL-L-gal3 ja BXPC-3-L-gal3) kasvanutta solujen verrattuna kontrollisoluihin L3.6PL-V ja BXPC-3-V (kuvio 3B, Alahavas). Sen tutkimiseksi, Gal-3 vaikuttaa invasiivisia ominaisuuksia PDAC solujen matrigeelin invaasio määritykset suoritettiin. Downregulation Gal-3 (A3) in MPanc96 ja MiaPaca-2-solut vähenivät soluinvaasiota 95% ja 90% vastaavasti verrattuna säätökennoja (kuvio 3C ja 3D). Sen sijaan, Gal3 cDNA ilmaistaan ​​solujen BXPC-3 L-gal3 lisääntynyttä solujen invaasiota kapasiteetti (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että Gal-3 on myös tärkeä rooli hyökkäyksen PDC soluja.

Lisäksi alas-säätely Gal-3 by shRNA vuonna MPanc96 soluissa (MPanc96 A3) laski rajusti pesäkemäärät pehmeässä agar verrattuna vektori-transfektoitujen hallintalaitteet (kuvio 4A, 4B ylälevyissä), kun taas säätely ylöspäin Gal-3 BXPC-3-soluissa lisäsi merkittävästi pesäkemäärät verrattuna kontrolleihin (Kuva 4A, 4B alempi paneeli). Nämä tulokset osoittavat, että Gal-3 tasoa vaikuttaa PDAC solujen lisääntymistä, invaasiota ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua.

. Pesäkkeenmuodostus määritykset suoritettiin MPanc96 GN10 kontrollisoluissa ja Gal-3 shRNA kaataa A3-soluja (ylempi paneeli) tai BXPC-3 V ohjaus-solujen ja BXPC-3 Gal3 cDNA yli-ilmentynyt L-gal3 soluissa (alempi paneeli), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. MPanc96-A3 solut muodostivat pienempiä ja vähemmän pesäkkeitä verrattiin vektorilla transfektoidut säätökennoja (GN10). Sen sijaan, BXPC-3 L-gal3 solut muodostivat suurempi ja suurempi määrä pesäkkeitä kuin kontrolli V-soluja. B. Pylväsgrafiikka oikeassa paneelissa osoittaa keskimääräisen pesäkemäärät pinnoituksen jälkeen joko MPanc96 GN10 ohjaus soluja ja shRNA kaataa A3 soluja (ylhäällä) tai BXPC-3 V ja BXPC-3 L-gal3 (alempi); p 0,001. C. edustaja bioluminenssi kuvia kateenkorvattomissa hiirissä 3 viikkoa sen jälkeen, kun potilaalle tehdä implantaation GN10 ja A3 haimasyöpäsoluissa ortotooppisesti haima kateenkorvattomissa hiirissä. D. Mittaukset fotonit /s /cm

2 /steridian kuvaa bioluminenssina alueella 10% piikin marginaali (keskiarvo ± SE) viikolla 3 käyttäen Xenogen IVIS kuvatulla Materiaalit ja menetelmät (

n

=

5

). E. Tuumorin paino verrokkihiiristä (GN10, n = 5) ja Gal3 pudotus ryhmä (A3, n = 5) punnittiin sen jälkeen, kun hiiret olivat uhri viikolla neljä. F. Hiiren tuumorikudoksista kontrollista (GN10) ja Gal-3 taintumisen ryhmä (A3) on immunohistokemiallisesti värjättiin käyttäen Gal-3, Ras ja fosfo-ERK vasta-aineita on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

alassäätely Gal-3 inhiboi kasvaimen kasvua in vivo potilaalle tehdä mallin

vaikutuksen selvittämiseksi Gal-3 tasoa in vivo kasvuun PDAC, MPanc96 pysyvästi transfektoitujen solujen Gal-3 shRNA tai ohjaus shRNA vektori oli merkitty tulikärpäsen lusiferaasi jotta reaaliaikaisen bioluminenssina kuvantamisen seurata kasvaimen tilavuuden ja levittää in vivo. Nämä solut ortotooppisesti ruiskutetaan kehoon haiman nude-hiirten, ja kasvaimen kasvua seurattiin ei-invasiiviset kerran viikossa. Erot tuumorien kasvun todettiin 3 viikon kuluessa (edustavat kuvat, kuten on esitetty kuviossa 4C). Määrällinen arviointi kasvaintaakkaa osoitti, että kasvaimet olivat merkittävästi suuremmat kontrolliryhmässä verrattuna Gal-3 kaataa ryhmä (kuvio 4D) (p 0,05). Lisäksi primäärikasvain painot olivat merkitsevästi vähemmän Gal3 kaataa ryhmässä kuin verrokkiryhmässä kuten on osoitettu kuvassa 4 E; Immunohistokemiallinen värjäys Gal-3, Ras ja fosfo-ERK näissä hiirissä kasvaimen kudokset (kuvio 4F) Lisäksi vahvistetaan, että ilmentyminen Gal-3, Ras ja alas-stream efektori fosfo-ERK ovat vähentyneet Gal-3 kaataa ryhmä verrattuna kontrolliryhmään. Alueelliset micrometastases havaittiin eläimissä ruiskutettiin säätökennoja (5/5 eläimet), mutta ei eläimissä injektoitu soluja, joissa galektiini-3 olivat tippuu alas vakaa transfektoimalla galektiini-3 shRNA (0/5 eläintä) (Kuva S1 ).

Gal-3 sitoutuu Ras ja lisää Ras aktiivisuus PDAC soluissa

aiemmin on raportoitu, että Gal-3 liittyy aktivoitu K-Ras ja edistää vahvan aktivointi Raf- 1 ja PI3-K mutta vaimentaa aktivoituminen ERK signalointi COS-soluissa [21]. Siksi arveltu, että Gal-3 sitoisi Ras ja välittäjänä Ras aktiivisuus PDAC soluissa ominaista esiintyy usein Ras mutaatioita. Vasta-ainetta käyttämällä array (Hypromatrix, Worcester, MA), olemme havainneet vuorovaikutus Ras ja Gal-3 käyttäen HA merkitty Gal3 transfektoitu BXPC-3 lysaattia (tuloksia ei ole esitetty). Ras vahvistettiin yksi sitoutumiskumppaneita Gal-3 saatujen tietojen perusteella vasta-jono. Edelleen vahvistaa, että Ras vuorovaikutuksessa Gal-3, käytimme co-immunoprocipitation määrityksissä. Lysaatit Panc-1 ja MPanc96 kanssa tai ilman kaataa Gal-3 saatettiin immunosaostus joko Gal3 rotan monoklonaalinen vasta-aine tai pannulla anti-Ras monoklonaalinen vasta-aine ja sen jälkeen immunoblottauksella anti-Ras tai ant-Gal3 vasta-aineita. Tulokset osoittivat, että Gal-3 co-immunosaostettiin Ras, kun taas lysaatit normaalilla IgG ei tuottanut näkyviä bändi (kuva 5A).

. Samanaikainen immunosaostus suoritettiin Pancin-1 ja MPanc96 n kanssa kaataa Gal-3 käyttäen joko anti-Ras tai anti-Gal-3-vasta-aine, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. B. Yhtä suuret määrät proteiinia Panc-1 ja Mpanc96 GN10 kontrollisolujen tai shRNA A3 soluja inkuboitiin agaroosin kanssa, jotka on päällystetty Raf1-RBD, ja aktiivinen Ras-GTP: n havaittiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. C. Aktiivinen Ras GTP-aktiivisuus määritettiin BXPC-3 L-gal3 solujen ja kontrollisolujen (V), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. D. Cell solukalvon ja sytoplasmisia jakeet GN10 ja A3 solut molemmista Panc-1 ja MPan96 alistettiin SDS-PAGE: lla ja sitten immunoblotattu anti-Ras-vasta-ainetta. E. Epäsuora immunofluoresenssi suoritettiin BXPC-3-V ja BXPC-3 L-gal3-soluissa käyttäen anti-Gal-3-vasta-aine (TIB166 1:100, punainen) ja anti-Ras-vasta-ainetta (1:100, vihreä), ja sen jälkeen DAPI counterstaining (sininen). Yhdistämisen Gal-3 (punainen) ja Ras (vihreä) kanssa DAPI (sininen) on myös esitetty.

edelleen selvittää, vuorovaikutusta Ras ja Gal-3 vaikuttaa Ras aktiivisuus, selvitimme vaikutukset manipuloimalla Gal-3 ilme Ras toimintaa. Kuten kuviossa 5B, alas-säätely Gal-3 in Pancin-1 ja MPan96 soluja (A3) vähentynyt Ras aktiivisuus käyttämällä Ras-GTP määrityksessä, kun taas yliekspressio Gal3 in BXPC-3-solujen määrä nousi Ras GTP aktiivisuutta (kuvio 5C) . Jotta edelleen valaista miten Gal-3 välittää Ras aktiivisuus, solukalvon ja soluliman proteiinit eristettiin [26] alkaen Pancin-1 ja MPanc96 säätökennotyyppi (GN10) ja kaataa soluja (A3) ja Ras-proteiini havaittiin käyttäen immunoblottauksella. Vähemmän Ras-proteiini havaittiin plasmassa kalvoja Panc-1 A3-solujen ja Mpanc96 A3 soluja verrattuna ohjata GN10 soluihin (kuvio 5D). Sopimukseen, lisää RAS-proteiinin havaittiin sytosolissa Panc-1 ja Mpanc96 A3 soluja verrattuna ohjata GN10 soluihin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Gal-3 voidaan säädellä Ras solunosasijaintia. Confocal immunofluoresenssilla vahvisti, että säätely ylöspäin Gal-3 BXPC-3-soluissa liittyy lisääntynyt Ras on solukalvon (kuvio 5E) .Tämä osoittaa, että Gal-3 sitoo Ras ja vastaa Ras kiinnitys solukalvoon, siten välittävä sen toimintaa.

Gal-3 välittää Ras loppupään signalointi PDAC soluissa

Aktivoidut Ras (GTP sitoutuneena) aktivoi alavirran efektoreja kuten Raf /mitogeeniaktivoidut proteiini (MAP) /al. al.