Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain genomin epästabiilisuuden ja valikoiva käsittely paineet johtavat klonaalisia Tautikehityksen; molekyyli- ositusta molecularly kohdistuva lääkkeiden anto vaatii toistuvaa pääsyä kasvaimen DNA. Oletimme, että kiertävästä plasman DNA (cpDNA) pitkälle syöpäpotilailla johtuu suurimmalta osin kasvain, on prognoosi- hyödyllisyys ja voidaan hyödyntää multiplex kasvaimen mutaation järjestyksessä, kun toista biopsia ei ole mahdollista. Hyödynsimme Sequenom MassArray Järjestelmä ja OncoCarta paneeli somaattisen mutaation profilointia. Hyväksytty näytteitä, osti samasta potilaasta mutta eri ajankohtina arvioitiin; Näiden koostui formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) arkistointi kasvainkudoksen (pää- ja /tai metastaattinen) ja cpDNA. Toteutettavuus, herkkyys, ja erityispiirteenä suurikapasiteettisten, multiplex mutaation havaitseminen lähestymistapaa testattiin käyttämällä yksilöt hankittiin 105 potilasta, joilla oli kiinteitä kasvaimia tarkoitetun osallistumiseksi faasin I tutkimuksissa molekyylirakennetta kohdennettuja lääkkeitä. Mediaani cpDNA pitoisuus oli 17 ng /ml (alue: 0,5-1600); Tämä oli 3-kertaa korkeampi kuin terveillä vapaaehtoisilla. Lisäksi korkeampi cpDNA pitoisuudet liittyvät huonompi kokonaiselinaikaa; siellä oli kokonaiselinaika (OS) riskisuhde 2,4 (95% CI 1,4, 4,2) kullekin 10-kertainen cpDNA pitoisuuden ja monimuuttuja analyysit, cpDNA keskittyminen, albumiini, ja suorituskyky säilyi riippumaton ennustavat OS. Nämä tiedot viittaavat siihen, että plasman DNA: n näissä syöpäpotilailla on suurelta osin peräisin kasvaimeen. Havaitsimme myös korkea havaitsemisen konkordanssin kriittisiin ”hot-spot” mutaatioita (

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

) in Hyväksytty cpDNA ja arkistointia kasvainkudoksen, ja merkittäviä eroja välillä arkistointiin kasvain ja cpDNA. Tämä multiplex sekvensointi määritystä voidaan käyttää havaitsemaan somaattisten mutaatioiden plasmasta pitkälle syöpäpotilailla, kun turvallinen toista Tuumorinäytteiden ei ole toteutettavissa ja genomisen analyysin arkistointia kasvain pidetään riittämättömänä. Kaiken kiertävä nukleiinihappo biomarkkereiden tutkimukset ovat kliinisesti merkittäviä monikäyttöinen apuohjelma pitkälle syöpäpotilailla ja lisätutkimuksia jatkaa niiden sisällyttäminen hoidon taso ovat perusteltuja.

Citation: Perkins G, Yap TA, Pope L, Cassidy AM, Dukes JP, Riisnaes R, et ai. (2012) Multi-Purpose Utility of kiertävästä plasman DNA Testing in Potilaat, joilla on pitkälle edenneitä syöpiä. PLoS ONE 7 (11): e47020. doi: 10,1371 /journal.pone.0047020

Editor: Jose Luis Perez-Gracia, University Clinic Navarran, Espanja

vastaanotettu: toukokuu 15, 2012; Hyväksytty: 07 syyskuu 2012; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Perkins et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Drug kehittämisyksikkö Royal Marsden NHS Foundation Trust ja The Institute of Cancer Research tukevat osittain ohjelmaan avustusta Cancer Research UK. Tukea annettiin myös, että Experimental Cancer Medicine Centre (The Institute of Cancer Research) ja National Institute for Health Research Biomedical Research Centre (yhdessä Royal Marsden NHS Foundation Trust ja The Institute of Cancer Research). GP tukivat avustusta Ranskan National Institute of Cancer (Institut National du Cancer, Inca, Ranska). TY on vastaanottaja 2011 Scott Minerd Eturauhassyöpä Foundation Young Investigator Award. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehittäminen syöpä johtuu pääosin geneettisiä poikkeavuuksia, jotka ohjaavat onkogeneesiin ja määrittää kliiniset oireet kasvaimia; nämä voivat myös vaikuttaa hoitovasteen [1]. Meidän lisäämään tietämystä taustalla biologian syövän ja saatavuus modernin bioteknologian työkaluja alkaa johtaa onnistuneeseen uudenlaisten antitumor molekyyli terapeuttisten sekä parempi tunnustaminen resistenssin [2], [3]. Huomattavia esimerkkejä ovat

KRAS

mutaatioita Kolorektaalituumorien ennustamisessa vastustuskykyä epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) kohdistaminen monoklonaalisia vasta-aineita (setuksimabi [ImClone ja Bristol-Myers Squibb] ja panitumumabipitoisuus [Amgen]) [4], [5], ja

KIT

mutaatioita ennustamisessa kasvaimenvastaista vastauksia imatinibi (Novartis) ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet [6]. Molecular analyysi näistä genomista aberraatioita yleensä suoritetaan arkistomateriaalia kasvainkudoksen johtuen eettisistä ja turvallisuuteen liittyvät haasteet toistuvia koepaloja. Kuitenkin kun otetaan huomioon mahdollisuudet perimän epävakaisuuden, liittyy edelleen, pätevyyttä tämän lähestymistavan analysoida arkistointia kasvainkudoksen sijaan rebiopsying kasvain Molekyylien analyysit jokaisessa terapeuttinen ratkaisupisteessä. Esimerkiksi on epäselvää, analysointi arkistointia kasvainbiopsioissa kestänyt vuosia ja usein useita hoitoja aiemmin, heijastaa riittävästi tauti biologian aikaan hoidon. Rebiopsy Valitun kasvainleesion eivät kuitenkaan voi tarjota riittävät tiedot sisäisestä potilaan sairauden molekyyli epäyhtenäisyys ja rebiopsying useita leesioita edelleen kliinisesti epäkäytännöllinen. Parannetut jatkaa potilaan molekyylien kerrostuneisuus kiireellisesti.

Lähdimme optimoida hyötyä potilaille, joilla oli pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia tarkoitetun vaiheen I kliinisissä kokeissa jakamalla kohdennettuja hoitoja potilaille, jotka satama kasvain molekyyli- aberraatioita saavuttamista agentti kyseessä [2], [3], [7]. Arvioimme kasvaimet on saatu näistä potilaista, joilla on korkea suoritusteho Sequenom MassArray alustan käyttämällä OncoCarta mutaatio paneelin (versio 1.0; Sequenom, San Diego, CA). Tämä paneeli hyödyntää ennalta suunniteltu ja valmiiksi validoitu massaspektrometrisia SNP genotyypitys teknologiaa rinnakkaisen multiplex analyysit 238 yksinkertaisia ​​ja monimutkaisia ​​mutaatiot yli 19 yhteistä onkogeenien minimoi näytteen tarvitaan ja maksimoida herkkyys [8]. Se on aikaisemmin käytetty onnistuneesti seulomiseksi mutaatioiden formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kasvainkudoksen [9] [10].

Vaihtoehtoinen lähde kasvain-DNA: ta, että plasma-DNA (cpDNA) [ ,,,0],11], jotka voivat olla helposti ja toistuvasti uuttaa plasmasta ja voidaan tuumorista peräisin [11], [12], jossa cpDNA pitoisuudet kanssaan sairauksien esiintyvyys ja etenemiseen [13]. Tutkimukset ovat myös osoittaneet, voidaanko mutaation havaitsemisen välillä cpDNA potilailla, joilla on edennyt syöpä [14], [15], [16], [17], [18]. Lähdimme tutkimaan mahdollisen käyttökelpoisuuden multiplex mutaation havaitsemisen mistä cpDNA kanssa korkea suoritusteho Sequenom MassArray alustan hyödyntäen OncoCarta mutaatio paneeli (v1.0), voiko tätä voidaan käyttää lisänä kudoskoepaloihin rikastuttaa ja tukea kasvainten tiedot potilaan valinnan. Toissijaisena tavoitteena oli tutkia, mittaamista cpDNA pitoisuuksien on ennusteen arvioinnissa.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

Potilaat, joilla on loppuvaiheessa edennyt kiinteä kasvain, joka saatettiin Drug Development Unit Royal Marsden NHS Foundation Trust välillä syyskuuta 2009 elokuussa 2010 ja jotka olivat oikeutettuja vaiheen I tutkimuksessa oli mukana tässä tutkimuksessa. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen geneettistä analyysi niiden kasvaimia ja plasmanäytteiden ennen osallistumista tutkimukseen. Kahdeksan ml ääreisverenkierron otettiin näytteet BD Vacutainer Cell valmistaminen Tube (CPT), joka sisältää natriumia hepariinia, joka sallii plasma ja mononukleaaristen solujen erottaminen aikana yhden sentrifugointivaiheessa. Putki käännettiin vähintään 8 kertaa sekoittumisen varmistamiseksi näytteen, ja sitten sentrifugoitiin 1800 g: ssä 15 minuutin ajan. Saatu plasma supernatantti siirrettiin puhtaaseen putkeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Lisäksi, 20 tervettä vapaaehtoista edellyttäen, 8 ml verta analysoitavaksi tällä menetelmällä. Vastaavat FFPE näytteet (pää- ja /tai metastaasien) kullekin potilaalle pyydettiin myös. Sääntely- ja riippumaton eettinen komitea (National Research Ethics Service (NRES) komitea London-Chelsea, Iso-Britannia) hyväksyi tämän tutkimuksen ennen oikeudenkäyntiä aloittamista.

DNA eristys ja kvantifiointiin

analyysien kasvaimen näytteitä, hemotoxylin- ja eosiini-värjättyä dioja tarkisti board-sertifioitu patologi (KT) varmistaa riittävä elinkelpoinen kasvain ja määrittää kasvaimen vyöhykkeen ytimeen. DNA FFPE yksilöitä uutettiin 1 mm ytimet jos mahdollista tai 10 um unstained kohdat pienempien koepaloja käyttäen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), mukaan valmistajan suositusten. Uutettu DNA eluoitiin sen jälkeen 30 ul: ssa ATE-puskuria ja säilytettiin -20 ° C: ssa lisäanalyyseihin saakka. DNA kvantifioitiin käyttäen Nanodrop 1000 Spektrofotometri (Thermo Scientific).

cpDNA uuttamalla, plasma sulatettiin ympäristön lämpötilassa ja cpDNA uutetaan 2 ml plasmaa käyttäen QIAamp DNA Veri Midi Kit (Qiagen, Valencia, CA , USA), mukaan valmistajan ohjeiden, seuraavin muutoksin: kullekin 2 ml: n plasmaa, ylimääräisen sentrifugointilla (16000 g, 5 min, RT) lisättiin ennen uuttomenetelmä, jotta voidaan poistaa solujen roskia plasma. Lopussa menettelyn DNA eluoitiin 100 pl AE eluutiopuskuria. DNA: n konsentraatio mitattiin fluoresenssivärjäys käyttäen Quant-iT ™ Pico-Green® kaksijuosteinen DNA (dsDNA) Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja SynergyHT mikrolevylukijaa (Biotek). DNA syöpäsolulinjasta analysoitiin uutettiin pelleteistä käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. Vertailun vuoksi kaikki cpDNA pitoisuudet esitetään tässä käsikirjoitus ilmaistaan ​​ng /ml plasmaa.

spektrometria TypePLEX teknologian ja OncoCarta paneeli (v1.0) B

OncoCarta paneeli (v1 0,0) koostuu 24 altaat alukepareja ja laajennus alukkeita, ja on kyky havaita 238 mutaatioita 19 geenejä. Protokolla, jonka Sequenom (San Diego, CA) seurasi vähäisin muutoksin. DNA: n määrä lisätään polymeraasiketjureaktio (PCR) oli 20 ng per reaktio FFPE DNA-näytteitä. Plasman DNA-näytteitä, 30 ui DNA: ta lisättiin 30 ul: aan puhdasta vettä, ja sitä käytetään OncoCarta paneelin (v1.0) käsittely. DNA monistettiin käyttämällä OncoCarta PCR-aluke-altaat, rekisteröimätön nukleotidit inaktivoitiin katkaravun alkalisella fosfataasilla (SAP), ja yhden emäksen pidennyksestä reaktio suoritettiin käyttäen laajennus alukkeita, jotka hybridisoituvat välittömässä läheisyydessä mutaatioiden ja mukautetun seos nukleotidia. Suolat poistettiin lisäämällä kationinvaihtohartsia. Multipleksoidut reaktiot täplittäin SpectroCHIP II taulukot, ja DNA-fragmentit erotettiin MALDI-TOF Compact Mass Spectrometer (Sequenom, San Diego, CA).

Tietojen analysointi

Tietojen analysointi suoritettiin käyttämällä MassArray typer Analyzer ohjelmisto 4.0.4.20 (Sequenom), mikä helpottaa visualisointi datakuviojoukko ja raaka spektrit. Typer automatisoi tunnistaminen mutanttien vertaamalla suhteet villityypin huipun, että kaikki epäillyt mutanttien ja luo OncoMutation esittää yksityiskohtaisesti spesifisiä mutaatioita ja suhteet villityypin ja mutaation huiput. Kaikki mutaatiot päässä Oncomutation raportin tarkistettiin käsin 2 sokaisi toimijoiden valittujen tarkistetaan mutaatioita päässä OncoMutation raportti verrattuna ja vahvistettu olevan sopusoinnussa. Manuaalinen tarkistaminen mutaatioiden kaikilla OncoCarta spektrit suoritettiin tunnistaa ”todellinen” mutantti piikkien suolasta piikkejä tai muista tausta huiput. Tilastolliset analyysit on eritelty Supplemental Methods S1.

FFPE mutaatio vahvistus

KRAS

mutaatioita havaittiin myös käyttämällä Therascreen KRAS-mutaatio (Qiagen, Saksa), joka perustuu Vahvistus Tulenkestävät Mutation System (ARMS) -Scorpion PCR [19].

BRAF

V600E mutaatioita havaittiin myös käyttämällä Kapillaarielektroforeesi-yksijuosteinen konformaatioanalyysi (CE-SSCA). Lisätietoja annetaan Supplemental Methods S1.

Tulokset

Potilasominaisuudet

Kaikkiaan 105 potilasta tarkoitetun vaiheen I tutkimuksessa osallistuminen otettiin syyskuun 2009 elokuu 2010 (taulukko 1, taulukko S1). Yksi potilas oli myöhemmin todettu kelpaamattomaksi faasin I tutkimuksissa ja siksi tässä tutkimuksessa, koska hän ei ollut käyttänyt kaikki linjat saatavilla antitumor hoitoja. Eri kasvaintyypeille edustettuna jäljellä 104 potilaat olivat peräsuolen syöpä (CRC) (n = 25), rintasyöpä (n = 19), melanooma (n = 15), munasarjasyöpä (n = 15), kastraatio kestävä eturauhassyövän ( CRPC) (n = 11) ja muissa elimissä (n = 19), mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), mesoteliooma, sarkooma, glioblastooma, adenokarsinooma tuntemattomasta ensisijaisen (ACUP), kolangiokarsinooma, ja kohdunkaulan, kohdun limakalvon, pohjukaissuolen , ruokatorven, haiman ja munuaisten syövät (taulukko 1).

104 potilasta analysoitiin tutkimuksessa, FFPE primäärikasvain näytteet saatiin 69 (66%) potilailla, joilla FFPE solmukohtien ja /tai etäpesäkekasvainten näytettä ovat käytettävissä vielä 31 (30%) potilaalla. cpDNA kerättiin 101 (97%) potilaista, ei ollut mahdollista vetää verta 1 potilaalla teknisistä syistä ja veri ei kerätty 2 potilaiden takia logistisia virheitä. Yhteensä 60 potilasta kuoli aikana seurata, kun taas tiedot 44 potilasta sensuroitiin varten tämän julkaisun. Mediaani seuranta aika oli 5,8 kuukautta (vaihteluväli +0,3-+17,5) (taulukko 1).

DNA sarjalaimennokselle kokeita määrityksen kehittämiseen

laimennukset poistettu DNA

KRAS

mutantti HCT116 ihmisen paksusuolen syövän solulinja osoitti, että

KRAS

G13D-mutaatio oli toistettavasti havaittavissa OncoCarta v1.0 paneeli DNA alhaisina pitoisuuksina kuin 40 ng /ml (kuvio S1). cpDNA kerätty myös terveillä vapaaehtoisilla (taulukko 2); Näiden näytteiden cpDNA pitoisuus havaittiin olevan alhainen: mediaani 6,5 ng /ml plasmaa (vaihteluväli 4,5-13,3 ng /ml plasmaa), ja mutaatioita ei havaittu missään näytteessä. Potilas pitkälle kehittynyt rintasyöpä, joka oli hyvin korkea cpDNA tasoilla (1600 ng /ml plasmaa) havaittiin olevan

PIK3CA

mutaatio sekä FFPE ja cpDNA näytteitä; sarjalaimennoksia tästä cpDNA osoitti, että

PIK3CA

mutaatio oli havaittavissa jopa pitoisuuteen 2,5 ng /ml plasmaa käyttäen tässä määrityksessä.

Plasma cpDNA pitoisuudet ja mutaation havaitseminen

yleinen mediaani cpDNA pitoisuus oli 17 ng /ml näillä potilailla, joilla on edennyt kasvaimia (alue: 0,5-1600) (kuvio 1, taulukko S1). Mediaani cpDNA pitoisuus oli 18 ng /ml (vaihteluväli: 5-230) potilailla, joilla CRC; 7 ng /ml (vaihteluväli: 2-50) potilaille, joilla on melanooma, 17 ng /ml (vaihteluväli: 0,5-1,6 tuhatta) potilaille, joilla on rintasyöpä, 15 ng /ml (vaihteluväli: 4-49) ja munasarjasyöpäpotilaalle ja 53 ng /ml plasmaa (alue: 7-1177) potilailla, joilla CRPC joilla oli korkeimmat plasman DNA pitoisuudet.

Box ja hiuksenhienosti tonttien osoittaa 25

th, 50

th ja 75

th persentiilit, ylempi ja alempi vierekkäisten arvojen (viikset) ja Tukey harha (•). P-arvo on kaksipuolinen parittomia t-testi log10 DNA pitoisuuksia käyttäen Welchin korjaus epätasainen vaihtelut.

Hyväksytty plasma ja FFPE oli saatavilla analysoitavaksi 84 potilaalla. Yhteensä 42 mutaatioita havaittiin joko toinen tai molemmat FFPE kasvain ja cpDNA näytteet on saatu näistä potilaista (taulukko 3, Taulukko S1, kuviot S2A-S2D). Yleinen yhteneväinen havaitaan mutaatioita FFPE ja cpDNA näytteet oli 60% (25 42 havaitaan mutaatioita) (taulukko 3). Nonparametric ROC analyysejä käytettiin arvioimaan raja Sequenom alustan havaitsemiseksi OncoCarta paneeli mutaatioita cpDNA (kuvio 2A). Pitoisuus cpDNA optimaalisen kyky havaita mutaatio oli 29,95 ng /ml (todennäköisyys suhde = 7,3043). AUC laskettiin oli 0,8075 (95% CI 0,6552-,9598). Kuvio 2B esittää erilaisia ​​mutaatioita eri kasvaintyypeissä vastaavissa cpDNA pitoisuudet ne havaitaan.

2A: Nonparametric ROC-analyysit käytettiin arvioitaessa raja Sequenom alustan havaita OncoCarta paneelin mutaatioiden in cpDNA. Jokainen piste kaavion vastaa herkkyyden ja spesifisyyden yhdessä mitatut pitoisuudet. Mutaatiot katsottiin ”käytettävissä havaitsemiseen”, jos ne havaittiin potilaan FFPE kudosta. Mutaatiot havaittu FFPE näytteissä 37 potilaalla. Pitoisuus cpDNA optimaalisen kyky havaita mutaatio on 29,95 ng /ml (todennäköisyys suhde = 7,3043). AUC laskettiin on 0,8075 (95% CI 0,6552-0,9598). Potilaat, joiden FFPE oli käytettävissä tai negatiivisen testituloksen mutaatioita suljettiin pois analyysistä. Spesifisyys viite Linjat kvartiileja DNA pitoisuudet on merkitty punaisella katkoviivoilla. 2B: Kaavio mutaatioiden tyypistä ja cpDNA pitoisuuksilla, joilla ne havaittiin eri kasvaimissa. Mutaatiot havaittiin kuudessa onkogeenien. Symbolit edustavat eri kasvaintyypeille.

Korrelaatio potilaiden hoitotuloksiin.

Keskimääräinen eloonjäämisaika (OS) kaikilla potilailla oli 7,9 kuukautta (95% CI 5,8, 9,2) . Potilaat luokitellaan matalan ja korkean cpDNA keskittyminen ryhmään sen perusteella suurimman terveillä vapaaehtoisilla kohortti DNA pitoisuus 13,3 ng /ml; 61 potilasta luokiteltiin korkea cpDNA pitoisuuksia 40, jolla alhainen. Mediaani OS potilailla luokitellaan, joilla on pieni cpDNA pitoisuuksia oli 10,5 kk (95% CI 6,0, NC), kun taas korkean cpDNA pitoisuuden ryhmässä oli mediaani 6,5 kk (95% CI 4,5, 8,4) (logrank p = 0,0383) (kuvio 3A). Jatkuvana muuttujana oli OS riskisuhde 2,4 (95% CI 1,4, 4,2) kullekin 10-kertainen cpDNA pitoisuuden (kuvio 3B).

(3A) Kaplan-Meier-kuvaaja, joka esittää selviytymisen käyrien cpDNA pitoisuus 101 potilailla, joilla on pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia. Potilaat kielteiset luokassa oli pitoisuus on yli terveen vapaaehtoisen kohortin enintään 13,3 ng /ml (logrank p = 0,0383). (3B) Survivor toiminto arvioitiin yhden muuttujan Coxin regressio osoittaa ennustettu eloonjäämiskäyriä eri cpDNA pitoisuuksia. Riskisuhde 2,4 (p = 0,002) on kuvattu vierekkäisten käyrien.

Korrelaatio RMH ennustetekijöiden pisteet.

Olemme hiljattain takautuvasti validoitu ennustetyövälineenä pisteet (RMH pisteet) varten potilaat osallistuvat faasin I kliinisissä kokeissa perustuu yhdistelmä kolmesta ennustetekijöitä: seerumin albumiini alle 35 g /l; (LDH) suurempi kuin normaalin yläraja (ULN); ja kahdessa tai useammassa paikassa etäpesäkkeiden. Läsnäolo kunkin näiden muuttujien liittyy pahenemista tuloksista [20]. Keskimääräinen cpDNA pitoisuus oli suurempi potilailla, joilla on huonompi RMH ennustetekijöitä pisteet (F [3,98] = 9.97, p 0,0001); Post-testit paljastivat merkittävä positiivinen lineaarinen trendi välillä log10 (cpDNA) ja RMH pisteet (beta = 0,247, p 0,0001) (kuva 4).

scatterplot esittää suhdetta cpDNA pitoisuuden ja RMH ennustetekijöiden pisteet. Oli merkittävä positiivinen lineaarinen trendi välillä log

10 (cpDNA) ja RMH pisteet (beta = 0,252, p 0,0001).

Korrelaatio yhden ja usean analyysi.

univariate testaus määrittämiseen käytettiin merkittäviä ennustajia kokonaiselinaika, joka sisälsi cpDNA pitoisuuden jatkuvana muuttujana (HR 2,4 per 10-kertainen, 95% CI 1,4-4,2), albumiini 35 g /l (logrank p = 0,0003 ), ja ECOG-toimintakykyluokka yhtä kuin 2 (logrank p = 0,0007). Kun cpDNA, albumiini ja suorituskyky tila liitettiin monimuuttujatestin malliin, kaikkien kolmen parametrin todettiin olevan riippumaton ennustajia eloonjäämisen (taulukko 4). Määrä metastaasien ei todettu olevan merkittävä ennustaja selviytymistä yhden muuttujan analyysiin ja sen vuoksi suljettu pois monimuuttuja mallista.

Mutaatiotutkimukset havaitseminen ja vastaavuutta välillä FFPE ja cpDNA

peräsuolen syöpä.

25 potilasta CRC, cpDNA näytteet saatiin kaikista potilaista, kun taas FFPE kasvainnäytteitä oli saatavilla analyysiä varten 22 potilasta. Kaiken mutaatioita havaittiin 15 22 (68,2%) käytettävissä FFPE kasvaimia ja 14 25 (56%) cpDNA yksilöt (taulukko S1). Erityisesti

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

mutaatioita havaittiin 10 (45%), 3 (14%) ja 2 (9%) Tuumorinäytteet, vastaavasti . Verraten, 9 (36%)

KRAS

, 3 (12%)

BRAF

ja 3 (12%)

PIK3CA

mutaatioita havaittiin cpDNA näytteissä.

Concordance havaitsemisessa mutaatioiden välillä Hyväksytty FFPE arkistointia kasvaimia ja cpDNA näytteistä Sequenom OncoCarta analyysit oli 70% (7 10 potilasta) ja

KRAS

ja 100% (3 3 potilasta) ja

BRAF

mutaatiostatuksesta riippumatta (taulukko 3). Potilailla ei villityyppisen

KRAS

tai

BRAF

kasvainkudoksen genotyyppejä oli mutaatioita omilla cpDNA. Viidellä potilaalla oli havaittavissa

PIK3CA

mutaatioita tai molempiin FFPE kasvaimen ja /tai cpDNA: 1 potilaalla oli Q546K mutaatio havaittiin sekä FFPE kudosten ja cpDNA; 1 potilaalla oli E545K mutaatio havaittiin vain FFPE, mutta ei cpDNA; 1 potilaalla oli E542K mutaatio havaitaan maksan etäpesäkkeiden (FFPE), mutta ei primaarikasvaimen (FFPE) tai cpDNA; 1 potilaalla oli E545K havaittiin vain plasmassa mutta ei FFPE; ja 1 potilas oli Q546K mutaatio löytyy cpDNA mutta ei FFPE näyte oli saatavilla. Hiljattain raportoitiin kasvaimia synnyttävän

AKT1

E17K mutaatio [21] havaittiin 1 potilaalla sekä kudosten ja plasma. Ei mutaatiot muissa testattu onkogeenien havaittu.

Ei ollut 90% (9 10

KRAS

mutatoitunut näytettä) vastaavuutta varten FFPE kasvainten

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta välillä OncoCarta paneelin ja ARMS-Scorpion PCR alustoille. BRAF välistä yhdenmukaisuutta OncoCarta paneelin ja CE-SSCA menetelmä oli 100% (3 3

BRAF

mutatoitunut näytettä).

melanoomaan.

Näistä 15 potilaalla, joilla melanooma , FFPE kasvain näytteet olivat saatavilla analyysiä varten 10 potilaalla, kun taas cpDNA näytteet saatiin kaikki 15 potilasta. Kaiken mutaatioita havaittiin 8 10 (80,0%) käytettävissä FFPE kasvaimet ja 6 15 (40%) cpDNA yksilöt (taulukko S1).

BRAF

,

sääntelyviranomaisten

ja

MET

mutaatioita havaittiin 5 (50%), 3 (30%) ja 1 (10%) 10 FFPE Tuumorinäytteet, vastaavasti, ja 3 (20%), 2 (13,3% ) ja 2 (13,3%) 15 cpDNA näytteitä, vastaavasti. Yhteneväinen havaitseminen mutaatioita Hyväksytty FFPE ja cpDNA oli 60% (3 5 potilasta) ja

BRAF

, 66,7% ja

sääntelyviranomaisten

(2 3 potilasta) ja 100%:

MET

mutaatiostatuksesta riippumatta (1 1 potilas) (taulukko 3). Toinen

MET

mutaatio, T992I, todettiin yhdessä cpDNA näytteessä, mutta ei FFPE tuumorinäytesylinterin oli saatavilla. Potilailla ei villityyppisen kasvainkudoksen genotyyppejä oli mutaatioita omilla cpDNA.

Ei ollut 100% konkordanssin (5 5 näytettä)

BRAF

mutaatiostatuksesta riippumatta välillä OncoCarta paneelin ja CE-SSCA menetelmällä.

rintasyöpä.

FFPE tuumorinäytteistä ja cpDNA näytteet olivat saatavilla analyysiä varten kaikkien 19 potilaalla, joilla on rintasyöpä. Kaiken mutaatioita havaittiin 5 19 (26,3%) FFPE kasvaimia ja 4 19 (21,1%) cpDNA yksilöt (taulukko S1).

PIK3CA

H1047R mutaatio havaittiin 4 19 (21,5%) kasvain näytteet ja 3 19 (15,8%) cpDNA näytteistä, joissa välistä yhdenmukaisuutta 3 4 (75%) sovitetun FFPE ja cpDNA yksilöt (taulukko 3).

AKT1

E17K mutaatio havaittiin 1 potilaalla sekä FFPE kudosten ja cpDNA. Ei mutaatiot jollekin muulle onkogeenien tutkittu ei havaittu OncoCarta paneeli. Potilailla ei villityypin kasvainkudoksen genotyyppejä oli mutaatiot niiden cpDNA.

kastraatio kestävä eturauhassyöpä.

Niistä 11 potilaasta, joilla CRPC, cpDNA näytteet saatiin kaikista potilaista, kun taas FFPE kasvaimia saatavilla 8 potilasta. Kaiken mutaatioita havaittiin 3 8 (37,5%) FFPE kasvaimia, ja 3 11 (27,3%) cpDNA yksilöt (taulukko S1).

PIK3CA

,

HRAS

ja

AKT1

(kaikilla n = 1) mutaatioita havaittiin FFPE kasvain näytteet, kun taas

sääntelyviranomaisten

,

PIK3CA

ja

AKT1

(kaikki n = 1) mutaatioita löydettiin cpDNA näytteissä. Vastaava FFPE kasvaimen

PIK3CA

ja

AKT1

mutaatioita löydettiin cpDNA näytteissä, mutta FFPE kasvaimen

HRAS

mutaatiota ei havaittu sovitetussa cpDNA näytettä (taulukko 3 ). Q61K

sääntelyviranomaisten

mutaatio löytyi 1 cpDNA näytteessä, mutta ei vastaavaa FFPE kasvainnäyte.

munasarjasyöpä.

Näistä 15 potilasta, joilla on edennyt munasarjasyöpä, cpDNA näytteet saatiin kaikista potilaista, kun taas FFPE kasvaimen näytteet olivat saatavilla 14 potilasta. Kaiken mutaatioita havaittiin 5 14 (35,7%) FFPE kasvaimia, ja 0 14 (0%) cpDNA yksilöt (taulukko S1).

KRAS

mutaatioita (G12V ja G13D) (n = 3) ja

PIK3CA

H1047R mutaatio (n = 1) havaittiin FFPE tuumorinäytteissä, mutta ei mutaatioita löydettiin tahansa cpDNA näytteet (taulukko 3). Yksi potilas munasarjojen karsinosarkooma oli

KIT

P585P mutaatio havaittiin FFPE, mutta ei cpDNA.

Muut kasvaintyypeille.

Lopuista 19 potilaalla joiden valikoima kasvaintyypeissä, cpDNA näytteet saatiin 17 potilaalta, kun taas FFPE kasvaimet olivat käytettävissä 12 potilasta.

sääntelyviranomaisten

G12D mutaatio löytyy sekä FFPE kasvain ja plasmaa potilaalta, jolla ACUP ( taulukko 3).

sääntelyviranomaisten

G13R mutaatio havaittiin plasman, mutta ei FFPE kasvaimen potilaalta, jolla kolangiokarsinooma.

KRAS

G12D mutaatio havaittiin FFPE kasvain, mutta ei plasmaa potilaalta, jolla on pohjukaissuolisyöpä. Ei mutaatioita havaittiin muilla potilailla, mukaan lukien ei epidermaalisen kasvutekijän reseptori (

EGFR

) mutaatioita 5 potilasta NSCLC.

Concordance vuonna mutaation havaitsemisen välillä FPFE ja cpDNA varten primaarikasvaimen tai metastaattinen yksilöt

Kun otetaan huomioon kaikki potilaat Hyväksytty näytteitä, mukaan lukien ne, joilla ei ole mutaatioita havaittu (n = 83), viskositeettiluku havaitsemaan mutaatioita välillä FFPE ja cpDNA oli suurempi metastaaseja (83,3% 18 yksilöt) verrattuna primaarikasvaimen (78,5% 65 yksilöt). Harkittaessa vain potilaille, joilla on mutaatioita havaittiin vähintään veressä ja /tai primaarikasvaimen (n = 40), viskositeettiluku havaitsemaan mutaatioita välillä FFPE ja cpDNA oli jälleen suurempi metastaaseja (70,0% 10 yksilöt) verrattuna primaarikasvaimen (53,3% 30 yksilöt). Kuitenkin, koska ero määrä primaarikasvaimen (n = 65) ja metastaattinen (n = 18) yksilöitä saatu, emme voi tehdä mitään tilastollisia päätelmiä näistä tiedoista.

Keskustelu

Tämä tutkimus on osoittanut, että ensimmäistä kertaa, toteutettavuus multiplex havaitseminen kasvain DNA mutaatioiden hyödyntäen multiplex OncoCarta paneelin molemmilta poistettu DNA FFPE arkistointia kasvain kudosta ja cpDNA. Olemme osoittaneet, että koko cpDNA määrinä potilailla, joilla on edennyt syöpä on yleensä huomattavasti korkeampi kuin terveillä vapaaehtoisilla, ja korkeimmat pitoisuudet todettu potilailla, joilla on edennyt eturauhassyöpä ja rintasyöpiä, vaikka tämä ero ei ollut merkittävä melanooman ja munasarjasyövän (Kuvio 1). Suurin konsentraatio terveillä vapaaehtoisilla havaittiin jakaa potilaille kahteen ryhmään, jotka liittyivät merkittävästi erilaiset ennusteet; potilasta matalan cpDNA ryhmällä oli merkittävästi korkeampi OS suhteessa niille korkean cpDNA ryhmä [11], [13], [22]. Lisäksi cpDNA pitoisuus pysyi erittäin ennustetekijöiden OS monimuuttuja analyysit hyödyntäen ennustetekijöitä biomarkkereita Faasin I tutkimuksessa potilasryhmässä, että olemme aiemmin kuvattu [20]. Olemme myös osoittaneet korrelaatiota cpDNA pitoisuuksien ja ennustetekijöiden pisteet, jotka olemme aikaisemmin kuvattu ennustaa potilaiden tarkoitettua Vaiheen I tutkimuksessa osallistumista; cpDNA pitoisuus, albumiini 35 g /l ja suorituskykyluokka oli ennusteen arvioinnissa meidän sarjassa potilaiden itsenäisinä ennustajia selviytymistä. Nämä tiedot yleistä osoittavat, että cpDNA tässä potilasryhmässä pitkälti kasvain peräisin, vaikka tämä voidaan muodostaa sekä pahanlaatuisten ja stroomasolut.

Sequenom OncoCarta paneeli on myös voineet analysoida yli 230 tunnettua mutaatio ”hot -spots ”mutaatiot yli sata potilasta suurikapasiteettisten tavalla. OncoCarta paneeli kattaa suuren ja yhä useammat onkogeenien ja voidaan sovittaa sisällyttää muita kiinnostuksen kohteena olevia geenejä. Sen avulla kasvain mutaation havaitsemisen jopa minimaalisia määriä kasvaimen DNA, huono kudos säilyttämistä ja läsnäolo merkittäviä määriä normaalia DNA: ta. Seuraavan sukupolven sekvensointi teknologia mahdollistaa enemmän DNA kattavuus ja tiedonkeruu, joka mahdollistaa sekvensointi satojen täyspitkä geenejä, joka on kriittinen tutkimus geenien jossa mutaatioiden löytyy useita erilaisia ​​paikkoja, kuten on laita monissa tuumorisuppressoriproteiinia geenejä, kuten BRCA1, BRCA2, p53 ja PTEN.

kun siirrymme kohti kehittämiseksi molekyylirakennetta suunnattu aineita valituille väestön potilaita, on tärkeää, että molekulaarinen kasvainten ennustamiseen tehon kohdennettujen hoitomuotojen sisällytetään Varhaisissa kliinisissä kokeissa [2], [3]. Tällainen lähestymistapa voi lisätä kertoimella yksittäisen potilaan hyöty, vähentämällä määrä saaneista potilaista tehoton hoitoja ja nopeuttamiseksi kliininen pätevyys ennustavaa biomarkkereita. Arkistointia kasvainkudoksessa, usein otetaan useita vuosia ennen, käytetään usein nämä analyysit. Kasvain rebiopsy edelleen harvinaista, vaikka se on mahdollista, mikä käy ilmi ensimmäisessä taistelussa keuhkosyövän mukautuva tutkimuksessa [23]. Kuitenkin Valtuutusmenettelyistä useita toistuva kasvain rebiopsies aiheuttaa logistisia, vero- ja eettisiä kysymyksiä, kun taas hidastaa oikeudenkäyntiä suoriteperusteinen eikä joissa käsitellään sisäisen potilaiden vaurio-to-vaurion heterogeenisuus. Rebiopsy ja cpDNA analyysit voivat molemmat huolenaiheiden ympäröivä kasvain genomin epästabiilisuuden ja klonaalisen molekyylievoluutio takia terapeuttinen valinta paineita samalla mahdollisesti kyselemällä sisäistä potilas heterogeenisuus kysymys.