Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että

KRAS

ja

TP53

mutaatioiden ennustaa hoitovaste kolorektaalisyövässä. Kuitenkin vähän tiedetään suhde Näiden kahden yhteisen geneettisiä muutoksia. Mikro-RNA: t (miRNA), luokka ei-koodaava RNA osallisina solun prosesseissa, on yhä enemmän sidoksissa

KRAS

ja

TP53

. Oletimme, että tappavaa-7a ​​(let-7a) miRNA säätelee

KRAS

kautta

TP53

. Tutkia suhdetta

KRAS, TP53

, ja anna-7a, käytimme HCT116

KRAS

mut

paksu- ja syöpäsolujen neljällä eri genotyypin muutoksia

TP53

(

TP53

– /-, TP53

+/-, TP53

mut /+,

ja

TP53

mut /-

). Käyttämällä näitä soluja havaitsimme, että K-Ras aktiivisuus oli korkeampi solujen mutantti tai tippuu

TP53

alleeleja, mikä viittaa siihen, että villityypin

TP53

voi tukahduttaa K-Ras aktiivisuutta. Anna-7a esiintyi HCT116

KRAS

mut

soluja, vaikka ei ollut mitään korrelaatiota let-7a tason ja

TP53

genotyypin tila. Tutkia, miten let-7a voi säädellä K-Ras eri

TP53

genotyypin soluja käytimme let-7a estäjä ja havaittu olevan K-Ras aktiivisuutta kaikissa

TP53

, mikä vahvistavia ennen raportteja että let-7a säätelee K-Ras. Arvioida mahdollisia kliinisiä vaikutuksia tällä sääntelyverkon, tutkimme vaikutus

TP53

genotyyppi ja anna-7a estoa paksusuolisyöpäsolulinjassa eloonjäämiseen chemoradiation hoidon (CRT). Havaitsimme, että solujen täydellinen menetys villityypin

TP53

alleelien (

– /- tai

– /mut) olivat resistenttejä CRT hoidon jälkeen 5-fluorourasiilin ja säteily. Lisääntyminen edelleen K-Ras aktiivisuus let-7a esto ei vaikuttanut selviytymistä näissä soluissa. Sitä vastoin solujen yhden tai kahden villityypin

TP53

alleelit olivat kohtalaisen herkkiä CRT ja näytteillä vastusta let-7a estyi. Yhteenvetona tuloksemme osoittavat monimutkainen sääntelyjärjestelmä, johon

TP53

,

KRAS

, ja anna-7a. Tuloksemme voi antaa vihjeitä ymmärtää ja kohdistaa näiden vuorovaikutusten kolorektaalisyövässä.

Citation: Luu C, Heinrich EL, Duldulao M, Arrington AK, Fakih M, Garcia-Aguilar J, et al. (2013)

TP53

ja Let-7 mikro-RNA: Asetus K-Ras Aktiivisuus HCT116 peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 8 (8): e70604. doi: 10,1371 /journal.pone.0070604

Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), Italia

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2013 Hyväksytty: 21 kesäkuu 2013 Julkaistu: 01 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Luu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on 4

th yleisin syöpä ja 2

nd yleisin syy syövän liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa [1]. Viimeaikaiset edistysaskeleet, jotka ovat parantaneet tuloksia CRC ovat olleet tunnistaminen tarkka prognoosi- ja ennakoivan molekyylitason biologisten merkkiaineiden [2] – [4]. Näihin ovat kuuluneet geneettisten muutosten

KRAS

ja

TP53

, joita usein havaitaan potilailla, joilla on CRC.

KRAS

mutaatiot ovat läsnä noin 30-50% CRC, mutta myös 17-25% kaikista ihmisen kasvaimista [2], [5] – [7]. Vastaavasti

TP53

muutokset ovat yleisempiä potilailla, joilla CRC (lähes 50%) [8]. Sekä prognoosi- ja ennakoivan roolit on tunnistettu sekä geenien [9]. Oman ryhmän ja muiden on viime aikoina osoittanut, että havaitseminen samanaikaisten

KRAS

ja

TP53

mutaatioita, joiden esiintyvyys on 5%: sta 20%: in CRC potilailla, korreloi vastustuskykyä neoadjuvant chemoradiation hoito ( CRT) potilailla, joilla peräsuolen syöpä [10] – [12]. Huolimatta usein näiden mutaatioiden CRC, tiedetään vähän vuorovaikutusta näiden kahden geenin välissä.

välinen yhteys näiden kahden usein muuttaa geenin CRC voi olla mikro-RNA: ta (miRNA), luokan ei- koodaus RNA jotka toimivat transkription säätelyyn ja erityisesti voivat vaikuttaa solujen jakautumisen ja apoptoosin [13], [14]. Viimeaikaiset raportit ovat ehdottaneet, että kasvain suppressoriaktiivisuutta miRNA tappavan 7a (let-7a) voi johtua sen yhdessä

KRAS

ja että tuumorin kasvu voi tapahtua tukahduttaminen K-Ras ilmentyminen kirjaimien 7 a [15], [16]. Kehittyvät kliiniset tiedot viittaavat siihen, että sisäinen kasvain let-7a ilmentyminen korreloi tuumorivaste ja eloonjäämiseen metastaattisessa kolorektaalisyövässä saaneilla potilailla kasvutekijän (EGFR) kohdentamisaineita molemmissa

KRAS

villin tyypin ja mutantti väestö [17 ]. Lisätutkimukset ovat arvelleet, että rooli

TP53

DNA: n korjaukseen ja apoptoosin voidaan osittain säätelee miRNA, kuten let-7a [18], [19]. Siksi monimutkaisen sääntelyn verkosto

TP53

ja

KRAS

voidaan yhdistää let-7a.

tutkia mahdollisia vuorovaikutuksia

TP53

,

KRAS

, ja anna-7a, analysoimme ainutlaatuisen perheen paksusuolisyövän solulinjojen kanssa mutantti

KRAS

ja muutokset

TP53

genotyyppi. Nämä solut meille mahdollisuuden tutkia muutoksia K-Ras ilmaisun ja toimintaa, joka vastasi vaihtelut

TP53

genotyyppi. Lisäksi pystyimme paremmin kuulustella rooli anna-7a asettamisessa mutantti

KRAS

ja erilaiset

TP53

genotyypit. Tuloksemme osoittavat romaani kasvaa K-Ras aktiivisuus erilaisilla

TP53

genotyypit. Emme kuitenkaan ole löytänyt selkeää suhdetta let-7a tason ja

TP53

genotyyppi. Kuitenkin muutokset K-Ras aktiivisuutta säätelee let-7a. Tämä ensimmäinen raportti

TP53

ja anna-7a sääntely K-Ras aktiivisuus antaa vihjeitä paremmin ymmärtämään monimutkaisia ​​vuorovaikutus

TP53

ja

KRAS

.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

ihmisen CRC solulinja HCT116, kätkeminen yksittäinen mutantti

KRAS

alleeli kaksinkertainen villin tyypin

TP53

(

TP53

+ /+

) alleeleja, muokattiin neljään stabiileja solulinjoja erilaisilla

TP53

genotyyppien (

TP53

– /-, TP53

+/-, TP53

mut /+,

ja

TP53

mut /-

). Vanhemman ja modifioitu solulinjoja ystävällisesti Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University, Baltimore, MD) [20]. Mutant ja Knockout alleelit käytettiin molempia voidaan arvioida mahdollisia eroja kahden alleelin, kuten ehdotetaan ennen raporteissa [21]. Kaikkia solulinjoja arvioitiin DNA: n eristämiseksi, polymeraasiketjureaktio (PCR), ja sekvensointi

KRAS

ja

TP53

geenimutaatioita tarkistaa genotyyppejä. Soluja ylläpidettiin McCoyn 5A-alustassa (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Omega Scientific; Tarzana, CA) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä-glutamiinia (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5% CO

2 37 ° C: ssa.

immunoblottauksella

Solulysaatit kerättiin RIPA-puskurilla (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja proteaasi-inhibiittorit (Thermo Scientific, Rockford, IL). Kaksikymmentä mikrogrammaa proteiinia erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-membraaneille (Millipore, Bedford, MA). Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta kuivamaitoa ja tutkittiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla. Pesun jälkeen kalvoja leimattiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarisia vasta-aineita (BioRad, Hercules, CA). Membraanit kehitettiin käyttäen kemiluminesenssisubstraatilla (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) ja kuvata. Käytetyt vasta-aineet olivat: anti-K-Ras (Millipore) ja anti-GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA).

K-Ras Activity

K-Ras-aktiivisuus mitattiin käyttäen Ras aktivointi ELISA Assay Kit (Millipore). Lyhyesti, solulysaatteja inkuboitiin Raf-1 Ras Binding Domain (RBD) -agarose. Raf-1-RBD käytettiin kuvaamaan aktiivisen GTP: hen sitoutuneen K-Ras-proteiinin, joka havaittiin sitten lisäämällä anti-K-Ras-vasta-ainetta (Millipore). HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen jälkeen lisättiin. Luminometrillä käytettiin mittaamaan signaalien lisäyksen jälkeen kemiluminesenssireagenssia (Perkin-Elmer, Shelton, CT). Koska analyysit suoritettiin arvioimaan suhteelliset muutokset K-Ras aktiivisuuden kesken eri

TP53

genotyyppejä, K-Ras aktiivisuutta vanhempien

TP53

+ /+ linja asetettiin 1. määrityksiä, joissa let-7a estäjä, kukin genotyyppi toimi oma ohjauksensa. Kolme riippumatonta määritykset suoritettiin kullekin solulinjan, ja absorbanssien keskiarvo ± keskihajonta (SD) piirrettiin jokaiselle riville.

Käänteinen transkriptio

RT-PCR suoritettiin käyttäen Taqman ® miRNA-määritys (Invitrogen) seuraten valmistajan protokollaa. Lyhyesti, käänteinen transkriptio suoritettiin käyttäen edellyttäen Multiscribe RT ™ Reagent master mix plus solulysaateista ja anna-7a spesifisiä alukkeita (Invitrogen). Reaktiot suoritettiin lämpösyklilaitteessa 16 ° C: ssa 30 minuutin ajan, 42 ° C: ssa 30 min, ja 85 ° C: ssa 5 min.

Real Time PCR

RT-PCR oli suoritettiin käyttäen TaqMan® miRNA-solujen CT ™ Kit (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, RT Tuote on lisätty PCR-cocktail (Taqman® miRNA reagenssilla ja edellyttäen, TaqMan® master mix) ja RT-PCR-reaktiot suoritettiin 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä, joissa 15 sekuntia 95 ° C ja 1 min 60 ° C: ssa Applied Biosystems 7500 nopeasti RT-PCR -järjestelmää (Foster City, CA). Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena.

Anna-7a Inhibitor

Anna-7a estyi miRIDIAN miRNA-inhibiittorit (Dharmacon; Lafeyette, CO) seuraten valmistajan protokollaa. Lyhyesti, HCT116-soluja (3 x 10

5) maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin yön yli. Ne transfektoitiin sitten 100 nM miRIDIAN miRNA-inhibiittoria 24 tuntia. Soluja inkuboitiin vielä 48 tuntia ennen kuin se käytetään määrityksissä.

chemoradiation Therapy

HCT116-soluja käsiteltiin CRT mukaisesti vakiintuneen protokollan [22]. Sen jälkeen, kun yhteensä 72 h inkubaation let-7a-inhibiittori, solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin yön yli. Soluja käsiteltiin sitten 4 nM 5-fluorourasiili (5-FU) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 16 h, jonka jälkeen ne altistettiin 4 Gy säteilyn. Lääkealtistuksen keskeytettiin 6 h kuluttua sädehoitoa keskipainekromatografialla vaihdon. Solut, joita ei ollut käsitelty let-7a estäjä käsiteltiin samalla tavalla CRT.

määritys elinkykyyn

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen ATP-pohjainen määritys (Cell Titer-Glo; Promega ; Madison, WI) kohti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, HCT116-soluja (5 x 10

3) maljattiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli. Cell titraaminen-Glo reagenssia lisättiin ja solujen hajoamisen aiheuttama. Luminenssi tallennettiin luminometrillä. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin. Esitetyt tulokset edustavat keskimääräistä kannattavuutta, koska prosenttia elinkelpoisuuden käsittelemättömien solujen.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin Microsoft Excel-ohjelmiston (Microsoft, Redmond, WA). Kukin datapiste edustaa keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta. Ohjaus ja käsittelyolosuhteet verrattiin Studentin t-testiä, ja erot solulinjat verrattiin analysoimalla varianssianalyysillä (ANOVA). P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

K-Ras Protein taso ei riipu

TP53

mutaatiostatus

määrittämiseksi vaikutus eri

TP53

genotyypit K-Ras ilme, western blot-määritys suoritettiin vertaamaan proteiinipitoisuuden. Tuloksemme osoittavat, että K-Ras ekspressiotasot ei vaikuttanut eri

TP53

genotyyppien (kuvio 1A), mikä viittaa, että

TP53

ei säännellä K-Ras-proteiinin ilmentymisen.

A) HCT116-solujen kanssa totesi vaihtelut

TP53

mutaatiostatus kerättiin ja lysoitiin western blotting K-Ras ilme. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. B) K-Ras aktiivisuus mitattiin kaikissa solulinjoissa käyttäen Raf avattavan ELISA-määritystä. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvoa 3 itsenäistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena suhteessa

TP53

+ /+ soluja, p 0,05. Virhe palkit osoittavat keskihajonnan (SD).

vaikutus

TP53

Mutaatio Status K-Ras Activity

vaikutus

TP53

genotyypin K-Ras-aktiivisuus mitattiin käyttämällä Raf pull-down määrityksessä. Huomasimme, että K-Ras aktiivisuus oli matalin

TP53

+ /+

soluja. Lisääntynyt K-Ras aktiivisuus oli voimakkainta

TP53

mut /-, sen jälkeen

TP53

– /-,

TP53

+ /mut, ja TP53

– /+ (44%, 32%, 20% ja 10% nousu, vastaavasti, p 0,05) (kuvio 1 B). Nämä tulokset osoittavat, että K-Ras aktiivisuus oli matalin soluissa villityypin

TP53

alleelit; ja korkeimmat tasot havaittiin soluissa homotsygoottista menetys villityypin TP53 alleelien.

Anna-7a ilmentyy kaikissa HCT116 Lines

Anna-7a ilmentyminen HCT116 solulinjoissa mitattiin by qPCR. Let-7a ekspressiota havaittiin kaikissa solulinjoissa (kuvio 2A). Ei ollut muutoskuvio let-7a tasolle, joka vastasi muutoksia

TP53

genotyypin.

A) Anna-7a ilmentyminen mitattiin qRT-PCR. Data näytetään edustaa yksittäistä qRT-PCR suoritettiin kolmena kappaleena. B) Soluja transfektoitiin 100 nM let-7a-inhibiittori 24 tuntia. Proteiini valvonnan ja anna-7a esti soluja kerättiin immunoblottauksella K-Ras ilme. GAPDH toimi latauskontrollina.

Anna-7a ei säädellä K-Ras Protein tasot

Anna-7a-geenin ilmentyminen estyi 90%: iin qPCR. K-Ras-proteiinin tasot arvioitiin koko

TP53

genotyyppejä läsnä ollessa tai poissa ollessa anna-7 inhibition. K-Ras-proteiinin tasot eivät muuta anna-7a eston (kuvio 2B).

Anna-7A säätelee negatiivisesti K-Ras Activity

The effect of let-7a estoa K-Ras aktiivisuus määritettiin myös. Let-7a esto, K-Ras aktiivisuus kasvoi kaikilla

TP53

genotyyppien (kuva 3). Huomasimme, että K-Ras aktiivisuus kasvoi 50%: sta 112% verrattuna let-7a ilmentävien solujen (p 0,05). Prosentuaalinen kasvu K-Ras aktiivisuutta kaikissa solulinjoissa ei selvästi liittynyt

TP53

genotyypin ja onko tyrmäys tai Mutanttialleelit olivat läsnä.

Solulysaatit kerättiin seuraavan 72 tunnin inkuboinnin ja alistettiin on Raf-alasveto määrityksessä, joka mittaa K-Ras aktiivisuutta. Tiedot esitetään edustaa kolmen kokeen tehdään kolmena kappaleena. Virhe palkit osoittavat SD. * P 0,05.

Solut Wild-type

TP53

alleelit ovat herkkiä CRT ja anna-7a esto Vähennykset vastaus CRT

Solut, eri

TP53

genotyypit käsiteltiin CRT ja solujen elinkyky mitattiin (kuvio 4). Solut puuttuu tahansa villityypin

TP53

alleeli oli resistenttejä CRT, kun taas solut kätkeminen yhden villin tyypin

TP53

alleeli esiintyi noin 50% solukuolemaa. CRT käsittely suoritettiin jälleen päästää 7a esto, joka laski CRT-solukuolema lähes 20% soluissa kätkeminen ainakin yhden villityypin

TP53

alleeli (p 0,05). Solut homotsygoottista menetys villityypin

TP53

alleelien (

– /- ja

mut /-), joka korreloi eniten K-Ras aktiivisuutta (katso kuvio 1 B), ei esiintynyt muutoksia solujen elinkelpoisuus muutoksista huolimatta let-7a ekspressiotasot.

Solut vaihtelevalla

TP53

tila +/- let-7a estäjä käsiteltiin 5-FU seuraa säteilyllä. Solujen elinkelpoisuus mitattiin. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvoa elinkelpoisuuden prosenttia käsittelemättömien solujen. * P 0,05, ** p 0,05.

Keskustelu

KRAS

ja

TP53

ovat yhteisiä somaattiset mutaatiot ennakoivaa ja prognostiset arvo potilailla, joilla on CRC. Havaitseminen valitsemalla

KRAS

mutaatioita on liitetty suurentunut riski taudin uusiutumisen ja kuoleman [23] ja on ennustettu vastustuskykyä EGFR hoitoja CRC [9]. Vastaavasti valitsemalla

TP53

muutoksia on yhteydessä huonoon tulosten CRC [8]. Olemme myös raportoitu, että samanaikainen havaitseminen

TP53

ja

KRAS

mutaatiot potilailla, jotka saavat neoadjuvant CRT peräsuolisyövässä ennustettu epäonnistuminen patologisen täydellinen vaste [10]. Tässä tutkimuksessa, pyrimme paremmin ymmärtämään mahdollista vuorovaikutusta kahden geenin. Havaitsimme let-7a mahdollisena yhteys

TP53

ja

KRAS

. Ennen luonnehdinta let-7a on paljastanut sen rooli valvoa solusyklin etenemisen ja divisioona ihmisen keuhko- ja paksusuolen syöpiin [24], [25]. Lisäksi, Johnson et ai. [15] havaitsivat, että let-7 negatiivisesti ohjattu

KRAS

ilmentymistä keuhkosyövässä. Lisäksi, Ruzzo et ai. [17] ilmoitetaan parannetun kokonaiselossaoloaikaa potilailla, joilla on kohonnut let-7a sisällä

KRAS

mutantti kolorektaalisyöpä väestö hoidettu anti-EGFR-hoidon, mikä viittaa kasvaininhibitorisen rooli päästää-7a

KRAS

aktivoiduilla kasvaimia.

TP53

on tunnettu transkriptionaalisesti säätelemään miRNA [26], [27]. Siksi me theorized olemassaolon sarjan sääntelyn askeleen päässä

TP53

päästää-7a

KRAS

. Huomasimme, että onkogeeniset K-Ras aktiivisuus säätelee

TP53

genotyyppi ja anna-7a; ja muutoksia sekä vaikuttanut vastauksena CRT.

Tutkimuksessamme käytimme CRC -solut eri

TP53

genotyypit. Nämä solut on johdettu alkuperäisestä solulinjasta kätkeminen vahvistuksen toiminnon

KRAS

mutaatio sijaitsee kodonien 13 [28], [29]. On perustelut hyödyntäen solujen knockout ja mutantti

TP53

alleelien tutkimuksessamme. Vaikka yhteinen menetys villityypin

TP53

alleelit, tyrmäys ja mutantti

TP53

alleelit eivät ole samanlaisia. Täydellinen menetys

TP53

alleelien johtaa vastaavaan menetykseen tuumorisuppressorin toimintaa ja samalla mutantti

TP53

alleelit voivat ilmaista p53 proteiineja, jotka menettävät tuumorisuppressoriproteiinia aktiivisuutta mutta myös saamaan kasvaimia synnyttävän ominaisuuksia [21]. Kuitenkin tässä tutkimuksessa emme löytäneet johdonmukaisia ​​eroja KO ja mutantti

TP53

alleeleja suhteen K-Ras aktiivisuus lähtötilanteessa ja vastauksena päästää 7a esto, eikä vastauksena CRT.

Kuten aikaisemmin, havaitsimme muutokset K-Ras toimintaa estämällä let-7a ilme. Emme kuitenkaan ole noudattanut vastaavat muutokset K-Ras-proteiinin ilmentymisen, joka on ristiriidassa ennen raportit osoittavat let-7 miRNA sääntely K-Ras ilmaisun [30], [31]. Siitä huolimatta meidän havainnot ovat sopusoinnussa olevien säännösten mekanismeja miRNA. Todellakin, miRNA voi säädellä geenien läpi erilaisia ​​mekanismeja mRNA käännös vakautta sytoplasmassa solukierron aktiivisuuden [14], [24]. Erot tuloksemme ja kuin aikaisempien raporttien voisi johtua myös eroista lajien tai solulinjoja hyödyntää. Siten, vaikka K-Ras ilme pysyi muuttumattomana let-7a esto, meidän kokeet osoittivat, että K-Ras aktiivisuus vaikutti let-7a. Lisäksi solut kätkeminen homotsygoottinen villityypin

TP53

alleelit ilmaistu pienin K-Ras aktiivisuutta, mikä viittaa siihen, että villityyppinen

TP53

alleelit voivat tukahduttaa K-Ras aktiivisuutta. Lisäksi meidän tulokset ovat yhdenmukaisia ​​raportin haimasyöpä, kasvua K-Ras aktiivisuutta, kun mutantti

KRAS

oli pariksi mutantti

TP53

[32]. Lopuksi K-Ras aktiivisuus selvästi lisääntynyt, kun let-7a estyi riippumatta

TP53

genotyyppi, edelleen viittaa let-7a sääntely K-Ras aktiivisuutta.

Kemoterapia ja säteily ovat tärkeä osa multimodaalinen hallinta kirurgisten potilaiden peräsuolen syöpä; ja neoadjuvantti- CRT on liittynyt downstaging taudin ja laski paikallisen uusiutumisen [33], [34]. Meidän tutkimuksessa havaitsimme, että solut puuttuu villityypin

TP53

alleeleja olivat resistenttejä CRT ja siinä esiintynyt solukuolemaa hoidetuilla CRT. Sitä vastoin solut, joissa on vähintään yksi villityypin alleelin (

TP53

+ /+, TP53

mut /+

, ja

TP53

– /+) oli noin 50% solukuolema hoidetuilla CRT. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​tuloksia meidän ennen kliinisiin tutkimuksiin, joissa potilaalla on kaksinkertainen mutaatioita (

KRAS

ja

TP53

) pystynyt osoittamaan patologinen täydellinen vaste hoidon jälkeen neoadjuvant CRT [10]. Kun let-7a ilmentyminen estyi (mikä lisää K-Ras aktiivisuus), soluja, joista puuttuu villityypin

TP53

alleelien (

TP53

– /-

ja

TP53

mut /-

) oli 100% solujen eloonjäämistä. Kuitenkin soluissa kätkeminen ainakin yhden villityypin

TP53

alleelin (aiemmin saatu joitakin solukuolemaa), solujen eloonjääminen lisääntyi vastauksella-7a esto. Nämä tulokset on kaksi tärkeää vaikutusta: (1)

TP53

genotyyppi vaikuttaa K-Ras aktiivisuutta ja voi ennustaa vastaus CRT ja (2) let-7a ekspressiotasot vaikuttavat K-Ras aktiivisuutta ja saattavat muuttaa vastauksena CRT.

Yhteenvetona tarjoavat tietoa mahdollisia mekanismeja, jotka kytkevät

KRAS

,

TP53

, ja anna-7a. Vaikka kaksinkertainen mutantit ovat suhteellisen harvinaisia, ehto näyttää olevan huono ilmiasuun vastustuskykyä CRT. Tuloksemme edistää parempaa ymmärrystä välisen yhteyden

KRAS

ja

TP53

. Tieto reittejä yhdistää

KRAS

,

TP53

, ja anna-7a voi tarjota paremman käsityksen mekanismeja ajo köyhien fenotyyppi havaittu tietyissä mutaatioita CRC. Vaikka tunnustamme, että rajoitukset tutkimuksemme sisältävät puute

vivo

mallintaminen ja rajoitukset yhden solulinjan, meidän painopiste oli tutkinnan mahdollisen cross-talk välillä let -7 ja p53, jota osoittavat selvästi mallissamme. On mahdollista, että tämä vuorovaikutus voi olla solulinjan erityinen tai voi riippua muista poikkeava väyliä HCT-116 (MSI-H,

di pIK3

mutantti). Tulevaisuuden työ keskitytään tutkii mahdollisia mekanismeja vuorovaikutuksen let-7a ja p53 eri peräsuolen solulinjojen ja erilaisilla molekyyliprofiilien.