Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

tarkastella

in vitro

ja

in vivo

tehoa dual PI3K /mTOR-estäjä NVP-BEZ235 hoidossa on

PIK3CA

villityypin peräsuolen syöpä (CRC).

Experimental suunnittelu

PIK3CA

mutantti ja villityypin ihmisen CRC solulinjoja käsiteltiin

in vitro

kanssa NVP-BEZ235, ja tuloksena vaikutukset jakautumista, apoptoosia ja signalointi arvioitiin. Paksusuolen kasvaimia peräisin geneettisesti hiiri (GEM) malli satunnaista villityypin

PIK3CA

CRC hoidettiin

in vivo

kanssa NVP-BEZ235. Tuloksena vaikutukset makroskooppisten kasvainten kasvua /regressio, leviämisen, apoptoosin, angiogeneesi, ja signalointi tutkittiin.

Tulokset

In vitro

hoidossa CRC solulinjojen kanssa NVP- BEZ235 ohimenevän PI3K saarto, jatkuva lasku mTORC1 /mTORC2 signalointi, ja vastaava lasku solujen elinkelpoisuuden (mediaani IC

50 = 9,0-14,3 nM). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin pareittain isogeenisiin CRC-solulinjat, jotka poikkeavat toisistaan ​​ainoastaan ​​läsnä ollessa tai ilman aktivoivan

PIK3CA

mutantti alleeli.

In vivo

hoidossa paksusuolen kasvainta kantavien hiirten kanssa NVP-BEZ235 ohimenevän PI3K eston ja jatkuva saarto mTORC1 /mTORC2 signalointi. Pitkittäinen kasvaimen valvontaa optinen kolonoskopia osoitti 97% tuumorin koon kasvuun kontrollihiirissä (p = 0,01) verrattuna 43%: n vähennys (p = 0,008) käsitellyissä hiirissä.

Ex vivo

analyysi NVP-BEZ235 saaneilla kasvaimia osoitti 56% laskun proliferaatiossa (p = 0,003), ei vaikutusta apoptoosiin, ja 75%: n vähennys angiogeneesiä (p = 0,013).

Johtopäätökset

Nämä tutkimukset tarjoavat prekliinisissä perustelut tutkimukset, joissa tutkitaan tehoa dual PI3K /mTOR-estäjä NVP-BEZ235 hoidossa

PIK3CA

villityypin CRC.

Citation: Roper J, Richardson MP, Wang WV, Richard LG, Chen W, Coffee EM, et al. (2011) Dual PI3K /mTOR Inhibitor NVP-BEZ235 indusoi kasvainten pienenemistä geenimuunnossolulinjoissa hiirimallissa

PIK3CA

Wild-Type peräsuolen syövän. PLoS ONE 6 (9): e25132. doi: 10,1371 /journal.pone.0025132

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 14 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 25 elokuu 2011; Julkaistu: 26 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Roper et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National Cancer Institute (2U01CA084301) ja National Institute of Diabetes ja Ruuansulatusjärjestelmään ja munuaistautirekisteri (NIDDK) (5K08DK7803325, R03DK088014, ja T32-DK07542). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

vuonna 2011 peräsuolen syöpä (CRC) on jatkossakin kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolleisuus Yhdysvalloissa [1]. Huolimatta kasvavasta arsenaali kemoterapeuttisten aineiden, mediaanielossaolosta metastasoituneen CRC on edelleen alle 20 kuukautta, mikä korostaa kiireellistä tarvetta kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja [2].

Nisäkkäiden rapamysiinin kohde ( mTOR) on seriini /treoniini-kinaasi, joka säätelee solujen lisääntymistä ja apoptoosia. mTOR sitoo sääntelyyn liittyvä proteiini mTOR (Raptor) ja nisäkkäiden LST8 /G-proteiinin β-alayksikköä kaltaisen proteiinin (mLST8 /GβL) muodostaa mTOR kompleksin 1 (mTORC1), joka edistää käännös kautta fosforylaation p70 S6 kinaasin (S6K), S6 ribosomaalisen proteiinin (S6), ja eukaryoottiset initiaatiofaktoria 4E sitova proteiini 1 (4E-BP1). Vaihtoehtoisesti mTOR voi sitoa rapamysiini erottelua kumppani mTOR (Rictor), mLST8 /GβL, ja nisäkkään stressi-aktivoidun proteiinikinaasin vuorovaikutuksessa proteiini 1 (mSIN1) muodostamaan mTOR kompleksin 2 (mTORC2) [3], [4].

ylävirtaan fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) signalointireitin voi aktivoida mTOR. Luokan IA PI3K: t aktivoituvat kasvutekijän reseptorityrosiinikinaasit (RTK: t), ja ne koostuvat heterodimeerin, joka koostuu p110α /p110β katalyyttinen ja p85-säätelyalayksikkö [5].

PIK3CA

(fosfatidyyli-3-kinaasin katalyyttinen, α-polypeptidiä) koodaavan geenin p110α usein mutatoitunut monissa ihmisen syövissä, mukaan lukien CRC [6]. Pistemutaatiot

PIK3CA

ryppään kahden kuormittajat: E545K in kierteisen domain (eksoni 9) ja H1047R katalyyttisessä kinaasidomeenissa (eksoni 20). Nämä mutaatiot lisäävät p110α aktiivisuutta ja edistää CRC solujen kasvua, invaasio, ja muuttoliike

in vitro

aktivoimalla PI3K-reitin [7]. Mutaatiot kierteiset ja katalyyttinen domeeneista

PIK3CA

antaa oleellisesti identtisiä fenotyyppejä ihmisen CRC solulinjoissa [7]. AKT on kriittinen alavirtavaikuttajainhibiittorit PI3K reitin ja edistää solujen kasvua ja selviytymistä kautta useita mekanismeja, mukaan lukien fosforylaatiota TSC2, joka johtaa mTORC1 aktivointi [5]. Täydellinen aktivaatio AKT saavutetaan jälkeen fosforylaation Thr308 ja Ser473 mukaan PDK1 ja mTORC2 vastaavasti [5], [8] – [11].

Koska sen keskeinen asema Karsinogeneesin mTORC1 saarto on houkutteleva terapeuttinen strategia CRC. Hoito APC Δ716 hiirten mTORC1 estäjän everolimuusi estää solujen lisääntymistä ja kasvaimen angiogeneesiä, mikä laski sekä määrän ja koon suoliston kasvaimet [12]. Olemme äskettäin raportoitu, että hoito on geneettisesti hiiri (GEM) malli satunnaista CRC mTORC1 estäjän rapamysiini aiheuttaa 80%: n vähennys yksittäisissä kasvaimen kasvua, havaittuna pitkittäiset kolonoskopia valvonnasta [11]. Kuitenkin kliininen teho mTORC1 estäminen voi vähentää niiden menetystä olevan mTORC1 riippuvainen negatiivinen silmukka PI3K signalointia (heijastuu kasvaneena AKT fosforylaation Thr308), ja edelleen mTORC2 aktivaatio AKT kautta fosforylaation Ser473 [9 ] – [14]. Itse asiassa vaiheen I kliinisen tutkimuksen tutkii tehoa mTORC1 estäjän Everolimuusin pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia osoitti vähäistä hyötyä vain yksi 16 peräsuolen syövän potilaiden ja yleinen kasvanut fosforylaatioon AKT at Ser473 [13]. Yhdessä näyttää siltä, ​​että hoitostrategioita, joissa PI3K ja mTOR ovat samanaikaisesti estyy voi olla tehokkainta.

NVP-BEZ235 (Novartis) on dual pan luokan I PI3K ja mTOR estäjät, jotka on osoitettu vähentää kasvaimen kasvua useissa eri ksenografti ja useita geneettisesti hiiren (GEM) mallit ja on tällä hetkellä kliinisissä kokeissa [14] – [50]. On ollut ehdotuksia, että tällaisten aineiden voidaan rajoittaa kasvaimia on aktivoivia mutaatioita

PIK3CA

[51], [52]. Kuten aktivoimalla

PIK3CA

mutaatiot ovat nähneet vain 17% CRC, tämä merkitsisi tällaiset aineet voidaan suunnattu vain pieni osa potilaista [53]. Koska NVP-BEZ235 estää villityypin ja mutantti muodot

PIK3CA

vertailukelpoisia teho [32], me arveltu, että NVP-BEZ235 voi olla merkittäviä tehoa hoidossa

PIK3CA

villin tyypin CRC.

tässä käsikirjoitus, kuvaamme tulokset

in vitro

hoidossa osoittavia tutkimuksia verrattavissa tehoa NVP-BEZ235 vastaan ​​sekä

PIK3CA

mutantti ja villityypin ihmisen CRC solulinjat. Kuvaamme myös tuloksia

in vivo

hoitotutkimuksissa osoittavat merkittävää tehoa GEM malli satunnaista villityypin

PIK3CA

CRC. Yhdessä meidän havainnot tarjoavat vakuuttavan prekliinisissä perustelut kliinisiä kokeita tutkia käytön NVP-BEZ235 hoidossa

PIK3CA

villityypin CRC potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

In vitro

hoidossa ihmisen CRC solulinjojen

HCT116 (

PIK3CA

mutantti; kinaasidomeeniin at H1047R), DLD-1 (

PIK3CA

mutantti; kierteiset domain at E545K), ja SW480 (

PIK3CA

villin tyypin) ihmisen CRC solulinjat (ATCC) ja isogeenisistä DLD-1

PIK3CA

mutantti ja villityypin solujen (saatu B. Vogelstein) pidettiin DMEM: ssä (Invitrogen), jossa oli 10% FBS: ää ja 1 x penisilliini /streptomysiiniä (Invitrogen). Solut maljattiin eri alku- tiheydet (HCT116: 3.000 solua /kuoppa, DLD-1: 5500 solua /kuoppa, SW480: 4500 solua /kuoppa, DLD-1

PIK3CA

mutantti: 7000 solua /kuoppa, ja DLD -1

PIK3CA

villityypin: 9.000 solua /kuoppa) tilille ero kasvukinetiikat. 16 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa NVP-BEZ235 (Novartis), ja lääkettä sisältävä kasvualusta vaihdettiin 24 tunnin välein. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 16 tunnin kuluttua ensimmäisen pinnoitus ja 48 tunnin kuluttua aloittamisesta lääkehoidon käyttäen kolorimetristä MTS-määritys CellTiter 96® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (Promega), kohti valmistajan ohjeiden. Solujen elinkyky lääkehoitoa normalisoitiin kuin käsittelemättömien solujen myös kasvatettiin 48 tunnin ajan. IC

50-arvot laskettiin käyttäen 4 parametrin lineaarisella regressiolla GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Western blot -analyysiä varten, solut maljattiin 0 nM tai maksimaalinen estävä annos (500 nM) NVP-BEZ235 2, 6, 24, tai 48 tuntia.

sekvensointi paksusuolen kasvainten GEM malli satunnaista CRC

C57BL /6J

APC

ehdollinen hiirten (APC CKO) käsiteltiin Adeno-Cre, kuten aiemmin on kuvattu [11]. Seuraavat ruumiinavauksessa, 10 Tuumorinäytteet kerättiin 1 ml: n RNA Myöhemmin (Invitrogen, Inc.), pidettiin yön yli 4 ° C: ssa, poistetaan sitten RNA Myöhemmin ja arkistoidaan -80 ° C: ssa. RNA uutettiin näytteistä käyttämällä RNeasy (Qiagen, Inc.), ja cDNA muodostettiin käänteiskopioijaentsyymin (Omniscript RT, Qiagen, Inc.). Alukkeita suunnitellut Tutkimuksen kirjoittajat käytettiin luomaan 553 emäsparin ja 477 emäsparin amplikonien (PCR suoritettiin käyttäen Platinum PCR SuperMix- High Fidelity, Invitrogen, Inc.) ulottuen kodonien 532-554 eksonin 9 (kierukka domain; 9F: 5 ’GCAGTGTGGTGAAGTTTCCA 3’, 9R: 5 ’TGGCCAATCCTTTGATTTGT 3’) ja c1011-1062 eksonin 20 (kinaasidomeeni; 20F: 5 ’ACTGCGTGGCAACCTTTATC 3’, 20R: 5 ’TGATGGTGTGGAAGATCCAA 3’)

Pik3ca

geenin, vastaavasti, jotka ovat mutaatio hotspot alueilla. Sangerin sekvensoinnin amplikoneista suoritettiin biopolymeerien Facility Harvard Medical School, ja tulokset analysoitiin Sequencher 4.10.1 (Gene Codes, Inc).

In vivo

hoidossa GEM malli satunnaisista CRC

APC CKO hiiriä käsiteltiin adeno-Cre ja seuraa optinen kolonoskopia, kuten aiemmin on kuvattu [11]. Koska colonoscopic metrinen kasvaimen koon, kasvaimen koon Index (TSI) laskettiin (kasvain alue /paksusuolen luumenalue) x 100 (%). Tuumoreita kantavaa hiirtä jaettiin satunnaisesti hoitoon joko ohjattu pelkästään vehikkeliä (n = 8) tai 45 mg /kg kehon paino NVP-BEZ235 10% 1-metyyli-2-pyrrolidoni /90% PEG 300 (n = 8), jonka päivittäinen letkulla suun kautta 28 päivän ajan. Hoito annos valittiin perustuu kirjallisuuteen osoittaa, että 40-50 mg /painokilo NVP-BEZ235 hoitaa tehokkaasti kasvainten hiirimallissa ilman haittavaikutuksia [15], [24], [26], [28], [32], [ ,,,0],47]. Farmakokineettisten tutkimusten osoittavat maksimaalinen kudoskonsentraatio tunnin kuluttua NVP-BEZ235 hallinto, tuumoreita kantavaa hiirtä tapettiin yhden tunnin kuluttua lopullisen hoitoannoksesta [32]. Paksusuolen kasvaimen arvioitiin käyttäen jarrusatulat (leveys x pituus x korkeus) ja kasvaimet kerättiin sekä western blot analyysi ja immunohistokemia.

Western blot-analyysi

pitoisuudet koko solu tai kasvain lysaatit määritettiin Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad). 10 ug ja 25 ug proteiinia lysaatin koko solun ja kasvaimen, vastaavasti, erotettiin 10% SDS /PAGE-geelillä, siirrettiin nitroselluloosamembraanille, estetty 1% BSA: lla yhden tunnin ajan, inkuboitiin huoneenlämpötilassa kaksi tuntia primaarisen vasta-aineen ja yksi tunti sekundaarisen vasta-aineen. Detektio suoritettiin käyttäen Amersham ™ ECL ™ Western Blot Detection Reagents (GE Healthcare). p-AKT Thr308 (1:1000 laimennus), p-AKT Ser473 (1:2000 laimennus), yhteensä AKT (1:1000 laimennus), p-S6 Ser240 /244 (1:3000 laimennus), p-S6 Ser235 /236 (1:1000 laimennus), S6 (1:1000 laimennus), pilkottiin kaspaasi 3 (1:1000 laimennos), ja pilkotaan PARP (1:1000 laimennos) saatiin Cell Signaling Technologies (Beverly, MA). β-aktiini (1:5000 laimennus) saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Peroksidaasi AffiniPure aasi Anti Rabbit Ig sekundaarisen vasta-aineen (1:10,000 laimennos) saatiin Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) [11].

immunohistokemia

Viisi um parafinoidut kudosleikkeiden poistettiin parafiini ksyleenillä seuraa alkoholin nesteytyksen. Antigeeni haku suoritettiin 1 x sitraattipuskurissa (pH 6,0) (Zymed) käyttäen Medical Decloaking jaosto (biocare Medical). Objektilasit blokattiin huoneenlämpötilassa Peroxidase estoreagenssia (DAKO), normaali aasi /kanin seerumia, ja Avidin /Biotiini Esto Kit (Vector Laboratories). Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen ja 30 minuuttia huoneenlämpötilassa sekundaarisen vasta-aineen. Vectastain ABC -kittiä (Vector Laboratories) käytettiin havaitsemiseen valmistajan ohjeiden mukaisesti. Objektilasit värjättiin Liquid DAB + Alustan Kromogeeni System (Dako) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä ratkaisu ja Scottin sinistämisaineita ratkaisu. p-AKT Ser473 (1:50 laimennus), p-S6 Ser240 /244 (laimennos 1:50), p-S6 Ser235 /236 (1:100 laimennus), saatiin Cell Signaling Technologies (Beverly, MA). CD31 (1:100 laimennus) saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). KI-67 (1:100 laimennos) saatiin US Biological (Swampscott, MA). TUNEL määritys (Apoptag) hankittiin Millipore (Billerica, MA) [11]. KI-67 leviämisen indeksi laskettiin keskimääräinen lukumäärä KI-67-positiivisia soluja /kokonaismäärä rauhas solua suuritehoiset alalla (keskiarvo 16 HPF) x 100, ja mikroverisuonitiheys (MVD) laskettiin määrä CD31-positiivisia soluja per suuritehoiset alalla (keskiarvo 16 HPF). TUNEL positiivisuus indeksi laskettiin keskimääräinen lukumäärä TUNEL positiivisten solujen /kokonaismäärä rauhas solua suuritehoiset alalla (keskiarvo 16 HPF) x 100. Mittaukset suoritettiin kolme sokaissut, riippumattomien tarkkailijoiden neljässä ohjaus ja neljä käsitellään kasvaimia.

Tilastot

vertaaminen lopulliseen kasvaimen tilavuuden, KI-67, MVD, ja apoptoottisten solujen välillä ohjaus ja NVP- BEZ235-käsitelty ryhminä laskettiin käyttäen kaksisuuntaisia ​​Independent-Samples T Test. Pre- ja jälkikäsittely TSI arvot verrattiin Wilcoxonin-rank-testi. P 0,05 katsottiin merkitseväksi kaikissa analyyseissä. Kaikki analyysit laskettiin SPSS 18.0 for Windows (IBM, Inc).

Tulokset

In vitro

NVP-BEZ235 hoitoon ihmisen CRC solulinjojen vähenee solujen lisääntymistä, mutta on ole vaikutusta apoptoosiin

vaikutusten tutkimiseksi

in vitro

NVP-BEZ235 hoito cellular elinkelpoisuuden kolmen ihmisen CRC solulinjoissa (HCT116, DLD-1, ja SW480) käsiteltiin yhä määriä NVP-BEZ235 48 tuntia, ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin kolorimetrisellä MTS-määritys. Nämä tutkimukset paljastivat samanlaisia ​​annoksesta riippuvainen lasku elinkyky NVP-BEZ235 hoitoa (keskiarvo IC

50 kolmen erillisen kokeen = 14,3 ± 6,4, 9,0 ± 1,5, ja 12,0 ± 1,6 nM HCT116, DLD-1, ja SW480 solulinjoissa, vastaavasti; p = 0,74) ja kaikki kolme solulinjoissa (kuvio 1A). Sen määrittämiseksi, havaittu lasku solujen elinkyky NVP-BEZ235 hoito aiheutunut apoptoosi western blot analyysi lohkaistaan ​​kaspaasi-3 ja halkaistut PARP suoritettiin, paljastaa ei lisätä näissä apoptoottista merkkiaineiden kanssa NVP-BEZ235 käsittely (kuvio 1 B ). Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että

in vitro

hoidon NVP-BEZ235 tuloksia vastaavalla laskua soluproliferaatiokokeessa kahdessa CRC solulinjoissa kätkeminen selvä

PIK3CA

mutaatioita (HCT116 ja DLD-1) sekä

PIK3CA

villityypin peräsuolen syöpäsolun (SW480), joilla ei ole vaikutusta apoptoosiin.

(A) solujen elinkelpoisuus HCT116, DLD-1, ja SW480 CRC solu viivat arvioitiin MTS-määritys hoidon jälkeen kasvavien pitoisuuksien kanssa (0-500 nM) NVP-BEZ235 48 tunnin ajan. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) Western blot analyysi p-AKT

Thr308, p-AKT

Ser473, p-S6

Ser240 /244, p-S6

Ser235 /236, halkaistut kaspaasi 3, ja pilkotaan PARP suoritettiin sen jälkeen, kun 2, 6, 24, ja 48 tunnin inkuboinnin (-) 0 tai (+) 500 nM NVP-BEZ235.

In vitro

NVP-BEZ235 hoitoon ihmisen CRC solulinjoja johtaa jatkuva mTORC1 ja mTORC2 esto, mutta ohimenevää PI3K saarto

vaikutusten tutkimiseksi

in vitro

NVP-BEZ235 kohtelu PI3K (p-AKT

Thr308) , mTORC1 (p-S6

Ser235 /236 ja p-S6

Ser240 /244), ja mTORC2 (p-AKT

Ser473) mTOR signalointi, western blot-analyysi suoritettiin. Kahden tunnin NVP-BEZ235 hoidon tasoa p-AKT

Thr308, p-AKT

Ser473, p-S6

Ser235 /236, ja p-S6

Ser240 /244 olivat kaikki merkittävästi vähentynyt. Kun taas jatkuvaa vähenemistä havaittiin tasot p-AKT

Ser473, p-S6

Ser235 /236, ja p-S6

Ser240 /244, täysi esto p-AKT

Thr308 oli menetetty niin vähän kuin kuusi tuntia (kuvio 1 B). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että

in vitro

NVP-BEZ235 käsittely johtaa jatkuvan eston mTORC1 ja mTORC2 signalointia, mutta PI3K saarto on ohimenevä.

teho

in vitro

NVP-BEZ235 hoitoon ihmisen CRC solulinjoista ei riipu PIK3CA mutaatiostatuksesta riippumatta

vertailukelpoinen tehokkuus NVP-BEZ235 hoitoa

PIK3CA

mutantti (HCT116 ja DLD-1) ja

PIK3CA

villityypin (SW480) ihmisen CRC solulinjoja viittaa siihen, että sen kliininen tehokkuus ei välttämättä rajoitu niille potilaille, joiden kasvaimet sisältävät aktivoimalla

PIK3CA

mutaatioita. Tehtäväksi tarkastella tätä mahdollisuutta, olemme arvioineet vaikutusta NVP-BEZ235 on solujen lisääntymistä ja solunsisäisen solusignaloinnille pariksi

PIK3CA

mutantti ja villityypin solulinjoilla.

PIK3CA

mutantti solulinja oli peräisin DLD-1 hajottamalla villityypin

PIK3CA

alleelin kohdennetuilla homologisella rekombinaatiolla, kun taas

PIK3CA

villityypin solu linja johdettiin hajottamalla mutantti

PIK3CA

alleeli (ystävällinen lahjoitus B. Vogelstein) [7]. Sellaisenaan, geneettinen koostumus näiden solujen eroaa vain

PIK3CA

lokukseen, jolloin nämä muuten täydellinen isogeenisiin valvontaa. Löysimme samanlainen IC50: t NVP-BEZ235 sekä

PIK3CA

mutantti ja villityypin DLD-1-solut (keskiarvo IC

50 kolmen erillisen kokeen = 15,1 ± 6,0 ja 12,1 ± 4,3 nM DLD-1

PIK3CA

mutantti ja villityypin solulinjat, vastaavasti; p = 0,82, kuvio 2A). Western blot-analyysi p-AKT ja p-S6 paljasti jatkuva inhibitio p-AKT

Ser473, p-S6

Ser235 /236, ja p-S6

Ser240 /244; kuitenkin, inhibitio p-AKT

Thr308 oli ohimenevä molemmissa solulinjoissa (kuvio 2B). Lisäksi NVP-BEZ235 hoito ei lisätä tasoa pilkottiin kaspaasi-3 ja pilkottiin PARP joko solulinjassa (kuvio 2B). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että

PIK3CA

mutaatiostatuksesta riippumatta ei ennusta tehoa NVP-BEZ235 hoitoa ihmisen CRC solulinjoissa.

(A) Solujen elinkelpoisuus mutantti ja villityypin isogeenisistä

PIK3CA

solut määritettiin MTS-määrityksellä sen jälkeen, kun hoidon kasvavien pitoisuuksien kanssa (0-500 nM) NVP-BEZ235 48 tunnin ajan. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo neljästä riippumattomasta kokeesta. (B) Western blot analyysi p-AKT

Thr308, p-AKT

Ser473, p-S6

Ser240 /244, p-S6

Ser235 /236, halkaistut kaspaasi 3, ja pilkotaan PARP suoritettiin jälkeen 2, 6, 24, ja 48 tuntia inkubaation (-) 0 tai (+) 500 nM NVP-BEZ235.

In vivo

NVP-BEZ235 hoito indusoi kasvainregressio on GEM malli satunnaista PIK3CA villityypin CRC

vaikutusten tutkimiseksi

in vivo

NVP-BEZ235 hoito paksusuolen kasvaimen kasvuun, käytimme uusi GEM malli satunnaista CRC että olemme viime aikoina kuvattu [11]. Adenovirus ilmentävät Cre rekombinaasia (adeno-Cre) synnyttämiseen käytettiin paksusuolen kasvaimia Floxed

APC

hiirillä. Kasvaimia 10 hiiret analysoitiin läsnäolon aktivoivien mutaatioiden suoralla sekvensoinnilla eksonien 9 ja 20

Pik3ca

geenin. Ei mutaatioita tunnistettiin, mikä viittaa siihen, että nämä hiiret edustavat

PIK3CA

villityypin CRC. Optinen colonoscopy käytettiin Satunnaista hoitoon vertailukelpoisella kokoinen koolonikasvainten ohjaus- lääkkeen ajoneuvon tai 45 mg /kg NVP-BEZ235 päivittäin letkulla suun kautta 28 päivän ajan. Totesimme ei toksisuutta tai sivuvaikutuksia aikana lääkehoitoa hoito. Myöhemmät pitkittäinen kasvua tai taantumista yksittäisten paksusuolen kasvainten määritettiin optinen kolonoskopia, kuten aiemmin on kuvattu [11]. Kunkin kasvain, suhteellinen kasvaimen kokoa Index (TSI) metrinen laskettiin kasvaimen kokoa (T) normalisoitu paksusuolen luminaaliselle alue (L) (kuvio 3A).

Hiiret koolonikasvainten satunnaistettiin hoitoon ohjaus laimenninta (N = 8) tai 45 mg /kg NVP-BEZ235 (N = 8), päivittäin suun kautta letkulla on 28 päivää. Tuloksena paksusuolen kasvaimen kasvua tai taantumista sarjalaimennettiin tutkittiin optisella kolonoskopia. (A) Kasvaimen koko Index (TSI) laskettiin Kasvaimen Area (T) jaettuna Lumen Area (L) x 100. (B) edustaja kasvain colonoscopy stillkuvia aikana 28 päivän hoitojakson ajan. (C) Kasvaimen tilavuus valvonta- ja NVP-BEZ235 saaneista kasvaimia ruumiinavauksessa (keskiarvo 65 mm

3 vs. 5 mm

3; p = 0,01). (D) Lopullinen TSI vs. kasvaimen tilavuus (R

2 = 0,89, P 0,0001). Muutos keskiarvo TSI (E) kontrolli (32% esikäsittely vs. 57% jälkikäsittelyä, P = 0,01) ja (F) käsiteltiin (32% vs. 20%, P = 0,02) ikäryhmät.

edustaja ajankulku kolonoskopia kuvien ohjaus (n = 8) ja NVP-BEZ235 saaneista kasvain (n = 8) on esitetty kuviossa 3B. Kasvaimen tilavuus ruumiinavauksessa oli merkittävästi suurempi ohjaus vs. testiryhmään (65 mm

3 vs. 5 mm

3; p = 0,01, kuvio 3C). Mukaisesti edellisessä analyysit [11], lopullinen TSI molemmissa hoitoryhmissä korreloi positiivisesti kasvaimen ruumiinavauksessa (R

2 = 0,89, p = 0,0001, kuvio 3D). Keskimääräinen TSI kontrolliryhmässä huomattavasti hoitojakson aikana (32% esikäsittely vs. 57% jälkikäsittelyä, p = 0,01, kuvio 3E), kun taas että NVP-BEZ235 kohortti vähensi merkittävästi (36% vs. 20%, p = 0,008, kuvio 3F). Jokainen kasvain kontrolliryhmässä kasvoi koko; käsitellyt tuumorit kaikki koko pieneni. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että

in vivo

hoidon NVP-BEZ235 johtaa merkittäviin heikentämiseen

PIK3CA

villityypin koolonikasvainten.

In vivo

NVP-BEZ235 hoitoon GEM mallin satunnaista CRC tulosten mukaan kestäviin mTORC1 ja mTORC2 esto, mutta ohimenevää PI3K saarto

vaikutusten tutkimiseksi

in vivo

NVP-BEZ235 käsittely PI3K ja mTOR signalointi, western blot-analyysi suoritettiin koolonikasvainten että korjattu tunnin kuluttua lopullisen lääkkeen annostelun päivinä 5 ja 28 hoidon. Western blot analyysi tasot p-AKT

Thr308, p-S6

Ser240 /244, ja p-AKT

Ser473 suoritettiin kuten korvikkeita aktivointi PI3K, mTORC1, ja mTORC2 polkuja, vastaavasti. Jatkuvaa alenemiset p-AKT

Ser473 ja p-S6

Ser240 /244 havaittiin kasvainten käsiteltyjen hiirien NVP-BEZ235, verrattuna kont- laimennusainetta (kuvio 4A ja 4B). Nämä havainnot varmistettiin kasvaimen immunohistokemiallisesti (kuvio 4C). Kuten meidän

in vitro

tutkimuksissa aluksi alenemiset p-AKT

Thr308 havaittiin viisi päivää hoidon jälkeen, mutta normalisoitu 28 päivää (kuviot 4A ja 4B). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että

in vivo

NVP-BEZ235 hoitotuloksia jatkuvan eston mTORC1 ja mTORC2, mutta ohimenevää PI3K saarto.

Hiiret koolonikasvainten satunnaistettiin hoitoon ohjaus laimennusaineen tai 45 mg /kg NVP-BEZ235 päivittäin suun kautta letkulla viiden päivän ajan. Western blot-analyysi p-AKT

Thr308, p-AKT

Ser473, ja p-S6

Ser240 /244 suoritettiin kasvaimia käsiteltiin (-) kontrolli laimennusaineen tai (+) NVP-BEZ235 varten ( A) viisi ja (B) 28 päivää. (C) Immunohistokemia p-AKT

Ser473, p-S6

Ser240 /244, ja p-S6

Ser235 /236 suoritettiin käsitellyt kasvaimet ohjaus laimentimen tai NVP-BEZ235 varten 28 päivää.

In vivo

NVP-BEZ235 hoitoon GEM malli satunnaista CRC estää proliferaatiota, sillä ei ole vaikutusta apoptoosiin, ja lohkot tuumoriangiogeneesi

vaikutusten tutkimiseksi on

in vivo

NVP-BEZ235 hoidon soluproliferaation, paksusuolen kasvaimet tutkittiin immunohistokemiallisesti varten leviämisen merkki KI-67. Tämä analyysi paljasti, että nopea lisääntyminen väheni 56% 28 päivän jälkeen NVP-BEZ235 hoitoa (p = 0,003, kuvio 5A). Vaikutuksen arvioimiseksi NVP-BEZ235 hoito cellular apoptoosiin, paksusuolen kasvaimet tutkittiin TUNEL määrityksessä. Mitään eroja ei nähty välillä käsitellyt kasvaimet ohjaus laimennusainetta ja NVP-BEZ235 (p = 0,9, kuvio 5B). Koska PI3K ja mTOR polkuja on merkittävä rooli tuumorin angiogeneesissä [54], [55], tutkimme vaikutuksia NVP-BEZ235 kohtelu mikroverisuonitiheys (MVD) kautta immunohistokemiaa varten endoteelimerkkiaineelle CD31. Tämä analyysi paljasti, että MVD laski 75% 28 päivän jälkeen NVP-BEZ235 hoitoa (p = 0,013, kuvio 5C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että

in vivo

hoidon NVP-BEZ235 johtaa merkittävään väheneminen kasvaimen leviäminen, ei indusoi solujen apoptoosia, ja estää kasvaimen angiogeneesiä.

(A) edustaja immunohistokemia varten leviämisen merkki KI-67 hoidon jälkeen ohjaus laimentimen tai NVP-BEZ2355 28 päivän (p = 0,003). KI-67 leviämisen indeksi laskettiin keskimäärin positiivisia kasvainsoluja kohti suuri teho kenttään. (B) TUNEL immunohistokemia suoritettiin käsitellyt kasvaimet ohjaus laimentimen tai NVP-BEZ235 28 päivän (p = 0,9). TUNEL värjäys määrällisesti prosenttia positiivisia soluja per suuritehoinen kenttään. (C) edustaja immunohistokemiaa endoteelisolujen markkerin PECAM hoidon jälkeen ohjaus laimentimen tai 45 mg /kg NVP-BEZ2355 (p = 0,013). Mikroverisuonitiheys laskettiin keskimäärin positiivisia suonia kohti suuri teho kenttään.

Keskustelu

Koska niiden keskeinen rooli taudin alkamisen ja etenemisen CRC, saarto mTOR ja PI3K signalointireiteissä on tullut pakottavia tavoite kehittää uusia CRC terapeuttisten [10], [56] – [59]. Me ja muut ovat osoittaneet tehoa mTORC1 reitin esto prekliinisissä CRC malleissa [11], [12]. Kuitenkin varhainen kliininen tutkimus tutkii mTORC1 estäjiä ihmisen CRC potilailla osoitti vaatimattomia tuloksia, mikä johtuu ehkä se menettää mTORC1 riippuvan takaisinkytkentäsilmukka, joka rajoittaa PI3K aktivointia ja /tai jatkaa mTORC2 aktivaatio AKT [3], [60]. Yhdessä se näyttää dual PI3K /mTOR-inhibiittorit, kuten NVP-BEZ235, tarvitaan maksimaalisen terapeuttisen tehon.

Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että

PIK3CA

mutantti syöpiä ”onkogeenisesti koukkuun” ja PI3K signalointi, mikä lisää herkkyyttä PI3K estäjähoidosta [7], [61], [62]. Kuitenkin yksi ryhmä on raportoinut yhdistyksen välillä

PIK3CA

mutaatiostatuksesta riippumatta ja vastaus PI3K-estäjien [63]. Kuitenkin toinen ryhmä on raportoinut yksinomaan kohdistaminen

PIK3CA

mutantti potilaita PI3K /mTOR hoito [64]. Kuten

PIK3CA

mutaatiot ovat nähneet vain 17% ihmisen CRC, tämä lähestymistapa rajoittaisi merkittävästi kliinistä vaikutusta näiden aineiden [53]. Koska NVP-BEZ235 yhtä estää mutantin ja villityypin muotojen

PIK3CA

, me arveltu, että NVP-BEZ235 olisi merkittävää tehoa ihmisen villityypin

PIK3CA

CRC [32]. Tämän tueksi, löysimme verrattavissa herkkyys

in vitro

NVP-BEZ235 hoitoa

PIK3CA

mutantti (HCT116, kinaasialue mutaatio, DLD-1, kierrejouset domain mutaatio) ja

PIK3CA

villityypin (SW480) CRC solulinjoissa, sekä Hyväksytty

PIK3CA

mutantti ja villityypin isogeenisiin solulinjoja. Suora sekvensointi hot spot alueita eksonit 9 ja 20

Pik3ca

paksusuolen kasvaimissa validoitu meidän GEM mallin korvikkeena

PIK3CA

villityyppisen CRC, jota käytimme meidän

in vivo

NVP-BEZ235 hoitotutkimuksissa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että NVP-BEZ235 hoito voi olla kliinistä hyötyä 83% CRC potilaista villin tyypin

PIK3CA

. Arvioidaan tarkemmin tätä ominaisuutta, me halunnut tutkia NVP-BEZ235 olisivat tehokkaita GEM malli satunnaista

PIK3CA

villityypin CRC.

Perinteinen

in vivo

tavoite validointi lähestymistavat luottavat ksenograftin alustoilla. Valitettavasti nämä mallit eivät ole aidosti ennustavia vasteen ihmisen potilaille, koska ne ovat peräisin korkea passage kasvainsolulinjoissa kasvanut

in vitro

. Nämä solulinjat istutetaan kohdunulkoinen sivustoja, jotka eivät muistuta paksusuolen microenvironment, ja siksi eivät kerrata epäyhtenäisyyttä syövän ja sen tukeminen strooman [65]. Vaikka GEM syöpä malleissa nämä puutteet, useimmat GEM mallit käyttävät ituradan tai kudokseen laajuinen muutos geenien tiedetään mutatoitunut ihmisen CRC. Lisäksi monet CRC GEM malleja pääasiassa läsnä ohutsuolen kasvaimia [66]. Tarkasti mallintaa ihmisen satunnaista CRC, olemme hiljattain kuvattu menettely, jossa adeno-Cre annetaan Floxed hiiriin somaattisesti inaktivoimiseksi

APC

geenin stokastinen tavalla ja rajoittaa kasvainten muodostumisen distaaliseen paksusuolen. Toistettavan anatominen sijainti näistä kasvaimista sallii optisten kolonoskopia käsitellä yksittäisiä kasvaimia pituussuunnassa muoti [11].

Tutkia tehoa

in vivo

NVP-BEZ235 hoito, me käytetyt meidän GEM malli satunnaista CRC. Meidän tutkimuksissa, oli voimakas korrelaatio lopullinen kasvaimen kokoa arvioidaan kolonoskopiaan versus ruumiinavauksessa (R

2 = 0,89), mikä validointi meidän kolonoskopia-pohjainen kasvaimen koon protokolla. Mukaisesti meidän

in vitro

NVP-BEZ235 hoitoon ihmisen CRC solulinjoissa, koolonikasvainten GEM mallista laski 43% kooltaan jälkeen

in vivo

hoidon NVP-BEZ235, kun taas kontrollituumoreilla kasvanut kooltaan 97% (p 0,0001). Samanlaisia ​​havaintoja on raportoitu toisen dual PI3K /mTOR-estäjä, PKI-587, vuonna ksenograftimallia CRC [67].