Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kemoterapia käytetään yleisesti syövän hoitojen, mutta vain 25% syövistä ovat herkkiä ja merkittävä osa kehittyy vastus. P53 kasvain vaimennin on erittäin tärkeää syövän kehityksen ja hoito, mutta on ollut vähemmän vastaanottavaisia ​​terapeuttisia sovelluksia monimutkaisuuden vuoksi sen toiminta, heijastuu 66000 papereita kuvataan sen toimintaa. Täällä tarjoamme järjestelmällistä lähestymistapaa integroida tätä tietoa rakentamalla laajamittainen looginen malli p53 interactome käyttää laajaa tietokantaa ja kirjallisuuden yhdentymistä. Malli sisältää 206 solmut edustavat geenejä tai proteiineja, DNA-vaurioita syöttö, apoptoosin ja solujen vanhenemista lähdöt, joita yhdistää 738 looginen vuorovaikutusta. Ennustuksia

in silico

läpilyöntiaihioilla ja vakaan tilan mallin analyysi validoitiin käyttäen kirjallisuushakuja ja

in vitro

perustuu kokeisiin. Tunnistamme säätelyä Chk1, ATM ja ATR reittejä p53 negatiivisissa soluissa ja 61 muita ennusteita saadaan tyrmäyksellä testejä matkimalla mutaatioita. Vertailu mallisimulaatiot kanssa microarray tiedot osoittivat huomattavan onnistuneiden ennusteita vaihtelee 52% ja 71% riippuen syövän tyypistä. Kasvutekijät ja reseptorit FGF2, IGF1 R, PDGFRB ja TGFa havaittiin tekijöitä selektiivisesti valvontaan U2OS osteosarkooman ja HCT116 paksusuolen syövän solujen kasvua. Yhteenvetona, tarjoamme periaatteen todiste, että tämä monipuolinen ja ennustava malli on valtava potentiaali käytettäväksi syövän hoidossa tunnistamalla väyliä yksittäisillä potilailla, jotka edistävät kasvaimen kasvua, joka määrittää sub väestö ”korkea” hoitovasteen ja tunnistaminen muutoksia reittejä mikä kemoterapian resistenssin.

Citation: Tian K, Rajendran R, Doddananjaiah M, Krstic-Demonacos M, Schwartz JM (2013) Dynamics DNA aiheuttaman vaurion Pathways to Cancer. PLoS ONE 8 (9): e72303. doi: 10,1371 /journal.pone.0072303

Editor: Peter Csermely, Semmelweis University, Unkari

vastaanotettu: toukokuu 20, 2013; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2013; Julkaistu: 04 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Tian et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos University of Manchester Intellectual Property rahoitusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

p53-proteiini on ollut yksi eniten tutkittu proteiineilla, koska sen paljastumisen vuonna 1979. Se on keskeisessä asemassa sääntelyn solujen eloonjäämistä ja syövän kehittymisen; p53 mutaatioita esiintyy yli 50% ihmisen kasvaimista ja muutoksia tai puute p53-toiminto on yhdistetty useimpien syöpäsolujen. P53-proteiini toimii transkriptiotekijä, joka säätelee ilmentymistä useita alavirran geenien monimutkaisia ​​mekanismeja, [1]. Se on antiproliferatiivisia vaikutuksia, kuten solusyklin pysähtymisen, apoptoosin, ja solun vanhenemista vasteena erilaisten stressi- signaaleja. Lisäksi p53 on kriittinen solmu matkapuhelinverkon piiri mukana fysiologinen vaste kasvutekijöitä tai epänormaali onkogeenisten ärsykkeisiin. Translaation jälkeiset modifikaatiot, proteiini-proteiini-vuorovaikutusten ja proteiinien stabiloimiseksi on todettu olevan ratkaiseva tasoja p53: n kontrollin aktiivisuus.

Kuitenkin, huolimatta sen keskeinen rooli p53 on huonommin terapeuttisiin sovelluksiin kuin muut kohde- geenien tai proteiinien että menestyksekkäästi hyödynnetään syövän hoitojen [2]. Ymmärrys p53-reitin mekanismien on sekä akateemisen ja kaupallista etua varten suunnittelemaan uusia syövän hoitomuotoja ja valinta turvallisempien syöpälääkkeen ehdokkaiden [3]. Suurin syy, miksi se on ollut niin vaikea hyödyntää tietämystä p53 terapeuttisia sovelluksia on todellakin monimutkaisuudesta sen toimintaa. On yli 66000 lehdistä p53 tieteellisessä kirjallisuudessa, mutta olemme vielä kaukana ymmärrystä yksityiskohdista sen funktio. Tämä havainto edellyttää systemaattisempaa lähestymistapaa integroida tämän valtavan määrän informaatiota johdonmukainen esityksiä, jotka mahdollistavat paremman käsityksen järjestelmien laajuisen sääntelymekanismeissa p53-toiminto.

Verkko ja systeemibiologian lähestymistapoja tarjoavat lupaavia uusia työkaluja tutkia monimutkaisia ​​mekanismeja mukana tautien kehitystä [4].

In silico

malleissa voidaan integroida suurien tietomäärien molekyylivuorovaikutusten osaksi johdonmukaisia ​​esityksiä, vastaanottavaisia ​​systemaattinen testaus ja ennakoivan simulaatioita. Malleja eri mittakaavoissa ja laskennallisen monimutkaisuuden kehitetään, mistä laadullinen verkko esityksiä määrällisiä kineettistä ja stokastisia malleja [5] – [7]. Kun kyseessä on p53, valtava määrä ja monimutkaisuus molekyylivuorovaikutusten mukana tekee laajamittainen kineettisen mallin ulottumattomissa. Kuitenkin valtava määrä biologisia tieto on käytettävissä p53, joka ei ole muodossa kvantitatiivisen kineettisen datan, mutta muodossa laadullista tietoa. Esimerkiksi useat raportit osoittivat, että ATM (ataksia teleangiektasia mutatoidun) vaikuttaa p53 vastauksena DNA vaurioita [8]. Vaikka 1350 julkaisut kuvaavat yhteyden ATM ja p53 PubMed, 57 paperit osoittavat, että ATM fosforyloi p53 ja vain 11 paperit sisältää tiedot, joita ATM fosforyloi ja aktivoi p53. Samoin esimerkkejä alavirran p53 kohdegeenien, kuten Bax (BCL2 liittyvä X proteiini), jotka kontrolloivat apoptoosin prosessin tai CDKN1A (sykliiniriippuvainen kinaasiestäjän 1A (p21, CIP1)), jotka ohjaavat solusyklin pysähtymiseen ovat hyvin tutkittu [9], [10]. Kuitenkin yksityiskohtainen kinetiikka vain osa näiden vuorovaikutusten tiedetään [11].

Tästä syystä me arveltu, että ymmärrystämme p53 toiminto voidaan parantaa järjestelmällisesti sisällyttämään tällaisen laadullisen tiedon isoon mittakaavaisia, johdonmukainen loogista mallia. Toisin kineettistä mallia, loogiset mallit eivät käytä kineettistä yhtälöt edustavat yksityiskohtainen dynaaminen mekanismi kunkin yksittäisen vuorovaikutuksen, mutta toisin kuin laadullisia verkostoja, ne sisältävät tietoa vaikutuksista vuorovaikutusta. Tämä tieto on yleensä edustettuna muodossa Looginen: jokainen solmu (geeni /proteiini) on loogista mallia voi olla kaksi määrätietoisesti valtiota, 0 tai 1, joka edustaa ei-aktiivinen tai aktiivinen muoto vastaavasti; kukin vuorovaikutus voi olla kaksi määrätietoisesti vaikutuksia, aktivointia tai esto Kohdesolmussa. Edut looginen mallit ovat, että simulaatiot ovat nopeasti jopa suuria malleja, ne mahdollistavat laajan tutkia tilaa solmun valtioiden tunnistaminen vakaa valtioiden tai pyöräily attractors, ja ne tarjoavat lähentämisestä todellisen epälineaarinen dynamiikkaa koko järjestelmän . Esimerkiksi Schlatterin ryhmä rakensi Boolen verkko perustuu kirjallisuuteen haut ja kuvattu käyttäytymistä sekä ulkoisen ja sisäisen apoptoosin väyliä vastauksena erilaisiin ärsykkeisiin. Niiden malli paljasti tärkeyttä ylikuulumisen ja takaisinkytkennät säätelyssä apoptoottisten reittien [12]. Rodríguez et ai. rakennettu suuri Boolen verkosto FA /BRCA (Fanconin anemia /Rintasyöpä) reitin ja simuloituja korjaamiseen DNA ICLs (säikeiden- ristisidosten). Tämä malli paljasti suhdetta aktivoitua DNA korjaukseen liittyvä reitti ja puutteita FA /BRCA-reitin [13].

Tässä artikkelissa esittelemme loogista mallia p53, joka integroi 203 geenit /proteiineja, DNA vahinko tulo, apoptoosin ja solujen vanhenemista lähdöt, joita yhdistää 738 looginen vuorovaikutusten koottu olemassa olevista tietokannoista ja tieteellisessä kirjallisuudessa. Malli, jäljempänä nimeltään PKT206 (PKT seisomaan p53 mallin konstruoida Kunin Tian, ​​ja numero ilmaisee väestön proteiinin tai geenin solmua mallissa) voidaan käyttää ennustamaan vaikutuksia DNA-vaurion reittien päälle solujen kohtaloa. Esitämme toiminnallinen analyysi tämän mallin ja vaikutusten tutkiminen aihiot käyttämällä CellNetAnalyzer ohjelmistoa [14]. Useat ennusteet tuotettu malli on validoitu ulkopuolisilta kirjallisuudesta ja uutta kokeellista tietoa, lisäämällä uusia maksuja tietämystämme p53-järjestelmän. Mallin suorituskyky testattiin mikrosiruanalyysi ja osoitamme, että suhde hyviä ennusteita huomattavasti suurempi kuin satunnainen ennustukset, jotka vaihtelevat välillä 52% ja 71%. On havaittu, että PKT206 malli on lupaava ennakoiva työkalu, joka voi lisätä ymmärrystä monimutkaisia ​​mekanismeja p53 polkuja ja tarjoaa uuden lähestymistavan yksilöllisiä syöpähoidon.

Tulokset

Malli rakentaminen

jotta järjestää tuntemus p53 interactome yhtenäiseksi kehyksen, looginen malli p53 järjestelmän rakennettiin (kuvio 1, taulukko S1 File S1). Tässä mallissa solmut edustavat geenejä tai liittyviä proteiineja, jotka vuorovaikuttavat p53, ja reunat ovat niiden vuorovaikutussuhteet. Kahdenlaisia ​​vuorovaikutuksessa menetelmää pidetään: aktivoimalla tai estämällä. Kun aktivointi vuorovaikutuksen tuloksena on induktio aktiivisuuden kohdesolmun (s), ja on inhiboiva vuorovaikutuksen tuloksena on tukahduttaminen aktiivisuuden kohdesolmun (t) [14]. Esimerkiksi, induktio p53 stimuloi ilmentymistä MDM2 (MDM2, p53 E3 ubikitiini-proteiinin ligaasia homologi (hiiri)) [15], joka edustaa aktivoivan vuorovaikutusta p53: MDM2. Samalla, MDM2 aktivointi johtaa alas-säätely p53, joka edustaa estävänä vuorovaikutuksen MDM2 ja p53 [16].

Java käyttöliittymä ohjelmat luotiin poimia p53 vuorovaikutusten päässä STRING tietokannasta . Me sitten manuaalisesti kuratoi data ja käytetyt Gene ontologia merkinnät yhteyden verkon DNA-vaurioita tulo ja apoptoosin lähdön. CellNetAnalyzer käytettiin analyysiin ja simulaatioita, ja tulokset validoitiin käyttäen kirjallisuuden tutkimukset ja kokeellisten tutkimusten mukaan lukien western blotting ja mikrosiruanalyysillä.

Vaikka on olemassa lukuisia tietokantoja, joihin tallennetaan geneettisiä ja proteiini-proteiini vuorovaikutusten, muutaman levy- vaikutus vuorovaikutus on kohde-solmussa. Merkittävä poikkeus on STRING (Hae Työkalu nouto Vuorovaikutus Genes /proteiinit) tietokantaan [17], jossa erotellaan eri toimintatapoja, kuten aktivoinnin esto ja sitova. Vuorovaikutus kirjaa ihmisen p53 interactome ensin hakea automaattisesti STRING tietokannasta (ks Materiaali ja menetelmät). Vuorovaikutuksia suodatettu säilyttäen korkea luottamus tulokset määrittelemien STRING (yli 0,7). Kuitenkin, koska rajoitukset nykyisen tekstin kaivausmenetelmiä tunnistamisessa toimintatapoja, jopa antoi korkean luottamuksen vuorovaikutukset todettiin sisältävän joitakin virheitä. Jotta vältettäisiin virheelliset tiedot sisällytetään malliin, kaikki vuorovaikutus ennätyksiä siis manuaalisesti kuratoi kartoittamalla liittyvä kirjallisuus ja etsivät lisänäyttöä. Esimerkkejä erityyppisistä havaittujen virheiden ja yksityiskohdat vuorovaikutusta, joka korjattiin jälkeen manuaalinen curation prosessi on esitetty Taulukossa 2 ja kuvioissa S1-S4 File S1.

toistuva kysymys rakentamiseen

in silico

malleissa on määritellä rajat järjestelmän. Saadakseen täydellisen kattavuus p53 interactome, mutta pitää koko järjestelmän hyväksyttävissä rajoissa simulointiin, me mukana kaikissa korkean luottamus vuorovaikutus geenien /proteiinien vuorovaikutuksessa suoraan p53, ja lisännyt kaikki vuorovaikutukset näiden geenien /proteiinien joihin ei liity p53 suoraan. Tämä prosessi varmistaa, että sääntely takaisinkytkennät sisällytettiin malliin. Muutamissa tapauksissa eri proteiinit yhdistettiin yhdeksi solmuun mikä osoittaa, että aikaisempi kirjallisuus ei pysty erottamaan niitä toisistaan: tämä päti HRAS (v-Ha-ras, Harvey rotta sarkooma viruksen onkogeenin homologi), KRAS (v- Ki-ras2, Kirsten rat sarkooma viruksen onkogeenin homologi), sääntelyviranomaisten (neuroblastooma RAS viruksen (v-ras) onkogeeni homologi) ja RASD1 (RAS, deksametasoni-indusoitu 1), esittää yhtenä solmu RAS; CCNA1 (sykliini A1) ja CCNA2 (sykliini A2) edustettuina CCNA; CSNK2A1 (kaseiinikinaasi 2, alfa 1-polypeptidiä) ja CSNK2A2 (kaseiinikinaasi 2, alfa ’polypeptidi) edustettuina CSNK2.

Solut täyttää monenlaisia ​​stressiä ärsykkeisiin kuten ionisoivan ja UV (ultravioletti) säteily, onkogeeni aktivointi, lämpö sokki, hypoksia, jne [18]. DNA vaurioita vastaus välittämä p53 on hyvin tutkittu ja useimmat kliinisesti merkityksellisiä, koska suurin osa syövän hoidossa strategioihin liittyy DNA-vaurioita reittejä. Näin ollen, DNA-vaurio lisättiin tulosignaalin yhdistää verkon yhteen tulosolmuun, jotka edustavat DNA-vaurioita. Samoin apoptoosin ja solujen vanhenemista valittiin parhaiten tutkittu ja kliinisesti relevantteihin tuotoksiin joukossa lukuisia muita mahdollisuuksia kuten solusyklin pysähtymiseen, DNA: n korjaukseen angiogeneesiä. Siten verkko oli kytketty kaksi lähtösolmut edustavat apoptoosin ja vanhenemista. Linkit DNA-vaurioita ja kohti apoptoosin ja vanhenemista oli kuratoinut käyttäen Gene ontologia termejä (taulukot S3-S5 File S1) sekä muita manuaalinen kuratointiin. Tuloksena malli, nimeltään PKT206, käsitti 203-geeni /proteiini solmuja, tulo solmu (DNA-vaurioita), kaksi lähtösolmut (apoptoosin ja vanhenemista) ja 738 vuorovaikutusta. Täydellinen luettelo geenien /proteiinien ja vuorovaikutus kirjallisuusviittauksista perustuvaa näyttöä annetaan taulukoissa S1 ja S3-S5 File S1.

rakenne p53 loogista mallia

p53 solmu on kytketty 202 geeneihin tai proteiineihin, verkon ja osallistuu 225 vuorovaikutusta (kuvio 2). Viisi kerrosta voidaan erottaa verkon suhteen mukaisesti solmujen p53: tulosignaalin, DNA-vaurion; ylävirran solmujen p53; p53 itse ja MDM2; alavirran solmujen p53; ja lähdöt, apoptoosin ja vanhenemista. Todettiin, että 67 solmut toimi ylävirran solmujen p53. Esimerkiksi ATM toimii DNA-vaurioita indusoituvan solmu ylävirtaan p53 [19]; se aktivoi p53 suoraan kautta sekä CHEK2 (Checkpoint kinaasi 2) ylössäätöä [20] – [22]. 146 solmut toimi p53 kohdegeenien, kuten hyvin tutkittu pro apoptoottinen geenejä kuten BAX [9] ja CDKN1A joka ohjaa solukierron pysähtymisen [23]. 11 geenit toimivat sekä alku- ja loppupään solmut p53 ja oli mukana kahdessa vaiheessa takaisinkytkentäsilmukoiden.

PKT206 malli edustaa Cytoscape sisältää 203 geeni /proteiini solmuja, tulo solmu (DNA-vaurioita), kaksi lähtösolmut (apoptoosin ja solujen vanhenemista) ja 738 reunoja. Aktivointi ja esto-yhteydet edustavat siniset ja punaiset nuolet, vastaavasti. Tulopisteen leimasi vihreällä; solmut ylävirtaan p53 leimasi keltainen; p53 ja MDM2 leimasi punaisella, solmut alavirtaan p53 leimasi vaaleansininen ja lähtösolmut leimasi oranssi.

Laskimme liitettävyys aste 206 solmut verkossa (kuva 3). Liitettävyys aste geenin osoittaa vuorovaikutusten määrä tämän geenin. Kaikkein yhdistetty geeni oli p53, joka osallistui 225 vuorovaikutusta PKT206 mallissa. Oli 30 geenien kanssa yhteyden asteen välillä 10 ja 100 ja loput geenit olivat mukana alle 10 vuorovaikutusta.

aste jakautuminen 206 solmuja mallissa oli saatu NetworkAnalyzer plugin Cytoscape; molemmat akselit kuvassa ovat logaritmisella asteikolla.

Verkko sisältää 30 kaksivaiheinen takaisinkytkentäpiireihin yhteensä, 14, joihin liittyy p53. Osa niistä on merkittävä rooli p53 sääntelyä; Esimerkiksi palaute silmukoita, joihin liittyy p53, MDM2 ja MDM4 (Mdm4 p53 sitovan proteiinin homologi (hiiri)), joka sisältää viisi vuorovaikutusta: p53 aktivoituu MDM2; MDM2 estää p53; MDM2 estää MDM4; MDM4 aktivoi MDM2 ja MDM4 estää MDM2 [24]. Palaute silmukoita on ratkaiseva rooli p53 sääntelyn ja ajatellaan lisätä luotettavuutta järjestelmän vastauksena häiriöitä [25].

P53 on liitetty lukuisiin soluvasteita stressiin myös IR (ionisoiva säteily), UV, onkogeeni aktivointi, ja hypoksia. Tätä mallia pystyä ennustamaan solujen kohtalon vastauksena stressiä, me liittyy 20 solmua tulosignaaliin DNA-vaurioita (taulukko S3 File S1). Useimmat linkit DNA-vaurioita ovat aktivoinnit ja vain 3 ovat estoja (DNA-vaurioita estää PTTG1 (aivolisäkkeen kasvaimen muuttamassa 1), MYC (v-myc, myelocytomatosis viruksen onkogeenin homologi (linnun)) ja AURKA (aurora-kinaasin A). Vastaavasti , p53 valvonta lukuisia soluvasteita painottaa esimerkiksi solusyklin pysähtymiseen, DNA vahinkosaneeraus, vanhenemista ja apoptoosia. Löysimme 95 yhteyksiä alavirran geenin solmujen ja apoptoosin ja 77 solmut vuorovaikutuksessa apoptoosin solmuun. niistä 18 solmut sekä edistetään ja esti apoptoosin, 38 solmut vain aiheuttaman apoptoosin ja 21 solmut oli vain apoptoosin vastaisen toiminnan. Löysimme 52 geenejä kytketty vanhenemista 61 yhteyksiä, joista 28 edistävät ja 33 estää vanhenemista.

Analyysi riippuvuuksien p53 malli

loogiset riippuvuudet välillä geenien /proteiinien edustaa riippuvuutta matriisi [14], joka edustaa vaikutukset kaikkien parien solmujen mallissa. Kuusi eri vaikutukset määritellään CellNetAnalyzer olemassaoloon perustuvaa (tai ei ) positiivisten ja negatiivisten polkuja kahden solmun: ei vaikutusta, epäselvyytenä, heikko estäjä, heikko aktivaattori, vahva inhibiittori, ja voimakas aktivaattori (katso menetelmät lisätietoja). On 42436 (206 x 206) elementtejä riippuvuutta matriisiin, josta 23468 vastaavat vuorovaikutukset, joilla ei ole vaikutusta; 16540 kaksijakoisia tekijöitä; 1100 ovat heikot estäjät; 1240 ovat heikot aktivaattorit; 33 ovat vahvoja estäjiä ja 55 ovat vahvoja aktivaattoreita (taulukko S6 File S1). Valtaosa riippuvuus matriisin elementtien ole vaikutusta tai kaksijakoinen tekijöistä. Suuri määrä kaksijakoinen tekijöistä johtuu monimutkaisuuden säätelyvaikutukset solmujen välillä, jotka vaikuttavat sekä positiivista että negatiivista palautetta silmukoita ja polkuja. Esimerkiksi on sekä positiivisia että negatiivisia polut ATM CHEK2: positiivinen polku on suora aktivointi CHEK2 ATM, kun taas negatiivinen polku on epäsuora esto, koska ATM aktivoi p53, p53 estää MYC, MYC aktivoi E2F1 (E2F transkriptiotekijä 1), ja E2F1 aktivoi CHEK2. Tämän seurauksena näiden välinen vuorovaikutus kahden solmun määräytyy vastakkaisten aktivoimalla ja estäviä vaikutuksia, jolloin se luokitellaan kaksijakoinen (kuva S5 File S1).

In silico

simulointi mutaatio vaikutukset

jotta voidaan arvioida kapasiteetin PKT206 mallin ennustaa häiriön vaikutukset, suoritimme

in silico

knock-out kokeita, joissa tietty solmu poistettiin verkosta näin matkien in vivo mutaation vaikutuksia. Koska 85% geenien tai proteiinien PKT206 -mallin huonosti kytketty, p53 ja ne 30 geenien yli 10 vuorovaikutusta valittiin suorittamaan

in silico

knock-out testejä. Esimerkiksi me simuloitu p53 knock-out poistamalla p53 solmu verkosta ja analysoidaan vaikutuksia tämän hämminki. Vertaamalla riippuvuutta matriisin jälkeen p53 solmu poistettiin villityypin tapauksessa, muutokset matriisin elementit paljasti, miten suhteet solmujen välillä vaikutti poistetaan. 11785 ulos 42025 (205 x 205) elementtien matriisi muuttunut seurauksena p53 poisto (kuvio 4A). Suuret muutokset ovat taulukossa S7 File S1. Merkittävimmät muutokset olivat kaksijakoinen tekijöistä aktivaattoreita tai inhibiittoreita, mikä osoittaa, että p53: lla on merkittävä rooli moduloimaan järjestelmän vaikutuksia. 11 pois 31

in silico

knock-out testejä ollut suuria muutoksia uusi riippuvuus matriisi kun tietty solmu poistettiin (taulukko S6 File S1). 63 potentiaali ennustukset suuria muutoksia riippuvuus solut saatiin niille 11

in silico

knock-out testit (taulukko 1). Ei tapahtunut merkittäviä vaikutuksia muutoksia toisessa havaita 20

in silico

knock-out testejä.

(A) Distribution muutosten riippuvuutta matriisin p53

in silico

knock-out verrattuna villityypin. Harmaa sykli edustaa mitään vaikutusta elementtejä, oranssi ympyrä edustaa ambivalentti tekijät, vaaleanvihreä ympyrä edustaa heikko aktivaattorit, vaaleanpunainen ympyrä edustaa heikkoja estäjiä, tumma punainen ympyrä edustaa vahvaa estäjiä, ja tummanvihreä ympyrä edustaa vahvaa aktivaattoreina; suunnassa nuolen edustaa suunnan muutoksista knock-out. (B) Chk1 (CHEK1) aktivointi on lisääntynyt p53 negatiivinen taustalla. U2OS solut, jotka on toimiva p53, ja SAOS2-solut, joilta puuttuu funktionaalinen p53 käsiteltiin 10 uM etoposidin 16 tuntia. Solu-uutteet analysoitiin SDS PAGE ja western blot-analyysillä käyttäen vasta-aineita yhteensä Chk1, ATR ja ATM. ATM ja ATR fosforyloitua Chk1 Ser 345.

vahvistaneet 4 Näistä 63 ennustukset kautta kirjallisuushakuja keskittyen suuria muutoksia aiheuttamista p53 poisto joita odotettiin olevan vahvempi kokeellisia vaikutuksia . Esimerkiksi vaikutus DNA-vaurion päälle FAS (Fas (TNF-reseptoreiden superperheen jäsen 6)) muuttui kaksijakoinen tekijä p53 villityypin malli vahvan aktivaattori kun p53 poistettiin. Vaikutus DNA-vaurion päälle FAS luokiteltiin kaksijakoinen villin tyypin solujen koska on mahdollisia negatiivisia polkuja DNA-vaurioita FAS kautta MYC ja PTTG1 lisäksi suora myönteinen polku DNA vaurioita FAS. Kun p53 poistetaan, vain ehdotetun myönteisen omistetaan. Manna et ai. ovat määrittäneet, että p53 miinus soluissa, Fas-proteiinin tasot ovat koholla alle DNA-vaurioita verrattuna p53 villityypin soluissa, mikä on yhtä mieltä meidän ennustus [26]. Samoin FAS vaikutus LATS2 (latia, suuri kasvain vaimennin, homologi 2 (Drosophila)) päälle apoptoosin muutettiin kaksijakoinen tekijä p53 villityypin malli vahvan aktivaattori kun p53 poistettiin. Havaittiin, että sekä p53 villityypin (A549) ja p53 miinus soluja (H1299), LATS2 pystyi apoptoosin ja että apoptoosi on hieman lisääntynyt H1299 mitattuna PARP ja kaspaasi 9 pilkkominen [27]. Havaitsimme, että vaikutus DNA-vaurion päälle CHEK1 (tarkistuspiste kinaasi 1) muuttui kaksijakoinen tekijä p53 villityypin vahvan aktivaattori kun p53 poistettiin. CHEK1 proteiinin määrän todettiin olevan suurempi p53 – /- soluissa kuin p53 + /+ HCT116 peräsuolen syövän soluja käsiteltiin daunorubisiinin [28], joka vastaa myös ennustuksemme (taulukko 1). Kerrottiin, että Klf4 (Kruppel kaltainen tekijä 4 (gut)) aiheutti enemmän vähentäminen CCNB1 (sykliini B1) ilmentymistä p53 – /- HCT116 kuin p53 + /+ HCT116-soluissa [29] ja se sopi mallimme ennuste. Kuitenkin yksi ennustaminen pois näistä 63 ennusteet havaittiin vastapäätä kirjallisuudesta todisteita. Ennustaminen muistutti, että IFNA1 (interferoni, alfa 1) parannettu TLR3 (toll-like-reseptori 3) p53 mutanttisoluista verrattuna p53 villityypin soluista. Mutta tämä oli päinvastainen siihen raportoineet Taura et al. että IFNA1 altistuvat DNA: ta vaurioittavat lääkeaine 5-fluori-urasiili (5-FU) vähensi ilmentymistä TLR3 p53 – /- HCT116 solu verrattuna p53 + /+ HCT116-soluja [30].

Lisäksi kirjallisuuteen pohjainen validointi, saimme

in vitro

perustuu kokeellisia todisteita tukemaan uusia ennusteita mallin. Malli ennustaa, että ilman toiminnallisen p53 vaikutukset ATM ja ATR (ataksia teleangiektasia ja Rad3 liittyvä) päälle CHEK1 olisi molempien muutos kaksijakoinen tekijöistä vahva aktivaattoreita. Western blot-analyysi U2OS ihmisen osteosarkooma-soluja, joilla on villityyppinen p53, ja SAOS2-solujen, joilla on mutantti ei-toiminnallinen p53, osoitti, että CHEK1 aktivoituu korkeammalle määrin p53-mutantin tausta kuin p53 villityypin tausta (kuva 4B) tulojen ennustetta. Lisäksi korkeampi ja mahdolliset aktivointi ATM ja ATR kinaasien havaittiin p53 miinus soluissa kuin p53-positiivisten solujen. Sen mukaan on sekä positiivisia että negatiivisia polut välillä ATM, ATR, CHEK1, ja p53 villityypin soluissa, ja siksi p53 mutanttisoluista tämä tasapaino on häiriintynyt (kuva 5). Tämä vahvistaa ennakoivaa kykyä meidän mallintamista ja on seurauksia hoidettaessa p53 syöpäkasvain.

(A) Positiiviset ja negatiiviset väyliä ATM /ATR CHEK1 p53 villityypin soluissa tunnetaan kirjallisuudesta kyselyn; (B) Positiiviset ja negatiiviset väyliä ATM /ATR CHEK1 p53 miinus soluissa. ARF on sykliiniriippuvaisen estäjä 2A. PPM1D on proteiinifosfataasi 1D. pRB on retinoblastoomaa 1.

Looginen vakaan tilan analyysi

p53-proteiini on tunnettu säilyttää genomista vakautta ja puuttuessa p53 johtaa solun jakautumista vasteena DNA-vauriolle [31] . Koska geneettinen stabiilius laukaisee mutaatioiden normaaleissa soluissa ja aiheuttaa syöpää [32]. Tutkiakseen, miten tällainen menetys vakautta voitaisiin vallata mallimme, me tehtiin vertaileva looginen vakaan tilan analyysi p53 villityypin mallia ja

in silico

p53 knock-out.

loogisen vakaassa tilassa (LSS), valtion kunkin solmun pysyy samana ajan mittaan [33]. Jokainen solmu voi olla kolme erilaista tilaa: inaktivoitu ( ”0”), aktivoitu ( ”1”) tai määrittelemätön ( ”NaN”). Olemme tutkineet neljä skenaariota loogista vakaan tilan analyysi: (1) DNA-vaurio aktivoituu p53 villityypin tausta; (2) DNA-vaurio ei aktivoida p53 villityypin tausta; (3) DNA-vaurio aktivoituu p53 knock-out tausta; (4) DNA-vaurio ei aktivoida p53 knock-out tausta (kuva 6, taulukko 2 ja taulukko S8 File S1). Vertailu loogisten tasaisen valtioiden eri skenaarioissa paljasti, että suuri määrä solmun valtiot eivät muuttuneet muutokseen tulosignaalin. Tämä tulos selittyy suuri määrä kaksijakoinen vaikutusten välillä solmujen ja palaute silmukoita verkossa, jotka tekevät mallista vankka tulosignaalin häiriöitä. Osuus määrätietoisesti valtioiden oli 181 ulos 206 solmujen (87,9%) skenaariossa (1), 182 ulos 206 solmujen (88,3%) skenaariossa (2), 94 pois 205 solmujen (45,9%) skenaariossa (3) ja 95 ulos 205 solmujen (46,3%) skenaariossa (4) (taulukko 2). Nämä luvut osoittavat, että lähes puolet solmujen jonka tila määritetään villityypin tullut määrittelemätön

in silico

p53 knock-out.

Solmut state ”1” oli edustettuina vihreä, solmut valtion ”NaN” (un määritetty) olivat edustettuina oranssi, ja solmut tila ”0” olivat edustettuina punaisella. (A) P53 villityypin kun DNA-vaurioita oli ”ON”; (B) P53 villityypin kun DNA-vaurioita oli ”OFF”; (C) P53 mutantti kun DNA-vaurioita oli ”ON”; (D) P53 mutantti kun DNA-vaurioita oli ”OFF”.

Vertaamalla tilasta 202 geenien, jotka ovat vuorovaikutuksessa p53 p53 villityypin solujen läsnä ollessa DNA-vaurioita ja ne p53 mutantti soluissa läsnäolo DNA-vaurioita, huomasimme, että vain 29 geenejä säädellään ylöspäin, 113 geenit eivät muutu ja 60 geenit säädeltiin (taulukko 3). Muutos FEN1 (läppä rakenne-specific endonukleaasi 1) valtion oli lisäksi kokeellisesti varmistettiin Christmann et ai, kautta löytää että FEN1 tukahdutettiin p53 null soluja DNA-vaurioita [34]. TLR3 todettiin alassäädetty p53 mutantti soluja DNA-vaurioita [35].

Verrattaessa valtion näiden 202 geenien p53 villityypin soluja ilman DNA-vaurioita ja ne, p53 mutanttisoluihin puuttuessa DNA-vaurion (taulukko 3), huomasimme, että 30 geenit olivat säädelty, 112 geenit pysyi samana ja 60 geenit alassäädetty p53 villityypin soluja ilman DNA-vaurioita. Muutos 6 solmujen varmistettiin O’Prey et al. [36]. 4 solmua osoitettiin oikeaksi ennustukset: ilmaisun tasot FAS (TNF-reseptoreiden superperheen jäsen 6), TNFRSF10B (tuumorinekroositekijä superperheen, 10b), PERP (PERP, TP53 apoptoosin efektori) ja p53AIP1 (tuumoriproteiinia p53 säännelty apoptoosin asiakkuutta proteiini 1), oli alassäädetty p53 villityypin soluja ilman DNA vaurioita p53 mutanttisoluista ilman DNA-vaurioita, kun taas muut 2 solmut MDM2 ja CDKN1A ennustettiin muuttumattomana mukaan simulointiin. Kuitenkin O’Prey et ai. noudattaneet alassäätöä p53 villityypin soluja ilman DNA vaurioita p53 mutanttisoluista ilman DNA-vaurioita [36]. Perusteiden mukaisesti määriteltyjä menetelmiä osiossa neljä ennusteet olleet oikeita ja kaksi muuta olivat pieni virhe ennusteita.

Verrattaessa valtion näiden 202 solmuja p53 villityypin solujen DNA-vaurion läsnäollessa ja ne solmut p53 villityypin soluja ilman DNA-vaurion (taulukko 3), huomasimme, että vain 5 geenejä säädellään ylöspäin, 185 geenit eivät olleet muuttuneet ja 12 geenit alassäädetty p53 villityypin solujen aiheuttama DNA-vaurioita.

Verrattaessa valtion näiden 202 solmuja p53 mutanttisoluihin läsnä ollessa DNA-vaurioita ja ne solmut p53 mutanttisoluihin ilman DNA-vaurion (taulukko 3), huomasimme, että 7 geenit olivat sääteli, 181 geenit pysyi samana ja 14 geenit alassäädetty p53 mutantti indusoiman DNA-vaurioita. Yhdessä nämä edellä esitetyt tulokset kuvastavat sitä, että p53 auttaa vakauttamaan järjestelmään.

Muutokset valtion Antiapoptoottisten ja anti-vanhenemista geenit on esitetty taulukossa S9 Tiedosto S1 ja ne proapoptootti- ja pro-vanhenemista geenit lueteltu taulukossa S10 File S1. Tämä jakelu havainnollistaa miksi apoptoosin tuotanto oli myös aktivoida p53 mutanttisoluista. Suurin osa näistä 56 pro-apoptoottisia geenejä ja 39 anti-apoptoottisia geenejä ei ole muuttunut samassa solutyypistä käsiteltiin DNA-vaurioita. Koska p53: n aiheuttama ilmeisiä muutoksia sekä pro-apoptoottisten ja antiapoptoottisten geenien jälkeen, kun soluja käsiteltiin DNA-vaurioita. Määrä proapoptoottisten ja antiapoptooppinen geenejä, jotka olivat säädelty tai alassäädetty lisääntyi ehtyminen p53. Niistä 56 proapoptoottisten geenejä, FAS ja p53AIP1 olivat säädellään ylöspäin p53 mutanttisoluja kun hoitaa DNA-vaurioita. FGF2 (fibroblastikasvutekijä 2 (perus)) oli sekä proapoptoottisten ja apoptoosin vastaisen toiminnan on PKT206 malli ja se alassäädetty p53 villityypin soluja tai p53 mutanttisoluihin läsnäollessa DNA-vaurioita. Erityisesti IGF1 R (insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 -reseptorin) ja PDGFRB (verihiutaleiden kasvutekijä reseptori, beeta polypeptidi) oli yläreguloituja p53 miinus skenaarioita, jotka yhdessä FGF2 muutoksia korostettuna kasvutekijä välittämää signalointireitteihin yhtä tärkeä tekijä eloonjäämisen nämä kasvaimet.